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CA 02261094 2003-03-11
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G~NE CHIM~RE Ä PLUSIEURS G~NES DE TOLÉRANCE
HERBICIDE, CELLULE VÉGÉTALE ET PLANTE
TOLÉRANTES Ä PLUSIEURS HERBICIDES
La présente invention a pour objet un gène chimère à plusieurs gènes de
tolérance
herbicide, une cellule végétale et une plante tolérantes à plusieurs
herbicides.
Dans la suite de la description, les herbicides seront désignés selon le nom
commun
en particulier référencé dans "The Pesticide Manual" 10 th edition par British
Crop
Protection Council.
On connaît des plantes qui ont été transformées pour être tolérantes à
certains
herbicides comme notamment les dihalogénohydroxybenzonitriles, en particulier
le
bromoxynil et l' ioxynil, grâce au gène codant pour la nitrilase dégradant ces
herbicides ou
encore celles tolérantes aux herbicides inhibiteurs de l'EPSPS notamment le
glyphosate, le
sulfosate ou la fosametine ou encore aux inhibiteurs de l'
acétolactatesynthase (ALS) du
type des sulfonylurées ou encore aux inhibiteurs de la dihydro-pteroate
synthase tel que
l'asulam ou encore aux inhibiteurs de la glutamine synthase tels que le
glufosinate.
On connaît certains herbicides tels que les isoxazoles
décrites notammeiît dans les demandes de brevets français
no. 2,734,840 et 2,734,841 et notamment l'isoxaflutole,
herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles tels que
ceux décrits dans les demandes européennes 0 496 630,
0 496 631, en particulier 1a ?-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02
CH3-4-CF3 phényl) propane-1, 3-dione et la ~'.-cyano-3-cyclo-
propyl-1-(2-S02CH3-4-2,3 C12 phényl) propane-1,3-dione, les
tricétones décrites àans les demandes européennes 0 625 505
et ~~ 62 . 508, en p.~a!~:' ~rul.~er_ la sulcotr Zone ou emcore
celles décrites ~~lans l'U.~P 5 506 195, ou enwore les pyrazo-
linates. De plus le gPne codant pour l'HPPD conférant une
tolérance à ces derniers herbicides a étF~ isolé et des
plantes transgéniques 1e contenant c~bt~~nues montrant une
_~~¿ c-:.1_e'~~i':~e ~ 1~~'.lf 1 '=tf . 'l c' e t: '-OT t ~ ' O~~~e~: c'(~~'~
Ciemcl;îdeS
françaises P~1° 2, 734, 8~_'_ rit 2, î34, 841.
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la
Cependant Ia pratique agricole montre que les agriculteurs aiment disposer
pour le
traitement des plantes, et notamment des cultures, d'associations d'herbicides
en
particulier pour répondre à différents problèmes de désherbage dûs aux limites
du spectre
des herbicides pris isolément. II peut être en outre intéressant de disposer
d' un gëne de
marquage de sélection associé à un gène de tolérance herbicide. II y a donc un
besoin de
plantes et notamment de cultures présentant une tolérance à plusieurs
herbicides, de
préférence au moins deux ou trois .
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I1 a maintenant été découvert qu'on pouvait conférer à une cellule végétale et
à une
plante un tolérance herbicide multiple.
La présente invention a d'abord pour objet un gène chimère comprenant au moins
deux
~~ènes chimères élémentaires contenant chacun, dans le sens de la
transcription. des éléments
de régulation nécessaires à sa transcription dans les plantes c'est à dire au
moins une
séquence de régulation promotrice, au moins une partie codante hétérologue
comprenant
une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance
à un
herbicide et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de
polyadénylation.
Comme séquence codante, on peut notamment utiliser toutes celles connues pour
conférer
la tolérance de plantes à certains inhibiteurs telles que:
- celle de l'EPSPS pour ia tolérance au glyphosate, au sulfosate ou à la
fosamétine,
notamment celles de la protéine mutée ou non, on peut citer notamment les
brevets;
- USP 4 535 060, EP 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094 945; USP 4 971 908, USP
5
l45 783. EP 293 358; EP 378 985 , WO 91/04323; WO 92 044 449; WO 92 06201.
Dans ia
suite ce type de gène sera désigné par séquence ou gène "EPSPS".
On peut également citer la glyphosate oxydoréductase (cf WO 92/ 000 377)
enzyme de
détoxification du glyphosate.
- celle du gène de la nitrilase de Klebsiella sp. pour la tolérance aux
dihalogénobenzonitriles décrite dans l'L'SP 4 810 648 et en particulier celui
issu de
Klebsiella ozaenae, qui sera désigné dans la suite par gène ou séquence "OXY".
celle de l'HPPD telle décrite dans les demandes françaises non publiées
N°95/06800,
95/i3570 et 96/05944 citées ci-dessus. Cette HPPD peut être de toute nature.
Plus particulièrement cette séquence peut être d'origine bactérienne, telle
que
notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale, telle que
notamment de
plante monocotylédone ou dicotylédone, notamment d'Arabidopsis ou
d'ombellifères comme
par exemple la carotte (Daucus carota). Elle peut être native ou sauvage ou
éventuellement
mutée tout en gardant fondamentalement une propriété de tolérance herbicide
contre les
inhibiteurs de l'HPPD, tels que les herbicides de la famille des isoxazoles ou
de celle des
tricétones ou des pyrazolinates.
D'autres séquences peuvent être utilisées:
- celle de la phosphinotrycine acëtyl transférase ou celle de la glutamine
synthase pour
la tolérance au glufosinate (cf EP 0 242 236)
- celle de la dihydroptéroate synthase pour la tolérance à fasulam (cf EP 0
369
367)
- celle de PALS pour la tolérance aux sulfonylurées
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- celle de la Protoporphyrogen oxydase ("protox") pour la tolérance aux
herbicides de la
famille des diphényléthers tels que l'acifluorfen ou l'oxyfluorfen ou celle
des
oxadiazoles tels que l'oxadiazon ou l'oxadiargyl ou celle des imides cycliques
tels
que le chlorophthalim ou celle des phénylpyrrazoles tel que le TNP ou celles
des
pyridines et les phénopylates et analogues carbamates (cf WO 95/34659).
De préférence l'un des gènes chimères contient une séquence codante de l'HPPD.
Dans
ce cas l'autre ou les autres séquences peuvent être quelconques et notamment
choisies dans
le groupe mentionné ci-dessus. De préférence les autres séquences sont
choisies dans le
groupe comprenant le gène de la nitrilase de tolérance aux
dihalogénohydroxybenzonitriles
l0 et un gène EPSPS.
Les gènes chimères selon l'invention peuvent en outre contenir des gènes
codant pour
des propriétés autres que de tolérance herbicides tels que par exemple des
gènes de
résistance aux insectes, tels que ceux de type Bacillus thurigensis conférant
une résistance à
divers représentants de la famille des coléoptères, des lépidoptères, ou
encore des gènes de
résistance aux nématodes, des gènes de résistance aux maladies fongiques ou
microbiennes,
ou encore des gènes conférant des propriétés agronomiques telles que les gènes
des diverses
desaturases intervenant dans la production des acides gras. On peut citer en
particulier celui
de la delta -6 desaturase décrit dans la demande internationale WO 93/06712.
Comme séquence de régulation promotrice on peut utiliser toute séquence
promotrice
d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un
promoteur d'origine
bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la
petite sous-unité
de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou de celui d'un gène de l'ot tubuline
(Demande
européennne EP n° 0 652 286), ou encore d'un gène de virus de plante
tel que, par exemple,
celui de la mosaïque du choux fleur (CaMV 19S ou 35S), mais tout promoteur
convenable
connu peut être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de
régulation promotrice
qtti favorise la surexpression de la séquence codante, tel que par exemple,
celle comprenant
au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP
0507698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence
de
régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées
entre le promoteur
et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer",
comme par
exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans
la demande
W087/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce
cas
éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire
comprenant, dans le sens
de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène
végétal codant
pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la
partie mature N
terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale,
puis une
séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant
pour une
enzyme à localisation plastidiale, constituée d'une partie de séquence de la
partie mature N
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terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale,
tels que décrit
dans la demande européenne n' 0 508 909.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut
utiliser
toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le
ternùnateur nos
d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple
un
terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP n° 0
633 317.
L'invention a encore pour objet une cellule végétale, de plantes
monocotylédones ou
dicotylédones, notamment des cultures, tolérante à aux moins deux herbicides
dont au moins
- un est un inhibiteur de l'HPPD. Cette cellule peut contenir au moins deux
gènes chimères
comprenant chacun une séquence codant pour la tolérance à un herbicide et dont
l'un
comprend une séquence codant pour l'HPPD. Les deux gènes chimères peuvent être
soit
portés par un même vecteur, soit chacun sur un vecteur différent, soit encore
apportés tels
quels par introduction dans la cellule par des moyens physiques ou physico-
chimiques, par
exemple par microinjection, électroporation ou bombardement, selon des
méthodes en soi
ï 5 connues.
L'invention a encore pour objet une plante transformée tolérante à au moins
deux
herbicides dont un est inhibiteur de fHPPD. Cette plante peut être obtenue
soit par
croisement d'au moins deux plantes contenant chacune un gène codant pour la
tolérance à un
herbicide, soit par régénération d'une cellule selon l'invention, telle que
décrite ci-dessus.
