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1038786
La présente invention concerne une nouvelle substance
antibiotique designee ci~apres par le numero 31.559 RP, de
la formule generale:
OCH 3 CH 3 OCH 3 ~ pCH 3
,CH3 H3 ~C9_ ~ 3 ~CH3 ~ H
H C~ H~H ~ O /\~ O H H ~
H CH3 OH CH3
3 3
ainsi que ses sels métalliques, ses sels avec les bases azotées,
son procédé de préparation et les compositions q~li les contiennent.
Le 31. 559 RP présente un intérêt tout particulier par
suite de l'activité anticoccidienne qu'il manifeste à côté de
son activité antibactérienne et de son activité antimalarique.
Il est également particulièrement intéressant comme facteur de
croissance des ruminants et comme agent de lutte contre la
dysenterie des porcins.
Le 31.559 RP peut être obtenu ~ partir des milieux de
culture appropriés d'un nouveau microorganisme identifié plus
complètement ci-apr8s, appartenant au genre Streptomyces et
d~signé par l'appellation Streptomyces hygroscopicus DS 24.367
(NRRL 5787).
Le 31.559 RP contient du carbone, de l'hydrog8ne et
de l'oxyg8ne. La composition élémentaire de son sel de sodium
est voisine de:
C % -,63,2 H % _8,8 0 % =24,3 Na %_ 2,9.
Son équivalent neutre (détermin~ par dosage du sel
de sodium en milieu acétique par l'acide perchlorique) est de
836.
D~apres son analyse élémentaire et ses spectres de
RMN du proton et du carbone 3C, le sel de sodium du 31.559 RP
r~pond a la formule brute probable C44H73_75O13 ~4Na.
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D~autre part les spectres RMN du proton et du
carbone C permettent de mettre en évidence la présence de
quatre groupements méthoxy ~ans sa molécule.
Le sel de sodium du 31.559 RP est en outre caracté-
risé par les propriétés physico-chimiques suivantes:
- aspect: poudre microcristalline blanche ~
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- solubilité ~notation selon la Pharmacopée ~rançaise IX édi-
tion, 2~ partie p. 13 (1972)~
- pratiquement insoluble dans l'eau
- peu soluble dans les solvants hydrocarbonés tels que
llhexane
- soluble dans les alcools tels que le méthanol, les céto-
nes telles que ltacétone, dans le diméthylformamide et
llacétate d~éthyle
- facilement soluble dans les solvants chlorés tels que le
chlorure de méthylène et le chloroforme
- E_int de fusion (déterminé au banc Kofler): 220C (décom-
position)
- pouvoir rotatoire: (c = 1,050% - méthanol)
[~20 = + 51,2
Co~436 = ~ 101 ~ 1~5
r.a~36s = + 167 1 2
~ ~E~tre ultra-vlolet: (détermlnation ~ partir d~une ~olution
a 0~950 mg/ml dans l~éthanol) pas d~absorption caractéristique
~usqu~à 210 nm.
- ~ectre infra-rou~e: (déterminat~on à partir de comprimés en ~
mélange avec KBr). Ce spectre est représenté par la figure 1 dans
laquelle on a porté en abscisses, d~une part les longueurs dlon-
de~ exprim~es en microns (échelle supérieure) et d~autre part
le~ nombres d~ondes en cm 1 (échelle in~érieure) et en ordonnée~ -
les densités optique~0
Dans le tableau I, on indique les principales bandes
d~a~orption infxa-rouge pour ce produit exprimée~ en nombre
d~ondes (cm 1)o
387 86
TABLEA~ I
3430 ~ 1372 ép. 1090 ~p. 775 ~p.
3180 F 1362 ~p. 1072 ~ 765 ép.
2970 t~ 1350 ép. 1065 ép. 748 m
Z935 ~ 1335 ép. 1040 F 705 m
2925 ép. 1298 ép. 1018 ~ 655 ép.
2880 ~ 1292 m 1000 épO 635 m
2825 m 1260 ép. 985 F 610 f
2600 ép. 1238 F 968 t~ 590 tf
2060 tf 1220 ép0 940 ~ 570 ép.
