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Patent 2486911 Summary

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Claims and Abstract availability

Any discrepancies in the text and image of the Claims and Abstract are due to differing posting times. Text of the Claims and Abstract are posted:

  • At the time the application is open to public inspection;
  • At the time of issue of the patent (grant).
(12) Patent Application: (11) CA 2486911
(54) English Title: METHOD OF SCREENING GROUPS OF RADIOACTIVE MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
(54) French Title: METHODE DE CRIBLAGE DE BANQUES DE MOLECULES RADIOACTIVES ET SES APPLICATIONS
Status: Dead
Bibliographic Data
(51) International Patent Classification (IPC):
  • G01N 33/50 (2006.01)
  • C07K 5/10 (2006.01)
(72) Inventors :
  • DIVE, VINCENT (France)
  • MENEZ, ANDRE (France)
  • STOCKLIN, RETO (Switzerland)
  • TAVITIAN, BERTRAND (France)
  • BEAU, FABRICE (France)
  • CZARNY, BERTRAND (France)
  • COTTON, JOEL (France)
(73) Owners :
  • COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE (France)
(71) Applicants :
  • COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE (France)
(74) Agent: ROBIC
(74) Associate agent:
(45) Issued:
(86) PCT Filing Date: 2003-05-28
(87) Open to Public Inspection: 2003-12-11
Availability of licence: N/A
(25) Language of filing: French

Patent Cooperation Treaty (PCT): Yes
(86) PCT Filing Number: PCT/FR2003/001630
(87) International Publication Number: WO2003/102579
(85) National Entry: 2004-11-22

(30) Application Priority Data:
Application No. Country/Territory Date
02/06698 France 2002-05-31
03/00645 France 2003-01-22

Abstracts

English Abstract

The invention relates to an amplification-free method of screening groups of radioactive molecules, the products from the molecule groups obtained and the application thereof in order to identify molecules that are capable of binding selectively to a tissue or a particular organ. The inventive method can be used for the development of novel therapeutic compounds and contrast agents for medical imaging and for the screening of medicaments. Said method of screening a group of molecules is characterised in that it comprises at least the following steps: (1) the group of molecules is administered to at least one animal, each molecule being marked first by a suitable radioactive isotope; (2) at least one of the animals is slaughtered and the tissue distribution of the radioactivity of the molecules administered is analysed from sections of tissue or organs taken using suitable imaging devices; (3) sections of tissue or organs in which a radioactivity signal is detected are selected; (4) radioactive fractions from the aforementioned sections of tissue or organs selected during step 3 are isolated using suitable techniques such as chromatography and/or extraction techniques; and (5) the molecule(s) from the radioactive fractions obtained in step 4 are characterised using suitable analysis techniques such as chromatography and/or mass spectrometry. According to one variation of the method, in step 2, where possible, the tissue distribution of the radioactivity of the molecules administered is analysed in vivo using suitable imaging devices from a biological sample which is pre-extracted and selected from the group containing cells and sections of tissue or organs. As a result, said variation does not require the animal to be slaughtered.


French Abstract




Procédé de criblage, sans amplification, de banques de molécules radioactives,
produits des banques de molécules obtenues ainsi qu'application du procédé à
l'identification de molécules capables de se fixer sélectivement à un tissu ou
à un organe particulier, utiles au développement de nouveaux composés
thérapeutiques, d'agents de contraste pour l'imagerie médicale et au ciblage
de médicaments. Le procédé de criblage d'une banque de molécules est
caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: (1)
l'administration, à au moins un animal, de ladite banque de molécules, dont
chaque molécule est préalablement marquée, par un isotope radioactif
convenable, (2) le sacrifice d'au moins l'un des animaux et l'analyse de la
distribution tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, à
partir de coupes de tissus ou d'organes prélevés, à l'aide d'imageurs
convenables, (3) la sélection de coupes de tissus ou d'organes dans
le(s)quel(s) un signal de radioactivité est détecté, (4) l'isolement, à partir
desdites coupes de tissus ou d'organes, sélectionnées à l'étape (3) de
fractions radioactives, par des techniques convenables, telles que des
techniques d'extraction et/ou de chromatographie et (5) la caractérisation à
partir des fractions radioactives obtenues à l'étape (4) de ladite ou desdites
molécules, par des techniques d'analyse convenables, telles que la
chromatographe et/ou la spectrométrie de masse. En variante, quand cela est
possible, l'étape (2) comprend l'analyse de la distribution tissulaire de la
radioactivité des molécules administrées, à l'aide d'imageurs convenables, in
vitro, à partir d'un échantillon biologique préalablement extrait et
sélectionné dans le groupe constitué par des cellules et des coupes de tissus
ou d'organes. Cette variante ne nécessite donc pas le sacrifice de l'animal.

Claims

Note: Claims are shown in the official language in which they were submitted.



38
REVENDICATIONS
1°) Procédé de criblage d'une banque de molécules, caractérisé en
ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
(1) l'administration, à au moins un animal, de ladite banque de
molécules, dont chaque molécule est préalablement marquée, par un isotope
radioactif
convenable,
(2) le sacrifice d'au moins l'un des animaux et l'analyse de la distri-
bution tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, à partir de
coupes de
tissus ou d'organes prélevés, à l'aide d'imageurs convenables,
(3) la sélection de coupes de tissus ou d'organes dans le(s)quel(s) un
signal de radioactivité est détecté,
(4) l'isolement, à partir desdites coupes de tissus ou d'organes,
sélectionnées à l'étape (3) de fractions radioactives, par des techniques
convenables,
telles que des techniques d'extraction et/ou de chromatographie et
(5) la caractérisation à partir des fractions radioactives obtenues à
l'étape (4) de ladite ou desdites molécules, par des techniques d'analyse
convenables,
telles que la chromatographe et/ou la spectrométrie de masse.
2~) Procédé de criblage d'une banque de molécules, caractérisé en
ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
(1) l'administration, à au moins un animal, de ladite banque de
molécules, dont chaque molécule est préalablement marquée, par un isotope
radioactif
convenable,
(2) l'analyse de la distribution tissulaire de la radioactivité des
molécules administrées, à l'aide d'imageurs convenables, in vitro, à partir
d'un
échantillon biologique préalablement extrait et sélectionné dans le groupe
constitué
par des cellules et des coupes de tissus ou d'organes,
(3) la sélection des cellules ou des coupes de tissus ou d'organes
dans le(s)quel(s) un signal de radioactivité est détecté,
(4) l'isolement, à partir desdites cellules ou desdites coupes de tissus
ou d'organes, sélectionnées à l'étape (3) de fractions radioactives, par des
techniques
convenables, telles que des techniques d'extraction et/ou de chromatographie
et
(5) la caractérisation à partir des fractions radioactives obtenues à
l'étape (4) de ladite ou desdites molécules, par des techniques d'analyse
convenables,
telles que la chromatographe et/ou la spectrométrie de masse.


39
3~) Méthode d'identification et d'étude de molécules cibles
s'exprimant sélectivement dans un organe ou un tissu à l'aide d'une banque de
molécules, qui comprend
(1) l'administration, à au moins un animal, de ladite banque de
molécules, dont chaque molécule est préalablement marquée, par un isotope
radioactif
convenable,
(2) le sacrifice d'au moins l'un des animaux et l'analyse de la distri-
bution tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, par
prélèvement et
analyse de coupes de différents tissus de l'animal, à l'aide d'imageurs
convenables,
(3) la sélection de coupes de tissus ou d'organes dans le(s)quel(s)
une radioactivité est détectée,
(4) l'isolement, à partir desdites coupes de tissus ou d'organes,
sélectionnés à l'étape (3) de fractions radioactives, par des techniques
convenables,
telles que des techniques d'extraction et/ou de chromatographie,
(5) la caractérisation à partir des fractions radioactives obtenues à
l'étape (4) de ladite ou desdites molécules, par des techniques d'analyse
convenables,
telles que la chromatographie et/ou la spectrométrie de masse,
(6) la mise en contact de la ou des molécules obtenues à l'étape (5)
avec un échantillon d'organe ou de tissu sélectionné et prélevé, conformément
à
l'étape (2), dans des conditions permettant la liaison entre la molécule
isolée à l'étape
(4) et la molécule cible et la formation d'un complexe et
(7) l'isolement de ladite molécule cible à partir dudit complexe.
4~) Méthode d'identification et d'étude de molécules cibles (ou
récepteurs) s'exprimant sélectivement dans un organe ou un tissu à l'aide
d'une
banque de molécules, qui comprend:
(1) l'administration, à au moins un animal, de ladite banque de
molécules, dont chaque molécule est préalablement marquée, par remplacement
d'un
atome présent dans ladite molécule par l'un de ses isotopes radioactifs,
(2) l'analyse de la distribution tissulaire de la radioactivité des
molécules administrées, à l'aide d'imageurs convenables, in vitro, à partir
d'un
échantillon biologique préalablement extrait et sélectionné dans le groupe
constitué
par des cellules et des coupes de tissus ou d'organes,
(3) la sélection de cellules ou de coupes de tissus ou d'organes dans
le(s)quel(s) une radioactivité est détectée,


40
(4) l'isolement, à partir desdites cellules ou desdites coupes de tissus
ou d'organes, sélectionnés à l'étape (3) de fractions radioactives, par des
techniques
convenables, telles que des techniques d'extraction et/ou de chromatographie,
(5) la caractérisation à partir des fractions radioactives obtenues à
l'étape (4) de ladite ou desdites molécules, par des techniques d'analyse
convenables,
telles que la chromatographie et/ou la spectrométrie de masse,
(6) la mise en contact de la ou des molécules obtenues à l'étape (5)
avec un échantillon de cellule, d'organe ou de tissu sélectionné et prélevé,
confor-
mément à l'étape (2), dans des conditions permettant la liaison entre la
molécule
isolée à l'étape (4) et la molécule cible et la formation d'un complexe et
(7) l'isolement de ladite molécule cible à partir dudit complexe.
5~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,
caractérisé en ce qu'au cours de l'étape (1), la banque de molécules
radioactives est
injectée à l'animal, de préférence par voie intra-péritonéale (I.P.) ou voie
intra-
veineuse (I.V.).
6~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caracté-
risé en ce que préalablement à l'étape (2), ledit procédé comprend une étape
(l')
d'analyse de la distribution tissulaire de la radioactivité des molécules
administrées, en
soumettant au moins l'un des animaux, à une imagerie externe, notamment au
moyen
d'appareils de détection incorporant des caméras adaptées à détecter la nature
des
particules émises par l'isotope radioactif sélectionné.
7~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,
caractérisé en ce que les isotopes radioactifs sont sélectionnés dans le
groupe constitué
par le tritium (3 H), le carbone 14 (14 C), le carbone 11 (11C), l'iode 131
(131 I), l'iode
125 (125 I), l'iode 124 (124I), l'iode 123 (1323I), le phosphore 32 (32 P), le
fluor 18
(18 F), le soufre 35 (35 S), le technétium 99 (99 m Tc), l'indium 113 (113
In), le cuivre 64
(64 Cu), le brome 76 (76 Br), l'azote 13 (13 N) et l'oxygène 15 (15 O).
8~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7,
caractérisé en ce qu'à l'étape (2), la distribution tissulaire de la
radioactivité est révé-
lée au moyen d'appareils de détection incorporant des imageurs adaptés à
détecter la
nature des particules émises par l'isotope radioactif sélectionné.
9~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8,
caractérisé en ce que les molécules radioactives sont injectées sous forme de
mélange.
10~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9,
caractérisé en ce que préalablement à l'étape (1), ladite banque de molécules
mar-
quées est préparée par:


41
- synthèse d'un mélange desdites molécules par voie chimique ou
enzymatique et
- marquage desdites molécules par lesdits isotopes radioactifs.
11°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,
caractérisé en ce que les étapes (1) à (5) sont réalisées simultanément sur
plusieurs
animaux pour lesquels, les quantités administrées à l'étape (1) sont
différentes et où
l'analyse de la distribution de la radioactivité des molécules selon l'étape
(2) est réali-
sée à des moments différents selon l'animal.
12°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11,
caractérisé en ce que l'isolement de la ou des molécules radioactives
associée(s)
au(x)dit(s) organes selon l'étape (4) est effectué, conformément aux étapes
suivantes:
- prélèvement des tissus ou organes dans lesquels une radioactivité a
été détectée,
- broyage desdits tissus ou organes dans un tampon convenable
- centrifugation de chaque broyat et récupération de la solution
- filtration de la solution
- ajustement du pH et
- séparation par fractions et récupération des fractions radioactives.
13°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12,
caractérisé en ce qu'à l'étape (5), l'analyse par spectrométrie de masse est
associée à
une analyse de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
14°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,
caractérisé en ce que les molécules de la banque selon l'étape (1) présentent
la
formule générale suivante : propyl-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-
NH2.,
dans laquelle Yaa et Yaa' représentent des positions dans lesquelles figurent
les 20
acides aminés naturels.
15°) Kit pour la mise en oeuvre dudit procédé selon l'une quel-
conque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend:
- au moins une banque de molécules, dont chaque molécule est
préalablement marquée par un isotope radioactif convenable,
- des moyens de détection des produits radiomarqués et
- des moyens d'analyse des produits radiomarqués détectés.
16°) Produit, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la reven-
dication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il correspond au
peptide de
formule suivante : propyl-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala NH2.


