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WO 98/036S3 PCT/P~7/01340
PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE MAMMIFERES NON
HUMAINS TRANSGENIQUES EN VUE DE LEUR TRANSPLANTATION
CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA
s MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques
0 pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'organes de m~mmifères
non hllm~in~ transgéniques susceptibles d'être greffés chez l'homme en
réduisant sensiblement les risques de rejet de greffes.
La transplantation d'organes animaux chez l'homrne, ou
xénotransplantation, est une technique considérée actuellement comme une
5 alternative possible, permettant de pallier le manque crucial de donneur en
allogreffe. Des avancées spectaculaires dans ce domaine ont été réalisées depuisquelques années, et le porc comme animal donneur s'impose à la communauté
scientifique et médicale. Les raisons de ce choix, par opposition au choix de
primates comme donneurs d'organes sont multiples: le risque de transmission de
20 virus pathogènes pour l'homme est bien moindre à partir du porc (Allan, 1996),
I'élevage et le temps de reproduction des primates, à l'opposé du porc, rend leur
utilisation difficile, et une barrière d'ordre éthique non négligeable existe pour
l'utilisation de singes à des fins de médecine hllm~ine L'obstacle majeur à
l'utilisation de greffons de porc chez l'homme est avant tout immunologique:
2s l'homme possède des anticorps naturels (appelés xénoanticorps naturels-XAN-)
dirigés contre des molécules exprimées par les cellules porcines. Lorsqu'un
organe de porc est greffé chez l'homme (et chez les primates supérieurs qui
possèdent aussi ces anticorps), ces anticorps réagissent avec l'endothélium
vasculaire entraînant un rejet suraigu de l'organe. Il s'agit en fait de la perte,
30 induite par les XAN et le complément, de l'intégrité de l'endothélium vasculaire
entrainant un oedème, une infiltration cellulaire et une destruction de l'organe~- (Bach et al., 1995). Les antigènes porcins reconnus par les XAN ont été
analysés: il s'agit majoritairement d'une structure glucidique constituée de
~ galactose branché en configuration al,3 sur le N-acétyllactosamine (épitope a-
,s galactosyl) présent sur les glycolipides et les glycoprotéines de membrane
(Sandrin et al., 1993).
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Les travaux réalisés par l'équipe de D. White (Cambridge) ont permis de
résoudre partiellement ce problème de rejet hyperaigu: en bloquant l'activation
du complément humain à la surface des cellules de l'endothélium porcin
(Carrington et al, 1995), ils sont parvenus à réaliser des gret'fes de coeur de
porc chez le macaque, dont la survie semble similaire à la survie d'une
allogreft'e (greffe d'un organe de la même espèce) réalisée dans les mêmes
conditions, dans la mesure où le dépôt de XAN n'est pa.s trop massif.
Techniquement, cela a été réalisé par insertion, par transgenèse germinale,
d'une molécule régulatrice du complément humain, le DAF (pour decay
n accelerating factor, ou CD55), dans le génome de porc. Cette molécule,
spécifique d'espèce, empeche la C3 convertase humaine d'enclencher la réaction
en chaîne d'activation du complément à la surface des celluies porcines. Cette
molécule semble toutefois " dépassée " lorsque la quantité de complément fixée
est trop importante. Dans ce cas, un rejet survient quand même.
:- La présence des épitopes oc-galactosyl, le xénoantigène majeur sur lescellules porcines, est due à l'action d'une enzyme golgienne, UDP-Gal:Gal(x1-
4GlcNacoc1,3-galactosyltransférase (encore désignée enzyme al,3GT).
I 'enzyme a1,3GT participe à la fixation de galactose, en configuration o~1,3,
sur le galactose du N-acétyllactosamine des glycoprotéines et glycolipides
~o membranaires, ce qui crée un épitope xénoantigénique appelé a-galactosyl
constitué de l'ensemble Gal(x1,3Gal-N-acétyllactosamine. L'inactivation du gène
codant pour cette enzyme chez le porc pourrait bloquer la synthèse des épitopes
a-galactosyl et induirait la non reconnaissance des cellules de porc par les XANhumains. Cette inactivation, utilisée conjointement a I'expression de DAF
~5 humain chez le porc, pourrait représenter un bénéfice décisif pour la réussite de
la xénogreffe d'organes de porc chez l'homme. Cependant, I'inactivation d'un
gène par recombinaison homologue ("gene knock out") est une technique dont
l'utilisation est actuellement restreinte à la souris, car sa mise en oeuvre
nécessite la disponibilité de cellules souches embryonnaires, dites cellules ES.~o Ces cellules, malgré d'intenses recherches, n'ont jamais pu etre obtenues chez
une autre espèce que la souris. L'inactivation de l'a1,3GT chez le porc ne peut
donc pas être réalisée par cette technique.
A part les molécules xénoantigéniques et les molécules participant à la
biosynthèse de ces dernières, il existe d ' autres molécules dont 1 ' inhibition~,~ pourrait être utile en xénotransplantation, en particulier les molécules dont
1 ' activité biologique concourt AU rejet de greffe, sans que ces molécules ne
soient des xénoantigènes ou ne participent à la synthèse de xénoantigènes. Il
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s ' agit notamment de I 'ensemble des molécules à caractère intlammatoire
produites par l'endothélium du greffon, en particulier lors d'une xénogreft'e:
cytokines (IL-1, IL-6), facteurs chémotactiques (IL-8, IP-10, RANTES,
MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GFM-CSF, G-CSF), molécules d'adhésion
(ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlba, vWF, ligand LAM-1), facteurs de
transcription (c-fos, NFkB, Gem), régulateurs du tonus vasculaire (iNO
syntllase, PGH synthase, endothéline), facteurs intervenant dans la coagulation
(PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), t'acteurs d'immunocompétence(CMH 1, CMH II). Il s'agit aussi des récepteurs, exprimés par l'endothélium du
o greffon, à des molécules provenant du receveur et ayant une activité biologique
concourant au rejet de greffe: récepteur au CSa, récepteur au TNFa, récepteur
à l'INFy, récepteurs aux cellules NK.
La présente invention a pour but de fournir des organes de m~mmifères
non humains transgéniques susceptibles d'être gref~ës chez des patients
nécessitant une greffe d'organes, avec diminution du risque de phénomène de
rejet du greffon, voire complète ~nn~ tion de ce risque.
La présente invention a également pour but de fournir des séquences
nucléotidiques susceptibles d'être utilisées pour la transformation génétique
d'animaux en vue d'obtenir les susdits organes.
~o L'invention a également pour but de fournir des m~mmifères non humains
transgéniques à partir desquels sont susceptibles d ' être prélevés les susdits
organes .
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques
codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un
7~ phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-
molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que
ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la
biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de m~mmifères non
humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant
.o susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque
lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non
humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules
transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains. au sein
desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes
,~ immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité
desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou
partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne
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reconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein
desquels la biosynthèse desdits épitopes xénoantigéniques est partiellement ou
totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de
mammitères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.
Les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente
inventioll sont avantageusement celles codant pour des anticorps dirigés contre:- tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par
des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques
galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non
humains, notamment l'épitope a-galactosyl présent à la surface de cellules de
porc et constitué de l'ensemble Galal,3Gal-N-acétyllactosamine susmentionné,
- toute molécule participant à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéni4ues
chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement
les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non
humains, notamment l'enzyme al,3GT présente dans les cellules de porc,
- toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium
de mam~nifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à
la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu
xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL-l, IL-6, IL-8, IP-
~o 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs plSE, GM-CSF, G-CSF), les molécules
d'adhésion (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlba, vWF, ligand LAM-l)
les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB, Gem),
les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéiine).
Ies l'acteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase. facteur
tissulaire, PAI-1), les facteurs d'irnmunocompétence (CMH I, CMH II),
- les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur,
I'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple
le C5aR, ou le TNFaR, ou les récepteurs aux cellules NK.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de molécules
30 impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, telles que décrites ci-dessus,
pour IA mise en oeuvre d'un procédé d'obtention, notarnrnent selon les méthodes
décrites ci-dessous, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps
dirigés contre les susdites molécules, ces séquences nucléotidiques étant elles-mêmes susceptibles d'être utilisées pour la préparation de cellules trans~éniques,
3~ ou d'organes transgéniques tels que définis ci-dessus selon l'invention.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de
1 ' invention sont obtenues par sélection des susdits anticorps anti-molecules à
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savoir des anticorps dirigés contre les molécules impliquées dans un phénomène
de rejet de gref'fe, cette sélection étant effectuée A l'aide desdites molécules- utilisées en tant que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, et
séquençage des séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi
- s sélectionnés.
Lesdits anticorps anti-molécules sont eux-mêmes avantageusement obtenus
à partir de tout hybridome susceptible d ' être formé, par des méthodes
classiques, à partir de cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou
de rat, immunisés contre l'une desdites molécules impliquées dans un
o phénomène de rejet de greffe, d 'une part, et des cellules d ' un myélome
approprié d'autre part, ledit hybridome étant sélectionné par sa capacité à
produire des anticorps monoclonaux reconnaissant ladite molécule initialement
mise en oeuvre pour l'immunisation des ~nim~llx.
L' ADN des hybridomes ainsi sélectionné est ensuite cloné, selon les
techniques bien connues de I ' homme de métier, dans des hôtes cellulaires
susceptibles de produire lesdits anticorps monoclonaux, les séquences
nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi sélectionnés, étant ensuite
séquencées.
Lesdits anticorps anti-molécules peuvent également être obtenus par
criblage d'une banque d'anticorps (telle que la banque décrite dans l'article deNissim et al., 1994) avec lesdites molécules, ladite banque d'anticorps étant
construite à partir de séquences d'ADN d'immunoglobulines h~lm~ines ou
murines, ou issues d'une autre espèce, dans un hôte cellulaire (notamment dans
des phages) susceptibles d'exprimer les anticorps codés par lesdites séquences
~s d'ADN d'immunoglobulines.
Avantageusement, les anticorps susmentionnés, à partir desquels sont
déduites les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente
invention sont des anticorps simple brin (encore désignés anticorps ScFv).
Ces anticorps ScFv sont avantageusement obtenus à partir d'une banque
d ' anticorps telle que décrite ci-dessus, dans laquelle les séquences d ' ADN
codant pour ces anticorps sont traitées, notamment selon la méthode décrite dans- I'article de Nissim et al., 1994, de manière à obtenir des anticorps simple brin,
notamment par jonction de tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour
une chaîne lourde d' immunoglobuline avec tout ou partie d'une séquence
3~ d'ADN codant pour une chaîne légère d'immunoglobuline.
Ces anticorps ScFv peuvent également être obtenus par clonage de l'ADN
complémentaire (ADNc) issu d'hybridomes, tels que décrits ci-dessus, codant
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pour une immunoglobuline dirigée contre une desdites molécules impliquées
dans un phénomène de rejet de greffe, suivi d'un traitement, tel que décrit ci-
dessus, de manière à obtenir des anticorps simple brin par jonction de tout ou
partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne lourde de
I'immunoglobuline avec tout ou partie de la traction dudit ADNc codant pour la
chaine légère de cette immunoglobuline.
Selon un mode préféré de réalisation de 1 ' invention, les séquences
nucléotidiques utilisées pour la préparation de cellules ou organes transgéniques
susmentionnés, sont celles codant pour des anticorps dirigés contre toute
molécule impliquée dans la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans les
cellules de mammifères non humains.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de
la présente invention sont celles codant pour des anticorps dirigés contre l'uneau moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des
galactosyltransférases présentes chez les m~mmifères non humains, et plus
particulièrement contre l'une au moins des isoformes de l'al,3GT présente chez
le porc, pour la préparation d ' organes de mammifères non humains
transgéniques au sein desquels la biosynthèse des épitopes a-galactosyl dans lescellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée.