1945 tf 1200 ~ 928 m 565 f
1850 tf 1190 ép. 912 F 550 f
1 1760 ti 1185 ép. 890 m 535 i
1 1730 tf 1170 F 870 F 500 tf
1630 ép. 1152 f 852 m 482 tf
1590 ~ 1~40 ép. 828 m 420 m
1450 ~ 1115 ~ 815 ép. 378 f
1398 F 1108 ép. 792 ép. 350 m
1380 F 1092 tF 788 m
tF z trè~ forte ~ = forte
m = moyenne f = faible
ti _ tr~s faible ~p. ~ ~paulement
~ e sel de sodium du 31.559 RP peut être encore ca-
ract~rlsé par chromatographie ascendante sur couche mi~ce de gel
de silice en utilisant deux systèmes de mélange de solvants:
- 1) ac~tate d~éthyle, cyclohexane, eau, butanol (50-50-25-5 en
volume~): dans ce système, le sel de sodium du 31.559 RP
a ~n Ri de 0,5O
- 2) chlorure de méthylane, méthanol (94-6 en volumes): dans ce
30système le ~el de sodium du 31.559 RP a un Rf de 0,7.
- activité bactériostatique in vitro:
:
--3--
,~ ' '''.
10387~36
~ e 31.559 RP montre une activité bactériostatique
qui s~exerce en particulier sur certaines bactéries prenant la
coloration de Gram.
~'activité bactériostatique du sel de sodium du
.31.559 RP vis-à-vis dlun certain nombre de germes a été déter-
minée par une des méthodes de dilution couramment employées à
cet ef~et. Pour chaque germe on a déterminé la plus petite
concentration de substance active qui, dans des conditions dé-
finies, emp~che tout développement visible dans un bouillon .
nutriti~ appropri~. ~es résultats des diverses déterminations
sont rassemblés dans le tableau I~ ci-apras où les concentra-
tions bactériostatiques minimales sont exprimées en microgram-
mes de substances par cm3 de milieu d~essai:
TA~LEAU II
Concentrations
. Organismes bactériens essayés minimales
bactériostatiques
. (en u ~cm3)
.
Staphylococcus aureus, souche209 P-A~CC 653~ 0,8
Staphylococcu3 aursu3, souche Smith 2,5
Sar¢ina lutea - ATCC 9341 1,9
Streptoooccus faecali~ - ATCC 8043 0,5
Streptococcus pyogenes hemolyticus, souche. 0,8
Dig 7 (In~titut Pasteur)
Diplococcus pneumoniae~ souche Til 0,2
(Institut Pasteur)
Neis~eria ¢atarrhalis (A152,InstitutP~st~ur) 50
~acillus subtilis - ATCC 6633 0,8
9aclllus cereus ATCC 6630 0,5
Myoobacterium species - ATCC 607 25
Esoheriohia coli - ATCC 9637 >150
.. Shigella dysenteriae, Shi~a ~ >150
(In~titut Pasteur)
Salmonella paratyphi A (souche Lacasse~>150
Institut Pasteur~
Salmonella schottmuelleri (paratyphi B),~150
(souche Fougenc, Institut Pasteur)
Proteus vulgaris >150
Pseudomonas aeruginosa >150
_ ~.~
~oxicite: 1038786
Cheæ le poussin, la dose l~tale 50% (D~50) du sel
de sodium du 3?1~559 RP est de 150 mg/kg p.o. en adm;nistration
unique.
Activité anticoccidienne: -
~ 'activit~ anticoccidienne du sel de sodium du
31.559 RP a ét~ déterminée chez le poussin infesté notamment
par ~imeria tenella et Eimeria acervulina.
~ 'acti~ité anticoccidienne du sel de sodium du
31.559 RP in¢orporé à la nourriture se manifeste ~ des concen-
trations non toxiques compr~ses entre 0,005 et 0,04% en poids
de produit contenu dans l'aliment.
Aciti~ité antimalariaue
,
~ e sel de sodium du 31.559 RP manifeste ~galement
une activité antimalarique vis-à-vis des infestations expéri-
mentales a pla~modium du poussin et de la souris.