42
17°) Peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est
marqué à l'aide d'un isotope radioactif.
18°) Vecteur de ciblage d'une molécule d'intérêt vers un site spéci-
fique, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule sélectionnée à l'aide du
procédé
de criblage d'une banque de molécules selon l'une quelconque des
revendications 1 à
14 et dont la distribution tissulaire vers ledit site spécifique a été
identifiée par ce
procédé.
19°) Vecteur de ciblage selon la revendication 18, caractérisé en ce
que ladite molécule est le peptide propyl-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2 selon
la
revendication 16.
20°) Composition site-spécifique, caractérisée en ce qu'elle
comprend (i) une molécule d'intérêt à cibler vers ledit site, couplée à une
molécule
spécifique dudit site, dont la distribution tissulaire a été identifiée à
l'aide du procédé
de criblage d'une banque de molécules selon l'une quelconque des
revendications 1 à
14 et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
21°) Composition selon la revendication 20, caractérisé en ce que
ladite molécule spécifique dudit site est le peptide propyl-NH-Arg-Phe(PO2-
CH2)Leu-
Ala-NH2 selon la revendication 16.
22°) Utilisation des molécules marquées, sélectionnées à l'aide du
procédé de criblage d'une banque de molécules, selon l'une quelconque des
reven-
dications 1 à 14 pour la préparation d'une composition destinée à être
utilisée en ima-
gerie médicale.
23°) Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que
ladite molécule marquée est le peptide selon la revendication 17.
24°) Utilisation selon la revendication 22 ou la revendication 23,
caractérisée en ce que ladite molécule marquée est associée à un agent de
contraste
convenable.
25°) Procédé d'identification d'au moins une cible d'une molécule
d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend au moins:
(1) le couplage de la molécule d'intérêt avec une molécule
radiomarquée, spécifique de ladite cible, sélectionnée à l'aide du procédé de
criblage
d'une banque de molécules, selon l'une quelconque des revendications 1 à 14,
pour
obtenir un conjugué radioactif,
(2) l'administration, à au moins un animal, du conjugué obtenu à
l'étape (1) et




43

(3) l'analyse, in vitro, à partir d'un échantillon biologique, de la
liaison d'au moins une cible dudit échantillon biologique avec la molécule
d'intérêt
couplée à ladite molécule radiomarquée.

26~) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ladite
molécule marquée est le peptide selon la revendication 17.

27~) Procédé de criblage in vivo par compétition, de molécules non
marquées, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend
(1) l'administration d'une molécule marquée dont la distribution
tissulaire a été identifiée à l'aide du procédé de criblage d'une banque de
molécules,
selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, à au moins un animal,
(2) une première analyse de la distribution tissulaire de la molécule
radioactive administrée à l'étape (1), en soumettant au moins l'un des
animaux, à une
imagerie externe, notamment au moyen d'appareils de détection incorporant des
caméras adaptées à détecter la nature des particules émises par l'isotope
radioactif
sélectionné,
(3) l'administration d'une banque de molécules non marquées,
(4) une deuxième analyse de la distribution tissulaire de la molécule
radioactive, en soumettant au moins l'un des animaux, à une imagerie externe,
notamment au moyen d'appareils de détection incorporant des caméras adaptées à
détecter la nature des particules émises par l'isotope radioactif sélectionné,
(5) l'établissement de la cinétique de déplacement de la molécule
marquée par au moins l'une des molécules non marquées, par comparaison avec la
première analyse de distribution de la molécule radioactive et
(6) la détection d'au moins une molécule non marquée ayant déplacé
la cinétique de la molécule radiomarquée, par fractionnements itératifs et
caractérisation de ladite molécule par des techniques d'analyse convenables,
telles que
la chromatographie et/ou la spectrométrie de masse.

28~) Procédé de criblage in vivo par compétition, de molécules non
marquées, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend
(1) l'administration d'une molécule marquée dont la distribution
tissulaire a été identifiée à l'aide du procédé de criblage d'une banque de
molécules,
selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, à au moins un animal,
(2) une première analyse de la distribution tissulaire de la molécule
radioactive administrée à l'étape (1), à l'aide d'imageurs convenables, in
vitro, à partir
d'un échantillon biologique préalablement extrait et sélectionné dans le
groupe
constitué par des cellules et des coupes de tissus ou d'organes,


44

(3) l'administration d'une banque de molécules non marquées,
(4) une deuxième analyse de la distribution tissulaire de la molécule
radioactive, à l'aide d'imageurs convenables, in vitro, à partir d'un
échantillon
biologique préalablement extrait et sélectionné dans le groupe constitué par
des cellu-
les et des coupes de tissus ou d'organes,
(5) l'établissement de la cinétique de déplacement de la molécule
marquée par au moins l'une des molécules non marquées, par comparaison avec la
première analyse de distribution de la molécule radioactive et
(6) la détection d'au moins une molécule non marquée ayant déplacé
la cinétique de la molécule radiomarquée, par fractionnements itératifs et
caractérisation de ladite molécule par des techniques d'analyse convenables,
telles que
la chromatographie et/ou la spectrométrie de masse.

29~) Procédé selon la revendication 27 ou la revendication 28,
caractérisé en ce que la molécule marquée selon l'étape (1) est le peptide
selon la
revendication 17.

30~) Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend au moins le
peptide propyl-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2 selon la revendication 16 et au
moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

31~) Utilisation du peptide propyl-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-
NH2 selon la revendication 16, pour la préparation d'un médicament anti-
hyperten-
seur.

Description

Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.




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WO 03/102579 PCT/FR03/01630
METHODE DE CRIBLAGE DE BANQUES DE MOLECULES
RADIOACTIVES ET SES APPLICATIONS
La présente invention est relative à un procédé de criblage, sans
amplification, de banques de molécules diverses radioactives, aux produits des
banques de molécules obtenues ainsi qu'à l'application du procédé à
l'identification
de molécules capables de se fixer sélectivement à un tissu ou à un organe
particulier,
utiles au développement de nouveaux composés thérapeutiques, d'agents de
contraste
pour l'imagerie médicale et au ciblage de médicaments.
Dans le cadre de la mise au point de nouveaux médicaments, les
composés obtenus par synthèse chimique ou bien issus du règne vivant
(substances
naturelles), sont habituellement évalués dans des tests in vitro. Ces cribles
ont pour
principales fonctions d'identifier des composés capables d'interagir à haute
affinité
avec toutes cibles d'intérêt thérapeutique (récepteurs, enzymes, etc) ou bien
d'isoler
des composés peu actifs, mais qui entreront dans des programmes
d'optimisation.
Alors que ces cribles permettent de repérer des milliers de composés très
originaux,
seule une infime fraction de ceux-ci fera l'objet d'études chez l'animal,
étape
incontournable pour aboutir à des produits utiles en santé humaine. L'absence
de prise
en compte dans tous ces tests de criblage in vitro des paramètres essentiels
pour le
devenir d'une substance testée chez l'animal, telles que la stabilité
métabolique, les
propriétés de distribution tissulaire et d'élimination, explique en grande
partie les
échecs de cette stratégie. La recherche d'une meilleure efficacité dans le
développe-
ment de substances utiles en santé humaine nécessite la mise au point de
nouveaux
procédés de criblage.
Des méthodes de criblage, comprenant une étape de sélection in
vivo, ont été décrites. Par exemple, R. PASQUALINI et al. (Nature, 1996, 380,
364-
366) décrivent l'injection à des souris, de banques de peptides générés par
pliage
display ou exposition sur pliage ; à l'aide de cette technique, les Auteurs de
cet article
ont montré que l'on pouvait identifier des ligands se fixant spécifiquement à
certains
organes, après amplification préalable. Toutefois, le succès de cette approche
dépend
essentiellement de la possibilité de ré-amplifier les quelques pliages qui
sont retenus in
vivo, afin d'avoir accès aux séquences peptidiques présentées par les
protéines des
pliages sélectionnés in vivo.
La méthode décrite dans ce document devrait, selon ses Auteurs,
être applicable à des banques basées sur des principes différents de celui du
pliage
display ; dans ce cas, la seule exigence est la capacité à identifier le
composé dans le



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tissu après sa liaison ; toutefois, PASQUALINI et al. précisent, que pour
cribler des
molécules chimiques, la présence d'une étiquette (tag), permettant une étape
d'amplification, telle qu'une séquence d'acide nucléique, est indispensable.
La technique définie dans l'article R. PASQUALINI et al. (Nature,
S 1996, précité) permet ainsi de sélectionner des peptides aptes à se lier de
manière spé
cifique à des tumeurs ; par exemple, lorsque de tels peptides sont couplés à
de la
doxorubicine, ils augmentent l'efficacité de cette drogue vis-à-vis des
tumeurs et
réduisent en outre sa toxicité. Une telle application est notamment décrite
dans
l'article au nom de W. Arap et al. (Science, 1998, 279, 377-380).
Dans la Demande Internationale PCT WO 97/10507, au nom de La
Jolla Cancer Research Foundation, les Inventeurs E. RUOSLAHTI et R.
PASQUALINI, décrivent une méthode d'obtention d'une molécule apte à se diriger
spécifiquement vers un organe ou un tissu sélectionné, laquelle méthode
comprend les
étapes suivantes
1 S - administration à un sujet d'une banque de phages
- recueil ou récupération d'un échantillon de l'organe ou du tissu
sélectionné
- amplification des phages, et
- identification d'une molécule apte à atteindre l'organe ou le tissu
sélectionné.
Il est précisé que lesdites molécules diverses peuvent être liées à une
étiquette, telle qu'un support.
Dans le contexte de cette Demande Internationale PCT
. Le terme « banque » signifie une collection de molécules, telles
que des molécules organiques, des peptides, des protéines, des acides
nucléiques.
. L'étiquette attachée aux molécules constituant la banque, peut être
une étiquette commune à plusieurs molécules ou une étiquette spécifique. Les
éti
quettes décrites dans cette Demande sont notamment : des microbilles de
plastique,
des oligonucléotides, des bactériophages ou des molécules telles que la
biotine ou
l' hémaglutinine.
L'identification des molécules qui atteignent leur organe cible peut
être, par exemple, réalisée par spectrométrie de masse, seule ou en
combinaison avec
une chromatographie en phase gazeuse ; une chromatographie liquide haute per-
formance peut également être effectuée sur l'organe cible ou des méthodes
d'extraction sélective peuvent être utilisées.



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3
A titre d'exemple, il est précisé que lorsque la banque comprend une
population de molécules chimiques organiques qui sont liées à des étiquettes
spéci-
fiques constituées par des oligonucléotides, identifiables par PCR, il est
préférable
d'éliminer de l'échantillon l'ADN génomique, pour réduire les PCR « parasites
».
Il est également précisé que, de manière générale, suffisamment de
pliages atteignent l'organe cible, ce qui permet effectivement leur
identification après
amplification, puis identification de la séquence peptidique.
De manière plus précise, les exemples concernent le criblage d'une
banque de pliages portant des peptides et l'identiFcation des peptides qui
atteignent le
cerveau, le rein ou une tumeur.
Toutefois, le procédé décrit par l'équipe de E. RUOSLAHTI est
essentiellement limité aux peptides et présente de nombreux inconvénients.
En particulier
- la présentation de peptides à la surface des pliages impose des
contraintes stériques et confonnationnelles altérant nécessairement les
interactions
entre les séquences peptidiques présentées et la cible potentielle. De plus,
la faible
capacité des pliages à pouvoir diffuser dans différents tissus, mais aussi
l'existence
des mécanismes d'élimination in vivo dirigés contre ce genre de particules,
constitue
des limitations importantes de l'approche pliage display (exposition sur
pliage) ;
- ce sont des pliages qui sont identifiés à l'étape de criblage in vivo.
Cependant, la fixation d'un pliage ne garantit pas que le peptide, ayant la
séquence
portée par le pliage, conservera les propriétés de distribution du pliage.
Cette situation
est d'autant plus probable si l'on considère la différence de taille entre le
pliage et le
peptide seul. Ainsi, dans la pratique, alors qu'un grand nombre de pliages
peut être
identifié par le crible, il n'est pas garanti qu'un seul peptide possédera les
propriétés
de distribution du pliage ;
- après extraction des pliages, ceux-ci doivent être re-amplifiés par
transfection de bactéries ; cette contrainte introduit une étape
supplémentaire dans le
procédé ;
- les pliages générant de nombreuses interactions non-spécifiques, le
procédé décrit par le groupe de E. RUOSLAHTI doit inclure plusieurs étapes de
sélection in vivo (en général trois étapes) ; ceci rend le procédé très lourd
à mettre en
oeuvre et a l'inconvénient que le criblage in vivo implique l'utilisation
d'animaux
différents et donc une variabilité pouvant introduire des biais importants ;



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- ce procédé ne permet pas de prendre en compte le métabolisme et
les données pharmacocinétiques (distribution et élimination) des composés, car
l'étape
de criblage in vivo s'effectue sur les phages et non sur les composés eux-
mêmes ;
- ce procédé détermine la sélectivité de la distribution tissulaire du
phage sélectionné et non pas du peptide lui-même ; ceci est dû au fait que le
groupe de
E. RUOSLAHTI utilise des anticorps reconnaissant les phages pour établir la
distri
bution tissulaire de ceux-ci ; il n'y a pas d'autres moyens pour suivre la
distribution
tissulaire des peptides.
En conséquence, eu égard à ces inconvénients, le procédé décrit par
le groupe de E. RUOSLAHTI présente un intérêt limité dans le domaine du
dévelop-
pement de molécules utiles en santé humaine.
D'autres méthodes, mettant également en oeuvre une étape in vivo,
ont également été proposées
- le Brevet US 5,770,455 décrit un procédé de synthèse d'une ban-
que de produits, obtenue par chimie combinatoire. Il est précisé que ces
méthodes
constituent un outil puissant pour trouver rapidement de nouveaux ligands.
Plusieurs stratégies de synthèse par chimie combinatoire sont décri-
tes (stratégies « spatially-adressable o, stratégies « split-bead o et
stratégies recombi-
nantes) et diffèrent par les conditions de synthèse : forme des tubes de
réaction, type
de polymère, contrôle des constantes physiques (temps, température, traitement
en
phase solide ou en phase liquide, type de mélange et méthode de détermination
de la
structure des différents membres de la banque).
Les étiquettes proposées dans ce document sont spécifiques pour
chaque produit (« identifier tag »).
Il s'agit donc d'une méthode qui a l'inconvénient majeur d'être
lourde à mettre en oeuvre.
- la Demande Internationale PCT WO 99/56789 décrit la sélection
d'agents de contraste à partir d'une banque obtenue par chimie combinatoire ;
de
manière plus précise, chaque produit de la banque comprend un marqueur
détectable ;
il est précisé que ne sont identifiés in vivo que les marqueurs ayant le
profil de distri-
bution ou le profil d'élimination souhaité. Les marqueurs doivent pouvoir être
détectés
sans prélèvement d'échantillon et sans nécessiter le sacrifice de l'animal ;
les mar-
queurs appropriés sont notamment des chromophores, des atomes lourds, des
étiquet-
tes radioactives et des particules magnétiques ; toutefois, la banque de
molécules doit
contenir une pluralité de marqueurs qui doivent pouvoir être distingués entre
eux.
Malgré cette préconisation, cette Demande Internationale PCT WO 99/56789 admet
3
A titre d'exemple, il est précis