~o A ce titre, I'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps, le
cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de
l'al,3GT lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'une des
méthodes décrites ci-dessus effectuées à l'aide d'une ou plusieurs isoformes de
l'al,3GT, en tant que molécules impliquées dans un phénomène de rejet de
s greffe .
L'invention concerne plus particulièrement les anticorps tels que décrits
ci-dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'al,3GT présentes
chez le porc, et notamment contre l'une au moins des isoformes représentées par
les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant à l'isot'orme 1),
~o SEQ ID NO 4 (correspondant à l'isot'orme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant à
l'isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4), ces isoformes 1 à
4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par
SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3~ SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codées par
toutes séquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par
,~ dégénérescence du code génétique.
L' invention vise plus particulièrement les anticorps tels que décrits ci-
dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de 1'(x1.3GT
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présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ
ID NO 6 et SEQ ID NO 8.
Avantageusement les anticorps anti-al,3GT susmentionnés de l'invention
sont des anticorps simple brin dont les séquences en acides aminés sont telles
qu'elles contiennent les parties CDR1, CDR2 et CDR3 de la chaîne lourde
desdits anticorps anti-al,3GT reliés par une séquence liante (linker) d'environ
6 à environ 36 acides aminés, à tout ou partie de la chaîne légère V~3 des
anticorps anti-al,3GT susmentionnés.
Un linker particulièrement préféré est celui constitué de trois répétitions
successives de la séquence en acides suivante:
Gly - Gly- Gly- Gly- Ser
Des anticorps particuliers selon l'invention sont ceux représentés par les
séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFvl), SEQ ID
NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3),
SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (anticorps désigné
ScFv5), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières,
notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides
aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs
séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant
~o susceptibles de reconnaître l'une au moins des isoformes de 1'~1,3GT.
L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques codant
pour un anticorps anti-Gc1,3GT tel que décrit ci-dessus, et comportant
notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant
pour ScFvl),SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2),SEQ ID NO 13 (codant pour
~5 ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour
ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment
les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant
néanmoins capables de coder pour les anticorps ScFvl, ScFv2, ScFv3, ScFv4
ou ScFv5, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution
io d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques
susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et
- lesdits t'ragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de
reconnaître l'une au moins des isoformes de 1'1x1,3GT.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 9,SEQ ID NO ll,SEQ ID NO
i~ 13~ SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17 susmentionnées sont avantageusement
obtenues par séquençage des ADNc codant pour les anticorps représentés par
SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16 et SEQ ID
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NO 18 respectivement, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectiolmé~s
pOUl leur capacité à produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones
cellulaires étant effectuée à l'aide de l'isoforme 2 de 1'(x1,3 GT (à savoir du
polypeptide représenté par SEQ ID NO 4) utilisée en tant que molécule cible
reconnue par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes
obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de pha~es,
avec des séquences nucléotidiques provenant d'une banque d'ADNc codant pour
des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al., 1994,
ou provenant d'hybridomes obtenus selon la technique indiquée ci-dessus par
immunisation d'un animal avec ladite isoforme n~ 2 de 1'o~1,3GT.
E' invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide,
contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus selon
l'invention, notamment l'une au moins des séquences SEQ ID NO 9, SEQ ID
NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 ou SEQ ID NO 17, et les éléments
nécessaires à l'expression des anticorps anti-molécules, et plus particulièrement
des anticorps anti-oc1,3GT susmentionnés.
L'invention concerne également tout hôte cellulaire (telle qu'une cellule
eucaryote) contenant l'un au moins des vecteurs tels que décrits ci-dessus, selon
l ' invention.
L'invention concerne également tout mammifère transgénique non humain.
ou toute cellule de m~mmifère transgénique non humain, comprenant dans leur
génome au moins une séquence nucléotidique décrite ci-dessus, codant pour des
anticorps anti-molécules tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement pour
des anticorps anti-oc1,3GT susmentionnés.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout mammifère
transgénique non humain, ou toute cellule de m~mmifère transgénique non
humain, tels que décrits ci-dessus, comprenant dans leur génome au moins une
des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO ll
SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou au moins une séquence
dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, desdites séquences
nucléotidiques .
Avantageusement, les mammifères transgéniques non humains, selon
l'hlvention sont tels qu'obtenus par introduction, notamment par microinjection,dallS Ull ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique telle que
définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules tel que défini ci-
dessus~ et plus particulièrement d'au moins une des séquences nucléotidiques
représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO ll, SEQ ID NO 13, SEQ NO 15
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et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou tragment tels que définis ci-
dessus. et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et
développement de l'embryon à terme.
L,' invention a également pour objet tout mammifère transgénique non
humain défini ci-dessus, tel que produit par croisement d'animaux transgéniques
exprimant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus,
codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement au moins une
des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11,
SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou
0 fragment tels que définis ci-dessus.
A titre d'illustration~ les mamrnifères transgéniques non humains, selon-
I' invention, peuvent être obtenus selon la méthode décrite dans l'article de
DePamphilis M.L., et al., 1988.
Parmi les m~mmifères transgéniques non humains susceptibles d'être
obtenus dans le cadre de la présente invention, on peut citer la souris, le rat. Ie
porc ou le lapin.
L' invention a plus particulièrement pour objet les porcs transgéniques
contenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques
représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO
~o lS et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-
dessus .
L'invention concerne également les cellules cultivées à partir des animaux
transgéniques non humains tels que décrits ci-dessus.
L' invention a également pour objet les organes de m~mmifères non
~s humains, et plus particulièrement les organes de porc, notamment les reins, le
foie le pancréas ou le coeur, colllplenant dans le génome des cellules les
constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus,
codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement d'au moins unedes séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11,
SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17,ou leur séquence dérivée ou
fra ment tels que définis ci-dessus, lesdits organes étant tels qu'obtenus par
- prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon l'invention.
L'invention concerne également tout polypeptide comprenant la séquence
- d'acides aminés telle que représentée par SEQ ID NO 6 (correspondant à
3~ l'isoforme 3 de l'al,3GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de
1'c~1~3GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6
acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit
, ,
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polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps
reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'al,3GT, ou comprenant
toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou
modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence
s dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes.
L' invention a également pour objet les séquences nucléotidiques
col-nprenant les séquences représentées par SEQ ID NO S et SEQ ID NO 7, ou
toutes séquences dérivées, notamment les séquences dérivées par dégénérescence
0 du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les polypeptides
représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6-
et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition,
suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des
séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leur séquences dérivées, lesdites
s séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un
anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'al,3GT.
L' invention concerne également tout vecteur, notamment plasmide,
comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour les séquences
représentées par SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6, ou par une séquence dérivée
~o ou fragment ce ces dernières, tels que définis ci-dessus, ainsi que les éléments
nécessaires à l'expression des isoformes de l'al,3GT codées par lesdites
séquences nucléotidiques.
L'invention vise également tout hôte cellulaire transformé par un vecteur
tel que décrit ci-dessus, ainsi que tout procédé de préparation des isoformes 3 et
~5 4 susmentionnées de l'al,3GT par mise en culture dudit hôte cellulaire dans un
milieu de culture approprié, et séparation desdites isoformes des autres
constituants du milieu de culture.
L' invention a plus particulièrement pour objet toutes séquences
nucléotidiques avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour
,o les anticorps dirigés contre les isoformes 3 et 4 susmentionnées de l'al.3GT.ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés pour leur capacité à
produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée à
l'aide de l'isoforme 3 et/ou 4 de l'al,3 GT (à savoir des polypeptides
représentés par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8, respectivement) utilisées en tant
,s que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires,
étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries
ou de phages, avec des séquences nucléotidiques provenant d ' une banque
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d'ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite
par Nissim et al., 1994~ ou provenant d'hybridomes obtenus selon la technique
indiquée ci-dessus par immllni~a~ion d'un animal avec ladite isoforme 3 ou ladite
isotorme 4 de 1'al,3GT.
L' invention a également pour objet toute méthode, notarnment
chirurgicale, de traitement de patients nécessitant une greffe de cellules ou
d ' organes, par implantation desdites cellules transgéniques selon I ' invention
dans des tissus appropriés dudit patient, ou par suppression de 1 ' organe
dét'ectueux du patient et remplacement de cet organe défectueux par un organe
de mammifère non humain transgénique selon l'invention.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui
suit de l'obtention des différentes isoformes de l'al,3GT de porc, ainsi que de
la transformation de cellules animales à l'aide de séquences nucléotidiques
codant pour des anticorps anti-al,3GT selon l'invention, et de procédures
d'obtention d'animaux transgéniques selon l'invention.
I - Obtention des différents isoformes de l'al,3 GT
1) Procédures expérimentales
~o
a) Cellules et tissus
Les organes porcins ont été obtenus à partir de porcs d'environ 200 à 300
kg. L'isolement enzymatique et la culture des cellules endothéliales aortiques de
porc (PAEC) ont été réalisés selon la méthode décrite dans l'article de Warren,
~5 1990. Les PAEC sont stimulées avec 100 U/ml de TNFa humain (Genzyme,
Cambridge, USA) en présence ou non delO ,ug/ml de cycloheximide.
b) Oligonucléotides
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés:
- oligonucléotide 1
5'-AGGAAGAGTGGTTCTGTC-3' hybridant aux nucléotides 24 à 41 de la
séquence SEQ ID NO 1,
-oligonucléotide 2
5'-GTTATGGTCACGACCTCT-3' hybridant aux nucléotides 323 à 306 de la
,5 séquence SEQ ID NO 1,
-oligonucléotide 3
5 ' -TATAGAATTCGAAAATAATGAATGTCAAAGGAATAGTGGTTCTGTC
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-3' hybridant à un site EcoRI situé en amont des nucléotides l à 41 de la
séquence SEQ ID NO 1,
- oligonucléotide 4
5'-ATATAACTAGTGGAAGCTCTCCTCTGTTG-3'- hybridant aux nucléotides
s 278 à 255 de la séquence SEQ ID NO 1, et introduisant une mutation de G en A
dans la troisième base du codon codant pour une proline,
- oligonucléotide 5
5'-ATATACTAGTGGACTGGTTTAATC-3' hybridant aux nucléotides 275 à
292 de la séquence SEQ ID NO 1, et introduisant la même mutation de G261 en
n A comme dans le cas de l'oligonucléotide 4,
- oligonucléotide 6
5 ' -GAGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCGATGTTATTTCTAACCA
AATT-3' hybridant aux nucléotides 1105 à 1123 de la séquence SEQ ID NO 1,
et additionné en phase à un oligonucléotide codant pour un peptide FLAG
(Kodak, New Haven, USA) un codon stop et un site Xhol.
o c) clonage et construction
Un clone d'ADNc al,3GT de 2 Kb (pCDNA-aGT) a été isolé d'une
banque d'ADNc construite dans le vecteur pCDNA-1 (Invitrogen, Leek, Pays-
Bas) par hybridation de transfert en utilisant une sonde PCR amplifiée avec les
amorces 1 et 2 (dérivées de la séquence publiée dans l'article de Sandrin et al.,
~s 1994. Ce clone correspond à celui de l'isoforme n~ 2.
Les isoformes 1, 3 et 4 de l'al,3GT porcine ont été isolées par
amplification par PCR d'une région comprenant les exons 4 à 7 avec les
amorces 1 et 2, en utilisant l'ARN rétro-transcript des PAEC. Les fragments
amplifiés sont traités par la polymérase de Klenow, pour obtenir des extrémités
franches, et clonés dans le site Smal du plasmide pUC18. Troi.s clones contenantdes fragments de 300, 237 et 201 pb ont été obtenus et utilisés en tant que
matrice pour introduire, par amplification PCR secondaire, un site EcoRI à
l'extrémité 5' (avec l'oligo 3) et un site SpeI dans l'exon 7 (avec l'oligo 4).