~ 'organisme produoteur de l'anti¢o¢¢idien 31.559 ~P
est une souohe de streptomyce~ gul a ~té lsolée à partir d'un
~chantillon de terre prélevë en Inde, et à laquelle a été attri-
bU~ le numéro DS 24-367. Un é¢hantillon en a été déposé au Nor-
the?rn Regional Resear¢h Laboratory de l'U.S. Department of
Agri¢ulture à PeDr~a, Ill. (Etats-Unis)~ où il a été enregistré
~OU8 la référen¢e ~RR~ 5787.
~'isolement de oette sou¢he a été effectué en sui-
vant la méthode générale qui ¢onsiste à mettre une petite quan-
tlté de terre en suspension dans de lleau distillée stérile~ a
dlluer la suspension à diiférentes concentrations~ et ~ é~aler
un petit ~olume de chaque dilution sur la surface de boites de
Pétri aontenant un milieu nutriti~ géloæé. Apr~s une~ncubation
~; ~30 de quelques jours à 25C, qui permet aux microorganismes de
se développer, les colonies que l'on veut isoler pour en pour-
~. . -
suivre l'~tude sont pr~lev~es et repiquées sur des g~loses nu-
' '. ,,:
-5- ~ ~
~ ~ ' . ' .' ~.
~ 0 3 87 8 6
tritives inclin~es afin d'en obtenir des cultures plus abondantes.
La ~ouche de streptomyces DS 2~.367 se rattache à
l'espace Streptomyces h.y~ro~copicus dont les caractéristiques
es~entielles ont été définies par H.D. ~R~Sl~ER et E J. ~ACK~S
(Applied r~crobiology, 4, 243-250, 1956) et par S.A. WAKSMAN
(The Actinomycete~, II, ~he Williams and Wilkins Company, Bal-
timore, 1961, p. 230-231), c'est pour~uoi elle a été désignée
par l'appellatio~ Stre~__~vces hy~roscopious~ souche DS 24.367.
S. hy~roscopi-cu-s DS 24.367 présente en effet les
trois caractère~ suivants, qui correspondent aux trois carac-
téristiques p~r lesquelles H.D. TRESNEn et E,J. ~CKUS ainsi
que S.A. WAKSMAN d~finissent l'espèce S. h~y~rôsco~icu~:
a) se~ ~porophores se terminent d'une manière générale en spi-
rales ~errées ayant un enroulement de quelques tours; ces ~po-
rophore~ spiralés sont habituellement groupé~ le long d'un fi-
lament en formant des grappes plu8 OU moins allongées,
b) son my¢~lium aérien ~porulé, lorsqu'il est arriv~ à un bon
~tade de développement~ montre une ooloration gris fonoé cor-
respondant à oelle mo.ntrée par l'espa¢e S. hygroscopicus,
c) ~ur certains milieux de culture permettant un bon développe-
ment du myc~lium aérien, apparition par vieillissement dans les
surface~ sporulées de zones noire~, brillantes, d'aspect humide,
oaractéristiques de l'espè¢e S,_h2~ æsco~icus.
Dan~ le cas de S. hygro~copicus DS ~4.367, la formation
de mycélium aérien .ne se produit souve.nt ~ue d'une manière peu
abondante, ~aisant même défaut sur un ¢ertain nombre
1~)38786
de milieux de culture. ~orsqu'un mycélium aérien sporulé gris
appar~ t, la formation par vie~llissement de zones noires, lors-
qulelle a lieu, ne s'e*fectue généralement que dtune manière
assez discr~te, et elle est limitée ~ de petits points ou de
petites zones répartis par endroits sur le mycelium aérien
plut8t que sur sa surface toute enti~re. Elle est cependant
mani~este et elle peut ~tre observ~e en particulier sur gélose
à l'extrait de levure de Pridham, sur gélose à la ~arine d'a-
voine et à l'extrait de tomates de Pridham, et sur gélose
~lucose-asparagine.
~a souche S.h~grosco~icus cit~e comme référence par
S.A. WAKSMAN dans "The Actinomycetes" montre, sur les quelques
milieux de culture où son aspect morphologique est décrit, quel-
ques petites différences avec la souche DS 24.367, dont les
plus appréciables consistent en ce qu'elle forme un mycélium
aérien sur gélo~e nitratée au saccharose et ~ur gélose nutri-
tlve~ alors que sur ces deux milieux 1~ souche DS 24.367 n'en
forme pas, De plus~ sur un milieu contenant du sacoharose
comme source de car~one, S. hy~rosco~icus ne réduit pas les
nitrate8 alors que dans les m~mes conditions la souche
DS 24.367 réduit fortement les nitrates en nitrites. Toutefois~
ces quelques di~férences ~on~ trop peu importantes pour dis-
tlnguer la souChe DS 240~67 de l'espèc~ S. hygroscopicus dont
elle présente par ~illeurs le~ principales ¢aractéristique~
~ervant à la dérinir.