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qu'il s'agit d'une situation idéale, difficile à obtenir ; il est en
particulier reconnu que
le rapport : différents membres de la banque:différents marqueurs doit être
idéalement
de 1:1, mais peut être aussi bas que 10000:1, avec des rapports compris entre
I:I et
1:1000, 1:1 et 1:200, l:l et I:50 et 1:1 et 1:25. Dans de tels cas, c'est-à-
dire lorsque
S les différents membres de la banque n'ont pas chacun une étiquette unique,
des tech-
niques de détection indirecte des marqueurs sont proposées pour identifier les
mem-
bres de la banque qui répondent aux profils recherchés. Par ailleurs, dans
cette
Demande, il est, de préférence, préconisé de détecter les marqueurs dans un
fluide
biologique (sang, urine, liquide cérébro-spinal, bile etc...) ; dans ce
contexte, le mar-
queur sera de préférence capable d'être amplifié (oligonucléotide, phage), ce
qui
implique qu'il vaut mieux que chaque membre de la banque soit étiqueté de
manière
unique ; on en revient donc aux techniques exposées ci-dessus et à leurs
inconvé-
nients. Dans cette Demande, la technique décrite n'est effectivement
applicable qu'en
cas d'étiquetage unique avec amplification ou bien en utilisant des techniques
de
1 S détection indirecte, par le biais de liaisons spécifiques à des
récepteurs.
Dans l'ensemble des techniques antérieurement décrites, les compo-
sés à cribler sont couplés avec une étiquette permettant leur identification
ultérieure ;
cependant, la présence de telles étiquettes peut empêcher, par encombrement
stérique,
l'interaction du composé à cribler avec sa cible.
En conséquence, la Demanderesse s'est donnée pour but de pourvoir
à un procédé qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les procédés de
l'Art
antérieur, notamment en ce qu'il permet
- de sélectionner, à partir d'un mélange pouvant contenir plusieurs
milliers de composés, les molécules capables de cibler un tissu ou un organe
chez
l'animal vivant, par analyse directe de la distribution tissulaire des
composés à cribler
eux-mêmes et
- d'identifier des molécules, douées de propriétés particulières, en
vue de leur utilisation en imagerie médicale ou bien à des fins
thérapeutiques.
Selon la banque de molécules étudiée, on parlera de banque de
molécules diverses (obtenues par chimie combinatoire, par exemple) ou banque
de
biomolécules (dans le cas de banques de peptides, par exemple).
De manière plus précise, la présente invention a pour objet un
procédé de criblage d'une banque de molécules, qui comprend
(1) l'administration, à au moins un animal, de ladite banque de
molécules, dont chaque molécule est préalablement marquée, notamment, mais non



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exclusivement par remplacement d'un atome présent dans ladite molécule par
l'un de
ses isotopes radioactifs,
(2) le sacrifice d'au moins l'un des animaux et l'analyse de la distri-
bubon tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, à partir de
coupes de
tissus ou d'organes prélevés, à l'aide d'imageurs ou radio imageurs
convenables ; les
radio imageurs utilisés sont notamment des (3-imageurs, sélectionnés en
fonction de
l'atome radioactif à détecter. Par exemple, on peut utiliser des (3-imageurs
qui
permettent la détection de produits radio marqués, émetteurs de particules (3-
(3H, '4C,
32p~ ssS~ ~zsl~ 99Tc) ou émetteurs de particules (3+ (~gF) présents sur
lesdites coupes de
tissus ou d'organes,
(3) la sélection de coupes de tissus ou d'organes dans le(s)quel(s) un
signal de radioactivité est détecté,
(4) l'isolement, à partir desdites coupes de tissus ou d'organes,
sélectionnées à l'étape (3) de fractions radioactives, par des techniques
convenables,
tells que des techniques d'extraction et/ou de chromatographie et
(5) la caractérisation à partir des fractions radioactives obtenues à
l'étape (4) de ladite ou desdites molécules, par des techniques d'analyse
convenables,
telles que la chromatographe et/ou la spectrométrie de masse.
En variante, quand cela est possible, l'étape (2) comprend
l'analyse,de la distribution tissulaire de la radioactivité des molécules
préalablement
administrées à au moins un animal, à l'aide d'imageurs convenables, in vitro,
à partir
d'un échantillon biologique préalablement extrait et sélectionné dans le
groupe
constitué par des cellules et des coupes de tissus ou d'organes. Cette
variante ne
nécessite donc pas le sacrifice de l'animal ; elle est ainsi aussi adaptée à
une utilisation
chez l'homme, dans des conditions qui s'y prêtent.
Au sens de la présente invention, le terme animal, inclut,
conformément aux classifications admises, aussi bien les animaux non humains
que
l'homme.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de criblage
selon l'invention, préalablement à l'étape (2), ledit procédé comprend une
étape (l')
d'analyse de la distribution tissulaire de la radioactivité des molécules
administrées, en
soumettant au moins l'un des animaux, à une imagerie externe, notamment au
moyen
d'appareils de détection incorporant des caméras adaptées à détecter la nature
des
particules émises par l'isotope radioactif sélectionné ('8F, 11C, ~Cu, z6Br,
1241, ~3N,
~s0 : tomographe à émission de positons, PET ; 99mTc, ~z3I : gamma-caméra).



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Le criblage in vivo de banques de composés radio marqués au tritium
impose de sacrifier les animaux ; en effet, la détection des électrons (3 du
noyau tritium
ne peut être réalisée qu'à partir de coupes de tissus, car au-delà de quelques
gym, ces
électrons ne sont plus détectables ; ceci explique que l'étape (l') ne peut
être mise en
oeuvre que pour certains atomes radioactifs.
Au cours de l'étape (1) du procédé selon l'invention, chaque banque
ou librairie de molécules radioactives est injectée, à un ou plusieurs
animaux, de
préférence par voie intra-péritonéale (LP.) ou voie intra-veineuse (LV.) ; la
capacité
des différentes molécules à cibler un tissu ou un organe est alors révélée par
détection
de la radioactivité au niveau des différents organes ou tissus [étapes (l') et
(2)]. Les
modalités de détection dépendent de la nature de l'atome radioactif choisi
pour
effectuer le radiomarquage des molécules, en particulier de la nature du
rayonnement
émis par le traceur radioactif. Le moment où s'effectue l'observation est un
paramètre
variable.
L'étape (l') présente de nombreux avantages
- elle permet de faire un test sur l'animal vivant et d'obtenir ainsi des
données pharmacocinétiques et des données concernant l'identification des
ligands
dont les propriétés de biodisponibilité, de toxicité et de métabolisme seront
compati-
bles avec leur utilisation ultérieure ;
- elle représente donc un avantage certain par rapport aux procédés
ne comportant que des étapes in vitro, notamment sur des cultures cellulaires
;
- en outre, elle permet de visualiser rapidement la distribution des
molécules administrées et de suivre leur cinétique ; on peut ainsi calculer
les ciné-
tiques d'élimination des molécules radioactives, pour savoir jusqu'à quand
l'observation peut être faite ou quel est le meilleur moment pour faire
l'analyse des
tissus selon l'étape (2). En conséquence, le moment où l'analyse de la
distribution
tissulaire selon l'étape (2) est effectuée, varie en fonction de la nature de
la molécule
injectée et de sa durée de vie dans l'organisme. On peut ainsi observer une
radioacti-
vité entre 10 minutes jusqu'à 48 heures.
- elle repose sur la détection de rayonnements suffisamment
énergétiques, émis par certains atomes radioactifs ; en particulier, la
tomographie
d'émission de positons (TEP ou PET en anglais) permet d'obtenir une imagerie
externe de la distribution d'un composé dans tous les compartiments d'un
animal,
comme le rat ou la souris, ou bien certains primates.
L'invention inclut la mise en oeuvre du présent procédé



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- dans sa variante dans laquelle l'étape (2) comprend l'analyse de la
distribution tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, à
l'aide
d'imageurs convenables, in vitro, à partir d'un échantillon biologique
préalablement
extrait et sélectionné dans le groupe constitué par des cellules et des coupes
de tissus
ou d'organes et
- dans sa variante dans laquelle le procédé comprend une étape (l')
(analyse in vivo).
A ce titre, chez l'homme, le procédé selon l'invention peut être à but
diagnostic, lorsqu'il est mis en oeuvre avec une banque de molécules,
présélectionnée à
l'aide du procédé selon l'invention mis en oeuvre dans un premier temps chez
un
animal non humain.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux des procédés selon
l'invention, à l'étape (2), la distribution tissulaire de la radioactivité est
révélée au
moyen d'appareils de détection incorporant des imageurs adaptés à détecter la
nature
des particules émises par l'isotope radioactif sélectionné.
L'étape d'analyse de la distribution tissulaire des composés, basée
sur la détection de la radioactivité, permet rapidement de sélectionner les
banques ou
librairies selon
A : La présence ou non de composés capables de se distribuer dans
l'organisme.
B : Selon un critère de sélectivité de ciblage, si l'on s'intéresse à
identifier des composés capables de cibler un organe particulier, comme le
cerveau,
par exemple.
C : La présence de composés fortement toxiques ; la banque ou
librairie est alors éliminée ou re-synthétisée sous forme de mélanges plus
discrets,
pour éliminer rapidement les composés toxiques.
Les étapes de sélection in vivo et plus particulièrement l'étape (l') a
un double objectif
- d'une part réduire considérablement le nombre de composés qui
feront l'objet d'une étude ultérieure ; en effet, toutes les molécules
rapidement élimi-
nées par l'organisme ou rapidement métabolisées, puis éliminées, ne sont plus
à pren-
dre en considération par la suite.
- d'autre part, pour les quelques composés retenus dans l'organisme,
obtenir des informations sur leur répartition tissulaire et par exemple
centrer l'étude
uniquement sur un tissu particulier, telle qu'une tumeur.



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Les étapes (3) à (5) concernent l'identification chimique des compo-
sés radioactifs présents dans un tissu ou un organe donné. Ces étapes montrent
tout
d'abord que la radioactivité observée est due uniquement à la présence de
molécules
présentes dans la librairie de départ.
De manière plus particulière, l'étape (4) permet, notamment à l'aide
de chromatographies appropriées sur un appareil muni d'un détecteur de
radioactivité,
d'isoler les différentes fractions contenant de la radioactivité ; ces
fractions sont
ensuite soumises à une analyse en spectroscopie de masse (étape (5), afin de
détermi-
ner la structure chimique des produits radioactifs. Cette étape (5) permet
donc formel-
lement d'identifier si le produit isolé était contenu dans la banque ou
librairie de
départ.
En outre, la combinaison (i) d'une étape mettant en oeuvre un
imageur convenable, pour une détection plus sensible des composés radioactifs
présents dans un tissu ou un organe donné et (ü) d'étapes d'analyse, notamment
par
spectrométrie de masse, augmente de manière significative, la sensibilité de
détection
du procédé selon l'invention par rapport à des procédés ne mettant en oeuvre
que la
spectrométrie de masse pour à la fois détecter et identifier lesdits composés.
En d'autres termes, la combinaison d'une détection d'un signal de
radioactivité (étape 2, notamment), préalablement à l'analyse, notamment par
spectrométrie de masse (étapes 3 à 5) augmente de manière significative la
sensibilité
de la détection (de l'ordre de la fentomole (10-~SM)/mmz). Le radioimageur
utilisé est
notamment un (3-imageur, sélectionné en fonction de l'atome radioactif à
détecter. Par
exemple, le (3-imageur de la société Biospace permet la détection de produits
radiomarqués, émetteurs de particules ~3-, présents sur des coupes de tissus à
des
concentrations de l'ordre de la fentomole/mmz, dans le cas du tritium ; ce
radioimageur permet la détection de différents types d'atomes radioactifs,
émetteurs de
particules (3-, avec un seuil de détection un peu moins élevé que celui du
tritium.
Selon l'atome radioactif, on peut définir les seuils de détection
suivants (coups par minute ou cpm)
3H : 0,07 cpm/mmz
3sS, ~aC, 33P : 0,01 cpm/mmz
3zP : 0,1 cpm/mmz.
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'identifier des composés
doués de deux propriétés essentielles : stabilité métabolique et distribution
tissulaire.
Ces étapes permettent, en particulier, d'extraire les composés présents dans
les diffé
rents tissus, dans le but d'effectuer la caractérisation de leur structure
chimique. Le