L'introduction de ce site SpeI ne modifie pas la séquence en acides aminés. Les
3s produits de PCR ont été ligués dans un plasmide pKS digéré par EcoRI-SpeI. La
partie 3' restante de la séquence codante a été amplifiée par PCR à partir du
clone pCDNA-aGT avec les amorces 5 et 6, traitée pour obtenir des extrémités
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t'ranches et clonée dans le site EcoRV d'un plasmide pKS. A partir de ce
plasmide recombinant, un fragment Spel portant la région codante du nucléotide
262 à 1125, en phase avec une séquence FLAG (contenue dans l'oligonucléotide
6)~ a été isolée et clonée dans les sites SpeI des plasmides pKS contenant les
régions 5' variables. Les construits résultant ont été contrôlés par séquençage, et
les fragments EcoRI, contenant les séquences codantes entières ont été sous-
clonés dans le vecteur d'expression encaryotique pCDAAS-néo conduisant
l'expression du transgène sous contrôle du promoteur du CMV. L'isoforme 2 de
l'o~GT porcine a été isolée de la même manière, en utilisant le clone pcDNA-
~GT comme matrice initiale.
d) transfection de cellules
Des cellules HeLa cultivées en RPMI - 10 % FCS ont été traitées par la
:- trypsine, resuspendues à raison de 5.106 cellules/ml dans un milieu glacé et
mélangées avec 20 ~g/ml d'ADN plasmidique portant le transgène et un gène de
résistance à la néomycine. Les cellules ont été traitées par électroporation à 250
V, 350 ,uF, laissées dans la glace pendant 10 mn et ensemencées à raison de
2000 cellules/cm2. Après 24 h, 500 ,ug/ml G418 ont été additiormés et les
cellules ont été cultivées pendant deux semaines. Les clones ont été isolés et
cultivés en présence de G418.
e) immunofluorescence
Les clones de cellules HeLa exprimant une des quatre isoformes de l'a
~5 1,3GT ont été ensemencées sur des lamelles à 4 chambres pour microscope
(Nunc, Rookilde, Danemark), pour l'analyse de l'expression des épitopes
o~-galactosyl sur les membranes cellulaires. Deux jours après l'ensemencement,
les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, fixées pendant 10 mn à
température ambiante avec du paraformaldéhyde 3 %, lavées encore et incubées
30 pendant une heure à température ambiante avec l ' isolectine B4 - FITC de
Banderaea simplicifolia (Sigma, St Louis, USA), dilution au 1.100 dans du
PBS. Les lamelles ont été lavées 4 fois dans du PBS avant montage. Pour la
localisation subcellulaire, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 3
% et perméabilisées par trois incubations séquentielles de 5 mn avec 50 %, 100
3~ % et 50 % d'acétone glacée. Après trois lavages avec du PBS/Tween-20 0,5 %,
les cellules ont été incubées avec l'anticolps anti-FLAG M2 (1:200; Kodak,
New Haven, USA), puis incubées pendant une heure avec un anticorps
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secondaire d'âne anti-souris marqué au FITC (1: 500; Jackson, Baltimore,
USA). Les préparations ont été montées dans un fluide FA (Dit'co, Grayson,
IJSA) et visualisées avec un microscope à épiiluorescence Nikon.
l) Analyses par transfert d'ADN (Northern blot)
L'ARN cellulaire total a été isolé à partir de cellules cultivées et d'organes
décrits par Zipfel et al.., 1989. Dix ~g d'ARN total ont été fractionnés sur un
gel d'agarose/formaldéhyde, transférés sur une membrane Hybond N
(Amersham, Little Chalfont, UK) par action capillaire dans 20 X SSC pendant
16 h et immobilisés par réticulation aux UV. Les filtres ont été pré-hybridés
pendant 6 h dans une solution contenant 50 % de formamide, 5 X SSPE (0,18
M NaCl, 10 mM phosphate de sodium, pH7,7, 1 mM EDTA), 5 X Denhart's,
0.5 % SDS, et 100 ~lg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon. L'ARN lié
aux membranes a été hybridé avec des sondes d ' ADNc marquées au p32
correspondant à la région codante de l'isoforme 1 de 1'o~1,3 GT, à la ~-actine
porcine ou à l'ARN 28S. L'hybridation a été réalisée pendant une nuit à 42~C
dans une solution de pré-hybridation contenant 106 cpm/ml d'une sonde. Les
filtres ont été lavés deux fois dans 2 X SSPE, 0,5 % de SDS à température
ambiante pendant 15 mn, et trois fois dans 0,5 X SSPE, 0,5 % SDS à 65 ~C
~o pendant 15 mn. L'hybridation a été visualisée et les signaux quantifiés avec un
dispositif phosphorimage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA).
g) test de protection à la RNase
Les tests de protection à la RNase ont été réalisés selon la méthode décrite
5 par Melton et al., 1984. Deux sondes d'ARN, complémentaires des exons 5 et
6, et des exons. 4 et 7, ont été préparées de la manière suivante: deux
fragments EcoRI-Spe~, correspondant aux nucléotides 7 à 266 du clone c~G Tiso
1, et aux nucléotides - 7 à 174 du clone o~T iso4 (Fig. 1) ont été sous-clonés
dans les sites EcoRI-SpeI des plasmides pKS. En utilisant l'ARN polymérase
,o T7~ les sondes d'ARN antisens ont été synthétisées et du 32p dUTP a été
incorporé. L'ADN plasmidique matrice a été digéré avec l'ADNase I, et 500
000 cpm de chaque sonde ont été hybridés pendant 16 h à 10 ~g d'ARN total
d'or~alles porcins ou de cellules dans 30 ,ul de tampon d'hybridation contenant
80 ~ de t'ormamide, à 50 ~C. Les échantillons de contrôle contiennent 10 ~g
" d ' ARN de levure. Les mélanges d ' hybridation été dilués à 400 ~l avant
l'addition de 5 ~g/ml de RNase A et 10 U/ml de RNase Tl. Après 1 h à 30 ~C,
50 %g de protéinase K et de SDS à 0,5 % ont été ajoutés. Le mélange a ensuite
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été extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. Les produits de
digestion ont été analysés sur des gels de polyacrylamide à 6 %. Les gels ont été
exposés pendant 16 h contre des films Kodak AR à - 80~C.
:- 2) Résultats
a) Clonage de quatre isoformes de 1'oc1,3GT
Comme décrit précédemment, une banque d'expression d'ADNc porcin
construite en utilisant l'ARN LLC-PK1 (Guerif et al, 1995), a été criblée en
n utilisant une sonde correspondant à l'extrémité 5' de la séquence codante. Un
clone d ' ADNc, pcDNA-oLGT, avec la région codante correspondant à une
(x1,3GT porcine déjà décrite (Sandrin et al, 1994), a été isolé. Cette oc1,3 GT
correspond à I ' isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4 et codée par la
séquence SEQ ID NO 3. Ce clone pcDNA-ocGT contient une région 3' non
traduite longue de 770 pb, une région codante de 1080 pb contenant les
homologues porcins de ce qui a été défini dans le.cas de la souris comme étant
les exons.. 4, et 6 à 9 (Joziasse et al., 1992) et une région 5' non traduite de150 pb. En utilisant des amorces adjacentes aux exons. 4 et 7, I'amplification
PCR de l'ADN des PAEC a été réalisée. Des produits d'amplification d'environ
~o 200 pb à 300 pb ont été trouvés, suggérant l'existence de transcrits
supplémentaires. Trois produits différents ont été clonés, l'un deux étant
identique à la séquence décrite par Strahan et al, 1995 (et désignée ici comme
étant l'isoforme 1, Fig. 1, à savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO 2
codée par la séquence SEQ ID NO 1 ) . En comparaison avec l ' isoforme 2
~s susmentionnée (provenant du clone pcDNA-o~GT), il contient un segment
supplémentaire de 36 pb après le nucléotide 80. Un autre produit, l'isoforme 3,
à savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO6 codée par la séquence SEQ ID
NO5, ne comporte pas un segment de 63 pb du nucléotide 117 au nucléotide
179~ et le dernier produit, l'isoforme 4, à savoir l'isot'orme représentée par SEQ
30 ID NO 8, et codée par la séquence SEQ ID NO7, ne comporte pas le segment
cle 36 pb du nucléotide 81 au nucléotide 116, et le segment de 63 pb du
nucléotide 117 au nucléotide 179 (Fig. 1). La traduction des ARNm
correspondant à chacun des transcripts identifiés, prédit la synthèse de quatre
formes du polypeptide o~1,3GT, de 372, 360, 351 et 339 acides aminés qui
,~ diffèrent seulement dans la longueur de leurs régions "stem" (tiges) respectives.
LA situation décrite ici est comparable à celle décrite dans le cas de la souris(Joziasse et al., 1992), puisque quatre ARNm différents ont été trouvés,
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contenant les exons 5 et 6, ou contenant seulement l'exon 5 ou l'exon 6, ou ne
contenant ni l'exon 5 ni l'exon 6. Les segments porcins de 36 pb et 63 pb
correspondent bien aux exons 5 et 6 murins, à l'exception du fait que, dans la
souris~ l'exon 6 est long de 66 pb au lieu de 63 pb chez le porc (Fig. 1).
-
h) Activité al,3GT des isoformes
La présence ou l'absence des exons 5 et 6 détermine quatre variations delcmgueul dans la région stem de l'al,3GT. Cette région, localisée à l'intérieur
de l'appareil de Golgi, lie le signal d'ancrage transmembranaire au domaine
l(~ luminal catalytiquement actif. Afin de vérifier si les quatre isoformes définies
par I'épissage alternatif des exons 5 et 6 sont catalytiquement actifs, des cellules
Hel,a humaines ont été transformées avec des plasmides recombinants exprimant
chacune des quatre isoformes de l'al,3GT porcine sous le contrôle du
promoteur CMV. Le produit de cette enzyme sur les surfaces des cellules a été
analysé par immunofluorescence, en utilisant la lectine IB-4 réagissant
spécifiquement avec les résidus Gala. L'épitope Gala pouvait être détecté à la
surface des cellules HeLa traduites avec les quatre isoformes de l'enzyme,
comme le montre la liaison à la lectine IB-4 (Fig. 2), indiquant que ces
isoenzymes possèdent toutes une activité a-galactosyltransférase. Les niveaux
~o d'expression des ARNm de l'al,3GT dans les clones HeLa-al,3GT de porc,
ont été contrôlés par Northern blot, et sont légèrement supérieurs dans les
clones contenant les isoformes 1 et 2, et légèrement inférieurs pour le clone
contenant les isoformes 2 et 3, par rapport au niveau trouvé dans les PAEC.
c) Localisation subcellulaire des isoformes al,3GT
La localisation Golgienne de l'al,3GT est due à la présence dans l'exon 4
d'un domaine signal d'ancrage. Les variations de longueur dans la région stem,
c'est-à-dire la présence ou l'absence des exons 5 et 6, peuvent également
influencer la rétention dans le Golgi (Dahdal et al., 1993) ou exposent un site de
.o clivage sensible aux protéases sur certaines isoformes (Weinstein et al., 1987;
Lammers and Jamieson, 1989, Shaper et al., 1986; Yadav and Brew, 1991).