Les plantes peuvent être des monocotylédones ou dicotylédones, notamment des
cultures,
grandes cultures telles que par exemple mais de manière non limitative pour
les
dicotyledones le tabac, le coton, le colza, le soja, la betterave, et pour les
monocotyledones
le maïs et les céréales à paille, ou en tore des cultures maraichères ou
florales.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention de plantes à tolérance
herbicide
multiple par trangénèse végtale, caractérisé en ce que:
- dans une première étape, on insère dans plusieurs cellules respectivement un
des gènes
élémentaires contenant chacun des éléments de régulation nécessaires à sa
transcription dans les plantes et une séquence codante codant pour une enzyme
conférant aux plantes la tolérance à un herbicide, et que
- ensuite les plantes sont croisées pour obtenir des plantes à tolérance
multiple.
L'invention a encore pour objet un autre procédé d'obtention de plantes à
tolérance
herbicide multiple par trangénèse végétale, une première étape comportant l'
intégration dans
des cellules végétales d'au moins deux gènes de tolérances à un herbicide dont
au moins un
est un inhibiteur de l'HPPD, la seconde étape compremant la régénération de la
plante à
partir des cellules transformées selon l'invention.
La transformation peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement
décrit
dans la littérature spécialisée et notamment les demandes et brevets cités
dans la présente
demande.
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~~ne série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes
avec des
particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Selon l'invention
ces ADN
peuvent être portés par les mêmes particules ou par des bombardements
différents. Une autre
série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante
un gène
5 chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d
Agrobacterium
rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou
l'électroporation.
L'homme de métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la
nature de la
plante, notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
On a observé que des plantes transformées selon l'invention présentent une
tolérance
significative aux inhibiteurs de l'hydroxy phényl pyruvate dioxygénase tels
que certains
herbicides récents tels que les isoxazoles décrites notamment dans les
demandes de brevets
IS français 9506800 and 95 13570 et notamment du 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl)
benzoylJ-5-
cyclopropyl isoxazole.ou "isoxaflutole", herbicide sélectif du maïs, les
dicétonitriles tels que
ceux décrits dans les demandes européennes 0 496 630, 0 496 63 I , en
particulier la 2-cyano-
3-cyclopropyl-I-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-
cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 CI2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones
décrites
dans les demandes européennes 0 625 505 et 0 625 508, en particulier la
sulcotrione et les
pyrazinolates. Ces mêmes plantes selon l'invention présentent une tolérance
significative à
d'autres herbicides tels que par exemple les dihalogéno benzonitriles,
notamment le
bromoxynil et l'ioxynil, le glyphosate et ses analogues, le glufosinate
La présente invention a encore pour objet les plantes régénérées à partir des
cellules
transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui
dépende de la
nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les demandes ci-dessus. Les
plantes
selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents,
chacun d'eux
portant l'un des gènes de tolérance herbicide décrites.
L'invention a enfin pour objet un procédé de désherbage de plantes, notamment
de
cultures, à l'aide d'un herbicide de ce type, caractérisé en ce qu'on applique
cet herbicide sur
des plantes transformées selon l'invention, tant en présen~is, en prélevée
qu'en postlevée de
la culture. Par herbicide au sens de la présente invention on entend une
matière active
herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par
exemple un
agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais
safener).
Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont
associée de
manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en
agrochimie
Selon l'invention l'un des gènes de tolérance herbicides présents dans les
plantes peut
être utilisé comme marqueur de sélection, soit in vitro, soit in vivo .
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Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des
exemples
expérimentaux ci-dessous.
Exemple l: Isolement du gène de l'HPPD de P.,fli~orescens A32
A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874
publié par Rüetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466), on déduit
la séquence de
différents oligonucléotides pour amplifier par PCR une partie de la séquence
codante de
l'HPPD de P. fluorescens A32 (isolée par McKellar, R.C. 1982. J. Appl
Bacteriol. 53:305-
316). Un fragment d'amplification du gène de cette HPPD a été utilisé pour
cribler une
banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et ainsi isoler le gène
codant pour cette
enzyme.
A) Préparation de l'ADN génomique de P. fluorescens A32.
La bactérie a été cultivée dans 40 ml de milieu minimum M63 (KH2P04 13,6g/1,
(NH4)2504 2g/l, MgS04 0,2g/1, FeS04 0,005 g/I pH7 plus L-tyrosine IOmM comme
seule
source de carbone) à 28°C pendant 48 heures.
Après lavage, les cellules sont reprises dans 1 ml de tampon de lyse (tris HCl
100 mM
pH 8,3, NaCI 1,4 M et EDTA 10 mM) et incubées 10 minutes à 65°C. Après
un traitement
au phénol/chloroforme (24/1) et un traitement au chloroforme, les acides
nucléiques sont
précipités par addition d'un volume d'isopropanol puis repris dans 300 ltl
d'eau stérile et
traités à la RNAse 10 lrg/ml final. L'ADN est de nouveau traité au
phénol/chloroforme,
chloroforme et reprécipité par addition de 1/10 de volume d'acétate de sodium
3M pH5 et 2
volumes d'éthanol. L'ADN est ensuite repris dans de l'eau stérile et dosé.
B) Choix dcs oligonucléotides et synthèses.
A partir de la séquence en acides aminés de I'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874
on
choisit cinq oügonucléotides, deux dirigés dans le sens NH2 terminal de la
protéine vers le
COOH terminal de la protéine et trois dirigés dans le sens inverse (voir
figure 1). Le choix a
été dicté par les deux règles suivantes:
-une extrémité 3' de l'oligonucléotide stable, c'est à dire au moins deux
bases sans
ambiguité.
-une dégénérescence la plus faible possible.
Les oligonucléotides choisis ont les séquences suivantes:
P1: S'TA(C!T)GA(G/A}AA(C/T)CCIATGGG3'
P2: 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3'
P3: 5'AA(CIT)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3'
P4:5'AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3'
P5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(CfT)TCICC3'
Ils ont été synthétisés sur le synthétiseur "Cyclone plus DNA Synthesizer" de
marque
MILLPORE.
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Avec ces cinq oligonucléotides par PCR les fragments d'amplification que l'on
doit
obtenir théoriquement d'après la séquence SEQ ID N° 1 ont les tailles
suivantes:
avec les amorces P 1 et P3 --------> environ 690 bp
avec les amorces P 1 et P4 --------> environ 720 bp
avec les amorces P 1 et P5 --------> environ 1000 bp
avec ies amorces P2 et P3 --------> environ 390 bp
avec les amorces P2 et P4 --------> environ 420 bp
avec les amorces P2 et PS --------> environ 700 bp
C) Amplification d'une partie codante de I'HPPD de P. fluorescens A32.
Les amplifications ont été faites sur un appareil PCR PERKIN ELMER 9600 et
avec la
Taq polymérise PERKIN ELMER avec son tampon dans les conditions standards,
c'est à
dire pour SOItI de réaction il y a les dNTP à 200~tNi, les primers à 20E.tM,
la Taq polymérise
2,5 unités et l' ADN de P. fluorescens A32 2,5 pg.
Le programme d'amplification utilisé est, 5 min à 95°C puis 35 cycles
<45 sec 95°C, 45
sec 49°C, 1 min 72°C> suivis de 5 min à 72°C.
Dans ces conditions, tous les fragments d'amplification obtenus ont une taille
compatible avec les tailles théoriques données au-dessus, ce qui est une bonne
indication de
la spécificité des amplifications.
Les fragments d'amplifications obtenus avec les jeux d'amorces P1/P4, P1/PS et
P2/P4
sont ligués dans pBSII SK(-) après digestion de ce plasmide par Eco RV et
traitement à la
terminal transférase en présence de ddTTP comme décrit dans HOLTON T.A. and
GRAHAM M.W. 1991. N.A.R. vol 19, n°5 p1156.
Un clone de chacun des trois types est séquencé partiellement; ceci permet de
confirmer
qu'on a bien amplifié dans les trois cas une partie de la région codante de
l'HPPD de P.
f luorescens A32. Le fragment P 1/P4 est retenu comme sonde pour cribler une
banque
génomique partielle de P. fluorescens A32 et isoler le gène complet de l'HPPD.
D) Isolement du gëne.
Par Southern on montre qu'un fragment de 7 Kbp après digestion de l'ADN de P.
fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI s'hybride avec la sonde HPPD
Pl/P4. On
a donc fait digérer 400~tg d'ADN de P..fluorescens A32 par l'enzyme de
restriction BamHI et
purifier sur gel d'agarose les fragments d'ADN faisant environ 7Kbp.
Ces fragments sont ligués dans pBSII SK(-), lui-même digéré par Bam HI et
déphosphorylé par traitement à la phosphatase alcaline. Après transformation
dans E. coli
DHIOb, la banque génomique partielle est criblée avec la sonde HPPD Pl/P4.
Un clone positif a été isolé et appelé pRP A. Sa carte simplifiée est donnée
figure 2. Sur
cette carte est indiqué la position de la partie codante du gène HPPD. Elle
est composée de
1077 nucléotides qui codent pour 358 acides aminés (voir SEQ ID N° 1 ).
L'HPPD de P.
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tluorescen,r A32 présente une bonne homologie en acides aminés avec celle de
Pseudomonas
sp. strain P.1. 874, il y a en effet 92~1o d'identité entre ces deux protéines
( voir figure 3 ).
Exemple 2 : Construction de deux gènes chimères avec une séquence HPPD
Pour conférer la tolérance de plantes aux herbicides inhibant I'HPPD, on
construit deux
gènes chimères:
Le premier consiste à mettre la partie codante du gène de l'HPPD de P.
fluorescens A32
sous Ie contrôle du promoteur double histone (Demande de Brevet européen
N° 0 507 698)
suivi du Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrington
and
Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) avec le terminateur du gène de la
nopaline synthase.
L'HPPD sera alors localisée dans le cytoplasme.