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choix de mettre en oeuvre des molécules radioactives est crucial, puisque le
suivi de la
radioactivité constitue un moyen très sensible pour suivre, tout au long des
étapes
d'extraction, voir de purification, la présence des composés d'intérêt.
Une fois les différentes étapes d'isolement (notamment par
5 extraction) réalisées, l'identité de la structure chimique des composés est
réalisée par
spectrométrie de masse ou toute autre méthode analytique convenable, comme
l'HPLC.
De manière plus précise, les molécules radioactives sont injectées
sous forme de mélange et ce afin de pouvoir cribler un grand nombre de
composés.
10 L'intensité de marquage, à un moment donné, est fonction de l'affinité du
composé
pour un site particulier, modulée par sa pharmacocinétique. Ainsi, les
expériences de
criblage sont, de préférence, réalisées à des moments différents. Cela permet
d'établir
la pharmacocinétique et d'évaluer les applications ultérieures envisagées pour
ces
composés.
I S Selon les techniques d'observation utilisées pour repérer la présence
de molécules radioactives au niveau d'un organe ou d'un tissu, on pourra
- soit faire l'analyse sur l'animal vivant : cas d'atomes radioactifs
émetteurs de positons, tels que le fluor 18 ou le technétium 99 émetteur de
rayons y,
en ayant recours à des appareils de détection incorporant des caméras adaptées
à la
détection de ce type de rayonnement,
- soit réaliser une détection après sacrifice de l'animal et procéder à
des détections de radioactivité à partir de coupes de tissu.
Dans tous les cas, pour une analyse fine, on procèdera au sacrifice
d'au moins un animal.
Il n'y a pas de restriction quant aux types d'animaux qui peuvent
être utilisés. En pratique, tous les animaux couramment utilisés en
pharmacologie
pourront faire l'objet d'une étude.
Conformément à l'invention, préalablement à l'étape (1), ladite ban-
que de molécules marquées est préparée par
- synthèse d'un mélange desdites molécules par voie chimique ou
enzymatique (peptides L ou D, pseudo-peptides, acides nucléiques, lipides,
composés
organiques) (synthèse combinatoire), et
- marquage desdites molécules par des isotopes radioactifs, tels que
le tritium (3H), le carbone 14 (14C), l'iode 131 (~31I), l'iode 125 (~ZSI), le
phosphore 32
(32P), le fluor 18 ('8F), le soufre 35 (35S), le technétium 99 (99Tc) ou
l'indium 113
i ~sln)



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De manière plus précise, la synthèse de grandes collections de molé-
cules radioactives est réalisée par synthèse combinatoire dans le cas de bio-
polymères
ou biomolécules (peptides, pseudo-peptides, nucléotides, polymères mixtes
nucléotide-peptide). Les approches de déconvolution (fractionnements itératifs
pour
séparer les différentes molécules d'un mélange), dans le cas des peptides,
décrites
dans la littérature facilitent l'identification des molécules d'intérêt. Des
molécules
non-peptidiques obtenues par synthèse en phase solide parallèle massive
peuvent être
mises en oeuvre dans le procédé selon l'invention, dans la mesure où elles
peuvent
être modifiées en vue de l'incorporation d'un atome radioactif.
Les molécules citées ci-dessus étant synthétisées en phase solide,
l'introduction d'atomes radioactifs est relativement aisée. Dans le cas des
peptides,
par exemple, la synthèse en phase solide aboutit à un peptide dont l'extrémité
amine
N-terminale peut être libérée, alors que toutes les fonctions réactives
portées sur les
chaînes latérales de ces polymères sont encore protégées. Cette propriété
permet ainsi
1 S d'introduire de façon très sélective des groupements porteurs d'atomes
radioactifs par
simple acylation de la fonction amine N-terminale du polymère encore greffé
sur le
support solide, notamment en utilisant les nombreux dérivés radiomarqués au
tritium,
disponibles dans le commerce, comme le propionate de succinimide ou
l'anhydride
acétique, qui permettent une acylation des fonctions amine, aboutissant au
radiomar-
quage par le tritium des composés porteurs de telles fonctions amine. Des
composés
analogues permettent d'introduire du '4C, par acylation de la fonction amine.
Le
radiomarquage de peptides au '8F ou au 99"'Tc peut être réalisé comme décrit
par
exemple dans HEPPELER A. et al. (Curr. Med. Chem., 2000, 7, 971-994).
Les synthèses de ces biopolymères peuvent être aussi conçues afin
de pouvoir, après les étapes de criblage in vivo, recevoir un atome radioactif
particu
lier. Ainsi, on peut synthétiser des banques de peptides dont tous les
éléments incorpo
rent une tyrosine iodée, avec de l'iode non-radioactif, et dont les extrémités
N-termi
nales sont marquées au tritium. Après criblage in vivo, les molécules
d'intérêt pour
ront être re-synthétisées, mais cette fois en incorporant sur la tyrosine de
l'iode
radioactif. La présence de la tyrosine iodée étant déjà présente lors des
étapes de
criblage, la molécule radioactive finale conservera nécessairement toute
l'activité
biologique. Cet exemple est applicable à différents types de biopolymères dans
lesquels on incorpore un synthon porteur d'atomes non-radioactifs, mais qui
une fois
le crible réalisé pourront être remplacés par leurs isotopes radioactifs. Une
telle straté-
gie s'applique notamment au technétium 99 ou au fluor 18.



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Des molécules d'origine naturelle, correctement radiomarquées,
peuvent être aussi criblées par la même démarche. On peut ainsi cribler des
extraits de
micro-organismes dont toutes les molécules sont radiomarquées à l'aide de
différents
isotopes radioactifs (3H,'4C, 32p, 355, par exemple). Une biomasse
radiomarquée peut
être obtenue lorsqu'on cultive ces micro-organismes en présence de nutriments
radio-
marqués. Des extraits naturels, comme des venins (TAKEDA M. et al., Toxicon,
1974, 12, 633-641 ; KOCHVA E. et al., Toxicon, 1982, 20, 3, 61 S-636) peuvent
être
obtenus sous forme radiomarquée, à condition que des acides aminés radioactifs
soient
fournis à l'animal, afin de permettre l'incorporation de ceux-ci dans les
toxines
produites dans la glande à venin, par exemple. Des stratégies de radiomarquage
de
produits naturels peuvent être développées, afin de produire en masse des
produits
radiomarqués utilisables dans le procédé de criblage selon l'invention.
De manière avantageuse, les étapes (1) à (5) sont réalisées simulta
nément sur plusieurs animaux pour lesquels, les quantités administrées à
l'étape (1)
sont différentes et l'analyse de la distribution de la radioactivité des
molécules selon
l'étape (2) est réalisée à des moments différents selon l'animal.
De manière surprenante, un tel procédé permet d'établir la présence
d'interactions spécifiques entre une ou des molécules contenues dans le
mélange
constitué par la banque de molécules avec un (des) sites) spécifiques)
localisés au
niveau d'un organe ou d'un tissu et ce sans la présence d'étiquettes
particulières, ni
nécessité d'amplification préalable des composés.
Le procédé selon l'invention présente notamment les avantages
suivants
- il n'est pas limité aux séquences peptidiques, mais concerne tous
types de molécules, notamment obtenues par chimie combinatoire, et notamment
les
bio-polymères ou biomolécules, ainsi que des molécules non peptidiques et des
substances naturelles, notamment extraites de végétaux.
- le radiomarquage ne constitue pas une contrainte, car de nombreux
procédés de radiomarquage ont été décrits dans la littérature, pour ce qui
concerne
différentes familles de composés obtenus par synthèse chimique ou enzymatique
; de
plus, dans le cas de substances naturelles, il est possible selon le type
d'organismes
produisant les composés d'intérêt, de mettre en place des stratégies qui
aboutissent à
la production de composés radioactifs bio-synthétiques. De telles stratégies
reposent
sur l'introduction de molécules radioactives capables d'entrer dans un cycle
métaboli-
que de l'organisme considéré. On peut citer, par exemple, le procédé de
radiomar-



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quage de peptides, tel que décrit dans (TAKEDA M. et al. (précité) ou KOCHVA
E.
et al. (également précité).
- le criblage in vivo avec des librairies de petites molécules (par
opposition aux phages), en favorisant la pénétration tissulaire, permet un
criblage bien
plus efficace de l'ensemble des récepteurs présents dans l'organisme. Une bien
meil-
leure exploitation de la diversité moléculaire contenue dans les banques
considérées
est donc possible avec ce type de criblage. Les phénomènes de clairance
éliminant les
phages de l'organisme ne constituent plus une limitation importante.
- l'identité chimique des composés est la même aux différentes éta-
pes du criblage, ce qui n'est pas le cas, comme précisé ci-dessus, dans le
procédé
développé par l'équipe de E. RUOSLHATI.
- il permet l'observation directe de la distribution tissulaire des com-
posés à cribler.
- il évite la présence d'étiquettes qui peuvent empêcher, par encom-
brement stérique, l'interaction du produit à cribler avec sa cible.
- il ne nécessite pas d'étape d'amplification et
- il permet l'étude du métabolisme et de la pharmacocinétique (dis-
tribution et élimination) des composés à cribler.
De manière surprenante, en combinant : le radiomarquage de
banques ou librairies de produits de synthèse, la chimie combinatoire, les
techniques
d'observation de la radioactivité chez l'animal (non humain ou humain, selon
les cas)
et les procédés d'isolement (extraction par exemple) de molécules, à partir
d'organes
ou de tissus, permettant leur analyse par spectrométrie de masse ou par
d'autres
méthodes analytiques convenables, il est effectivement possible d'identifier
des
ligands dont les propriétés de biodisponibilité, de toxicité et de métabolisme
seront
compatibles avec leur utilisation ultérieure dans un contexte in vivo et ce,
contrairement à ce qui est exposé dans l'art antérieur, dans lequel des
étiquettes plus
sophistiquées que la radioactivité sont considérées comme les seules
permettant effec-
tivement de détecter les molécules étiquetées. En effet, il est possible
d'observer un
produit radiomarqué sur un animal vivant, si l'on utilise des émetteurs de
radioactivité
très énergétiques et dont les temps de demi-vie sont assez courts, pour ne pas
com-
promettre la vie de l'animal. Ce type de traceur est donc très avantageux, par
rapport à
des traceurs moins énergétiques ; cependant, la faible durée de vie de ces
traceurs peut
être incompatible avec les analyses ex vivo ; dans ce cas, des traceurs de
longue durée
de vie comme le tritium, même s'ils ne peuvent servir pour une observation
extérieure



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v ~ i ~ 1 \ - _ . _ ,
14
de l'animal, s'avèrent très avantageux, d'autant que la manipulation de ce
type de tra-
ceurs est peu contraignante, en termes de sécurité.
A l'inverse des criblages mis en oeuvre sur des organes ou sur des
cellules isolées, le criblage, comprenant une étape effectuée sur l'animal
vivant, ga
rantit l'intégrité fonctionnelle des récepteurs ciblés par les ligands, dans
la mesure où
l'expression des gènes est modifiée dans les systèmes de culture cellulaire.
Enfin,
comparée aux approches de ciblage reposant sur l'utilisation d'anticorps, le
procédé
selon l'invention peut être mis en oeuvre avec des molécules de faibles poids
molécu-
laire ( 1000 Da en moyenne). Cette propriété, par rapport aux anticorps,
implique une
meilleure pénétration tissulaire et donc une meilleure exploitation du
répertoire des
récepteurs s'exprimant sélectivement au niveau d'un tissu ou d'un organe.
De plus, compte tenu de la taille des composés recherchés, ceux-ci
n'induiront pas de réponse immunitaire de la part de l'hôte.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon
l'invention, l'isolement de la ou des molécules radioactives associées)
au(x)dit(s)
organes selon l'étape (4) est effectué, conformément aux étapes suivantes
- prélèvement des organes dans lesquels une radioactivité a été
détectée,
- broyage desdits organes dans un tampon convenable
- centrifugation de chaque broyat et récupération de la solution
- filtration de la solution
- ajustement du pH
- séparation par fractions et récupération des fractions radioactives.
De manière plus précise, dans le cas de peptides, cette étape
d'isolement peut comprendre, après la centrifugation des broyats, la
récupération de la
solution et la filtration de cette dernière
- une acidification du filtrat
- un passage du filtrat sur une colonne contenant de la silice greffée
avec des groupements hydrophobes, permettant, la mise en place, de techniques
d'élution dite de phase inverse ; selon la présence de charges positives ou
négatives,
dans les composés de la banque ou librairie, des procédés de chromatographie
mettant
en jeu l'échange d'ions pourront être avantageusement mis en place,
- collecte de l'éluat par fractions et
- sélection des fractions contenant une substance radioactive,
- concentration sous vide des fractions radioactives



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- filtration sur une membrane de filtration apte à retenir les produits
de poids moléculaires supérieurs à ceux de la librairie d'origine,
- concentration du filtrat puis
- analyse des échantillons par chromatographie haute pression
5 (HPLC) en utilisant des colonnes remplie avec un support phase inverse ; au
sortir de
la colonne de séparation, la présence de produits radioactifs est détectée en
utilisant un
détecteur classique de radioactivité.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon
l'invention, à l'étape (5), l'analyse par spectrométrie de masse est associée
à une ana-
10 lyse de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du pro-
cédé selon l'invention, les molécules de la banque selon l'étape (1)
présentent la
formule générale suivante : propyl 3H-NH-Yaa-~R,s~Phe(POZ-CHZ)~R,s~Leu-Yaa'-
NHZ.,
dans laquelle Yaa et Yaa' représentent des positions dans lesquelles figurent
les 20
15 acides aminés naturels.
Un tel procédé trouve de nombreuses applications ; on peut citer
notamment
- la mise au point de nouveaux agents de contraste pour l'imagerie
médicale ; les composés criblés, étant dès le départ, porteurs d'atomes
radioactifs, les
molécules une fois sélectionnées peuvent être directement utilisées pour
réaliser une
imagerie médicale ou bien modifiées par l'addition d'agents de contraste,
compatibles
avec une observation in vivo par des techniques appropriées. A cet égard, les
banques
ou les librairies de molécules tritiées, dans lesquelles toutes les molécules
seraient
porteuses d'un atome de fluor 19 sont particulièrement intéressantes. Une fois
la
sélection réalisée par criblage in vivo, les molécules identifiées pourront
être
synthétisées en incorporant cette fois-ci le fluor 18, permettant ainsi
l'utilisation des
molécules comme agents de contraste pour l'imagerie basée sur la détection de
positons par des tomographes adaptés.
- l'élaboration de composés à usage thérapeutique ; en effet, outre
leur capacité à se fixer au niveau des sites bien précis dans un organisme
vivant,
certaines des molécules identifiées, peuvent présenter des activités
biologiques propres
et pourront servir ainsi de base au développement de composés thérapeutiques.
- le ciblage de médicaments ou de toute autre molécule d'intérêt
(vectorisation vers un site spécifique par couplage chimique d'un médicament
avec
une molécule sélectionnée). On peut en effet envisager pour cibler une
substance
d'intérêt vers un tissu ou un organe particulier, coupler chimiquement cette
substance