Afin de vérifier si ces variations de la région stem de l'al,3GT pourraient
modifier la localisation dans le Golgi, la localisation cellulaire des différentes
isoformes a été analysée. Les quatre vecteurs d'expression basés sur le CMV
,~ décrits ci-dessus, expriment les isoformes al,3 GT avec un marqueur FLAG
tusionné à l'extrémité C-terminale ce qui permet de détecter la protéine par
immunofluorescence indirecte dans les cellules HeLa transfectées avec un
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anticorps anti-FLAG. Comme observé par microscopie à tluorescence, les
quatre isoformes sont localisées de façon similaire et forment une structure
juxtanucléaire compacte correspondant à celle de l'appareil de Golgi (Roth et
Bergel-, 1982). De façon surprenante, alors que 100 % des cellules expriment
~ I'enzyme, comme cela a été mis en évidence par coloration uniforme obtenue
avec la lectine ~B4, I'enzyme n'est pas détectable sur la totalité de ces cellules
en utilisant l'anticorps anti-FLAG. Cela peut être due à une expression
irrégulière de l'enzyme associée à une sensibilité limitée de l'anticorps, ou à la
réorganisation de l'appareil de Golgi durant le cycle cellulaire.
d) Expression des isoformes de l'al,3GT
L'épitope Galal,3Gal, résultant de l'activité de l'u1,3GT, n'est pas
exprimé de façon homogène dans les tissus de porc (Oriol et al., 1993). Dans le
but d'étudier ces variations au niveau enzymatique, le niveau des transcripts a
5 1,3GT a été étudié par Northern blot, et la distribution des isoformes a été
étudiée par test de protection à la RNase.
L ' analyse par Northern blot montre I ' expression dans tous les tissus
étudiés, mais avec une différence frappante entre les tissus. Les reins
contiennent environ 50 % de ce ~ue l'on trouve dans la rate, le thymus 40 % et
20 le coeur et les ovaires, 20 à 25 %. Les poumons et le foie contiennent moins de
10 % de ce qui a été trouvé dans la rate. La stimulation des cellules
endothéliales avec les cytokines inflAmm~toires induit une augmentation de la
régulation ou la synthèse de beaucoup de gènes, dont les molécules d'adhésion,
à savoir les molécules liées à l'infl~mm~tion et la coagulation. Une
75 augmentation de la régulation de 1'al,3GT n'a jamais été décrite dans les
cellules endothéliales. En lltili.s:~n~ des PAEC stimulées pendant 6 heures avec100 U/ml de TNFa humain, une augmentation de deux fois le niveau global
d'ARNm codant pour l'al,3GT a été observée. L'incubation des PAEC en
présence de cycloheximide augmente également le niveau d'ARNm codant pour
30 1'o~1,3GT probablement par stabilisation du messager. De façon surprenante, la
stimulation par TNF(x + cycloheximide ne conduit pas à une augmentation du
- niveau de l'ARNm codant pour l'al,3GT, mais plutôt à une légère diminution
Cet effet est peut-être relié à la découverte du fait que la cycloheximide t'acilite
l'apoptose due au TNFo~ conduisant à une diminution de la régulation de
certains antigènes (Malorni et al., 1993).
L'expression des isoformes de l'al,3GT a été analysée par test de
protection à I ' ARNase dans les tissus de porc . Deux sondes antisens
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radiomarquées ont été utilisées pour analyser les quatre espèces d'ARN
identifiées .
Le transcript de l'ARNm de l'isoforme 1 hybride avec un t'ragment de
273 pb SUI la sonde 1 correspondant à une séquence délimitée par les
nucléotides 7 à 266 sur le transcript (les numéros des nucléotides correspondentci la séquence représentée sur la figure 1, isoforme l). L'hybridation de la sonde
1 avec l'ARNm codant pour l'isoforme 2 conduit à un fragment de 87 pb
délimité par les nucléotides - 7 à 80, et un t'ragment plus grand de 150 pb
délimité par les nucléotides 117 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec
lO I'ARNm codant pour l'isoforme 3 conduit à un fragment de 123 pb délimité par
les nucléotides - 7 à 116 et un plus petit fragment de 87 pb délimité par les
nucléotides 180 à 266. L'hybridation de la sonde l avec l'ARNm de l'isoforme
4 de l'al,3 GT conduit à deux fragments de 87 pb délimités par les nucléotides
- 7 à 80 et par les nucléotides 180 à 266. La deuxième sonde, sonde 4, est un
~S t'ragment d'ARNm de 174 pb correspondant à l'isoforme 4. Il est entièrement
protégé par l'ARNm codant pour l'isoforme 4, et conduit à deux fragments de
87 pb avec les isoformes 1, 2 et 3.
Les fragments de sonde protégés par les ARNm codant pour les isot'ormes
1, 2 et 3 sont ceux de 273, 150 et 123 pb, respectivement, la sonde 4 proté~ée
~o par l'ARNm codant pour l'isoforme 4 conduit à une bande de 174 pb. La
répartition des produits de transcription diffère d'un tissu à un autre: dans lerein. I ' isoforme 3 seule est exprimée, alors que dans les ovaires, seule
l'isot'orme 4 est exprimée. Dans le coeur, les poumons et la rate, on trouve lesisoformes 1 et 2, alors que les isoformes 2 et 4 sont trouvée.s dans le foie. Les
~s cellules endothéliales expriment les isoformes 1, 2 et 4. Dans les thymus, on peut observer les 4 isoformes.
.o Il - Transformation de cellules animales à l'aide de séquencesnucléotidiques codant pour des anticorps anti-al,3 GT selon I'invention
1) Matériels et méthodes
,s a) Banques d'ADNc, cellules et plasmides:
La banque d'ADNc provient de cellules épithéliales porcines LLC-PK1.
Elle est construite dans le vecteur pCDNA-1. Les souches bactériennes utilisées
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sont: E. coli-TGl sup ~, E. coli-XL-1, SURE, M15, MC 1061/P3, et DHSa.
Le plasmide d'expression procaryote pQE-30 vient de Qiagen. Le plasmide
d'expression eucaryote pCDAAS-9, contient UII gène de résistance à la
néomycine et entraîne la transcription d'ADNc qu'il porte sous le contrôle du
s promoteur du cytomégalovirus. La banque d'immunoglobulines humaines ScFv
est construite dans le plasmide pHEN-l et a été utilisée comme décrit dans
l'article de Nissim et al., 1994. La préparation des phages recombinants est
également décrite
b) Système d'expression recombinante et purification:
Le système de production et de purification de l'a1,3GT recombinante
provient de Qiagen. La transcription a été induite par culture des E.coli-M15
transformées par l'ADNc de l'enzyme avec 2mM IPTG, pour 5 heures. La
protéine recombinante dans le Iysat cellulaire a été alors purifiée sur une
colonne échangeuse d'ions, en conditions dénaturantes. La protéine purifiée a
été dialysée en PBS et stockée à -20~C jusqu'à son utilisation.
c) ELISA:
~o Des plaques de microtitration (Nunc) ont été glacées une nuit à 4~C avec
5 ~/ml de protéine al,3GT purifiée, en tampon carbonate à pH 9,5. Elles ont
ensuite été saturées 2h à 37~C en 2% lait écrémé, puis incubées 2h, 37~C avec
une suspension de phages recombinants exprimant un fragment ScFv d'anticorps
provenant de la banque ScFv. Après lavage, les plaques ont été incubées lh,
~s 37~C avec un anticorps anti-phage M13 marqué à la peroxydase (Pharmacia),
dilué 1/500. La révélation a été effectuée par réaction de la peroxydase avec dela diaminobenzidine en présence d'eau oxygénée.
d) Transfection et cellules porcines:
,o Des cellules de porc LLC-PK1 ont été transfectées avec des plasmides
pCDAAS portant l'ADNc de clones anti-al,3 GT positifs. La transfection a été
réalisée par électroporation d'un mélange de 500.000 cellules et de 20 ,ug
d ' ADN plasmidique, à 250V et 350~F. Les clones ont été sélectionnés par
culture de 15 jours en présence de 1500 ~/ml de néomycine (G418). isolés à
,s l'aide d'anneaux de clonage et cultivés séparément en présence de G418 jusqu'à
1 ' analyse .
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e) Immunofluorescence et cytofluorométrie:
Les cellules ont été marquées par 1 ' isolectine B4 de Bandeiraea
.5i~np~icifolia marquée à la fluorescéine (IB-4-FITC, Sigma), lectine spécifiquedes structures a-galactose: les cellules ont été lavées à 4~C en PBS-2%BSA,
incubées a 4~C pendant 30 mn. avec 20 ~g/ml IB-4-FITC, relavées 3 fois et
analysées par cytofluorométrie en utilisant un FACS-can (Becton Dickinson).
I) Séquence:
Lcs réactions de séquence ont été effectuées avec la D-taq (Amersham), en
utilisant comme amorces deux oligonucléotides situes dans la partie 5 ' du
segment V~3. Oligo 1, permettant la lecture de la partie 5' de l'ADNc 5'-
TTCTGAGGCTGTCTCCTT-3'. Oligo 2, permettant la lecture de la partie 3'
de l'ADNc 5'-ATCGTCTGAGCTGACTCA-3'.
g) Ciblage moléculaire des ScFv anti-al,3-GT dans le Golgi:
Dans le but de faire exprimer les anticorps ScFv dans le même
compartiment cellulaire que l'al,3 GT, c'est-à-dire dans le Golgi, des
séquences signal et de rétention golgienne ont été ajoutées aux clones ScFv en
N-terminal et en C-terminal, respectivement. Les séquences signal et de
~o rétention choisies ont été adaptées à partir des données rapportées par
Richardson et al., 1995. Elles ont été introduites par amplification PCR des
clones ScFv de départ, à l'aide d'amorces contenant l'ADNc de ces séquences,
et des sites de restriction pour le clonage. La séquence de ces amorces est la
suivante:
~s - amorce encodant la séquence signal:
5 ' -TTTGAATTCATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCAGGT
GCAGCTGGTGCAG-3 ' .
- amorce encodant la séquence de rétention golgienne:
5 ' -TTTCTCGAGTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTACCTAGGA
CGGTGCAGCTT-3'.
2~ RESULTATS
a) Clonage de l'al,3GT de porc
3~ Un fragment de 313bp correspondant à l'extrémité 5' de l'ADNc de 1'~
1,3GT de porc a été amplifié par RT-PCR à partir d'ARN de cellules
endothéliales aortiques de porc. Ce fragment a servi de sonde pour le clonage de
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l'ADNc entier dans une banque de cellules épithéliales de porc exprimée en E.
Cc)li MC1061 P3, dans le plasmide pCDNA-1. Le clone isolé mesure environ
2Kb. comporte une partie 5' non codante de 147 pb suivie d'une phase ouverte
de lecture de 1104 pb et d'une partie 3' non codante d'environ 750 pb. Il
correspond à 1 ' isoforme de I 'enzyme dont l 'exon 5 est absent (à savoir
l ' isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4). L ' ADNc porcin isolé est
fonctionnel car il confère une activité al,3GT à des cellules Cos, naturellementdépourvues de cette activité, après transfection. Cette activité peut être
démontrée par l'acquisition d'une réactivité avec l'isolectine B4 de Bandeiraea
si~7lplicifoli~, marquant spécifiquement les résidus ~-galactosylés.
h) Expression protéique de l'al,3GT recombinante.