S.h~roscoPicus DS 24.367 ~orme des chaines de spo-
res qui, en g~neral~ se terminent en spirales ~errées d'un nom-
bre de tours limité, raxement supérieur a 3 ou 4, bien que, oc-
casionnellement, on puisse observer des spirales ~ormant un nom-
bre de tours plus important, ou aussi ~uelques chaines de spores
simplement recourbés dans leur partie terminale sans former un
tour complet, ou encore des spirales ~lus ou moins l~ches et
,
--7-- -
)38786
d~rouléesO ~'appareil sporifère présente une structure en grappe,
les sporophores spiralés, susceptibles de présenter eux-m~mes
quelques ramifications, étant insérés le long d'un ~ilament prin- -
cipal qui peut atteindre une assez grande longueur. ~es spores
sont ovales à cylindriques, mesurant 0,8 à 1,0 ~ / 0,6 à 0,8 ~.
Des examens microscopiques ont montré une organisation identique
de l'appareil sporif~re sur gélose de Bennett et sur gélose avoi-
ne-tomate de Pridham. Par son mode de sporulation, S. hygrosco-
~icu8 D~ 24~367 se place dans la section SPira de la classifica-
tion de Pridham.
S0 hy~roscopicus DS 24.367 se développe bien ~ 25C,
un peu moins bien à 37C~ et ne se développe pas ~ 50C. Dans
~e8 cultures effectuées à 25C, il pré8ente les caractères bio-
chimiques suivants:
-productlon de ~élanine : négative
-productio~ de H2S s négative
-ty~osinase s négative
-llquéfaction do la gélatine : po~itive
-utilisation de la cellulose : positive
-production de nitrites ~ partir des nitrates: forteme~t positive
-hydrolyse de l'amidon : positive
~culture sur lait : peptonigation3ans
coagulation; peu
de variationdu pH
en 1 mois i
~es caracteres culturaux de streptomYces hygroscopi-
CU8 DS 240367 sont rassemblés dans le tableau ci-dessous. Ce
sont ceux de culture arrivées à un bon stade de développement,
o'est-à-dire d'environ 2 à 3 semaines ~ 25C sauf indication3
contraires. Ces caractères ont été observés sur des géloses nu-
tritive5 et des bouillons habituellement utilisés pour déterminer
le3 caractères morphologiques des souches de streptomyces, les
-8-
.,
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- . . .. . - ~ . . . . , ... ,.. . ~, .. .. . .. . .. . .
1~38~86
cultures sur milieux gélosés étant e~fb~tuées sur des géloses
inclinées. Un certain nombre des milieux de culture employés
ont ét~ préparés d~apr~s les formules indiquées dans "~he Acti-
nomycetes~' (S.A. WAKSMAN, p. 193-197, Chronica Botanica Company,
Waltham, Mass., U.S~ ., 1950); dans ce cas, ils sont indiqués
par la lettre W suivie du num~ro qui leur a été attribué dans
"The Actinomycetes". ~es ré~érences ou constitutions des autres
milieux de culture sont les suivantefi:
- Ré~. A - Bennett's Agar" - S.A WAKSMAN - The Actinomycetes,
vol. 2~ pO 331- n 30 - The Williams and Wilk~ns Com-
pany, Baltimore, 1961
- Ré~O B - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. PRIDHAM et coll.,
Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950
- ~éi. C - Formule W-23, additionnée de 2% de gélose
- Ré~. D - "Yeast Extract Agar" - T.G. PRIDHAM et coll., Anti-
bioti¢s Annual "956-1957, p. 950
- R~i. E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. PRIDN~ et ooll.