Le deuxième sera identique au premier, à ceci près qu'entre l'activateur de
translation
TEV et la partie codante de I'HPPD, on intercale Ie peptide de transit
optimisé (OTP)
(Demande européenne EP n° 0 508 909). L'HPPD sera alors localisée dans
le chloroplaste.
A) Construction du vecteur pRPA-RD-153:
- pRPA-RD-11 Un dérivé de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog #212206) contenant
le
site de polyadenylation de la nopaline synthase (NOS polyA) (Demande
européennne n° 0
652 286) est cloné entre les sites Kpnl et Sall. Le site Kpnl est transformé
en un site NotI
par traitement avec la T4 ADN polymerase I en présence de 150 NM de
deoxynucleotide
triphoshates puis ligation avec un linker NotI (Stratagene catalog #1029).
Ainsi on obtient
une cû~sette de clonage NOS polyA .
- pRPA-RD-127: Un dérivé de pRPA-BL-466 (Demande européenne EP n° 0 337
899)
cloné dans pRPA-RD-11 créant une cassette d'expression du gène oxy et
contenant le
promoteur de la petite sous unité de la ribulose-biscarboxylase:
" promoter (SSU) - oxy gene - NOS polyA"
Pour créer ce plasmide, pRPA-BL-488 a été digéré avec Xbal et HindIII pour
isoler un
fragment de 1.9 kpb contenant le promoteur SSU et le gène oxy, qui a été ligué
dans le
plasmide pRPA-RD-11 digéré avec des enzymes compatibles.
- pRPA-RD-132: C'est un dérivé de pRPA-BL-488 (Demande européenne EP n°
0 507
698) cloné dans pRPA-RD-127 avec création d'une cassette d'expression du gène
oxy avec
le promoteur double histone:
" promoteur double histone - oxy gène - NOS polyA "
Pour fabriquer ce plasmide, pRPA-BL-466 est digéré par HindIII, traité par la
Klenow
puis redigéré avec NcoI. Le fragment de 1.35 kbp purifié contenant le
promoteur double
histone H3A748 est ligué avec le plasmide pRPA-RD-127 qui avait été digéré par
XbaI,
traité Klenow et redigéré par NcoI.
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- pRPA-RD-153: C'est un derivé de pRPA-RD-132 contenant l'activateur de
translation
du virus etch du tabac (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990: J. Virol.
64: 1590-
f~97~ est digéré avec Ncnl et EcoRl et le fragment de 1~0 bp est ligué dans
pRPA-RD-132
digéré avec les mêmes enzymes. Donc on a créé une cassette d'expression
contenant le
promoteur:
"double histone promoteur - TEV -oxy u - NOS polyA"
B) Construction du vecteur pRPA-RD-185:
pUCl9/GECA: Un dérivé de pUC-19 (Gibco catalog #15364-011) contenant de
nombreux sites de clonage. pUC-19 est digéré avec EcoRl et ligué avec
l'oligonucleotide
linker l:
Linker l: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA
Le clone sélectionné contient un site EcoRl suivi du polylinker qui contient
les sites
suivants: EcoRl. Apal, Avrll. Pmel, Sfil, Sacl. Kpnl, Srnal, BamHl, Xbal,
Sall, Pstl. Sphl et
1 ~ Hindlll.
pRPA-RD-18~: c'est un dérivé de pUCl9/GECA contenant un polylinker modifié.
pUCl9/GECA est digéré par HindIII et ligué avec l'oligonucleotide linker 2:
Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
Le clone sélectionné contient un site Hindlll site au milieu du polylinker qui
contient
maintenant Ies sites suivants: EcoRl, Apal, Avrll, Pmel, Sfil, Sacl, Kpnl,
Smal, BamHl,
Xbal. Sall. Pstl, Sphl, Hindlll. Pacl. Ascl Xhol et EcoNl.
C) Construction du vecteur pRP T:
- pRP O: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de
l'HPPD,
promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur Nos. Pour fabriquer
pRP O,
pRPA-RD 153 est digéré par Hind III, traité par la Klenow puis redigéré par
NcoI pour
enlever le gène oxy et le remplacer par Ie gène HPPD sorti du plasmide pRP A
par digestion
BstEII, traitement par Ia Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP R: pour l'obtenir le plasmide pRP O a été digéré par PvuII et SacI, le
gène
chimère a été purifié puis ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et
SacI.
- pRP T: il a été obtenu par ügation du gène chimère sorti de pRP R après
digestion par
SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 digéré par les mêmes
enzymes
(Demande européenne EP n° 0 508 909).
CA 02261094 1999-O1-14
WO 98/02562 PCT/FR97/01256
Le Gène chimère du vecteur pRP T a donc la structure suivante:
Promoteur double histone ~ TEV ~ Réaion codante de l'HPPD I Terminateur nos
D) Construction du vecteur pRP V
5 - pRP P: c'est un dérivé de pRPA-RD-7 (Demande européennne EP n° 0
652 286)
contenant le peptide de transit optimisé suivi du gène de l'HPPD. Il a été
obtenu par ligation
de la partie codante de l'HPPD sorti de pRP A par digestion BstEII et NcoI,
traitement à la
Klenow et du plasmide pRPA-RD-7 lui-même digéré SphI et AccI et traité à la
DNAse
polymérase T4.
10 - pRP Q: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de
l'HPPD,
promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur Nos. Pour le
construire le
plasmide pRPA-RD-153 est digéré par Sal I, traité par la Klenow puis redigëré
par NcoI
pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du
plasmide.pRP P par
digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP S: pour l'obtenir, le plasmide pRP Q a été digéré par PvuII et SacI pour
sortir le
gène chimère qui a été ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et
Sacl.
- pRP V: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP S après
digestion par
SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 (Demande européennne EP
n° 0 508
909).
Le gène chimère du vecteur pRP Q a donc la structure suivante:
Promoteur doubleTEV OTP Rgion codante de Terminateur
fHPPD nos
histone
Exemple 3 : Transformation du tabac industriel PBD6.
Afin de déterminer l'efficacité de ces deux gènes chimériques, ceux-ci ont été
transférés
dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de
régénération déjà
décrites dans la demande européenne EP n° 0 508 909.
1 ) Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101
(flood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komari et al,1986). La
technique de
transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al. (1985) Science,
227, 1229-1231.
2) Régénération:
CA 02261094 1999-O1-14
WO 98!02562 PCT/FR97/Oi256
11
La ré;énérution du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants
tuiiaire, est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS)
comprenant 30g/1 de
saccharose ainsi que 100 ~tg/ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont
prélevés sur des
plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques
foliaires(Science
t985,Vo1 227, p.1229-1231) en trois étapes successives:la première comprend
l'induction
des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose contenant
O.OSmg/1 d'acide
naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours.
Les
pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture
sur un milieu
MS âdditionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant
10 jours.
Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu
d'enracinement MS à
teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone. Au
bout d'environ
jours, les pousses enracinées sont passées en terre. Les plantes obtenues sont
appellées Co
17.
Au sortir de l'in-vitro, les plantules de tabac transformées ont été
acclimatées à la serre
15 (60% d'humidité relative; température: 20°C la nuit et 23°C
la jour) pendant cinq semaines
puis traitées au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole.
Le tabac témoin, non transformé et traité au 4-[4-CF3-2-
(méthylsulfonyl)benzoyl]-5-
cyclopropyl isoxazole à des doses allant de 50 à 400 g/ha, développe en
environ 72 heures
des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très
prononcées en une
semaine (couvrant environ 80% des feuilles terminales).
Après transformation ce même tabac, qui surexprime l'HPPD de P. fluorescens,
est très
bien protégé contre un traitement au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoyl]-5-
cyclopropyl
isoxazole à la dose de 400 g/ha.
Si l'enzyme surexprimée est dans le chloroplaste, c'est à dire si la
transformation a été
faite avec le gène porté par le vecteur pRP V, alors la plante est
parfaitement protégée, ne
présente aucun symptôme.
Exemple 4: Transformation du tabac industriel PBD6. avec gène EPSPS pour ~
construction 173
Isolement d'un ADNc codant pour une EPSPS de maïs:
Les différentes étapes, qui ont conduit à l'obtention de fADNc d'EPSPS de
maïs, qui a
servi de substrat à l'introduction des deux mutations, sont décrites ci-
dessous. Toutes les
opérations décrites ci-dessous sont données à titre d'exemples et
correspondent à un choix,
effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même
résultat. Ce
choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute
méthode
adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même
résultat. La plupart des
méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current
Protocole in
CA 02261094 1999-O1-14
WO 98/02562 PCT/FR97/01256
12 -
Molecular Bioloay" Volumes I et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene
Publishing
Associates et Wiley -Interscience ( 1989)(Par la suite, les références à des
protocoles décrits
dans cet ouvrage seront notées "réf. CPMB"). Les opérations concernant l'ADN,
qui ont été
effectuées selon les protocoles décrits dans cet ouvrage sont, en particulier
les suivantes:
~ libation de fragments d'ADN, traitements par l'ADN polymérase de Klénow et
la T4 ADN
polymérase, préparation d'ADN de plasmides et de bactériophages ~, soit en
minipréparation
soit en maxi préparation, analyses d'ADN et d'ARN respectivement selon les
techniques de
Southern et Northern. D'autres méthodes décrites dans cet ouvrage ont été
suivies, et seules
les modifications ou ajouts significatifs à ces protocoles ont été décrits ci-
dessous.