La partie codante de 1'oc1,3GT a été sous-clonée par PCR dans le vecteur
d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de
s six llistidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une
matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement séquencé
pOUI s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui
auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-
~1,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in
o vitro par induction de la transcription à l'IPTG, et purifiée.
c) Production d'anticorps ScFv anti-al,3GT
La banque d'immunoglobulines (Ig) hllm~in~s est constituée par 50
séquences de parties variables de chaînes lourdes d'Ig en configuration
germinale, associées à un peptide contenant de 4 à 12 acides aminés aléatoires,
~s codant par la partie CDR3 de la chaîne lourde, et insérées dans le phagemide
pHEN1-V~3, en fusion avec la partie plasmidique codant pour la protéine g3p
de l'enveloppe phagique. I,es phages pouvant être dérivés de ces plasmides
expriment donc un fragment (ScFv) d'Ig fonctionnel en fusion avec une protéine
d'enveloppe, et se comportent, au niveau de leur propriétés de reconnaissance
,o d'un antigène, cornme l'Ig dont ils expriment la séquence. Les phages dérivés de
cette banque d'Ig ont fait l'objet de 4 tris successifs par "panning" sur la
- protéine recombinante purifiée, comme décrit dans Nissim et al., 1994
d) Test ELISA de la positivité des anticorps ScFv anti-al,3GT.
~s Quatre-vingt-seize colonies individuelles de bactéries E. Coli-TGl sllpE
contenant chacune un clone pHEN1-ScFv ont été isolées, de manière aléatoire,
après les 4 cycles d'enrichissement à l'encontre de la protéine al,3GT. Ces
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colonies ont été cultivées une nuit dans 200111 de milieu LB, en plaque de
microtitration. Le surnageant, contenant des phages exposant sur leur enveloppe
1 à 3 molécules de f-ragment ScFv d'anticorps, a été testé par ELISA pour
mesurer la réactivité relative des différents clones à l'encontre de 1'o~1,3GT. Sur
les 96 clones testés, 15 montraient une réactivité supérieure à trois fois le niveau
du contrôle (Figure 2). Les six clones les plus positifs ont été réamplifiés et des
phages purifiés ont été préparés à partir de 500 ml de surnageant de bactéries
TG-l. Les phage purifiés, et concentrés par précipitation et resuspension en PBSont un titre supérieur à 101~ cfu/ml. Cette préparation de phages concentrés a
été re-testée en ELISA. Les résultats, montrés à la figure 2, reproduisent l'ordre
de réactivité observé dans la Fig. 2.
e) Séquence de l'ADNc des fragments d'anticorps ScFv anti-~1,3GT
Les clones ScFv anti-al,3GT sélectionnés ont été séquencés pour
s'assurer de la non introduction d'erreurs lors du sous-clonage par PCR et pour
déterminer les associations chaîne lourde génomique-peptide aléatoire (de 4 à 12acides aminés)-chaîne légère V~3 qui produisent un anticorps réactif à
l'encontre de l'al,3GT. Sur les six séquences analysées, deux sont identiques
(n~ 2 et 6), et deux ne diffèrent que par deux acides aminés dans la partie CDR3~o (n~ 1 et 5). La séquence n~ 3 présente un codon ambre (codon reconnu comme
un stop traductionnel dans un système eucaryote, mais considéré cotnrne une
glutamine dans la souche E. coli-TG 1 supE utilisée pour le clonage) à la
jonction CD3-peptide linker reliant les chaînes lourdes à la chaîne légère V?~3.Un codon stop à cette position est une conséquence prévisible de l'association
2~ aléatoire des fragments d'ADNc qui se produit lors de la fabrication de la
banque ScFv. Le remplacement du nucléotide T en position 313 par un C
permet d'obtenir un codon correspondant à une glutamine en position 105 (voir
SEQ ID NO 13). Les chaînes lourdes (désignées séquences VH) sélectionnées
ainsi que la séquence des régions CDR3 sont décrites dans le tableau 1; la
~o séquence de clone ScFvl correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO
9, la séquence du clone ScFv2 et celle du clone ScFv6 correspondent à la
séquence représentée par SEQ ID NO 11, la séquence du clone ScFv3
correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 13, la séquence du clone
ScFv4 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 15 et la séquence
,~ du clone ScFvS correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 17.
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Tableau l
Clone n~ Segment VH Séquence CDR3
-
ScFvl DP - 25 Ser - Gly - Met - Phe
ScFv2 DP - 5 Pro - Glu - Ile - Asp - Gln
ScFv3 DP - 21 Ser - Asn - Asp - Pro - Ala -
Asp - Glu
ScFv4 DP - 51 Ala - Trp - Arg - Thr - Asp
ScFv5 DP - 25 Ser - Gly - Val - Tyr
ScFv6 DP - 5 Pro - Glu - Ile- Asp - Gln
Séquences VH d'origine génomique et CDR3 des anticorps synthétiques
5 spécifiques de l'al,3GT porcine: Les séquences nucléotidiques des clones ScFv
sélectionnés en ELISA pour leur affinité à l'encontre de l'al,3GT de porc ont
été effectuées. Le tableau montre les séquences des troisièmes régions de
complémentarité des anticorps (CDR3). La nomenclature des segments variables
des chaînes lourdes en configuration germinale est celle utilisée dans Tomlinson~o et al ., 1992 .
g) Evaluation de l'efficacité de l'immllni~ion intracellulaire
Les ADNc codant pour les anticorps anti-al,3GT n~ 1 à 6, natifs ou
~5 possédant les séquences signal et de localisation golgienne, ont été sous-clonés
dans le vecteur d'expression eucaryote pCDAAS, sous le contrôle du promoteur
de CMV. Pour tester la conséquence de l'expression des ScFv anti-al,3GT sur
la diminution de l'expression de l'épitope a-galactosyl sur la membrane des
cellules de porc, des cellules LLC-PK1 ont été transfectées avec les différents
30 plasmides pCDAAS-ScFv, et des clones ont été isolés. La présence de l'épitopexénoantigénique a-galactosyl a été évaluée en immunofluorescence avec la
lectine IB4-FITC (spécifique du galactose branché en configuration a)~ en
comparaison avec les memes cellules, non transfectées. Les résultats montrent
que l'anticorps ScFv n~ 2 (à savoir celui représenté par SEQ ID NO 12)
,~ encodant la séquence VH DP-5, associée une partie CD3 artificielle composée
des acides aminés PEIDQ, reliée à la séquence V~3, sans adjonction de
séquences signal et de rétention golgienne, lorsqu'il est exprimé dans une cellule
. " . . . . . ... . . . ..
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de porc, entraîne jusqu'à 95% de ~iminntion de l'expression du galactose
branché en configuration a. En effet, la fluorescence moyenne des cellules
LLC-PK1 est de 465 unités lorsque le marquage est réalisé avec 20 ~g/ml IB-4-
FITC. et elle tombe à 49 unités pour le clone LLC-PK1-ScFv6.
-
En conclusion, dans le contexte de la xénotransplantation, la possibilitéd'inhiber dans une cellule de porc l'expression de l'a1,3GT en utilisant cette
~echnique, conduit à des applications très claires: la disponibilité de porcs
transgéniques n'exprimant pas ou peu d'épitopes o~-galactosyl, conséquence de
l'inhibition de 1'oc1,3GT, et exprimant un inhibiteur du complément humain,
comme cela existe déjà, permet d'effectuer des xénogreffes en évitant la réaction
des cellules du greffon avec les anticorps et avec le complément du receveur
humam.
Les résultats qui sont présentés ci-dessus, montrent que des cellules
d'origine porcine exprimant un anticorps ScFv anti-al,3GT peuvent être
obtenues, et que cette expression résulte en une diminution importante du niveaude xénoépitopes exprimés
III - Anticorps monoclonaux anti-al,3GT
~o
La partie codante de l'al,3GT, isoforme n~ 2 a été sous-clonée par PCR
dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec
une queue de six histidines servant à la purification de la protéine recombinante
sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement
2s séquencé pour s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de
départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide
pQE30-al,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante
produite in vitro par induction de la transcription à l'IPTG. Après purification,
l'al,3GT a été dialysée en PBS et injectée à une souris BALB/C à raison de
,o 3 injections de 40 ~g chacune tous les 15 jours. Les Iymphocytes spléniques ont
été collectés et fusionnés avec l'hybridome de souris SP2-O. La sélection des
hybridomes sécrétant une irnmunoglobuline reconnaissant l'al,3GT s'est
effectuée par test ELISA: des plaques de microtitration ont été glacées avec
10microg/ml de protéine a1,3GT recombinante, 16h à 4~C à pH 9.5. puis
,~ saturées 2h, 37~C avec PBS-BSA1%, Tween 20 0.5%. Les surnageants de
hybridomes ont été incubés lh, 37~C et les anticorps immunoabsorbés révélés à
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l'aide d'un anti-Ig marqué à la peroxydase. Les hybridomes fournissant une
densité optique au moins trois fois supérieure au bruit de fond ont été retenus.
IV - Clonage d'anticorps ScFv (Single chain Fv) à partir d'hybridomes
:,
Le clonage de fragments d'immunoglobulines sous t'orme de fragments
ScFv est décrit dans Clackson et al. (1991)). En bref, de l'ARN est préparé à
partir de 5X108 cellules d'hybridome, et l'ARN messager est sélectionné sur
oligo(dT)-cellulose. Un premier brin d'ADNc est synthétisé comme suit: 10,ug
d'ARNm sont incubés avec 20 pmoles des oligos VHlFOR ou VKlFOR
(Clackson et al., 1991), 250 ~M de chaque dNTP, 10 m M DTT, 100 m M
Tris.HCI (pH8.3), 10 mM MgCl2, et 140 mM KCI, 10 min. à 70~C, puis lh à
42 ~C en présence de 50 unités de Transcriptase Reverse. L'amplification par
PCR des fragments VH et VL est réalisée en mélangeant 2 ,ul de réaction RT
5 avec 25 pmoles des amorces VHlFOR ou VKlFOR, et VHlBACK ou
VKlBACK (Clackson et al.., 1991), 250 ,uM de chaque dNTP, 67 mM
Tris.HCl (pH 8.8), 17 mM (NH4)2S04, 10 mM MgCl2, et 2 unités de Taq
polymérase, pour 30 cycles d'amplification. Les fragments obtenus sont alors
purifiés et 1 ~g de chaque sont mélangés avec 300 ng de linker (gly4Ser)3, et
~o amplifiés par 7 cycles de PCR destinés à relier les fragments. Les fragments VH
et VL reliés sont alors amplifiés en 20 cycles avec les oligos VHlBACK et
VK4~0R. Les fragments obtenus sont alors ré-amplifiés avec les oligos
VHlBACK-BarnHl et VK4FOR-BamH1, digérés par BamH1 et clonés dans le
vecteur d'expression eucaryote PCDAAS, sous le contrôle du promoteur CMV.
2s
V -Voies d'action intracellulaire des anticorps anti-al,3GT
l,e méc:lrlisme moléculaire par lequel un anticorps exprimé dans une
cellule interfère avec la fonction d'une molécule portant le site antigénique
30 contre lequel cet anticorps est exprimé n'est pas élucidé. Cependant, plusieurs
explications ont été proposées. Dans le cas de 1' inhibition de la reverse
transcriptase de HIV (Maciejewski et al., 1995), l'anticorps anti-RT n'est pas
neutralisant dans un test in vitro. Les auteurs proposent que le complexe
anti~ène/anticorps formé dans la cellule puisse bloquer stériquement le
,s mouvement de l'enzyme le long de la molécule d'ARN, ou bien puisse modifier
sa structure secondaire. Dans le cas de l'inhibition de la chaîne a du récepteur à
l'IL-2 (Richardson et al., 199S), un processus de dégradation du complexe
. .
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antigène/anticorps a été proposé. Ce processus semble non Iysosomial, car la
méthionine méthyl ester (un inhibiteur Iysosomial) n'entraîne pas
d'accumulation du complexe. La dégradation ne se produit pas non plus dans le
compartiment Golgien car la brefeldin A (qui détruit le Golgi) est sans effet. La
dégradation se produit donc précocement, sans doute au niveau du réticulum
endoplasmique. Dans plusieurs cas où la localisation intracellulaire de la
molécule cible conditionne sa fonction, il est possible que 1 ' anticorps
intracellulaire retienne cette molécule dans un compartiment qui lui est étranger.