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v... .. - _ - _ _
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d'intérêt aux molécules identifiées par le procédé selon l'invention et
pouvoir ainsi la
vectoriser vers un espace tissulaire puis un site spécifique.
- l'identification de nouveaux récepteurs s'exprimant sélectivement
dans un tissu ou un organe donné.
Le procédé selon l'invention permet l'identification de nouveaux
récepteurs s'exprimant sélectivement dans un tissu ou un organe donné. Ce type
d'information et d'identification peut être extrêmement précieux pour le
développe-
ment de nouvelles stratégies thérapeutiques. La caractérisation, dans une même
étape,
à la fois d'un ligand sélectif et de son récepteur sélectif associé, non
encore identifié,
représente un atout précieux pour isoler ce récepteur, en développant une
colonne
d'affinité sur laquelle sera greffé le ligand spécifique de ce récepteur. Ce
même ligand
représente une structure de départ à partir de laquelle d'autres ligands
pourront être
conçus, notamment en vue d'applications thérapeutiques.
Un tel procédé permet donc également d'étudier différentes patholo
gies. En effet, des pathologies, qui entraînent la sur-expression de certains
récepteurs,
peu ou pas exprimés chez l'individu sain, pourront être aisément détectées par
le
procédé selon l'invention. Ainsi, la mise en évidence de marquages sélectifs
entre
animaux sains et malades est extrêmement utile en termes de diagnostic, de
thérapie,
d'imagerie et de ciblage de médicaments vers le tissu ou l'organe malade.
Cette
approche concerne à titre d'exemple la capacité à identifier des composés
chimiques
capables de se lier sélectivement sur une tumeur primaire ou secondaire, sans
marquer
les tissus ou organes sains de l'animal.
On doit à cet égard noter que l'injection des mêmes banques à des
animaux sains, par différence, devrait être un moyen de caractériser
l'expression de
récepteurs propres à une pathologie et donc par là même de mettre en évidence
de
marqueurs spécifiques à une pathologie donnée.
De manière préférée, la synthèse desdites molécules ou ligands est
réalisée en phase solide, à l'aide de techniques connues en elles-mêmes, avec
introduction, par exemple d'un groupement CT3-CT2-CO, en N-terminal par
acétyla-
tion de la fonction NH2-terminale des peptides liés au support solide par de
l'anhydride acétique tritié.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en
oeuvre dudit procédé de criblage selon l'invention, caractérisé en ce qu'il
comprend
- au moins une banque de molécules marquées, dont chaque
molécule est préalablement marquée, notamment mais non exclusivement, par



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remplacement d'un atome présent dans ladite molécule par l'un de ses isotopes
radioactifs,
- des moyens de détection des produits radiomarqués, notamment
sélectionnés dans le groupe constitué par des imageurs adaptées à la détection
du
rayonnement à détecter sur coupes d'organes ou de tissus et
- des moyens d'analyse des produits radiomarqués détectés, tels
que : HPLC et/ou spectrométrie de masse.
La présente invention a également pour objet une méthode
d'identification et d'étude de molécules cibles (ou récepteurs) s'exprimant
sélective
ment dans un organe ou un tissu, à l'aide d'une banque de molécules, laquelle
méthode comprend
(1) l'administration, à au moins un animal, de ladite banque de
molécules, dont chaque molécule est préalablement marquée, notamment mais non
exclusivement par remplacement d'un atome présent dans ladite molécule par
l'un de
ses isotopes radioactifs,
(2) le sacrifice d'au moins l'un des animaux et l'analyse de la distri-
bution tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, par
prélèvement et
analyse de coupes de différents tissus de l'animal, à l'aide d'imageurs
convenables,
tels que définis ci-dessus,
(3) la sélection de coupes de tissus ou d'organes dans le(s)quel(s)
une radioactivité est détectée,
(4) l'isolement, à partir desdites coupes de tissus ou d'organes,
sélectionnés à l'étape (3) de fractions radioactives, par des techniques
d'analyse
appropriées, telles qu'extraction et/ou chromatographie,
(5) la caractérisatibn à partir des fractions radioactives obtenues à
l'étape (4) de ladite ou desdites molécules, par des techniques d'analyse
convenables,
telles que la chromatographie et/ou la spectrométrie de masse,
(6) la mise en contact de la ou des molécules obtenues à l'étape (S)
avec un échantillon d'organe ou de tissu sélectionné et prélevé, conformément
à
l'étape (2), dans des conditions permettant la liaison entre la molécule
isolée à l'étape
(4) et la molécule cible et la formation d'un complexe et
(7) l'isolement de ladite molécule cible à partir dudit complexe.
En variante, quand cela est possible, l'étape (2) comprend l'analyse
de la distribution tissulaire de la radioactivité des molécules administrées,
à l'aide
d'imageurs convenables, in vitro, à partir d'un échantillon biologique
préalablement



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extrait et sélectionné dans le groupe constitué par des cellules et des coupes
de tissus
ou d'organes. Cette variante ne nécessite donc pas le sacrifice de l'animal.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, préala-
blement à l'étape (2), ledit procédé comprend une étape (l') d'analyse de la
distribu-
tion tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, en soumettant
au moins
l'un des animaux, à une imagerie externe, notamment au moyen d'appareils de
détection incorporant des caméras adaptées à détecter la nature des particules
émises
par l'isotope radioactif sélectionné (18F, 11C, 6aCu, ~6Br, ~zah 13N, ~s0 :
tomographe à
émission de positions, PET ; 99mTc, 1z31 : gamma-caméra etc...).
L'étape (7) de ce procédé, en particulier, permet d'étudier plus préci-
sément les propriétés des composés qui ont été identifiés. Chaque molécule
sélection-
née par le crible in vivo est à nouveau synthétisée, radiomarquée et étudiée
afin
d'illustrer ses capacités de distribution tissulaire, par les mêmes méthodes
qui ont servi
au criblage.
La présente invention a pour objet un vecteur de ciblage d'une molé-
cule d'intérêt vers un espace tissulaire et/ou un site spécifique, caractérisé
en ce qu'il
comprend une molécule sélectionnée à l'aide du procédé de criblage d'une
banque de
molécules, tel que défini ci-dessus et dont la distribution tissulaire vers
ledit site a été
identifiée par ce procédé.
La présente invention a également pour objet une composition site-
spécifique, caractérisée en ce qu'elle comprend (i) une molécule d'intérêt à
cibler vers
ledit site, couplée à une molécule spécifique dudit site, dont la distribution
tissulaire a
été identifiée à l'aide du procédé de criblage d'une banque de molécules, tel
que défini
ci-dessus et (ü) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des
molécules marquées, sélectionnées à l'aide du procédé de criblage d'une banque
de
molécules, tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'une composition
destinée à
être utilisée en imagerie médicale.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, les
molécules marquées sont associées à un agent de contraste convenable.
La présente invention a également pour objet un procédé d'identifi-
cation d'au moins une cible (par exemple un récepteur) d'une molécule
d'intérêt,
caractérisé en ce qu'il comprend au moins
(1) le couplage de la molécule d'intérêt avec une molécule
radiomarquée, spécifique de ladite cible, sélectionnée à l'aide du procédé de
criblage



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d'une banque de molécules, tel que défini ci-dessus, pour obtenir un conjugué
radioactif,
(2) l'administration, à au moins un animal, du conjugué obtenu à
l' étape ( 1 ) et
S (3) l'analyse, in vitro, à partir d'un échantillon biologique, de la
liaison d'au moins une cible dudit échantillon biologique avec la molécule
d'intérêt
couplée à ladite molécule radiomarquée.
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage
in vivo par compétition, de molécules non marquées, lequel procédé est
caractérisé en
ce qu'il comprend
(1) l'administration d'une molécule marquée dont la distribution
tissulaire a été identifiée à l'aide du procédé de criblage d'une banque de
molécules,
tel que défini ci-dessus, à au moins un animal,
(2) une première analyse de la distribution tissulaire de la molécule
radioactive administrée à l'étape ( 1 ), en soumettant au moins l'un des
animaux, à une
imagerie externe, notamment au moyen d'appareils de détection incorporant des
caméras adaptées à détecter la nature des particules émises par l'isotope
radioactif
sélectionné,
(3) l'administration d'une banque de molécules non marquées,
(4) une deuxième analyse de la distribution tissulaire de la molécule
radioactive, en soumettant au moins l'un des animaux, à une imagerie externe,
notamment au moyen d'appareils de détection incorporant des caméras adaptées à
détecter la nature des particules émises par l'isotope radioactif sélectionné,
(5) l'établissement de la cinétique de déplacement de la molécule
marquée par au moins l'une des molécules non marquées, par comparaison avec la
première analyse de distribution de la molécule marquée et
(6) la détection d'au moins une molécule non marquée ayant déplacé
la cinétique de la molécule marquée, par fractionnements itératifs (méthode de
déconvolution) et caractérisation de ladite molécule par des techniques
d'analyse
convenables, telles que la chromatographie et/ou la spectrométrie de masse.
En variante, quand cela est possible, les étapes (2) et (4) compren-
nent l'analyse de la distribution tissulaire de la radioactivité des molécules
admi-
nistrées, à l'aide d'imageurs convenables, in vitro, à partir d'un échantillon
biologique
préalablement extrait et sélectionné dans le groupe constitué par des cellules
et des
coupes de tissus ou d'organes.



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La présente invention a en outre pour objet un composé de la banque
de molécules de formule générale propyl-3H-NH-Yaa-~R,s~Phe(POZ-CHZ)~R,s>Leu-
Yaa'-
NH2, dans laquelle Yaa représente Arg et Yaa' représente Leu, susceptible
d'être
obtenu par le procédé de criblage d'une banque de molécules, tel que défini ci-
dessus..
S De manière surprenante, ce composé de formule
propyl-NH-Arg-Phe(P02-CH2)Leu-Ala NHz,
qui a été sélectionné par le procédé selon l'invention présente notam-
ment les propriétés suivantes
. il est un inhibiteur puissant in vivo des peptidases à zinc ACE
10 (enzyme de conversion de l'angiotensine I) et NEP (endopeptidases neutre ou
néprily-
sine) et trouve donc application dans les pathologies cardiovasculaires.
- il peut passer la barrière hémato-encéphalique et par conséquent
peut avoir, les applications telles que définies ci-dessus, notamment
lorsqu'il est
marqué : ( 1 ) en imagerie médicale, (2) dans un procédé de ciblage d'une
molécule
15 d'intérêt, par couplage de cette molécule d'intérêt à ce peptide dans
l'espace cérébral,
(3) dans un procédé de criblage de molécules spécifiquement exprimées dans le
cerveau.
D'autres peptides phosphiniques, de formules générales différentes
avaient déjà été décrits (Demande de Brevet français n°89 14978 ;
Demande de Brevet
20 français n°91 05403 ; Demande de Brevet français n°95 01328 ;
Demande de Brevet
français n°98 08464), dont certains (voir Demande de Brevet français
n°98 08464)
présentent une activité inhibitrice vis-à-vis de l'ACE ; toutefois, de manière
surpre-
nante alors que selon l'art antérieur, les structures chimiques de la plupart
des compo-
sés se comportant comme des inhibiteurs mixtes de l'ACE et la NEP, présentent
un
groupement carboxylate libre à leur extrémité C-terminale, considéré comme un
groupe essentiel pour l'obtention d'une interaction forte entre l'inhibiteur
et ces deux
peptidases (Bralet et al, Tips, 2001, 22, 3,106-109 ; Weber, The Lancet, 2001,
358,
1525-1532 ; Fink, Exp. Opin. Ther. Patents, 1996, 6, 11, 1147-I 164), le
composé
propyl-NH-Arg-Phe(POZ-CH2)Leu-Ala-NHz ne comporte pas un tel groupement, bien
qu'il présente effectivement cette activité mixte.
Ledit peptide présente les applications telles que définies ci-dessus, à
savoir
- médicament,
- vecteur de ciblage d'une molécule d'intérêt, plus spécifiquement
dans l'espace cérébral,
- composition site spécifique en imagerie médicale,