A I . Obtention d'un fragment d'EPSPS d' Arabidopsis thaliana
a) deux oligonucleotides 20-mers de séquences respectives:
~'- GCTCTGCTCATGTCTGCTCC -3'
5'- GCCCGCCCTTGACAAAGAAA- 3'
ont été synthétisés à partir de la séquence d'un gène d'EPSPS d'Arabidopsis
thaliana
1~ (Klee H.J. et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Ces deux
oligonucleotides sont
respectivement en position 1523 à 1543 et 1737 à 1717 de la séquence publiée
et en
onentauon convergente.
b) L'ADN total d'Arabidopsis thaliana (var. Columbia) a été obtenu chez
Clontech
(référence catalogue: 6970-1 )
c) On mélange 50 nanogrammes(ng) d'ADN avec 300ng de chacun des
oligonucleotides et soumis à 3~ cycles d'amplification avec un appareil Perkin-
Elmer 9600,
dans les conditions de milieu standard pour l'amplification préconisées par le
fournisseur. Le
fragment de 204 pb résultant constitue le fragment d'EPSPS d' Arabidopsis
thaliana.
2. Construction d'une bibliothèque d'un ADNc à partir d'une ligne cellulaire
de maïs
BMS .
a) On broye 5 g de cellules filtrées dans l'azote liquide et les acides
nucléiques totaux
extraits selon la méthode décrite par Shure et al. avec les modifications
suivantes:
- le pH du tampon de lyse est ajusté à PH = 9,0;
-après la précipitation par l'isopropanol, le culot est repris dans l'eau et
après
dissolution, ajusté à 2,5 M LiCI. Après incubation pendant 12 h à °C,
le culot de la
centrifugation d 15 min. à 30000g à 4°C est resolubilisé. L'étape de
précipitation
par LiCI est alors répétée. Le culot resolubilisé constitue la fraction ARN
des acides
nucléiques totaux.
b) La fraction ARN-polyA+ de la fraction ARN est obtenue par chromatographie
sur
colonne oligo-dT cellulose telle que décrite dans "Current Protocols in
Molecular Biology" .
c) Synthèse d'ADNc double brin à extrémité synthétique EcoRI: elle est
réalisée en
suivant le protocole du fournisseur des différents réactifs nécessaires à
cette synthèse sou
forme d'un kit: le "copy kit" de la société In Vitrogen.
CA 02261094 2003-03-11
13
Deux uli~onucleotides simples brins et partiellement complémentaires de
séquences
re5pecuves:
~'- AATTCCCGGG -3'
~'- CCCGGG- 3' (ce dernier étant phosphorylé)
sont ligués avec les ADNc double brin à extrémités franches.
Cette libation des adaptateurs résulte en la création de sites Sma I accolés
aux ADNc
double brin et EcoRI sous forme cohésive à chaque extrémité des ADNc double
brin.
d) Création de la bibliothèque:
Les ADNc préséntant à leurs extrémités les sites artificiels cohésifs EcoRI
sont
t0 ligués avec le ADNc du bactériophage ~.gtl0 coupé par EcoRI et
déphosphorylé
selon le protocole du fournisseur New England Biolabs.
Une aliquote de la réaction de ligation a été encapsidée in vitro avec des
extraits
d'encapsidation: Gigapack Gold selon les instructions du fournisseur, cette
librairie
a été titrée en utilisant la bactérie E.coli C600hf1. la librairie ainsi
obtenue est
I5 amplifiée et stockée selon les instructions du même fournisseur et
constitue la
librairie de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS.
3. Criblage de la bibliothèque de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS
avec la
sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana:
Le protocole suivi est celui de "Cucrent Protocole in Molecular Biology"
Volumes I et
20 ?, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et S (
1989)(CPMB). En
bref, environ 106 phages recombinants sont étalés sur boîte LB à une densité
moyenne de
100 phages /cm2~ Les plages de lyses sont répliqués en doubles sur membrane
Hybond N
d'Amersham.
h) L'ADN a été fixé sur les filtres par traitement UV 1600kJ (Stratalinkei de
25 Stratagene). Les filtres iont été préhydridés dans: 6xSSC/0,1%SDS/0,25 lait
écrémé pendant
2h à 65°C. La sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été marquée au 32P-
dCTP par
"random-priming" selon les instructions du fournisseur (Kit Ready to Go de
Pharmacia).
L'activité spécifique obtenue est de l'ordre de 108 cpm par ug de fragment.
Après
dénaturation pendant 5 min à 100°C, la sonde est ajoutée dans le milieu
de préhybridation et
30 l'hybridation est poursuivie pendant 14 heures à 55°C. Les filtres
sont fluorographiés 48h à
80°C avec un film Kodak XARS et des écrans renforçateurs Hyperscreen
RPN d'Amersham.
L'alignement des spots positifs sur le filtre avec les boîtes d'où ils sont
issus permet de
prélever, sur la boîte, des zones correspondant aux phages présentant une
réponse
d'hybridation positive avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Cette étape
d'étalement,
35 transfert, hybridation, récupération est répétée jusqu'à ce que tous les
spots de la boîte des
phages successivement purifiés se révèlent positifs à 100% en hybridation. Une
plage de lyse
par phage indépendant est alors prélevée dans du milieu ~, diluant (Tris-Cl
pH= 7,5; MgS04
* ( marques de commerce )
CA 02261094 2003-03-11
14
IOmM; NaCI 0, I M; gélatine 0. l X70 ), ces pliages en solution constituant
les clones positifs de
l' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS.
:~. Préparation et analyse de l'ADN des clones d'EPSPS de la suspension
cellulaire de
maïs BMS.
On ajoute environ ~.10g pliages à 20 ml de bactéries C600hfl à 2 OD 600nm/ml
et
incubés 15 minutes à 37°C. Cette suspension est alors diluée dans 200m1
de milieu de
croissance des bactéries dans un Erlen de 11 et agitée dans un agitateur
rotatif à 250 rpm. La
lyse est constatée par clarification du milieu, correspondant à 1 lyse des
bactéries turbides et
se produit après environ 4 h d'agitation. Ce surnageant est alors traité comme
décrit dans
"Carrent Protocole in Molecular Biology". L'ADN obtenu correspond aux clones
d'EPSP de
la suspension cellulaire de maïs BMS.
Un à deux. pg de cet ADN sont coupés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose
LGTAlTBE (réf. CPMB) à 0,8%. Une dernière vérification consiste à s'assurer
que l' ADN
purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS
d'Arabidopsis thaliana.
Après fëlectrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur mennbrane
Hybond N
d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Carrent Protocols in
Molecular
BioioQy". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana
selon les
conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone présentant un signal
d'hybridation
avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana et contenant le plus long fragment
EcoRI a une
taille estimée sur gel à environ l,7kpb.
5. Obtention du clone pRPA-ML-711:
Dix ug de l'ADN du clone phagique contenant l'insert de l,7kpb sont digérés
par EcoRI
et séparés sur gel d'agarose LGTAltBE (réf. CPMB) à 0,8%. Le fragment de gel
contenant
l'insert de l,7kpb est excisé du gel par coloration BET et le fragment est
traité à la (3-agarase
selon le protocole du fournisseur New a Biolabs. L'ADN purifié du fragment de
l,7kpb est
ligué à 12°C pendant 14h avec l'ADN du plasmide pUC 19 (New England
Biolabs) coupé
par EcoRI selon le protocole de ligation décrit dans "Carrent Protocole in
Molecular
Biology". Deux pl du mélange de ligation ci-dessus sont utilisés pour la
transformation d'une
aliquote d'E.coli DH l OB électro compétentes; la transformation se fait par
électroporation en
utilisant les conditions suivantes: le mélange de bactéries compétentes et de
milieu de
ligation est introduit dans une cuvette d'électroporation d'épaisseur 0,2 cm
(Biorad)
prélablement refroidie à 0°C. Les conditions physiques de
félectroporation utilisant un
électroporateur de marque Biorad sont 2500 Volts, 25 pFarad et 200 S2. Dans
ces conditions,
le temps de décharge moyen de condensateur est de l'ordre de 4,2
millisecondes. Les
bactéries sont alors reprises dans 1 ml de milieu SOC (réf, CPMB) et agitées
pendant 1
heure à 200 rpm sur un agitateur rotatif dans des tubes Cotning de 15 ml.
Après étalement
sur milieu LBIagar supplémenté à 100 ~tg/ml de carbéniciline, les mini-
grêparations des
clones bactériens ayant poussé après une nuit à 37 °C est réalisée
selon le protocole décrit
* ( marque de commerce )
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dons "Current Protocole in Molecular Biology". Après digestion par 1~coRI de
I'ADN et
séparation en électrophorèse sur gel d'agarose LGTA~TBE (réf. CPMB) à 0.8%.
les clones
présentant un insert de l.7kpb sont conservés. Une dernière vérification
consiste à s'assurer
que l' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS
d'Arabidopsis
thaliana. Après l'électrophorèse. les fragments d'ADN sont transférés sur
membrane Hybond*
N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Cuitent Protocole in
Molecular
Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana
selon les
conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone plasmidique présentant
un insert de
l,7kpb et hybridant avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis rhaliana a été préparé à
plus grande
IO échelle et l'ADN résultant de la Lyse des bactëries purifié sur gradient de
CsCI ainsi que
décrit dans "Current Protocole in Molecular Biology". L'ADN purifié a été
partiellement
séquencé avec -un kit Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur 'et
en utilisant
comme amorces, les amorces universelles de M13 directes et inverses commandées
chez le
même fournisseur. La séquence partielle réalisée couvre environ 0,5 kpb. La
séquence
15 dérivée en acides aminés dans la région de la protéine mature (environ 50
résidus acides
aminës) présente une identité de 100% avec la séquence aminée correspondante
de l'EPSPS
mature de maïs décrite dans le brevet américain USP 4 971 908}. Ce clone
correspondant à
un fragment EcoRl de l,7kpb de l'ADN de l' EPSP de la suspension cellulaire de
màis BMS
a été nommé pRPA-ML-711. La séquence complète de ce clone a ëté réalisée sur
les deux
brins en utilisant le protocole du kit Pharmacie et en synthétisant des
oligonucléotides
complémentaires et de direction opposée tous les 250 pb environ. La séquence
complète de
ce clone de 1713 pb obtenue est présentée par SEQ ID N° 2.