Richardson et al. ont en effet montré que l'expression d'un anticorps anti-RT,
0 retenu dans le réticulum endoplasmique par incorporation d'une séquence de
rétention KDEL, retient la RT dans ce compartiment.
Dans le cas de l'inhibition de 1'(x1,3GT par des anticorps ScFv, on peut
supposer que: 1) soit les anticorps modulent l'activité de l'enzyme (par exempleen modifiant sa structure), 2) soit ils la retiennent dans un compartiment
intracellulaire autre que le trans-Golgi (compartiment dans lequel le
branchement de galactose en o~1,3 sur le galactose du N-acélyllactosamine est
effectué), 3) soit ils entraînent la dégradation du complexe antigène/anticorps
par un mécanisme non élucidé. Il pourrait s'agir par exemple d'une
ubiquitination suivie d'une dégradation par le complexe protéasome.
~o
VI - Construction d'~nim~llx transgéniques avec les ScFv proposés
L'obtention d'~nim~-lx transgéniques pour un ScFv anti-al,3GT présente
des intérêts en recherche et en clinique. Pour la recherche, la transgenèse chez25 le rat convient particulièrement car ses organes peuvent être greffés chez lesinge, où ils subissent un rejet semblable au rejet de xénogreffe dans le modèleporc-primate Pour l'utilisation thérapeutique de greffons, le porc est l'animal de
choix .
a) Transgenèse chez le rat:
Les embryons au stade unicellulaire sont obtenus à l'issue d'un protocole
de super-ovulation appliqué à des rates de souche CD âgées de 28 à 38 jours
(Amstrong et Opavoky, 1988). Ce protocole permet d'obtenir de façon régulière
une moyenne de 40 à 50 embryons par femelle. La construction portant l'ADNc
3:, codant pour l'anticorps anti-al,3GT (deux exemples de constructions pouvant
être utilisées sont montrés sur les figures 4 et 5) est injectée à raison de quelques
milliers de copies par embryon. Les embryons traités sont alors réimplantés
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dans la matrice. Les rats issus de ces embryons sont ensuite testés pour
sélectionner les animaux ayant effectivement incorporé dans leur génome l'ADN
transoénique. Ces tests sont effectués au niveau de l'ADN et de l'ARN, que l'on
peut détecter par hybridation avec une sonde ADN correspondant au transgène,
~ et au niveau protéique. La détection de la protéine ScFv peut être effectuée par
réaction avec un anticorps anti Fab humain, ou par un anticorps anti-épitope, sil'ADNc ScFv est en fusion avec un ADNc codant pour un peptide portant cet
épitope.
h) Transgenèse chez le porc:
Des embryons fécondés au stade pronucléaire sont obtenus par
laparotomie à partir des oviductes de truies matures âgées de 7 à 10 mois,
50 heures après 1 ' induction de la superovulation et 20 à 26 heures après
I'insémination. Le Pronucleus, dans lequel est injecté l'ADN, est visualisé par
une centrifugation de l'ovocyte à 15000 g pendant 3 minutes. Les résultats aprèsréimplantation d'ovocytes traités de cette manière montrent que 10 % d'entre
eux se développent et donnent un animal, et que 15 % d'entre eux ont incorporé
l'ADN transgénique, soit 1,5 % des ovocytes traités. Parmi ces ;lnim~llx positifs
- quant à I ' intégration d'ADN, 67 % expriment effectivement la protéine
~o correspondant au transgène (White et al., 1994; Cozzi et White, 1995).
VII - Etude de l'expression intracellulaire des séquences nucléotidiques
codant pour des anticorps anti-al,3GT selon l'invention, sur la production de
l'épitope Galal,3Gal
Une analyse des conséquences de l'expression intracellulaire des séquences
nucléotidiques codant pour des anticorps single chain (ScFv) anti-al,3
galactosyltransférase porcine (al,3GT), sur la production de l'épitope sucré
Gala1,3Gal par des cellules porcines, a été effectuée au niveau de l'expression
,o membranaire du sucre lui-même, et au niveau de 1 ' activité enzymatique
intracellulaire. L'analyse porte également sur les conséquences de la diminutionde l'expression de ce sucre sur la toxicité du sérum humain vis à vis des cellules
porcines .
Dans le but d'étudier l'incidence de la valence de l'anticorps intracellulaire
,s Sc~v anti-al,3GT sur le fonctionnement de cette enzyme, un anticorps ScFv a
été di- et tétramérisé, et testé in vitro dans des cellules de porc.
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a) Etude de la diminution de l'expression de l'épitope Galoc1,3Gal à la
surt'ace de cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-(x1,3GT.
Les séquences nucléotidiques indiquées dans la figure 6, ainsi qu ' une
séquence contrôle (codant pour un anticorps ScFv analogue mais ne
recolmaissant pas l'al,3GT), ont été clonées dans un vecteur d'expression
eucaryote, sous le contrôle du promoteur du CMV. Des cellules porcines LLC-
PK1 ont é~e transfectées avec ces vecteurs d'expression et des clones ont été
dél-ivés. Les résultats de la figure 6 montrent une diminution significative de
l'expression de l'expression du sucre Galal,3Gal de l'ordre de 30 à 40 %.
1~
b) Etude de la (liminlltion de l'activité enzymatique al,3GT dans les
cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-c~1,3GT.
Des Iysats cellulaires totaux provenant des clones de cellules porcines
LLC-PKl présentés à la figure 7 (exprimant des séquences codant pour des
5 ScFv anti-(x1 ,3GT, avec ou sans la séquence KDEL de rétention dans le
réticulum endoplasmique) ont été analysés par une technique biochimique
mesurant spécifiquement l'activité de l'enzyme ~1,3GT (Cho et al., 1996, J.
Biol. Chem. 271:3238). Les résultats sont exprimés en moyennes +/- SD des
pourcentages d'activité par rapport à celles obtenues à partir de cellules LLC-
~o PKl non transfectées. Ils montrent une diminution significative de l'activitéenzymatique de l'ordre de 40 à 60 % lorsque des séquences ScFv anti-(x1,3GT
ScFv-l ou ScFv-2, le cas échéant associées à la séquence codant KDEL, sont
exprimées.
~s c) Etude de la ~limimltion de la cytotoxicité du sérum humain à
l'encontre des cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-oc1,3GT.
Certains clones de cellules porcines LLC-PKl présentés à la figure 8
(exprimant des séquences codant pour des ScFv anti-oc1,3GT) ont été marqués
au 51Cr puis incubés en présence de sérum humain contenant des xénoanticorps
30 anti-Galo~1,3Gal et du complément. Le relar~age de 51Cr, comme estimation de
la Iyse cellulaire, a été mesuré. 100 % de Iyse correspond à une Iyse totale
induite par un agent chimique, et 0 % de Iyse correspond à une incubation avec
le sérum décomplémenté. Les résultats montrent une diminution importante de
la sensibilité à la Iyse par le complément humain des clones exprimant les
3~ séquences SEQ ID NO 9 (ScFv-1) ou SEQ ID NO 11 (ScFv-2/6).
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d) Etude de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-al,3GT
intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme.
- Cette augmentation a été testée par fusion des séquences de dimérisation et
de tétramérisation zip et T-zip dérivées du facteur GCN4 (Pack et al., 1995) à
I'extrémité C-terminale de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 1; les
séquences résultantes sont désignées ScFv-zip et ScFv-tetrazip sur la figure 9.
Les constructions obtenues ont été sous-clonées dans le vecteur d'expression
eucaryote pHook (Invitrogen) permettant l'identification en cytométrie de flux
des cellules exprimant ces plasmides (car possédant une séquence codant pour
un marqueur membranaire identifiable). Après transfection transitoire de
cellules porcines LLC-PK1 avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une
séquence de dimérisation (ScFv-zip), une diminntion de l'expression de l'épitopeGalal,3Gal de 31 % par rapport aux cellules de départ a été observée dans les
cellules exprimant le vecteur. Dans les mêmes cellules transfectées avec la
séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tétramérisation (ScFv-
tetrazip), une ~liminlltion de l'expression de l'épitope Galal,3Gal de 45 % par
rapport aux cellules de départ a été observée.
En conclusion, I'expression dans des cellules de porc des séquences
20 nucléotidiques SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO 11 entralnent une dimimltion
importante de l'activité enzymatique al,3GT et une (~iminlnion significative de
la présence du sucre Galal,3Gal à la surface des cellules. Cette diminution est
suffisante pour entraîner une protection très importante vis à vis de la Iyse
induite par le complément humain. Ces résultats démontrent 1 ' intérêt de
~5 I'expression des séquences ScFv anti-al,3GT chez le porc dans une situation de
xénogreffe porc-homme. L'augmentation de la valence de l'anticorps
intracellulaire codé par la séquence SEQ ID NO 11 entraîne une augmentation
de son efficacité inhibitrice.
~o
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Légendes des figures:
- Figure 1:
Analyse des séquences des transcripts des isoformes de 1'~1,3GT de porc,
:- et alignement sur une carte de transcript primaire murine. Les ADNc des
isoformes 1, 3 et 4 ont été clonés à partir d'ARNm rétrotranscripts et amplifiéspar PCR provenant de PAEC et l'ADNc correspondant à l'isoforme 2 a été
cloné à partir d'une banque LLC-pK1, comme décrit ci-dessus. La séquence
nucléotidique a été déterminée par utilisation de Séquenase (USB), et comparée
par contrôle avec les séquences correspondant aux isoformes 1 et 2 décrites par
Strahan et al., 1995 et Sandrin et al., 1994. Les numéros en gras sur le côté
gauche de la figure correspondant aux isoformes 1 à 4. Les premières bases des
exons 5, 6 et 7 sont numérotées sur la séquence correspondant à l'isoforme 1.
Les chift'res représentés en italique indiquent le nombre de bases manquantes
5 dans l'exon épissé correspondant. La carte primaire de transcription de la souris
avec ses 9 exons, telle que décrite par Joziasse et al., 1992, est comparée avecles séquences des isoformes 1 à 4.
La queue cytoplasmique (encadré noir) et la région transmembranaire
(encadré avec lignes verticales) sont codées par l'exon 4. Les régions d'origineo (encadré grise) comprend les exons 5 et 6. Les exons 5 et 6 sont épissés
alternativement chez la souris et le porc. Le domaine catalytique est codé par les
exons 7, 8 et 9.
- Figure 2:
Réactivité mesurée par ELISA de préparations non purifiées de phages
correspondant à 15 clones reconn~i.cs~n~ la protéine ~1,3GT: Quatre vingt seize
colonies individuelles de bactéries TG1 contenant un clone pHEN-1-ScFv,
présélectionnées par une procédure d'enrichissement décrite dans Nissim et al.,
1994, ont été cultivées et leur surnageant (contenant les phages exprimant
30 I'anticorps) testé en ELISA comrne décrit dans Matériels et Méthodes ci-dessus.
Les 15 surnageants positifs (numérotés 1 à 15) sont représentés en abscisse sur
la figure. Le contrôle négatif (-) est constitué d'un blanc et le contrôle positif
(+) par la mesure de la densité optique obtenue par la réaction d'un phage M13
(Pharmacia) sur une IgG de souris anti-phage M13 (Pharmacia) déposée sur la
35 plaque. Les valeurs de densité optique (DO) sont indiquées en ordonnée.