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- utilisation dans un procédé d'identification d'au moins une cible
(un récepteur, par exemple),
- utilisation dans un procédé de criblage direct in vivo par compéti-
tion, de molécules non marquées.
S De manière plus précise
La présente invention a également pour objet un médicament,
caractérisé en ce qu'il comprend au moins le composé propyl-NH-Arg-Phe(POZ-
CHZ)Leu-Ala-NHz et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet un vecteur de ciblage
ou de transfert ciblé de médicament, caractérisé en ce qu'il est constitué par
le
composé propyl-NH-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NH2.
La présente invention a également pour objet le composé tel que
défini ci-dessus (propyl-NH-Arg-Phe(P02-CHz)Leu-Ala-NH2), marqué à l'aide d'un
isotope radioactif sélectionné dans le groupe constitué par le tritium (3H),
le carbone
14 (14C), le carbone 11 ("C ) ou le phosphore 32 (32P).
La présente invention a pour objet une composition destinée à
l'imagerie médicale, caractérisée en ce qu'elle comprend le composé tel que
défini ci
dessus (propyl-NH-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHZ), marqué à l'aide d'un isotope
radioactif et éventuellement couplé à un autre composé ainsi qu'au moins un
excipient
pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du
composé marqué, tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'une
composition des-
tinée à être utilisée en imagerie médicale.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé
d'identification d'au moins une cible d'une molécule d'intérêt, tel que défini
ci-des
sus, caractérisé en ce que la molécule radiomarquée est le peptide propyl-NH-
Arg
Phe(POZ-CH2)Leu-Ala-NH2 radiomarqué.
Dans ce cas, la cible est, de préférence, située dans l'espace cérébral.
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage
in vivo par compétition de molécules non marquées, tel que défini ci-dessus,
dans
lequel, la molécule radiomarquée est le peptide propyl-NH-Arg-Phe(P02-CHZ)Leu-
Ala-NHZ radiomarqué.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore
d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui
se réfère à des
exemples de mise en oeuvre du procédé selon l'invention ainsi qu'aux dessins
annexés,
dans lesquels



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- la figure 1 illustre la distribution théorique des masses de la librai-
rie de formule générique propyl3H-NH-Yaa-~R,s~Phe(POZ-CH2)~R,s>Leu-Yaa'-NHz,
dans laquelle Yaa et Y'aa représentent des positions dans lesquelles figurent
les 20
acides aminés naturels, aboutissant à la synthèse de 400 molécules différentes
(1600 si
l'on décompte les diastéréoisomères dus à la présence de centre asymétrique au
niveau
des résidus Phe et Leu.
_ la Figure 2 représente le spectre de masse expérimental de la librai-
rie de formule générique propyl-3H-NH-Yaa-~R,s~Phe(P02-CHZ)~R,s~Leu-Yaa'-NH2.
- la Figure 3 représente un exemple des structures chimiques obser-
vées dans les spectres MS/MS lors de la fragmentation du peptide phosphinique
propyl 3H-Phe-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHz (sélection du composé de masse à 595).
- la Figure 4 illustre le spectre MS/MS du peptide propyl-3H-Phe-
Phe(P02-CHZ)Leu-Ala-NH2.
la Figure 5 représente une autoradiographie réalisée au (3-imageur
I S d'une coupe sagittale du corps entier d'une souris à laquelle on a
administré une solu-
tion contenant une librairie de peptides phosphiniques, répondant à la formule
généri-
que propyl-3H-NH-Yaa-~R,s~Phe(P02-CHZ)~R,s~Leu-Yaa'-NHZ, l'animal ayant été
sacri-
fié 1 h après l'injection.
- les Figures 6 à 8 représentent des spectres de masse de différents
extraits d'organes (rein, poumon et coeur) après injection LP. de la librairie
de peptides
phosphiniques.
- les Figures 9 et 10 représentent les fragments obtenus lorsque le
peptide propyl 3H-Arg-Phe(POZ-CHz)Leu-Ala-NH2 est soumis à un spectre MS/MS.
- les Figures 11 à 13 illustrent les pics de fragmentation obtenus à
paritr des extraits de rein, de poumon et de coeur dans une expérience de
fragmentation
MS/MS en sélectionnant le produit de masse à 595. Ces figurent démontrent la
présence du produit propyl-NH-Arg-Phe(POz-CHZ)Leu-Ala-NH2 dans ces trois
extraits d'organes
- les Figures 14 à 19 illustrent des spectres HPLC correspondant au
peptide propyl3H-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHZ sous forme pure
(4 diastéréoisomères, fig. 13) puis dans les différents extraits d'organes
(poumon,
coeur, foie, rein, et cerveau).
- la Figure 20 illustre des images d'autoradiographie de différentes
coupes d'organes réalisées à partir d'une souris à laquelle on a administré le
peptide
propyl-3H-NH-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHZ et sacrifiée une heure après
l'injection
du produit et



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- la figure 21 montre des images d'autoradiographie de différentes
coupes d'organes réalisées après injection du peptide propyl 3H-NH-Tyr-Phe(POZ-

CHZ)Leu-Pro-NHZ à une souris. L'animal a été sacrifié 1 h après l'injection du
produit.
- la figure 22 illustre l'inhibition de l'ACE par le composé propyl-
NH-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NH2.
- la figure 23 illustre l'inhibition de la NEP par le composé propyl-
NH-Arg-Phe(P02-CHz)Leu-Ala-NH2.
- la figure 24 illustre l'inhibition de l'ACE par les sous-banques de
formule générique : propyl-NH-Yaa-Phe(POZ-CHZ)Leu-Yaa'-NH2 (concentration de
chaque banque : 500 nM),
- la figure 25 illustre l'inhibition de la NEP par les sous-banques de
formule générique : propyl-NH-Yaa-Phe(POZ-CH2)Leu-Yaa'-NH2 (concentration de
chaque banque : 250 nM).
- la figure 26 illustre un protocole d'isolement par extraction des
produits radiomarqués.
- les figures 27, 28 et 29 illustrent la distribution tissulaire du
composé radiomarqué propyl-NH-Arg-Phe(P02-CH2)Leu-Ala-NHZ (pro-Arg)
respectivement dans le rein, le poumon et le cerveau de la souris et
permettent de
comparer la sensibilité de détection du peptide phosphinique, en combinant un
radioimageur (~3-imageur de la société Biospace) et la spectroscopie de masse
sur ce
composé (Electrospray, Quatro, MicroMass).
EXEMPLE 1: Banque ou librairie de pseudo-peptides phosphiniques radiomar-
qués au tritium
- Synthèse et radiomarquage des librairies de pseudo-peptides
phosphiniques
a) Radiomarquage de la librairie
La synthèse de librairies de peptides phosphiniques repose sur des
protocoles publiés (A. YIOTAKIS et al., J. Org. Chem., 1996, 61, 19, 6601-6605
; J.
JIRACEK et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 37, 21701-21706 ; J. JIRACEK et
al., J.
Biol. Chem., 1996, 271, 32, 19606-19611 ; V. DIVE et al., PNAS, 1999, 96, 4330-

4335). La librairie est synthétisée sur phase solide, en utilisant une résine
Rink-amide
(J. JIRACEK et al., J. Biol. Chem., 1996 et V. DIVE et al., PNAS, 1999,
précités),
avec un protocole split & combine (J. JIRACEK et al., J. Biol. Chem., 1995 et
J.
JIRACEK et al., J. Biol. Chem., 1996, précités). En fn de protocole de
synthèse, la



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structure générique des peptides sur la résine est du type : Fmoc-NH-Yaa-NH-
~R,s>Phe(PO(Oad)-CHZ)~R,s~Leu-Yaa'-CONH-R.
Yaa et Yaa' représentent une position substituée par 20 aminoacides
différents, R la résine.
Le groupe Fmoc est clivé, afin de générer une fonction N-terminale
libre, permettant l'incorporation du réactif radioactif par acylation de la
fonction N-
terminale. Les peptides phosphiniques ont été radiomarqués par incorporation
sur leur
fonction N-terminale libre de propionate de N-succinimidyle-T5, composé ayant
une
radioactivité spécifique de 97 Ci/mmol. Pour 16,6 moles de peptides
phosphiniques
(masse moléculaire moyenne de 607, correspondant à 10 mg de peptide en final,
après
déprotection), 10,3 nmoles de propionate de N-succinimidyle-TS ont été
incorporées
aux peptides, correspondant à une incorporation d'une radioactivité de 1 mCi
par
librairie.
La réaction d'acylation est complétée par du propionate de N-
succinimidyle froid, mis en excès. Afin rinçage de la résine, les peptides
phosphini-
ques sont clivés par des protocoles classiques de déprotection et de clivage
(J.
JIRACEK et al., J. Biol. Chem., 1996 et V. DIVE et al., PNAS, 1999, précités).
Les
solvants de clivage sont éliminés par évaporations successives. Les peptides
portés à
sec sont repris dans 50 ~l de DMSO, 15 ~l de NaHC03 1M et 50 ~l de PBS. Le pH
de
la solution est ajusté à 7 avec la solution de NaHC03 1M. Le volume final est
ajusté
avec du PBS, à 500 Vil. Cette solution est utilisée pour l'injection aux
animaux. Le
spectre de masse de la librairie (figure 2), ainsi que différentes expériences
de
fragmentations MS/MS sur cette librairie montrent une très bonne
représentation de
tous les composés attendus théoriquement.
b) Caractéristiques de la librairie obtenue
On obtient ainsi des librairies de peptides phosphiniques radiomar-
gués au tritium. La librairie synthétisée, selon le protocole défini ci-dessus
a pour
formule générique propyl-3H-NH-Yaa-~R,s~Phe(P02-CHZ)~R,s~Leu-Yaa'-NHZ, dans
laquelle Yaa et Yaa' représentent une position dans laquelle figure un mélange
équi-
molaire de 20 aminoacides. Cette librairie comporte donc 400 composés,
formelle-
ment 1600 si l'on prend en compte la présence de deux centres asymétriques
dans ces
structures. Les composés ont été radiomarqués sur l'extrémité N-terminale par
incor-
poration d'acide propylique tritié du type C3H3-C3Hz-COOH, incorporant dans sa
structure cinq atomes de tritium.
La figure 1 illustre la distribution théorique des masses de la librairie
de formule générique propyl-NH-Yaa(~,s~Phe(P02-CH2)~R,s~Leu-Yaa'-NHz.



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Une enveloppe théorique correspondant aux masses des différents
peptides phosphiniques contenus dans la librairie est représentée dans cette
figure. On
remarque que cette enveloppe n'est pas continue, mais est constituée de
massifs
distincts, traduisant une distribution par groupe des différentes masses des
produits de
S cette librairie.
La figure 2 illustre le spectre de masse expérimental (ES-MS =
Electro Spray Mass Spectroscopy) de la librairie de formule générique propyl-
NH-
Yaa((R,s~Phe(P02-CHZ)(R,s)Leu-Yaa'-NHZ.
Lorsque l'on compare l'enveloppe théorique (figure 1) avec le spec
10 tre de masse expérimental correspondant à la librairie (figure 2), on
remarque la très
bonne correspondance entre données théoriques et expérimentales. Cette
concordance
indique une très bonne représentativité de tous les peptides phosphiniques
dans cette
librairie. Les expériences MS/MS de fragmentation des pics observés dans le
spectre
MS, permet de montrer l'existence des peptides phosphiniques théoriquement
attendus
15 dans cette librairie.
Caractérisation des peptides phosphiniques par spectrométrie de
masse
Le choix d'un groupement protecteur de type CH3-CH2-CO, plutôt
que celui traditionnellement utilisé en chimie peptidique CH3-CO, s'est révélé
utile
20 lors de la caractérisation des molécules par spectrométrie de masse. Chaque
peptide
phosphinique dans cette librairie se caractérise par la nature des résidus
d'acides
aminés présents respectivement en position N et C-terminale. Cette librairie
se carac-
térise par la présence de paires de peptides, qui ont exactement la même
masse, le
même contenu en acides aminés, seule leur séquence varie, comme illustré ci-
des-
25 sous
Par exemple, les deux peptides suivants ne peuvent être distingués
l'un de l'autre selon leur masse, qui est identique
Propyl-Asp-Phe(P02-CHZ)Leu-Ala-NHZ
Propyl-Ala-Phe(POZ-CHZ)Leu-Asp-NH2
Les techniques de fragmentation MS/MS pratiquées sur un certain
nombre de peptides phosphiniques permettent de conclure qu'il est possible,
sans
ambiguïté, d'identifier la structure chimique des composés, même dans le cas
où, à
une même masse correspondent au minimum deux peptides. Cette propriété est due
au
mode de fragmentation de ce type de peptide phosphinique, qui permet en
particulier
d'identifier la nature du résidu en position N-terminale.