6. Obtention du clone pRPA-ML-715:
L'analyse de Ia séquence du clone pRPA-ML-711 et en particulier la comparaison
de la
séquence d' acides aminés dérivés avec celle de maïs montre une extension de
séquence de
92 pb en amont du codon GCG codant pour l'Alanine NH2-terminale de la partie
mature de
l'EPSPS de maïs (brevet amêricain USP 4 971 908}. De même une extension de 288
pb en
aval du codon AAT codant pour l'asparagine COOH-terminale de la partie mature
de
l'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908) est observée. Ces deux
parties pourraient
correspondre, pour l'extension NH2-terminale à une portion de la séquence d'un
peptide de
transit pour la localisation plastidiale et pour l'extension COOH-terminale à
la rëgion 3' non
traduite de I'ADNc.
Afin d'obtenir un ADNc codant pour la partie mature de fADNc de fEPSPS de
maïs,
telle que décrite dans l' USP 4 971 908, les opérations suivantes ont été
réalisées:
a) Elimination de la région 3' non traduite: construction de pRPA-ML-712:
Le clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction AseI et les
extrëmités
résultant de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de
Klenow de
I'ADN polymérase I selon le protocole décrit dans CPMB. Une coupure par
l'enzyme de
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restriction SacII a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces opérations a
été séparé par
électrophorèse sur bel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) 1 %.
Le fragment de gel contenant l'insert "AseI-extrémités franches/SacII" de 0.4
kpb a
été excisé du bel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe S ci-
dessus. L'ADN du
~ clone pRPA-ML-71 1 a été coupé par l'enzyme de restriction HindIII située
dans le polylinker
du vecteur de clonage pUC 19 et les extrémités résultant de cette coupure ont
été rendues
franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une
coupure
par l'enzyme de restriction SacII a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de
ces
manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf.
CPMB)
0,7%.
Le fragment de gel contenant l'insert HindIII-extrémités franches/SacII de
environ
3,7kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe
5 ci-dessus.
Les deux inserts ont été ligués, et 2 Itl du mélange de ligation ont servi à
transformer
E. coli DH10B ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.
On analyse le contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la
procédure
décrite pour pRPA-ML-711. Un des clones plasmidique retenu contient un insert
EcoRI-
HindllI de 1,45 kpb environ. La séquence des extrémités terminales de ce clone
révèle que
l'extrémité 5' de l'insert correspond exactement à l'extrémité correspondante
de pRPA-ML-
711 et que l'extrémité 3' terminale présente la séquence suivante:
" 5'-...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3' ".
La séquence soulignée correspond au codon de l'acide aminé COOH-terminal
asparagine, le codon suivant correspondant au codon stop de la traduction. Les
nucléotides
en aval correspondent à des éléments de séquence du polylinker de pUCI9. Ce
clone
comprenant la séquence de pRPAML-711 jusqu'au site de terminaison de la
traduction de
fEPSPS mature de maïs et suivie de séquences du polylinker de pUC 19 jusqu'au
site
HindIII a été nommé pRPA-ML-712.
b) Modification de l'extrémité 5' de pRPA-ML-712: construction de pRPA-ML-715
Le clone pRPA-ML-712 a été coupé par les enzymes de restrictions PstI et
HindIll.
L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel
d'agarose
LGTAlTBE (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert PstI/EcoRI de
1,3 kpb
a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe S ci-
dessus. Cet insert a
été mis en ligation en présence de quantité équimoléculaire de chacun des deux
oligonucléotides partiellement complémentaires, de séquence:
Oligo 1: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3'
Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3'
ainsi qu'en présence d'ADN du plasmide pUCl9 digéré par les enzymes de
restrictions
BamHI et HindIII.
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Deux pl du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHIOB ainsi que
décrit plus haut au paragraphe ~. Après analyse du contenu en ADN plasmidique
de
différents clones selon la procédure décrite ci-dessus au paragraphe ~, un des
clones
présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses
ultérieures. La séquence
de l'extrémité 5' terminale du clone retenu révèle que la séquence ADN dans
cette région est
la suivante: séquence du polylinker de pUCl9 des sites EcoRI à BamHI, suivi de
la séquence
des oligonucléotides utilisés lors du clonage, suivi du reste de la séquence
présente dans
pRPAML-712. Ce clone a été nommé pRPA-ML-713. Ce clone présente un codon
methionine ATG inclus dans un site NcoI' en amont du codon Alanine N-terminal
de
l'EPSPSynthase mature. De plus, les codons alanine et glycine de l'extrémité N-
terminale ont
été conservées, mais modifiées sur la troisième base variable : GCGGGT initial
donne
GCÇGGÇ modifié.
Le clone pRPA-ML-713 a été coupé par l'enzyme de restriction HindIjZ et les
extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment
de Klenow de
la ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite
été effectuée.
L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel
d'agarose
LGTA/FBE (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert "HindIII-
extrémités
franches/SacI" de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole
décrit au
paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence d'ADN du
plasmide
pUCl9 digéré par l'enzyme de restriction XbaI et les extrémités de cette
coupure rendues
franches par traitement avec le fragment de Klenow de I'ADN polymérase I. Une
coupure
par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée. Deux pl du mélange
de ligation ont
servi à transformer E. coli DHiOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.
Après analyse
du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite
ci-dessus au
paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été
conservé pour
analyses ultérieures. La séquence des extrémités terminales du clone retenu
révèle que la
séquence ADN est la suivante: séquence du polylinker de pUCl9 des sites EcoRI
à SacI,
suivie de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage délétée
des 4 pb GATCC
de l'oligonucléotide 1 décrit ci-dessus, suivi du reste de la séquence
présente dans pRPA-
ML-712 jusqu'au site HindllI et séquence du polylinker de pUCl9 de XbaI à
HindIII. Ce
clone a été nommé pRPA-ML-715.
7) Obtention d'un ADNc codant pour une EPSPS de maïs mutée
Toutes les étapes de mutagénèse ont été réalisées avec le U.S.E. mutagenesis
kit de
Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur. Le principe de ce
système de
mutagénèse est le suivant: l'ADN plasmidique est dénaturé par la chaleur et
réassocié en
présence d'un excès molaire d'une part de l'oligonucléotide de mutagénèse, et
d'autre part
d'un oligonucléotide permettant d'éliminer un site d'enzyme de restriction
unique présent
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dans le polylinker. Après l'étape de réassociation, la synthèse du brin
complémentaire est
réalisée par l'action de la T4 ADN polvmérase en présence de T4 ADN ligase et
de protéine
du gène 32 dans un tampon approprié fourni. Le produit de synthèse est incubé
en présence
de l'enzyme de restriction, dont le site est supposé avoir disparu par
mutagénèse. La souche
d'E. soli présentant, en particulier, la mutation mutS est utilisée comme hôte
pour la
transformation de cet ADN. Après croissance en milieu liquide, l'ADN
plasmidique total est
préparé, incubé en présence de l'enzyme de restriction utilisée précédemment.
Après ces
traitements, la souche d'E. coli DH10B est utilisée comme hôte pour la
transformation.
L'ADN plasmidique des clones isolés est préparé et la présence de la mutation-
introduite
vérifiée par séquençage.
A)- modifications de sites ou de séquence sans incidence a priori sur le
caractère de
résistance de l'EPSPS de maïs aux produits inhibiteurs compétitifs de
l'activité EPSP
synthase: élimination d'un site NcoI interne de pRPA-ML-71~.
La séquence de pRPA-ML-715 est numérotée arbitrairement en plaçant la première
base
1 ~ du codon Alanine N-terminal GCC en position 1. Cette séquence présente un
site NcoI en
position 1217. L'oligonucléotide de modification du site présente la séquence
5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.
Après séquençage selon les références données ci-dessus, la séquence lue après
mutagénèse correspond à celle de I'oligonuciéotide utilisé. Le site NcoI a
bien été éliminé et
?0 la traduction en acides aminés dans cette région conserve la séquence
initiale présente sur
pRPA-ML-715.
Ce clone a été nommé pRPA-ML-716.
La séquence de 1340 bp de ce clone est présentée SEQ ID N° 3 et SEQ
ID N° 4.
B) modifications de séquence permettant l'augmentation du caractère de
résistance de
?~ l'EPSPS de mass aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP
synthase.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés
a) mutation Thr 102 ~~~ Ile.
5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'
b) mutation Pro 106 ~~~ Ser.
30 5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
c) mutations Gly i01 ~~~ Ala et Thr 102 ~~~ Ile.
5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'
d) mutations Thr 102 ~~~ Ile et Pro 106 ~~~ Ser.
5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
Après séquençage, la séquence lue après mutagénèse sur les trois fragments
mutés est
identique à la séquence de l'ADN parental pRPA-ML-716 à l'exception de la
région
mutagénéisée qui correspond à celle des oligonucléotides de mutagénèse
utilisés. Ces clones
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ont été nommés : pRPA-ML-717 pour la mutation Thr 102 ~~ Ile, pRPA-ML-718 pour
la
mutation Pro 106 v~~ Ser, pRPA-ML-719 pour tes mutations Gly 101 "'~ Ala et
Thr 102 "'~ Ile
et pRP.A-ML-720 pour les mutations Thr 102 ~~~~ Ile et Pro 106 ~~~ Ser.