-r
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- Figure 3:
Réactivité mesurée par ELISA de phages purifiés eorrespondant à 6 clones
reeonnaissant la protéine al,3GT: Les six elones les plus positifs dans l'ELISA
ci-dessus (Fig.2) ont été amplifiés en vue de la préparation de phages purifiés.Les phages purifiés et eoneentrés ont été re-testés en ELISA, de manière
similaire à ee qui est déerit dans la figure 2. Ces phages ont été testés à une
dilution de I à 1/8. Les dilutions effeetuées sont représentées en abseisse, et la
densité optique (DO) mesurée est indiquée en ordonnée. Ia courbe correspondant
au contrôle positif passe par des points représentés par des croix, celle
lO correspondant au phage contenant SeFvl (M13-ScFvl) passe par des points
représentés par un point noir au eentre de earrés blancs, celle correspondant auphage contenant ScFv2 (M13-SeFv2) passe par des points représentés par des
losanges noirs, eelle correspondant au phage eontenant ScFv3 (M13-SeFv3)
passe par des points représentés par des points représentés par un point blanc au
centre de carrés noirs, celle eorrespondant au phage eontenant ScFv4 (M13-
ScFv4) passe par des points représentés par des losanges blancs, celle
correspondant au phage eontenant SeFv5 (M13-SeFv5) passe par des points
représentés par des earrés noirs, eelle eorrespondant au phage eontenant SeFv6
(M13-ScPv6) passe par des points représentés par des carrés blanes, le blanc
étant représenté par un rond noir.
- Figure 4:
Cet exemple de eonstruetion eonsiste en 1 ' utilisation du promoteur du
CMH-l de souris H-2Kb, permettant l'insertion du transgène (ADNc ScFv;
~s 0,7Kb) entre la partie promotrice proprement dite (promoteur H-2kb; 4Kb) et
une série d'introns/exons (5,5 Kb) appartenant au gène H-2Kb, cette série étant
suivie par pA SV40 de 0,3 Kb. Ces introns eontiennent des séquenees
régulatriees permettant d'obtenir une bonne aetivité du promoteur, et done une
bonne expression du transgène. Le promotéur H-2Kb permet une expression
30 constitutive et ubiquitaire de l'ADNc dont il eontrôle l'expression (Kimura et
al., 1986; Byrne et al., 1995).
- Figure 5:
Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du minigène DAF
,~ (Cozzi et al., 1996), dont l'effieaeité a déjà été démontrée en transgenèse ehez le
porc. De manière analogue à la eonstruction H-2Kb, ee minigène plaee l'ADNc
ScFv (0,7 Kb) sous le eontrôle du promoteur du DAF, lui-même eontrôlé par
. ~ . .
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WO 98/03653 PCT~FR97/01340
des séquences introniques (I'ensemble constitué par le promoteur DAF, les
exons et les introns représentant 4,6 Kb), I'ADNc ScFv étant suivie par pA
SV40 de 0,3 Kb.
- Flgure 6:
Cette figure représente l'analyse en cytométrie de flux (FACscan) de la
reconnaissance des épitopes Galal,3Gal par la lectine I134-FITC, en
comparaisoll avec des cellules LLC-PK1 non transfectées. Les résultats sont des
pourcenta~es moyens +/- SD de fluorescence par rapport à la fluorescence
o obtenue a partir des LLC-PK1 non transfectées. n : nombre de clones
indépendants analysés par groupe; ScFv-neg: cellules LLC-PK1 non
transt'ectées; ScFv-1 : cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1;
ScFv-2/6: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-2 ou ScFv-6: les
pourcentages de fluorescence sont indiqués en ordonnée.
I ~
- Figure 7:
Mesure de l'activité al,3GT dans les cellules porcines LLC-PK1
transfectées avec le clone ScFv-1, ou ScFv-2, avec ou sans la séquence KDEL
de rétention dans le réticulum endoplasmique. n: nombre de clones
indépendants analysés par groupe; ScFv-neg: cellules LLC-PK1 non
transt'ectées; ScFv-1: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1;
ScFv-2: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-2; ScFv-lKDEL:
cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1 et contenant la séquence
codant KDEL; ScFv-2KDEL: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone
~5 ScFv-2 et contenant la séquence codant KDEL; les pourcentages d'activité
1,3GT sont indiqués en ordonnée.
- Figure 8:
Mesure de la Iyse par le complément des cellules LLC-PKl transfectées ou
,(~ non avec des séquences ScFv anti-al,3GT, et incubées avec du sérum humain
contenant des xénoanticorps naturels. Ies dilutions de sérum sont indiquées en
ahscisse, et le pourcentage de cytotoxicité en ordonnée (moyenne de deux
expérience~s indépendantes); carrés creux: cellules LLC-PK1 non transfectées:
carrés pleins: cellules LLC-PK1 transfectées avec un plasmide contrôle; cercles
,5 creux: cellules LLC-PK1 exprimant le ScFv correspondant à la séquence SEQ
ID NO 9 (clone 1.7-7); cercles pleins: cellules LLC-PK1 exprimant le ScF~
correspondant à la séquence SEQ ID NO 11 (clone 2.6-2).
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- Figure 9:
Mesure de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-ul,3GT
intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme. L'intensité de fluorescence est
indiquée en ordonnée (unités arbitraires); LLC-PKl: cellules LLC-PK1 non
transl'ectées; ScFv-neg: cellules LLC-PK1 transfectées avec un plasmide de
contrôle ne contenant pas de séquence ScFv; ScFv2zip : cellules LLC-PKl
transfectées avec la séquence SEQ ID NO l l comportant une séquence de
dimérisation (ScFv-zip); ScFv2tetrazip: cellules LLC-PKl transfectées avec la
l0 sé4uence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tétramérisation (ScFv-
tetrazip).
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CA 022~8872 1998-12-16
W O 98/036S3 PCT~FR97/01340
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, rue de Tolbiac
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654 Cedex 13
(ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE
MAMMIFERES NON HUMAINS TRANSGENIQUES EN W E DE LEUR
TRANSPLANTATION CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES
POUR LA MISE EN OE W RE DE CE PROCEDE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1128 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1128
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
1 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGC CCA ~6
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro
20 25 30
GAA GGT TCT TTG TTC TGG ATA TAC CAG TCA A~A AAC CCA GAA GTT GGC 144
Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly
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38
AGC AGT GCT CAG AGG GGC TGG TGG TTT CCG AGC TGG TTT AAC AAT GGG 192
Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly
50 55 60
ACT CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC AAC GAA AAG GAA 240
Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu
65 70 75 80
CAA AGA AAA GAA GAC AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA GTG GAC TGG TTT 288
Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe
85 90 95
AAT CCT GAG AAA CGC CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC AGA TGG AAG GCT 336
Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala
100 105 110
CCA GTG GTA TGG GAA GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC TTA GAT AAT TAT 384
Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr
115 120 125
TAT GCC AAA CAG AAA ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT CTT GCT GTC GGA 432
Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly
130 135 140
AGA TAC ATT GAG CAT TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA TCT GCA AAT ACA 480
Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr
145 150 155 160
TAC TTC ATG GTT GGC CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC ATG GTG GAT GAT 528
Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp
165 170 175
ATC TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT AAA 576
Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys
180 185 190
GTG TTT GAG ATC AAG TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC ATC AGC ATG ATG 624
Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met
195 200 205
CGC ATG AAG ACC ATC GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC ATC CAG CAC GAG 672
Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu
210 215 220
GTG GAC TTC CTC TTC TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC TTC CAA AAC AAC 720
Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn
225 230 235 240
TTT GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG CTA CAG GCC TGG 768
Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp
245 250 255
TGG TAC AAG GCA CAT CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG AGG CGG AAG GAG 816
Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu
260 265 270
CA 022~8872 l998-l2-l6
W 0 98/036S3 PCT~FR97t01340
39
TCC GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA 864
Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala
275 280 285
GCC ATT TTT GGG GGA ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC ATC ACT CAG GAG 912
Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu
290 295 300
TGC TTC AAG GGA ATC CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC ATA GAA GCC GAG 960
Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu
305 310 315 320
TGG CAT GAT GAA AGC CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT CTC AAC AAA CCC 1008
Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro
325 330 335
ACT AAA ATC TTA TCC CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT CAT ATA GGC ATG 1056
Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met
340 345 350
TCT GTG GAT ATT AGG ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG AAA AAA GAG TAT 1104
Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr
355 360 365
AAT TTG GTT AGA AAT AAC ATC TG 1128
Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile
370 375
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 375 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
~ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
l 5 10 15
~eu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro
Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly
Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly
Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu
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W 098103653 PCTA~R97/01340
40~ln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe
~sn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala
lO0 105 110
Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr
115 120 125
Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly
130 135 140
Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr
145 150 155 160
~yr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp
165 170 175
~le Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys
180 185 190
Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met
195 200 205
Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu
210 215 220
Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn
225 230 235 240
~he Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp
245 250 255
~rp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu
260 265 270
Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala
275 280 285
Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn lle Thr Gln Glu
290 295 300
Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu
305 310 315 320
~rp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro
325 330 335
~hr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met
340 345 350
Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr
355 360 365
Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile
370 375
CA 022~8872 l998-l2-l6
WO 98/03653 PCTIFR97/01340
41
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1092 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: si~ple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(li) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
~A) NOM/CLE: CDS
~B) EMPLACEMENT: 1..1092
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
l 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGA AAC 96
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Asn
20 25 30
CCA GAA GTT GGC AGC AGT GCT CAG AGG GGC TGG TGG TTT CCG AGC TGG 144
Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp
35 40 45
TTT AAC AAT GGG ACT CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC 192
Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly
50 55 60
AAC GAA AAG GAA CAA AGA AAA GAA GAC AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA 240
Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu
65 70 75 ~0
GTG GAC TGG TTT AAT CCT GAG AAA CGC CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC 288
Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr
85 90 95
AGA TGG AAG GCT CCA GTG GTA TGG GAA GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC 336
Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val
100 105 110
TTA GAT AAT TAT TAT GCC AAA CAG AAA ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT 384
Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val
115 120 125
CTT GCT GTC GGA AGA TAC ATT GAG CAT TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA 432
Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile
130 135 140
.
CA 022~8872 1998-12-16
W O 98/03653 PCT~R97/01340
4~
TCT GCA AAT ACA TAC TTC ATG GTT GGC CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC 480
Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile
145 150 155 160
ATG GTG GAT GAT ATC TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG 528
Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu
165 170 175
CGC TCC TTT AAA GTG TTT GAG ATC AAG TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC 576
Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp
180 185 190
ATC AGC ATG ATG CGC ATG AAG ACC ATC GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC 624
Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His
195 200 205
ATC CAG CAC GAG GTG GAC TTC CTC TTC TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC 672
Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val
210 215 220
TTC CAA AAC AAC TTT GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG 720
Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln
225 230 235 240
CTA CAG GCC TGG TGG TAC AAG GCA CAT CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG 768
Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu
245 250 255
AGG CGG AAG GAG TCC GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT 816
Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe
260 265 270
TAT TAC CAC GCA GCC ATT TTT GGG GGA ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC 864
Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn
275 280 285
ATC ACT CAG GAG TGC TTC AAG GGA ATC CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC 912
Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp
290 295 300
ATA GAA GCC GAG TGG CAT GAT GAA AGC CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT 960
Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu
305 310 315 320
CTC AAC AAA CCC ACT AAA ATC TTA TCC CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT 1008
Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr
325 330 335
CAT ATA GGC ATG TCT GTG GAT ATT AGG ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG 1056
His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln
340 345 350
AAA AAA GAG TAT AAT TTG GTT AGA AAT AAC ATC TG 1092
Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile
355 360
CA 022~8872 l998-l2-l6
WO 98/03653 PCT~R97/0}340
43
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 363 acldes aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
1 5 10 15
~eu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Asn
Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp
Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly
Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu
~al Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr
~rg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val
100 105 110
Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile
130 135 140
Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile
145 150 155 160
~et Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu
165 170 175
~rg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp
180 185 190
Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His
195 200 205
Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val
210 215 220
Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln
225 230 235 240
. .