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La figure 3 illustre un exemple des structures chimiques observées
dans les spectres MS/MS, lors de la fragmentation du peptide phosphinique
propyl-
Phe-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHZ.
La figure 4 illustre le spectre MS/MS du peptide propyl-Phe-
Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NH2.
Comme illustré dans ces figures 3 et 4, le résidu en position N-
terminale apparaît toujours sous la forme d'une entité portant le groupe
propylate
(pro-Phe-CO+, pic D des figures 3 et 4). L'observation de cette entité dans
les spectres
MS/MS permet donc, dans la plupart des cas, de déterminer quelle est la nature
de
l'acide aminé en position N-terminale du peptide, et par conséquent celle du
résidu en
position C-terminale, la masse du peptide étant connue. Une autre espèce est
aussi
systématiquement observée (pro-Phe-Phe (POZ-CH2)Leu CO+, pic C des figures 3
et
4) ; son observation vient côrroborer la nature du résidu en position N-
terminale de la
séquence (résidu Phe dans l'exemple).
Ces caractéristiques du mode de fragmentation des peptides phos-
phiniques présents dans cette librairie tiennent à l'introduction du groupe
propylate.
Grâce à ces caractéristiques, on peut aussi identifier la structure chimique
des compo-
sés, même dans les cas où à une même masse correspondent plusieurs peptides
phos-
phiniques.
On remarquera la présence d'un pic à 120 de masse dans les spectres
MS/MS lorsque les peptides phosphiniques sont fragmentés (pic E, des figures 3
et 4).
L'observation de ce pic, qui est caractéristique d'un peptide phosphinique,
est très
utile pour repérer la présence d'un peptide phosphinique dans des extraits
d'organes.
- Injection de la librairie à des animaux et observation de la dis-
tribution tissulaire des peptides tritiés.
a) Injection des librairies obtenues à des animaux.
Les souris utilisées pour les expériences sont des femelles Balb/C.
Les peptides phosphiniques de la librairie (10 mg, radioactivité variant de
0,8 à 1 mCi)
sont solubilisés dans une solution de PBS, contenant 10 % de DMSO. Si l'on
consi-
dère la présence de 400 molécules dans cette librairie, la quantité de chaque
produit
injecté est de l'ordre de 25 ~g par animal, représentant une dose de 1,25
mg/kg pour
des souris de 20 g. Dans le cas d'injection d'un seul produit, les doses
utilisées ont été
de 20 mg/kg, pour une radioactivité totale variant de 100 à 150 pCi. Les
injections
sont réalisées à différents moments (5 min, I h, 3 h et 24 h).
b) Réalisation des coupes d'organes



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Immédiatement après le sacrifice des animaux, les différents organes
ou tissus sont prélevés, rincés dans une solution de PBS et plongés dans de
l'heptane
refroidi à - 70°C (mélange eutectique d'heptane et carboglace). Les
coupes congelées
de tissus, d'une épaisseur de 25 gym, sont réalisées à l'aide d'un microtome à
-20°C.
Après séchage, les coupes sont analysées au (3-imageur.
c) Résultats
* Analyse des coupes au (3-imageur.
Les librairies de peptides phosphiniques radiomarqués sont injectées
par voix intra-péritonéale à des souris, conformément au protocole décrit ci-
dessus.
Après un certain temps (1 h ou 15 min), les animaux sont sacrifiés.
Des coupes de corps entiers sont réalisées et analysées par autoradiographie
sur (3-
imageur, appareil capable de détecter le rayonnement (3 du tritium. Ces
expériences
indiquent, aussi bien à 15 min ou 1 h après injection de la librairie, que de
la radioacti-
vité est observée au niveau de différents organes ; la figure 5 illustre une
autoradiogra-
I 5 phie réalisée au (3-imageur d'une coupe sagittale du corps entier d'une
souris à laquelle
a été administrée une solution contenant la librairie de peptides
phosphiniques et qui a
été sacrifiée 1 h après l'injection.
Outre dans le foie et le rein, de la radioactivité est observée au
niveau du coeur et des poumons par exemple. D'autre part des expériences où
les ani
maux ont été sacrifiés ultérieurement confirment que cette librairie ne
possède pas de
composés induisant une mortalité ou une toxicité sur les animaux pour les
périodes
d'observation effectuées. On peut donc conclure que durant ces expériences les
fonc-
tions vitales des animaux ont été préservées. Cet aspect est important,
puisqu'il garan-
tit que les composés qui seront identifiés doivent interagir avec des «
récepteurs » ex-
primés physiologiquement.
- Extraction des peptides phosphiniques
a) Protocole
Les organes sont prélevés rapidement après le sacrifice de l'animal
et déposés dans une solution de PBS à 4°C. Quelques minutes après, les
organes sont
transférés dans un potter contenant 2 ml de PBS à 4°C, puis broyés
manuellement. Le
broyat est transféré dans un tube à centrifuger contenant 15 ml de PBS. Après
centri-
fugation 30 min à 4.000 tours/min, la phase supérieure est séparée du culot de
cellules
et passée sur filtres 0,45 pm. Ce filtrat, après avoir été acidifié, est
chargé sur une
cartouche contenant 5 g de phase C18, cette cartouche ayant été préalablement
rincée
sur une solution aqueuse contenant 0,1 % de TFA.



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Le protocole d'élution consiste à passer d'abord 20 ml d'eau conte-
nant 0,1 % de TFA, puis 30 ml d'une solution aqueuse contenant 50 %
d'acétonitrile
et 0,1% de TFA, puis 20 ml d'une solution aqueuse contenant 80% d'acétonitrile
et
0,1 % de TFA.
L'éluat sortant de la cartouche de C18 est collecté par fractions de
2 ml. Un comptage de radioactivité permet d'identifier les fractions contenant
des
peptides phosphiniques radiomarqués.
Les fractions radioactives sont concentrées sous vide et les produits
sont repris dans de l'eau, puis les différentes solutions sont passées sur une
membrane
de filtration retenant les produits ayant un poids moléculaire supérieur à
5000 Da. La
solution ainsi filtrée est concentrée sous vide jusqu'à un volume de 100 pl.
Ces échantillons sont alors prêts pour être analysés, soit par
chromatographie haute performance, couplée à un système de détection de
radioacti-
vité pour observer les peptides phosphiniques radioactifs, soit par
spectrométrie de
masse.
Cette étape révèle la présence de dérivés phosphiniques, contenus
dans la librairie de départ, capables de se distribuer dans certains organes.
Pour être en
mesure d'identifier les dérivés phosphiniques retenus dans ces organes,
différents
protocoles d'extraction des dérivés phosphiniques ont été testés, en utilisant
notam-
ment la détection de la radioactivité, comme précisé ci-dessus, pour suivre la
présence
des composés de la librairie, tout au long des étapes de la procédure
d'extraction.
L'utilisation du protocole de fractionnement, a permis l'analyse de ces
extraits à la fois
par HPLC couplée à une détection de radioactivité et par spectrométrie de
masse. Une
utilisation optimale de la spectrométrie de masse, en particulier la
sensibilité de la
méthode, repose sur la qualité des échantillons qui seront soumis à l'analyse.
Les pro-
tocoles de préparation des échantillons sont donc extrêmement importants à
cette
étape, mais peuvent varier, selon les fonctions chimiques portées par les
produits de la
librairie. Par exemple, dans le cas des pseudo-peptides phosphiniques, après
rinçage,
avec H20, 0,1 % TFA, tous les pseudo-peptides phosphiniques de la librairie
peuvent
être élués avec SO % CH3CN, alors qu'à 80 % CH3CN, on élue beaucoup de
produits
endogènes qui peuvent interférer avec les analyses ultérieures.
b) Analyse des spectres de masse d'extraits d'organes issus
d'animaux ayant reçu par injection i.p. la librairie des peptides
phosphiniques
L'analyse de spectres de masse des différents extraits préparés à
partir de différents organes et tissus (rein, foie, poumon, coeur, cerveau,
tumeur) indi-



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que qu'en dehors du rein, aucun signal propre aux peptides phosphiniques
n'apparaît
dans les spectres de masse de ces différents extraits.
Ces résultats sont illustrés aux figures 6 à 8.
La figure 6 représente un spectre de masse de l'extrait rénal, dans
lequel on observe la présence de nombreux pics caractéristiques de peptides
phosphi-
niques (à comparer à la figure 2).
La figure 7 représente un spectre de masse de l'extrait pulmonaire,
dans lequel on observe l'absence de pics caractéristiques de peptides
phosphiniques.
La figure 8 représente un spectre de masse de l'extrait de coeur, dans
lequel on observe l'absence de pics caractéristiques de peptides
phosphiniques.
Toutefois, on observe que les résultats obtenus par analyse de spec-
tre de masse et par HPLC sont divergents ; en effet, on détecte la présence de
pics
caractéristiques de peptides phosphiniques par HPLC dans les extraits
provenant des
poumons et du coeur. Cette dichotomie provient du fait qu'en spectrométrie de
masse,
les pics de masse pouvant correspondre aux produits recherchés peuvent être
masqués
par les pics de masse provenant des composés endogènes contenus dans les
organes,
gui sont encore présents après les étapes d'extraction. Sur la base de ces
résultats, des
spectrométries de masse en tandem MS/MS de fragmentation sont systématiquement
réalisées, afin de mettre en évidence la présence de peptides phosphiniques
dans les
différents extraits.
Ces spectrométries de masse MS/MS permettent de fragmenter un
peptide à une masse donnée et donc de ne faire apparaître, dans le spectre
MS/MS,
que les fragments d'un tel peptide (signature spectrale). Ces expériences
s'avèrent
donc beaucoup plus efficaces pour mettre en évidence la présence d'un produit,
même
si celui-ci n'apparaît pas dans le spectre MS.
Ces spectrométries de masse MS/MS ont permis d'identifier la
présence d'un peptide phosphinique dans les poumons et le coeur, à savoir le
propyl-
Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NH2. Ce peptide apparaît aussi dans le rein et dans le
foie ; cependant dans ces organes, d'autres peptides phosphiniques sont aussi
obser-
vés. Les figures 9 et 10 représentent les fragments obtenus lorsque le peptide
propyl-
Arg-Phe(POZ-CH2)Leu-Ala-NH2 est soumis à un spectre MS/MS. L'observation des
pics de fragmentation caractéristiques du peptide propyl-Arg-Phe(POZ-CH2)Leu-
Ala-
NHZ dans les extraits rénaux (figure 11 ), pulmonaires (figure 12) et
cardiaques (figure
13) permet de conclure à la présence de ce peptide dans ces organes.



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La sélection du produit propyl-Arg-Phe(PO2-CHZ)Leu-Ala-NH2 par
cette approche de criblage d'une banque de peptides, a conduit à préparer ce
peptide
sous forme pure, afin d'établir en détail ses propriétés de distribution
tissulaire.
L'étude de la distribution tissulaire du peptide propyl-Arg-Phe(P02-
S CH2)Leu-Ala-NH2 radiomarqué, injecté sous forme pure, montre que ce composé
est
effectivement capable de se distribuer dans différents tissus, chez la souris
(24mg/kg,
100pCi, puis sacrifice de la souris 1 h après l'injection en LP. du produit,
comme en
témoignent les images des différents organes, obtenues par autoradiographie :
on
observe ce produit au niveau du coeur, du cerveau, du foie, des poumons et des
reins.
10 De façon très intéressante, on observe que ce peptide est capable de
franchir la barrière
hémato-encéphalique, puisqu'il est observé au niveau du cerveau. Les mêmes
procé-
dures d'extraction et d'analyse structurale démontrent que toute la
radioactivité obser-
vée par autoradiographie correspond à la présence du peptide propyl-Arg-
Phe(POZ CHZ)Leu-Ala-NH2 sous forme intacte (figure 20).
15 Les figures 14 à 19 représentent des spectres HPLC, avec détection
de radioactivité, correspondant au produit propyl-Arg-Phe(P02-CH2)Leu-Ala-NH2
pur
tritié, et aux différents extraits d'organes provenant d'une souris ayant reçu
le peptide
propyl-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHZ (20 mg/kg, 100 pCi) et sacrifiée 1 h après
l'injection du produit.
20 Afin d'illustrer la capacité du peptide propyl-Arg-Phe(P02-
CH2)Leu-Ala-NHZ à, d'une part cibler certains organes comme le coeur et les
poumons,
et d'autre part à s'accumuler dans ces organes, une autre molécule a été mise
en oeuvre
dans les mêmes conditions comme contrôle négatif ; il s'agit d'une autre
molécule de
la libraire décrite ci-dessus, à savoir le propyl-Tyr-Phe(P02_CH2)Leu-Pro-NH2.
25 L'étude de sa distribution tissulaire, dans les mêmes conditions
expérimentales que celles utilisées pour le composé propyl-Arg-Phe(P02-CH2)Leu-

Ala-NH2 montre que le composé propyl-Arg-Phe(P02_CHZ)Leu-Ala-NHZ se différen-
cie très nettement du peptide propyl-Tyr-Phe(POZ-CHz)Leu-Pro-NH2 tant dans sa
capacité à s'accumuler au niveau du coeur et des poumons, que dans sa capacité
à ap-
30 paraître au niveau du cerveau.
La figure 21 représente des images d'autoradiographie de différentes
coupes d'organes réalisées à partir d'une souris ayant reçu le peptide propyl-
Tyr-
Phe(POZ-CHz)Leu-Pro-NHz (20 mg/kg, 100 pCi), sacrifiée 1 h après l'injection
du
produit.
EXEMPLE 2: Propriétés et identification des cibles potentielles du peptide
phosphinique propyl-NH-Arg-Phe(P02-CH2)Leu-Ala-NH2



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La distribution tissulaire particulière du peptide phosphinique
propyl-NHArg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHZ, notamment au niveau du cerveau, a
conduit à faire l'hypothèse que ce composé pouvait interagir avec des peptides
à zinc
du type, enzyme de conversion de l'angiotensine I (ACE) ou/et endopeptidase
neutre
(NEP, néprilysine). En effet, de manière générale, les peptides phosphiniques
ont la
capacité à interagir spécifiquement avec des protéases ou peptidases à zinc
(voir
Demande de brevet français n°98 08464 ; en outre, ces deux peptidases à
zinc sont
connues pour avoir des distributions tissulaires compatibles avec celle
observée pour
le produit phosphinique propyl-NH-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHz (Cadwell et al.,
Science, 1975, 191, 1050-1051 ; Roques et al., Tips, 1990, 11, 245-249).
C'est la raison pour laquelle le pouvoir inhibiteur du peptide phos-
phinique propyl-NH-Arg-Phe(POZ-CHZ)Leu-Ala-NHZ a été évalué vis-à-vis des
formes purifiées de ces deux peptidases (mesure des Ki selon Dive et al.,
PNAS, 1999,
96, 4330-4335). Comme le montre les figures 22 et 23, ce peptide présente des
ICso
1 S égales à 30 nM et 100 nM, respectivement, vis-à-vis de l'enzyme de
conversion de
l'angiotensine et de la NEP, correspondant à des valeurs de constantes
d'inhibition Ki
de lSnM et 30nM. Ce composé se comporte donc comme un inhibiteur extrêmement
puissant vis-à-vis de ces deux peptidases.
Ces deux peptidases étant considérées comme peu sélectives, il peut
apparaître surprenant, qu'après le criblage in vivo, seul le peptide propyl-NH-
Arg-
Phe(P02-CHZ)Leu-Ala-NHZ ait été identifié par ce procédé de criblage.
Afin de mieux connaître les propriétés inhibitrices des différentes
molécules contenues dans la banque de départ, vis-à-vis de l'ACE et la NEP, le
pouvoir inhibiteur de sous-banques contenant des mélanges discrets de formule
géné-
rique
propyl-NHAaa-Phe(POZ-CH2)Leu-Yaa-NH2
dans lesquels la position notée Aaa contient un acide aminé particu-
lier, alors que dans la position Yaa figure un mélange de 20 acides naturels,
a été
évalué.
La figure 24 présente le pourcentage d'inhibition des mélanges de
peptides phosphiniques, répondant à la formule générique ci-dessus, vis-à-vis
de
l'ACE, selon la nature du résidu en position Aaa. Les résultats reportés dans
cette
figure indiquent très clairement que de nombreux peptides phosphiniques
présents
dans ces sous-banques apparaissent comme des inhibiteurs puissants de l'ACE.
De
manière intéressante, on voit que parmi les résidus en position Aaa,
optimisant le