La séquence de 1340 bp de pRPA-ML-720 est présentée SEQ ID N° ~ et SEQ
ID N° 6.
L'insert Ncol-Hindlll de 1395 pb est à la base de toutes les constructions
utilisées pour
la transformation des plantes pour l'introduction de la résistance aux
herbicides inhibiteurs
compétitifs de l'EPSPS et en particulier la résistance au glyphosate. Cet
insert sera nommé
dans la suite des descriptions "le double mutant de fEPSPSJde maïs".
B Tolérance au glyphosate des différents mutants in vitro.
2.a: Extraction de fEPSP synthase.
Les différents gènes d'EPSP synthases sont introduits sous forme d'une
cassette NcoI-HindIII
dans le vecteur plasmidique pTrc99a (Pharmacia, ref : 27-5007-Ol) coupé par
NcoI et
HindIII. Les E. coli DH lOB recombinantes surexprimant les différents EPSP
synthases sont
soniquées dans 40 ml de tampon par 10 g de cellules culottées et lavées avec
ce même
tampon (tris HC1200 mM pH 7,8, mercaptoethanol 50 mM, EDTA 5 mM et PMSF 1 mM),
auxquels on ajoute 1 g de polyvinylpyrrolidone. La suspension est agitée
pendant 15 minutes
à 4°C, puis centrifugée 20 minutes à 27000g et 4°C.
Le surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la solution à
40% de la
saturation en sulfate d'ammonium. Le mêlange est centrifugé 20 minutes à
27000g et 4°C.
Le nouveau surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la
solution à 70%
de la saturation en sulfate d'ammonium. Le mélange est centrifugé 30 minutes à
27000g et
4°C. L'EPSP synthase, présente dans ce culot protéique, est reprise
dans 1 ml de tampon (tris
HCl 20 mM pH 7.8 et mercaptoethanol 50 mM). Cette solution est dialysée une
nuit contre
deux litres de ce même tampon à 4°C.
2.b: Activité enzymatique.
L'activité de chaque enzyme ainsi que sa résistance au glyphosate est mesurée
in vitro sur 10
minutes à 37°C dans le mélange réactionnel suivant: acide maléfique 100
mM pH 5,6,
phosphoénol pyruvate 1 mM, shikimate-3-phosphate 3 mM (préparé selon Knowles
P.F. et
Sprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 à partir de Aerobacter
aerogenes
strain ATCC 25597) et fluorure de potassium 10 mM. L'extrait enzymatique est
ajouté au
dernier moment après l'addition de glyphosate dont la concentration finale
varie de 0 à 20
mM.
L'activité est mesurée par dosage du phosphate libéré selon fia technique de
Tauslcy H.A. et
Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685.
Dans ces conditions, l'enzyme sauvage (WT) est inhibée à 85% dès la
concentration de 0,12
mM de glyphosate. A cette concentration, l'enzyme mutante connue Ser106 n'est
inhibée
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qu'à 50% et les trois autres mutants Ile 102. Ile 102/Ser 106, Ala 101/Ile 102
ne sont pas ou peu
inhibées.
II faut multiplier la concentration de glyphosate par dix, soit 1,2 mM, pour
inhiber l'enzyme
mutante Ile 102 à 50%, les mutants Ile 102/Ser 106. Ala/Ile et Ala n'étant
toujours pas inhibés.
Il faut noter que l'activité des mutants Ala/Ile et AIa n'est pas inhibée
jusqu'à des
concentrations de 10 mM de glyphosate, et que celle du mutant I1e102/Ser106
n'est pas
réduite même si la concentration en glyphosate est multipliée par 2, soit 20
mM.
C
Résistance des plantes de tabac transformés.
10 0-I Constructions des plasmides:
pRPA-RD-124: Addition d'un signal de polyadénylation "nos" à pRPA-ML-720,
obtenu précédemment, avec création d'une cassette de clonage contenant le gène
d'EPSPS
double mutant de mâis (Thr 102 --~ Ile et Pro 106 -~ Ser). pRPA-ML-720 est
digéré avec
Hind III, traité avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli
pour produire
15 une extrémité franche. On effectue une seconde digestion avec Nco I et le
fragment EPSPS
est purifié. Le gène EPSPS est ensuite ligué avec pRPA-RD-12 purifié (une
cassette de
clonage contenant le signal de polyadénylation de la nopaline synthase) pour
donner pRPA
RD-124. Pour obtenir le vecteur pRPA-RD-12 purifié utile, il a fallu que celui-
ci soit
préalablement digéré par SaII, traité avec l'ADN polymérase de Klenow, puis
digéré une
20 seconde fois avec NcoI.
pRPA-RD-125: Addition d'un peptide de transit optimisé (OTP) à pRPA-RD-124
avec
création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS ciblé sur les
plasmides.
pRPA-RD-7 (demande de brevet européen EP 652 286) est digéré avec Sph I,
traité avec la
T4 ADN polymérase, puis digéré avec Spe I et le fragment OTP est purifié. Ce
fragment
OTP est cloné dans pRPA-RD-124 qui a été préalablement digérée par NcoI,
traité avec
l'ADN polymérase de Klenow pour enlever la partie protubérante 3', puis
digérée par Spe I.
Ce clone est alors séquencé pour assurer la fusion traductionnelle correcte
entre le OTP et
le gène d'EPSPS. On obtient alors pRPA-RD-125.
pRPA-RD-159: Addition du promoteur double d'histone d'arabidopsis H4A748
(demande de brevet EP 507 698 ) à pRPA-RD-125 avec création d'une cassette
pour
expression dans les plantes pour l'expression du gène "OTP- gène d'EPSPS
double mutant"
dans les tissus de dicotylédones. pRPA-RD-132 (une cassette contenant le
promoteur
double H4A748 (demande de brevet EP 507 698)) est digérée avec Nco I et Sac I.
Le
fragment purifié du promoteur est ensuite cloné dans qui a été digéré avec Eco
I et Sac I.
pRPA-RD-173: Addition du gène "promoteur H4A748-OTP-gène d'EPSPS double
mutant" de pRPA-RD-159 dans plasmide pRPA-BL-150A (demande de brevet européen
508 909) avec création d'un vecteur de transformation Agrobacterium
tumefaciens. pRPA-
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21
RD-t~9 est digéré avec Not I et traité avec la polymérase de Klenow. Ce
fragment est
ensuite cloné dans pRPA-BL-150A avec Sma I.
1-1- Transformation.
Le vecteur pRPA-RD-173 est introduit dans la souche dAgrobacterium
ta~mefaciens
EHA101 (Hood et al.,1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari et al.,1986). La
technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al.( 1985).
1-2- Régénération.
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants
foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS)
comprenant 30g/1 de
saccharose ainsi que 200 Irg/ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont
prélevés sur des
plantes cultivées en serre ou in,vitro et transformées selon la technique des
disques foliaires
(Science,1985,Vo1 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première
comprend
l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30g/1 de saccharose
contenant 0,05 mg/1
d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15
jours. Les
pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10
jours par
culture sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose mais ne conténant
pas
d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un
milieu
d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant
pas
d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en
terre.
1-3- Résistance au glyphosate.
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la
construction
pRPA-RD-173. Ces plantes ont étë traitées en serre au stade 5 feuilles avec
une susFension
acqueuse de RoundUp correspondant à O,8kg de matière active glyphosate par
hectare.
'25 Les résultats correspondent à l'observation d'indices de phytotoxicité
relevés 3 semaine
après traitement. Dans ces conditions, on constate que les plantes
transformées par la
construction pRPA-RD-173 présentent une très bonne tolérance alors que les
plantes
témoins non transformées sont complètement détruites.
Ces résultats montrent clairement l'amélioration apportée par l'utilisation
d'un gène
chimère selon l'invention pour un même gène codant pour la tolérance au
glyphosate.
t~ u t t ' . av c ène e 1 'tr~ e o r ~
construction 238:
Ce tabac est obtenu selon l'enseignement de la demande européenne n° 0
337 899 page 6
ligne 50 et suivantes à partir de la construction 238, qui est celle décrite
sous le norn de
pRPA-BL 238.
* ( marque de commerce )
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Eremple 6~ Croisement par pollinisation
On procède par pollinisation en serre au croisement respectivement des lignées
Co 17, 173
et X38
Co 17 avec 238 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double
tolérance à
l'isoxaflutole et au bromoxynil (" plantes HPPD + OXY") et
Co 17 avec 173 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double
tolérance à
l'isoxaflutole et au glyphosate ( "plantes HPPD + EPSPS").
Les trois lignées sont homozygotes vis à vis du gène concerné: en conséquence
la
descendance est hemizygote pour chacun des deux gènes introduits par
croisement.
Les plantes croisées sont obtenues au bout de six semaines.
Exemple 7' Mesure de la tolérance du tabac en traitement de postlevée avec
l'isoxaflutole et
de postlevée avec le bromoxvnil ou le glyphosate.
Dans cet essai, chaque test est effectué sur un échantillon de 10 plantes, 10
plantes étant
1~ gardées non traitées.
Tous les traitements sont effectués par pulvérisation à raison de 5001 de
bouillie par
hectare.
Pour le traitement en postlevée, on fait un semis puis on repique les plantes
en godets de
9cm x 9cm.