CA 022~8872 l998-l2-l6
W O 98/03653 PCT~R97/01340
44
Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu
245 250 255
~rg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe
260 265 270
Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn
275 280 285
Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp
290 295 300
Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu
305 310 315 320
~eu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr
325 330 335
~is Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln
340 345 350
Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile
355 360
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1065 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
~B) EMPLACEMENT: 1..1065
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
1 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGC CCA 96
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro
20 25 30
GAA GGT TCT TTG TTC TGG ATA TAC CAG TCA AAG ACT CAC AGT TAC CAC 144
Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Thr His Ser Tyr His
CA 022~8872 1998-12-16
W O 98/03653 PCT~R97/01340
GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC AAC GAA AAG GAA CAA AGA AAA GAA GAC 192
Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp
S0 55 60
AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA GTG GAC TGG TTT AAT CCT GAG AAA CGC 240
Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg
65 70 75 80
CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC AGA TGG AAG GCT CCA GTG GTA TGG GAA 288
Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu
85 90 ~5
GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC TTA GAT AAT TAT TAT GCC AAA CAG AAA 336
Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys
100 105 110
ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT CTT GCT GTC GGA AGA TAC ATT GAG CAT 384
Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His
115 120 125
TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA TCT GCA AAT ACA TAC TTC ATG GTT GGC 432
Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly
130 135 140
CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC ATG GTG GAT GAT ATC TCC AGG ATG CCT 480
His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro
145 150 155 160
TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT AAA GTG TTT GAG ATC AAG 528
Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys
165 170 175
TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC ATC AGC ATG ATG CGC ATG AAG ACC ATC 576
Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile
180 185 190
GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC ATC CAG CAC GAG GTG GAC TTC CTC TTC 624
Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe
195 200 205
TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC TTC CAA AAC AAC TTT GGG GTG GAG ACC 672
Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr
210 215 220
CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG CTA CAG GCC TGG TGG TAC AAG GCA CAT 720
Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His
225 230 235 240
CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG AGG CGG AAG GAG TCC GCA GCC TAC ATT 768
-Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile
245 250 255
CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA GCC ATT TTT GGG GGA 816
Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly
260 265 270
CA 022~8872 1998-12-16
W O 98/03653 PCTtFR97tO1340
46
ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC ATC ACT CAG GAG TGC TTC AAG GGA ATC 864
Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile
275 280 285
CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC ATA GAA GCC GAG TGG CAT GAT GAA AGC 912
Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser
290 295 300
CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT CTC AAC AAA CCC ACT AAA ATC TTA TCC 960
His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser
305 310 315 320
CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT CAT ATA GGC ATG TCT GTG GAT ATT AGG 1008
Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg
325 330 335
ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG AAA AAA GAG TAT AAT TTG GTT AGA AAT 1056
Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn
340 345 350
AAC ATC TG 1065
~ Asn Ile
355
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 354 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
l 5 10 15
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro
Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Thr His Ser Tyr His
Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp
Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg
Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu
CA 022~8872 1998-12-16
W O 98/03653 PCTA~R97/01340
47
Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys
100 105 110
Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His
115 120 125
Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly
130 135 140
His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro
145 150 155 160
~eu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys
165 170 175
~er Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile
180 185 190
Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe
195 200 205
Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr
210 215 220
Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His
225 230 235 240
~ro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile
245 250 255
~ro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly
260 265 270
Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile
275 280 285
Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser
290 295 300
His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser
305 310 315 320
~ro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg
325 330 335
~le Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn
340 345 350
~sn Ile
CA 022~8872 l998-l2-l6
WO 98t03653 PCT~R97/01340
48
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1029 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1029
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
1 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGG ACT 96
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Thr
20 25 30
CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC AAC GAA AAG GAA CAA 144
His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln
35 40 45
AGA AAA GAA GAC AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA GTG GAC TGG TTT AAT 192
Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn
50 55 60
CCT GAG AAA CGC CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC AGA TGG AAG GCT CCA 240
Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro
65 70 75 80
GTG GTA TGG GAA GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC TTA GAT AAT TAT TAT 288
Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr
85 90 95
GCC AAA CAG AAA ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT CTT GCT GTC GGA AGA 336
Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg
100 105 110
TAC ATT GAG CAT TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA TCT GCA AAT ACA TAC 384
Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr
115 120 125
TTC ATG GTT GGC CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC ATG GTG GAT GAT ATC 432
Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile
130 135 140
CA 022~8872 l998-l2-l6
W 0 98/03653 PCTn~R97/01340
49
TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT AAA GTG 480
Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val
145 150 155 160
TTT GAG ATC AAG TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC ATC AGC ATG ATG CGC 528
Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg
165 170 175
ATG AAG ACC ATC GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC ATC CAG CAC GAG GTG 576
Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val
180 185 190
GAC TTC CTC TTC TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC TTC CAA AAC AAC TTT 624
Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe
195 200 205
GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG CTA CAG GCC TGG TGG 672
Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp
210 215 220
TAC AAG GCA CAT CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG AGG CGG AAG GAG TCC 720
Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser
225 230 235 240
GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA GCC 768
Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala
_ 245 250 255
ATT TTT GGG GGA ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC ATC ACT CAG GAG TGC 816
Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys
260 265 270
TTC AAG GGA ATC CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC ATA GAA GCC GAG TGG 864
Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp
27S 280 285
CAT GAT GAA AGC CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT CTC AAC AAA CCC ACT 912
His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr
290 295 300
AAA ATC TTA TCC CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT CAT ATA GGC ATG TCT 960
Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser
305 310 315 320
GTG GAT ATT AGG ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG AAA AAA GAG TAT AAT 1008
Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn
325 330 335
TTG GTT AGA AAT AAC ATC TG 1029
Leu Val Arg Asn Asn Ile
340
CA 022~8872 l998-l2-l6
W 0 98/03653 PCT~R97/01340
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 342 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi~ DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
1 5 10 15
~eu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Thr
His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln
Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn
Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro
~al Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr
~la Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg
100 105 110
Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr
115 120 125
Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile
130 135 140
Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val
145 150 155 160
~he Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg
165 170 175
~et Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val
180 185 190
Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe
195 200 205
Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp
210 215 220
Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser
225 230 235 240
CA 022~8872 1998-12-16
W O 98/03653 PCT~FR97/01340
~la Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala
24S 250 255
~le Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys
260 265 270
Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp
275 280 285
His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr
290 295 300
Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser
305 310 315 320
Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn
325 330 335
~eu Val Arg Asn Asn Ile
340
~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 708 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A~ NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..708
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACT AGC TAT 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
GCT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA AGG CTT GAG TGG ATG 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
GGA TGG ATC AAC GCT GGC AAT GGT AAC ACA AAA TAT TCA CAG AAG TTC 192
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/03653 P~TA~R97/01340
52
CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC AGG GAC ACA TCC GCG AGC ACA GCC TAC 240
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
GCA AGA AGT GGT ATG TTT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG TCG 336
Ala Arg Ser Gly Met Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG 384
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA 432
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
130 135 140
GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC 480
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
145 150 155 160
TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT 528
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
165 170 175
AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC 576
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
180 185 190
TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT 624
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
195 200 205
GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG 672
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val
210 215 220
GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 708
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CA 022~8872 l998-l2-l6
WO 98/03653 PCT/~Rg7/01340
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
~er Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
~et Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
~la Arg Ser Gly Met Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
130 135 140
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
145 150 155 160
~rp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
165 170 175
~ys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val
210 215 220
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO~
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 711 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/03653 PCT~FRg7/01340
54
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..711
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GTT TCC GGA TAC ACC CTC ACT GAA TTA 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
TCC ATG CAC TGG GTG CGA CAG GCT CCT GGA AAA GGG CTT GAG TGG ATG 144
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
GGA GGT TTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATC TAC GCA CAG AAG TTC 192
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
CAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GAG GAC ACA TCT ACA GAC ACA GCC TAC 240
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cy5
85 90 95
GCA AGA CCT GAG ATT GAT CAG TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG 336
Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA 384
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 432
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
130 135 140
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA 480
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
145 150 155 160
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 528
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
165 170 175
GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 576
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/03653 PCT/FR97/01340
AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 624
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
195 200 205
GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT 672
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His
210 215 220
GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 711
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 237 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cy5
85 90 95
Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
130 135 140
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
145 150 155 160
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
165 170 175
, .
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/036S3 PCT/FRg7/01340
56
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
195 200 205
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His
210 215 220
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 717 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(li) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..717
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACT AGC TAT 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
GCT ATG AAT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG 144
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
GGA TGG ATC AAC ACC AAC ACT GGG AAC CCA ACG TAT GCC CAG GGC TTC 192
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
ACA GGA CGG TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 240
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
CTG CAG ATC TGC AGC CTA AAG GCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
CA 022~8872 1998-12-16
W Og8/~3653 PCTAFR97/01340
GCA AGA TCT AAT GAT CCT GCT GAT CAG TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC 336
Ala Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 384
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG 432
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
130 135 140
GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT 480
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC 528
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
165 170 175
ATC TAT GGT A~A AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 576
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG 624
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
195 200 205
GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT 672
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
210 215 220
AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 717
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 239 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
... . .. . .. .
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/03653 PCT/FR97101340
58
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
~eu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
~la Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
130 135 140
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
~yr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
165 170 175
~le Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
195 200 205
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
210 215 220
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 762 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..762
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/03653 PCT/FR97/01340
59
(xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
CGA TTC ATG GAA AGG CAC TGG ATC TTT CTC TTC CAG GTG CAG CTG GTG 48
Arg Phe Met Glu Arg Hls Trp Ile Phe Leu Phe Gln Val Gln Leu Val
1 5 10 15
CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC 96
Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
20 25 30
TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT AGC ATG AAC TGG GTC 144
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val
35 40 45
CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTT TCA TAC ATT AGT AGT 192
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser
50 55 60
AGT AGT AGT ACC ATA TAC TAC GCA GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC 240
Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
65 70 75 80
ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC 288
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
85 90 95
CTG AGA GAC GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA GCT TGG AGG 336
Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg
100 105 110
ACG GAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC 384
Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly
115 120 125
GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT 432
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr
130 135 140
CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA 480
Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr
145 150 155 160
TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG 528
Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG 576
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg
180 185 190
CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA 624
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr
195 200 205
~ , .
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WO 98/03653 PCTAFRg7/01340
GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT 672
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA 720
Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT AGC GAA AAG GAC GAG CTG 762
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu
245 250
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 254 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(Y~i ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
Arg Phe Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Gln Val Gln Leu Val
1 5 10 15
~ln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser
Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
~le Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
~eu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg
100 105 110
Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr
130 135 140
Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr
145 150 155 160
Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/03653 PCT~R97/01340
61
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg
180 185 190
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu
245 250
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 687 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléi~ue
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
~A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..687
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC 48
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
ACT AGC TAT GCT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA AGG CTT 96
Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
20 25 30
GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC GCT GGC AAT GGT AAC ACA AAA TAT TCA 144
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser
35 40 45
CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC AGG GAC ACA TCC GCG AGC 192
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser
50 55 60
ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCC GTG 240
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
65 70 75 80
TAT TAC TGT GCA AGA AGT GGG GTG TAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC 288
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/036S3 PCT/FR97/01340
62
ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 336
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG 384
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
115 120 125
GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT 432
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
130 135 140
TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC 480
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
145 150 155 160
ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 528
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
165 170 175
GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG 576
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
180 ~85 190
GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT 624
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
195 200 205
AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT AGC 672
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
210 215 220
GAA AAG GAC GAG CTG 687
Glu Lys Asp Glu Leu
225
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 229 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
~hr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser
35 40 45
CA 022~8872 1998-12-16
WO 98/03653 PCT/FR97/01340
63
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
~yr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
~hr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
115 120 125
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
130 135 140
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
145 150 155 160
~le Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
165 170 175
~ly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
180 185 190
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
195 200 205
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
210 215 220
Glu Lys Asp Glu Leu
225
.. . .. .