Antlblotics Annual, 1956-1957, p. 950 `
- Réf. ~ - "Melanin ~ormation medium" - S.A. ~AKSMAN - The Actl-
nomgcetes, vol.2, p.333 - n 42 - ~he Williams and
Wilkins Company, ~altimore, 1961
- Réi. G - ~.E. GRUNDY et coll., Antibiotics and Chem. 2, 401,
1952
- Rbi. H - "Inorganic Salts Starch Agarn _ T.G.PRIDHAM et collO,
Antibiotics Annual, 1956-1957, p.951
- R~r. I - correspond à la ~ormule W-1, où 30 g de saccharose
sont remplacés par 15 ~ de gluco~e
- R~r. J - correspond à la ~ormule W-1, o~ 30 g de saccharose
sont remplacé 8 par 15 g de glycérine
- Réf. X - correspond à la iormule W-18, où 30 g de saccharose
sont remplacés par 15 g de glucose
.
_g_ ::
~'s ~,
1038786
Ré~ correspond à la formule ~-18, o~ le saccharose est suppri-
mé et remplacé par de petites bandes de papier ~iltre im-
mergées partiellement dans le liquide
Réf. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria"-
Society oi American ~acteriologist~, Geneva, N.Y.
II50-18
Réf. N - "Plain Gelatin" -préparé suivant le~ indications du
"Manual of Methods for Pure Culture Study of Ba~teria"-
Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,
II50 18-
Réf. P - ~ait écrémé en poudre commercial reconstitué selon les
indications du ~abricant
Réi. Q - Milieu indiqué pour la recherche de la production de
H2S par : H.D. TRESNER et ~0 DANGA-Journal o~ Bacterio-
logy, ~ 239-244~ 1958.
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. ~0,~ ~ v ~
~0 1~ 3c ~ 0 a~ -
.. :~ V O aV~ ~ ~ ~ c~ E 0 C n~ ~
_~ rl V t~ E s~ o ~ ~ v ~c~ o ~n ~o~ .....
V o p~ ~0 ~ O ~ 3 ~ 3 c~ -- V c ~o
'.,:....
. . .
1U38786
a capacité de Streptomyces h~oscopicus DS 24.367
à utiliser diverses sources de carbone et d'azote pour assurer ~on
d~veloppement a ét~ déterminée sui~ant le principe de la méthode
de Pridham et G~ttlieb (J. o~ ~act. 56, 107-114, 1948) ; le degré
de développement a ét~ observé, après un temps convenable d'incu-
bation à 25C, sur le milieu de base indiqué par les auteurs
en remplaçant soit le glucose par les diverses sou~ce9 de carbone
xespectivement essayées, soit S04(NH4)2 par le~ dlverses sources
d'a~ote respectiveme~t es~ayées. ~es résultats sont i.ndigués
dans le tableau ci-dessous: :
,
. '
: " . ,
~' ' .
1 ~,,
, ................................................................. .
~' .
! ~ . .. .
''~ ~ , ' .
'1 ( ' '
`-' ~ ',
_ 16 - ~
` 10 3 87 8 6
. _ _
Sources de carbone Sources d'azote
essayée~ Utilisation essayé~ Utilisation
. , . ~ ~:
D-Xylose po~itive, 3 positive :~
I-Arabinose positive N2Na positive
~-Rhamnose positive S04(NH4)2 positive
D-Glucose positive P04H(~H4)2 positive
DbGalactose posltive, Urée po3itive
mais lente
D-~ructo~e positive I_Asparagine posltive
D-Manno~e posltive, Glucosa~ine positive
mais lente
~-Sorbose n~gative Glycocolle positive
~actose positive .Sarcosine positive
Maltose négative D~-Alanine posltlve
~aocharose positive D~_Valine positive
Acite
~réhalo8e poslti~e IL-aspartigue positive
Cellobiose positi~e ~-glutamique positlve
Raf~inose positive I Areinine po~itive .
Dextrlne positive ~-Iyslne positive
. Inuline positi~e DI-Sérine positive : :
Amidon positive DI-Thréonlne positiYe ~ :
Glycogène po~ltive D~-N~thionlne négative j .
lycérol positi~e Taurine négativ~ ~
: Erythritol négative D~-Phény~b~n~ mais lente ...
Adnnltol po~ltive ~-Tyrosine po~itive . .