Les traitements de post levée sont faits à un stade bien développé (3-4
feuilles)Des lots de
plantes respectivement sauvage et génétiquement transformées obtenues ci-
dessus sont
répartis en plusieurs pans, avec:
a) un lot non traité,
b) d'autres lots qui sont traités respectivement avec un herbicide seul,
- de fisoxaflutole en post levée, à deux doses (respectivement 200 et 400
g/ha) ,
- du bromoxynil en post levée à deux doses (respectivement 400 et 800 g/ha)"
- du glyphosate en post levée à deux doses (respectivement 800 et 1200 glha),
c) d'autres lots qui sont traités respectivement avec deux herbicides, en post
Levée, en
mélange extemporané:
- de l'isoxaflutole et du bromoxynil à deux doses (respectivement 200/400 et
400/800
g/ha)
- de I'isoxaflutole et du glyphosate à deux doses (respectivement 200/800 et
400/1200 g/ha).
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Les traitements sont effectués avec les formulations suivantes: isoxaflutole à
75%, le
bromoxynil ( produit commercial PARDNER) sous forme octanoate en concentré
émulsionnable à ''25a /1 et le ~lyphosate (Round-UP)
Dans ces conditions, on observe 17 jours après le traitement les
phytotoxicités suivantes,
exprimées en pourcentage de destruction indiquées dans le tableau suivant,
ainsi que le
nombre de plantes par lot et les doses d'herbicide(s) exprimées en gramme de
matière active
par hectare:
Traitement de ~,ostlevée avec l'isoxaflutole
et de postlevée avec le bromoxynil ou le glyphosate
Herbicide Plantes
avec
gne
de tolrance
en /1
* HPPD * HPPD * SANS =
+
+ OXY EPSPS Sauvage
Contrles 10 10 10
isoxaflutoie200 20 4% 20 2% 10 75%
seul 400 20 5% 20 3% 85%
bromoxynil400 10 3% 10 0%
seul 800 10 0% ,: ., 10 0%
Glyphosate800 20 0% 10 100%
seul 1200 20 0% 10 100%
Isoxaflutole200 20 20% 10 100%
+ bromoxvnil400
Isoxaflutole400 20 30% 10 100%
+ bromox 800
nil
Isoxaflutole200 40 5% 10 100%
+ 1 hosate800
Isoxaflutole400 40 10% 10 100%
I + glyphosate1200
* nombre de plants
Exem lie 8
Dans le but d'étudier si le gène de fHPPD de Pseudomonas fluorescens peut être
utilisé
comme gène marqueur au cours du cycle "transformation - régénération" d'une
espèce
végétale, le tabac a été transformé avec le gène chimère composé du gène de
1'HPPD et du
gène EPSPS doublement muté de résistance au glyphosate et des plantes
transformées
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résistantes à la fois à l'isoxaflutole et au glyphosate ont été obtenues après
sélection sur
isoxatlutole.
Matériel et méthodes et résultats
~ Le gène chimérique pRP 2012 décrit ci-dessous est transféré dans du tabac
industriel PBD6
selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans
la demande
européenne EP n° 0 508 909.
Le gène chimère du vecteur pRP 2012 a la structure A-B suivante, dans
laquelle:
A est:
Promoteur doubleTEV OTP Rgion codante de Terminateur
l'HPPD nos
histone
st B est
Promoteur doubleTEV OTP Rgion codante de Terminateur
l'EPSPS nos
histone
comme celui utilisé dans le vecteur pRPA-RD-173
Le gène chimère pRP 2012 est introduit dans le tabac.
1 )Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'AgroBacterium EHA
101 (flood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komari et al,1986). La
technique de
transformation est basée sur la procédure de Horsh et al(1985).
2) Régénération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants
foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS)
comprenant 30g/1 de
saccharose ainsi que 350 mg/1 de cefotaxime et 1 mg/I d'isoxaflutole. Les
expiants foliaires
sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la
technique des disques
foliaires (Science 1985,Vo1 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la
première
comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de
saccharose
contenant O.OSmg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de
benzylaminopurine (BAP)
pendant 15 jours et 1 mg/1 d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours
de cette étape
sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de
saccharose et
1 mg/i d'isoxaflutole mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis
on prélève des
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pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement NIS à
teneur moitié en
sels, vitamines et sucres et 1 mg/1 d'isoxaflutole et ne contenant pas
d'hormone. Au bout
d'environ 15 jours. les pousses enracinées sont passées en terre.
Toutes les plantules obtenues selon ce protocole sont analysées par PCR avec
des
amorces spécifiques de l'HPPD de P.fluorescens. Cette analyse PCR a permis de
confirmer
que toutes les plantules ainsi obtenues ont bien intégré le gène de l'HPPD et
qu'elles sont
tolérantes à la fois à l'isoxaflutole et au glyphosate, dans les conditions
décrites à i'exemple7.
10 En conclusion, cet essai confirme que le gène de l'HPPD peut être utilisé
comme gène
marqueur et que, associé à ce gène, fisoxaflutole peut être un bon agent de
sélection.
Exemple9:Plante avec un Qène HPPD et un gène bar. résistant à la fois à
l'isoxaflutole et à
la phosphinothrvcine.
15 1. Construction d'un gène chimère avec une séquence HPPD:
Le plasmide pRPA-RD-1004 représenté à la figure 4 est obtenu par insertion du
gène
chimère de résistance aux isoxazoles dans le plasmide pUC 19 de 2686 pb,
commercialisé
par New Englamd Biolabs (Yannish-Perron, C.Viera, J. and Massing, J. (1985)
Gene 33,
103-119 et contenant la résistance à l'ampicilline.
20 Les différents éléments du gène chimère sont, dans le sens de la
traduction:
le promoteur histone H3C4 de maïs de 1020pb décrit dans la demande EP 0 507
698;
- l'intron du gène de l'alcool déshydrogénase 1 de maïs décrit par Sachs M et
al.
Genetics 113: 449-467 ( 1986) et constitué de 536pb
- le peptide de tansit optimisé (OTP) décrit dans la demande de brevet EP 0
508 909; cet
25 OTP est constitué des 171 pb du peptide de transit de la petite sous unité
de la Ribulose 1,5
bisphosphate carboxylase /oxygénase d'Helianthus annuus (Waksman G. et al
1987.
Nucleics acids Res. 15: 7181 ) suivies des 66 pb de la partie mature de la
petite sous unité de
la Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase /oxygénase de Zea mays (Lebrun et al
1987.
Nucleics acids Res. 15: 4360) elles mêmes suivies des 150 pb du peptide de
transit de la
petite sous unité de la Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/ oxygénase de
Zea mays
(Lebrun et al 1987. Nucleics acids Res. 15: 4360); L'ensemble fait donc 387
pb;
- la région codante de l'HPPD de Pseudomonas fluorescens décrite ci-dessus;
- le terminateur du gène de la nopaline synthase (nos) (zone de
polyadenylation du gène nos
isolé de pTi 37, 250 pb (Bevan M. et al. Nucleics Acids Res. 11: 369-385);
2. construction d'un gène chimère de tolérance à la phosphinothricine (gène
bar):
La phosphinathricine acetyl tranferase (PAT) codée par le gène bar est une
enzyme qui
inactive un herbicide, la phosphinothricine (PPT). La PPT inhibe la synthèse
de
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~lutamine et provoqie une accumulation rapide d'ammoniaque dans les cellus
conduisant
à leur mort (Tachibana et al. 1986) .
Le plasmide utilisé pour introduire la tolérance à la phosphinothricine comme
agent de
sélection est obtenu par insertion du gène chimère pDM 302 dans le vecteur
pSP72 de
?462 pb, commercialisé par Promega Corp. (Genbank/ DDBJ database accession
number
X65332) et contenant le gène de résistance à l'amplicilline.
Le plasmide pDM 302 de 4700pb a été décrit par Cao, J., et al. Plant Cell
Report 11:
X86-591 (1992).
Les différents élêments de ce plasmide sont:
- le promoteur du gène active de riz décrit par Mc filroy D. et al. Plant
Molecular Biology
15: 257-268 (1990) constitué de 840 pb;
- le premier exon du gène active de riz constitué de 80 pb;
- le premier intron du gène active de riz constitué de 450 pb;- la région
codante du gène bar
de 600 pb excisée du plasmide pIJ41404 décrit par White J. et al. Nuc. Acids
res. 18:
1862 ( 1990):
- le terminateur du gène de la nopaline synthase (nos) (zone de
polyadenylation du gène nos
isolé de pTi 37, 250 pb (Bevan M. et al. Nucleics Acids Res. 11: 369-385).
3. transformation:
La technique du bombardement est utilisée pour introduire la construction
génétique. Les
palsmides sont purifiés sur colonne Qiagen et coprécipités sur particules de
tungstène
M10 selonle procédé Klein (Nature 327: 70-73, 1987).
Une mixture de particules métalliques et des deux plasmides
décrits ci-dessus est ensuite bombardée sur des cellules
embryogènes de maïs selon 1e protocole décrit par Finer et
al. dans Plant Cell Reports 12: 84-88 (1993).
9. Régénération et utilisation du gène bar comme agent de
sélection:
Les cals bombardés sont sélectionnés sur glufosinate
jusqu'à l'apparit~'_on de secteurs verts. Les cals
positifs sont alors convertis en embryons somatiques
puis mis dans les conditions favorisant la germination.
IJes jeunes p.~_ant J.ont transférées en serre pour la
production de gra-~nes.
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26a
Les analyses moléculaires réalisées sur ces plantes
montrent que:
- au moins 4 cals sélectionnés sur phosphinothricine ont
engendré des plantes révélant la présence du gène de
l'HPPD par PCR;
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27
- au moins ~ cals sélectionnés sur phosphinothricine ont engendré des plantes
révélant ia
présence du gène de l'HPPD par Southern blot;
au moins 5 cals sélectionnés sur phosphinothricine ont engendré des plantes
révélant la
présence de la protéine recombinante par Western blot;
- le gène chimère de l'HPPD et la protéine hétérologue sont absents des cals
non
transformés.