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pouvoir inhibiteur des composés vis-à-vis de l'ACE, figurent les résidus His,
Arg et
Tyr.
Lorsque les mêmes sous-banques sont testées sur la NEP (figure 25),
il apparaît aussi que de nombreux peptides contenus dans les sous banques
doivent se
comporter comme des inhibiteurs très puissants de la NEP. On notera que
plusieurs
types d'acide animé en position Aaa optimisent les interactions enzyme-
inhibiteur.
Sur la base de ces données in vitro, il est clair que le produit propyl-
NH-Arg-Phe(POZ-Cl-12)Leu-Ala-NHZ ne correspond certainement pas à l'inhibiteur
le
plus puissant in vitro, contenu dans la banque vis-à-vis de ces deux
peptidases.
Cela montre clairement l'intérêt du procédé selon l'invention ; en
effet, sur la base du seul crible in vitro, il est impossible de sélectionner,
par exemple
le seul composé effectivement efficace ; en effet, à l'aide du test in vitro,
on sélec-
tionne de nombreux composés de la banque, ayant la capacité d'agir comme des
inhi-
biteurs puissants, alors que le procédé selon l'invention, qui inclut une
étape in vivo,
va être beaucoup plus sélectif, dans la mesure où seul le composé apte à agir
in vivo
est ainsi sélectionné.
Sur la base de la capacité du composé propyl-NHArg-Phe(POZ-
CHz)Leu-Ala-NHZ à inhiber de façon puissante in vivo des peptidases ACE et
NEP,
les applications d'un tel produit dans les pathologies cardiovasculaires
peuvent être
attendues.
La stabilité métabolique du composé propyl-NH-Arg-Phe(POZ-
CHZ)Leu-Ala-NH2, et sa très bonne distribution tissulaire, notamment dans des
régions
connues pour exprimer ces deux peptidases à zinc laisse prédire une excellente
capa-
cité de ce produit à inhiber in vivo ces deux peptidases. En conséquence, un
tel produit
trouvera des applications importantes dans les pathologies cardiovasculaires
chez
l' homme.
Exemple 3 : Importance de la combinaison des étapes (2) et (3) à (5) dans le
procédé selon l'invention
- Rappel du procédé selon l'invention
Après injection d'une librairie de composés radiomarqués au tritium
à des animaux, le procédé selon l'invention comprend l'analyse de la
distribution
tissulaire de la radioactivité des molécules administrées, à partir d'un
échantillon
biologique et plus particulièrement de coupes de tissus ou d'organes prélevés,
par la
détection d'un signal de radioactivité sur lesdites coupes de tissus ou
d'organes
congelés, à l'aide d'un radioimageur approprié.



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Dans la mesure où seuls les organes ou tissus présentant un signal de
radioactivité sont par la suite analysés pour établir l'identité du ou des
composés
présents dans le tissu considéré, la sensibilité de la méthode employée pour
la
détection du signal de radioactivité joue ici un rôle central.
- Comparaison de la sensibilité relative de la radioimagerie
tritium et de la spectrométrie de masse.
Pour établir cette comparaison, 500 pg d'un composé phosphinique
radiomarqué au tritium propyl-Arg-Phe(POZ-CH2)Ala-Ala-NHZ (pro-Arg)
(radioactivité spécifique de 68 mCi/mmoles) ont été injectés à des souris. Une
heure
après l'injection du produit, sa distribution tissulaire a été étudiée par
détection de la
radioactivité à partir de coupes de tissus congelés. Les organes contenant de
la
radioactivité ont été traités afin de préparer des extraits tissulaires
pouvant permettre
leur analyse par spectrométrie de masse, conformément au protocole
d'extraction
illustré à la figure 26. La comparaison de la capacité de ces deux méthodes à
détecter
la présence du composé phosphinique injecté aux animaux permet de montrer que
c'est la combinaison des étapes du procédé selon l'invention qui permet de
résoudre le
problème de la détection et de l'identification de composés radioactifs
présents dans
des organes ou des tissus, à partir d'un banque de molécules diverses
radioactives.
* Rein (figure 27)
(3-imageur : la radiographie indique la présence du composé
radiomarqué dans cet organe (dans ces images, l'intensité maximale et minimale
de
radioactivité sont représentées respectivement en gris foncé et gris clair.
A partir de l'intégration du signal et de la radioactivité spécifique du
produit (68 mCi/mmoles), il est possible de déterminer la quantité de produit
présente
par mm2 de rein.
Sur la coupe, le signal de radioactivité observé est de 14,5 pCi/mm2,
représentant 0,2 pmoles/mm2 de produit ( 127 pg/mm2). En intégrant cette
quantité sur
le volume d'un rein entier, on parvient à déterminer que la quantité totale de
produit
présente dans le rein correspond à 15% de la dose injectée (75 pg).



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Masse : On extrait le produit à partir d'un broyat rénal provenant
d'un animal traité dans les mêmes conditions que précédemment (protocole
d'extraction décrit à la figure 26), puis concentration des fractions à sec et
reprise du
produit dans 100 ~L de solvant (Eau/Acide formique ; 50:50) ; si l'extraction
était
quantitative, la concentration théorique de l'échantillon devrait être de
l'ordre
1,5 mM. A partir de cette hypothèse de travail, on peut estimer que
l'injection d'un
microlitre de cette solution diluée par 100 (15 pM) représente 15 pmoles de
produit
introduit dans le spectromètre de masse (Electrospray, Quatro, Micromass).
Cette quantité est tout à fait compatible avec la sensibilité de la
spectrométrie de masse.
La figure 27 confirme en effet que l'on peut très bien observer la
présence du produit dans cet échantillon, caractérisée par un pic de masse
correspondant à un poids moléculaire de 596 Daltons (M+H). Sur ce spectre de
masse
par rapport aux autres signaux, le pic à 596 Da possède l'intensité la plus
élevée, ce
qui permet de conclure que le peptide phosphinique injecté est largement
majoritaire
par rapport aux produits endogènes co-extraits avec ce produit. L'identité
chimique du
produit est confirmée par l'observation des fragments A, B et C, lorsque
l'échantillon
est passé en mode MS/MS, permettant la fragmentation de ce composé. Les mêmes
pics A, B et C sont observés lorsque l'on fragmente le produit pur.
Poumon (figure 28)
(3-imageur La radiographie indique une quantité plus faible du
produit dans le poumon ; 2,6 pCi/mm2 de radioactivité dans cet organe au lieu
de 14,5
pCi/mm2 dans le rein, soit 2,2 % de la dose injectée.
Masse : une solution de concentration théorique 22 ~M de
l'échantillon pulmonaire a été soumise à une analyse de masse. L'injection
d'un
microlitre de cet échantillon, par rapport à l'expérience réalisée dans le
rein, pouvait
laisser prédire une très bonne observation du produit pro-Arg. Le spectre MS
de la
figure 28 indique que l'on est dans les limites de détection, le signal
correspondant au
pro-Arg étant de l'ordre du bruit observé dans ce spectre. Néanmoins par
fragmentation (expériences MS/MS), on peut conclure à la présence du produit,
les
fragments attendus (A, B et C) étant clairement observés dans le spectre
MS/MS.



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Cerveau (figure 29)
(3-imageur : la radiographie indique un très faible radiomarquage,
dans une région très localisée du cerveau : 0,35 pCi/mm2 au lieu de 14,5
pCi/mm2
dans le rein. Cette fois-ci, le volume du cerveau concerné par le
radiomarquage
5 n'étant pas déterminé précisément, la quantité totale de produit présente
dans le
cerveau est plus problématique à estimer.
Masse : Après extraction du produit à partir du cerveau, l'injection
de l'intégralité de la fraction susceptible de contenir notre produit dans le
spectromètre
n'a pas permis d'observer un pic à 596. Les expériences de fragmentation
permettent
10 la détection des pics A, B et C, et confirment donc la présence du produit
intact dans
le cerveau. Cependant ces expériences sont à la limite du seuil de détection.
Les résultats illustrés aux figures 27 à 29 démontrent le rôle de la
combinaison radioimageur/spectrométrie de masse, pour réaliser la détection
d'un
peptide phosphinique radiomarqué au sein d'un tissu. En effet, dans le cas du
cerveau
15 (figure 29), on peut constater que la spectrométrie de masse, seule, était
en limite de
détection, alors que la présence du peptide phosphinique est révélée par le
radioimageur ; ces données montrent la nécessité de combiner une étape de
détection
des produits radioactifs, dans les organes ou les tissus, à l'aide d'un
radioimageur pour
la détection la plus sensible desdits produits radioactifs, suivie d'une étape
d'analyse
20 par spectrométrie de masse, permettant d'établir l'identité chimique des
produits
détectés dans le cerveau grâce à la radioimagerie.
En effet, bien que très performante, la spectrométrie de masse
nécessite, selon la nature du tissu, la purification absolue d'un produit en
très faible
quantité, ce qui constitue un objectif extrêmement difficile à atteindre,
compte tenu de
25 la présence en très grande quantité de produits endogènes contenus dans les
différents
organes. La présence de produits endogènes, dans la gamme des masses
concernées
pour les produits injectés (200-800 Da), a une autre conséquence très
importante sur la
sensibilité relative de la spectrométrie de masse. La sensibilité de la
spectrométrie de
masse est en effet conditionnée par la pureté des échantillons à analyser. La
présence
30 de sels ou d'autres impuretés dans l'échantillon à analyser peut faire
descendre de
plusieurs ordres de grandeur la sensibilité théorique de la spectrométrie de
masse.



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La mise en oeuvre d'une étape de détection d'un signal de
radioactivité, qui ne nécessite aucun traitement visant à isoler les produits
que l'on
souhaite identifier, à l'aide d'un radioimageur convenable, permet la
détection de ces
produits de façon optimale, associée à une étape d'analyse fine des produits
radioactifs ainsi sélectionnés, permet d'obtenir les performances recherchées
du point
de vue de la sensibilité de la détection des produits dans les différents
organes ou
tissus.
Exemple 4 : Analyse de la distribution tissulaire de mélanges de
composés radiomarqués au fluor 18 par tomographie d'émission de positons
(présence
d'une étape (l') selon l'invention).
Matériel et Méthodes
Animaux : les expériences ont été réalisées sur des rats Wistar de
200 g (Janvier) nourris ad libitum, stabulés en animalerie conventionnelle
(atmosphère
contrôlée, nictipériode 12/12). Les rats sont anesthésiés par un mélange
gazeux 3,5
isoflurane sous OZ pour la phase d'induction et maintenus à 2% d'anesthésique
durant
toute l'acquisition. L'injection du mélange (pour les co-injections) des
différents
traceurs est effectuée par voie intraveineuse sous forme d'un bolus de 300 ~l
dans un
laps de temps inférieur à 30 secondes pour les quatre animaux.
TEP : Quatre rats sont positionnés dans une caméra EXACT HR+
(Siemens) (63 coupes contiguës simultanées, résolution en mode deux dimension
mesurée à 1 cm du centre de 4,5 mm dans la direction transverse et 4,1 mm dans
la
direction axiale). La correction d'atténuation des tissus et du support pour
les rayons
gamma de 511 keV est obtenue par un scan de transmission avec des sources de
6gGe-
68Ga (15 min). L'analyse dynamique après injection des traceurs est réalisée
par
acquisition de 102 frames (25 * 0,2 min ; 19 * 0,3 min ; 20 * 0,5 min, 38 * 1
min).
Traceurs : Le [~8F]FDG est un marqueur métabolique de la
consommation de glucose ; le [18F]F-A85380 est un agoniste nicotinique az(34.
Deux
rats reçoivent le mélange (1 :1) des deux traceurs tandis que deux autres rats
reçoivent
un seul des deux traceurs. Pour tous les animaux, la dose totale administrée
par voie
IV rapide (bolus) est de 1,4*10~ Bq, en solution aqueuse sous un volume de 400
Vil.



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Analyse des données : Les régions d'intérêt sont tracées à l'aide du
logiciel CAPP et les concentrations de radioactivité sont exprimées en Bq par
ml de
tissu.
Résultats
La tomographie d'émission de positons après injection de mélanges
de produits radioactifs à un animal, permet de sonder rapidement la présence
dans de
tels mélanges de produits aptes, par exemple, à atteindre le cerveau ou bien
le coeur ;
sur un tel critère, il est possible de trier rapidement des mélanges, afin de
retenir
uniquement ceux qui satisfont aux critères de distribution tissulaire retenus.
Cette étape, combinée aux autres étapes du procédé permet ainsi la
détection de produits radiomarqués avec un seuil de détection très faible.

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Drawings 2004-11-22 29 853
Claims 2004-11-22 7 355
Abstract 2004-11-22 2 118
Description 2004-11-22 37 2,058
Cover Page 2005-03-10 1 56
PCT 2004-11-22 11 434
Assignment 2004-11-22 6 162
Correspondence 2005-03-08 1 31
Fees 2005-04-29 1 30
Assignment 2005-06-23 3 116
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Fees 2007-05-04 1 49