Ces résultats montrent l'efficacité du gène chimère bar pour la sélection des
cals transformés
contenant un autre gène d'intérêt agronomique.
5. Analyse de la descendance des plantes transformées:
Les plantes transformées obtenues ci-dessus ont émis du pollen supposé en
partie
transgénique, qui a fécondé des ovules d'un maïs sauvage non transgénique. Les
graines
obtenues sont sélectionnées sur sable après traitement à l'isoxaflutole.
Le protocole de sélection est le suivant:
1 ~ 800m1 de sable de Fontainebleau sont placés dans une barquette de 15 x 20
cm de côtés.
Ces barquettes sont alors arrosées oar de l'eau ei maintenant hydratées par
apport d'une
solution nutritive constituée de Sml de Quinoligo (La Quinoléine) par litre
d'éau. Vingt
graines de maïs sont placées sur les barquettes, qui sont alors traitées à
l'isoxaflutole par
pulvérisation à raison de 100 à 200g de matière active par hectare (300 ou 600
pg de
matière active par barquette). Les barquettes sont ensuite placées en culture
en serre.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant:
Gnotypes Isoxaflutolenombre nombre nombre nombre
(g/ha) de de de de
graines plantes plantes plantes
semes germes mortes survivantes
non 0 20 20 0 20
transgnique
100 20 20 20 0
261 2B 459 100 10 10 5 5
200 10 9 4 5
261 2D2 100 10 9 6 3
200 10 10 7 3
261 2A2 100 10 5 3 2
200 10 7 7 p
CA 02261094 1999-O1-14
WO 98/02562 PCT/FR97/01256
28
Ces résultats montrent l'efficacité du gène de l'HPPD pour la sélection des
plantes résistantes
de maïs. Ils montrent aussi que la surexpression de l'HPPD de Pseudomonas dans
les
IlSSIIS de maîs leur confère la tolérance à fisoxallutole.
Les séquences illustrées sont les suivantes:
SEQ ID N° 1
Séquence du gène de fHPPD de Pseudomonas fluorescens A32.
SEQ ID N° 2
Séquence d' ADNc d'EPSPS d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID N° 3 et 4
séquences respectivement du gène et de la protéine de fEPSPS de mâis mutée,
partie
1340 pb du clone pRPA-ML-716
SEQ ID n° ~ et SEQ ID n° 6
séquences respectivement du gène et de la protéine de fEPSPS de mâis mutée,
partie
1340 pb du clone pRPA-ML-720
Les figures ci-après sont données à titre indicatif pour illustrer
l'invention.
La Figure 1 représente la séquence protéique de fHPPD de Pseudomonas sp.
strain P.J. 874
et la séquence nucléotidique théorique de la partie codante correspondante;
les cinq
oligonucléotides choisis pour faire l'amplification d'une partie de cette
région codante sont
symbolisés par les cinq flèches.
La Figure 2 représente la cartographie du plasmide avec le fragment d'ADN
génomique de 7
kb contenant le gène de fHPPD de P. fluorescens A32.
La Figure 3 donne la comparaison des séquences en acides aminés de l' HPPD de
P.
f luorescens A32 et de l'HPPD de Pseudomonas sp strain P.J. 874 (seuls les
acides aminés
divergents entre les deux séquences sont indiqués) ainsi que la séquence
consensus.
~
.. 2261094 . seq
t
(1) INFORMATIONS GENERALES:
LISTE DE SEQUENCES
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14/20 rue Pierre Baizet
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: F-69009
(ii) TITRE DE L' INVENTION: GENE CHIMERE A PLUSIEURS GENES DE
TOLERANCE HERBICIDE, CELLULE VEGETALE
ET PLANTE TOLERANTES A PLUSIEURS HERBICIDES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE:
(A) DESTINATAIRE: Robic
(B) RUE: 55 St-Jacques
(C) VILE: Montréal
(D) PROVINCE: QC
(E) PAYS: CANADA
(F) CODE POSTAL: H2Y 3X2
(G) TELEPHONE: 514-987-6242
(H) TELECOPIE: 514-845-7874
(v) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Disquette 3.5" / 1.44 MO
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Texte ASCII
(vi) DONNÉES RELATIVES Ä.LA DEMANDE ACTUELLE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: 2,261,094
(B) DATE DE DÉPÖT: 10 Juillet 1997
(vii) DONNÉES RELATIVES Ä LA DEMANDE ANTÉRIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: PCT/FR97/01256
(B) DATE DE DÉPÖT: 10 Juillet 1997
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1077 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
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2261094.seq
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTCGCG 60
TCGCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 120
ACCCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180
AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCC'rACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240
ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300
CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360
GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCc~ACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420
GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGc;AGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480
GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540
AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600
ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCG(iACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660
TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720
CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780
ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCACJACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 840
GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900
GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960
TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGC~GCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020
CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGAC(:AGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
( i ) CARACTERISTIQUES I)E LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 171.3 paires de bases
(B) TYPE: nucléot:ide
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2261094.seq
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGC'rATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60
ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120
CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCG'rCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180
TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240
AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300
AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTG'.rTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360
AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420
CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480
AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTG'.CCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540
TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600
AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCA(iCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660
CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGA'.CTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720
TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780
GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGCzTCAAA AATACAAGTC CCCTP.AP.AAT GCCTATGTTG 840
AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900
TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960
TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020
CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080
CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140
GAGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200
TAACCAAGCT GGGAGCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260
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2261094.seq
AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320
CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380
CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGC':CGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440
ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTC~ATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500
CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560
TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTG'L'GCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620
GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAAT'rACGTT TCAGTGAAAA 1680
AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC 1713
(2) INFORMATIONS POUR LA SIEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1340 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATIO:L~: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:6..1337
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile
20 25 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TC'.C GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala Leu Se:r Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CF,C TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu Asp Val Hi.s Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
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2261094.seq
50 55 60
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser Val Glu Ala As~g Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CC:~ GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
80 8.5 90
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GG:~. ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335
Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala
95 100 105 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AA'T GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly Gly As:n Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125
AGA ATG AGG GAG AGA CCC AT'T GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu Arg Pro Il~~ Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln
130 135 140
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TG'T TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala Asp Val Asp Cy~s Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 150 155
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 16.5 170
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TA~~ TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575
Gly Ser Ile Ser Ser Gln Ty:r Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro
175 180 185 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623
Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser
195 200 205
ATT CCG TAC GTC GAA ATG AC.A TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro Tyr Val Glu Met Th:r Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val
210 215 220
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AG~C TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser
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2261094.seq
240 24:5 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GC'T GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val
255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC AC~~ ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Th:r Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG AT~~ GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CC.A CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe G1~ Arg Lys His
305 310 31
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val As:n Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg
335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GT.A AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT TAA 1340
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
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2261094.seq
435 440
(2) INFORMATIONS POUR LA S:EQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUE~S DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 444 acides aminés
(B) TYPE: acide .aminé
(D) CONFIGURATIOI~T: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Pro Gly Se:r Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn
35 40 45
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu
50 55 60
Ser Val Glu Ala Asp Lys Al~a Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys
65 70 75 80
Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe
85 90 95
Leu Gly Asn Ala Gly Thr Al.a Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125
Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
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2261094.seq
180 185 190
Leu Gly Asp Val Glu Ile Gl,a Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro
195 200 205
Tyr Val Glu Met Thr Leu Arl~ Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 21.5 220
Glu His Ser Asp Ser Trp As~p Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Al,a Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255
Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Al,a Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
260 265 270
Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285
Val Leu Glu Met Met Gly Al.a Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr Gly Pro Pro Ar~~ Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys
305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met As:n Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr
385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
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. 2261094.seq
435 440
(2) INFORMATIONS POUR LA S:EQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES :DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1340 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATIO:~T: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:6..1337
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG .ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
1 5 10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile
15 20 25 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
50 55 60
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
g0 85 90
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACA GCA GCT 335
Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala
g5 100 105 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AA.T GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
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2261094.seq
Val Thr Ala Ala Gly Gly As:n Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125
AGA ATG AGG GAG AGA CCC AT'r GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu Arg Pro I1~~ Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln
130 135 140
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TG'r TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala Asp Val Asp Cy,s Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 150 155
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 165 170
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575
Gly Ser Ile Ser Ser Gln Ty:r Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro
175 180 185 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623
Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser
195 200 205
ATT CCG TAC GTC GAA ATG AC;?~ TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro Tyr Val Glu Met Th:r Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val
210 215 220
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AG~~ TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu His Ser Asp Se:r Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser
240 . 245 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GC'T GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Al.a Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val
255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
270 275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG AT~G GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CC.A CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
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. 2261094.seq
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val As:n Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 32.5 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CT~~ TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg
335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GT:~r AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Va.l Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CC~J GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG AT~G GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GT~G CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT TAA 1340
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 444 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly
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2261094.seq
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn
35 40 45
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu
50 55 60
Ser Val Glu Ala Asp Lys Al.a Ala Lys Arg Ala Val Val val Gly Cys
65 70 75 80
Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe
85 90 95
Leu Gly Asn Ala Gly Ile Al~a Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Asn Ala Th:r Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125
Arg Glu Arg Pro Ile Gly As:p Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Se:r Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
180 185 190
Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro
195 200 205
Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 215 220
Glu His Ser Asp Ser Trp As:p Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Al.a Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255
Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Al,a Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
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2261094.seq
260 265 270
Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285
Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr Gly Pro Pro Ar~_~ Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys
305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Al,a Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr
385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Se:r Thr Phe Val Lys Asn
435 440
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