Dulcitol négative DL-Proline ositive
~3 ~ D-Y~nnltol positive I_Hydro2ypr~ine ositive
;~ ~ D-SorbitoL n~gative ~-Histidine ositive ..
~nositol négative I-Tryptophane ositive,
~ : . mais lente -
;~. Salicine négative . Bétaine négative
. . .
-16(bis)- .
1~)38786
~ e procédé de préparation de 31~559 RP consiste essen-
tiellement à cultiver Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 ou
ses mutants producteurs sur un milieu et dans des conditions
appropriés et à séparer le produit formé au cours de la culture.
~ a culture de Streptomyces hydroscopicus DS 24.367
peut ~tre effectuée par toute méthode de culture aérobie en sur-
face ou en pro~ondeur mais cette dernière est à préférer pour
des raisons de commodité. On utilise à cette ~in les dif~érents
types d'appareils qui sont d'un usage courant dans l'industrie
des fermentations.
On peut en particulier adopter la marche suivante pour
la conduite des opérations:
Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 - stock
culture sur gélose
culture en flole agitée
culture inoculum en iermenteur
.,' 1
culture de production en fermenteur
~e milieu de iermentation doit contenir essentiellement une sour-
ce de carbone et une æource d'azote assimilables, des éléments 'f
minéraux, en parti~ier des chlorures, et éventuellement des
raoteurs de croissance, tou~ ces éléments pouvant etre apportés
80U9 ~orme de produits bien dé~inis ou par des mélanges comple-
xes, tels quton en rencontre dans des produits biologiques
d'origines diverses.
Comme ~ources de carbone assimilable, on peut utiliser
de~ hydrates de carbone tels que le glucose, les deztrines,
l'amidon ou d'autres substances hydrocarbonées comme des sucres
a}oools (glycérol) ou comme certains acides organiques : acides
lactique, citrique. Certaines huiles animales ou végétales
-17-
.
1~ 3 87 ~ 6
comme l'huile de lard ou l'huile de soja peuvent remplacer avan-
tageusement ces di~férentes sources hydrocarbonées, ou leur 8tre
ad~ointes.
~ es sources convenables dlazote assimilable sont extra-
ment vari~es. Elleæ peuvent atre des substances chimiques très
simples comme le~ Rels minéraux ou organiques dlammonium, llurée,
certains acide~ ~minés. Elles peuvent aussi être apportées par
des sub~tances complexes contenant principalement l'azote sous
~orme protidique; caséine~ lactalbumine, gluten et leurs hydroly-
sats, ~arine de soja~ dlarachide, de poisson, extraits de vian-
de, de levure~ distillers' solubles, corn-~teep.
Parmi le~ él~ments minéraux a~outés, certains peuvent
avoir un ef~et tampon ou neutralisant comme les phosphates alca-
lins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium ou de ma-
~nésium.D'autresapportent l'équilibreionique nécessaireau développe-
ment de Streptom~ce~ ~y~ro~copicus DS 24 367 et à l'élaboration
du 31.559 RP comme les chlorures et sulfate3 de~ métaux alcalin~
et alcalino-terreux. En~in certains a~i~sent plus ~p~cial~ment
oomme activateurs des réactions métaboligues de Streptomyces
~Y~roscopicus DS 24.367, ¢e sont les sels de zinc, de cobalt, de
~er, de cuivre, de manganase.
~es ~acteurs de croissance sont de~ produits de nature
~itaminique tels gue la ribo n avine, l'acide ~olique~ l'acide
pantothénigue,
~e pH du milieu de ~ermentation de départ de la culture
doit être compr~s entre 5,8 et 7,8 et de pré~érence entre 6,2 et
7~4. ~a température optimale pour la ~ermentation est comprise
entre 25 et 30C, mais une production satis~aisante est obtenue
pour des températurès comprises entre 23 et 33C. ~!aération
de la fermentation peut varier entre des valeuræ assez larges.
On a cependant trouYé que des aérations de 0,3 ~ 3 litres d'air
par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement
~ 387~6
bien. ~e rendement maximal en 31.559 RP est obtenu apr~s 2 à 8
jours de culture~ ce temps dépendant essentiellement du milieu
util~s~.
Dlaprès ce qui précade, on conçoit que les conditions
gén~rales de la culture de Streptomyces ~ygroscopicus DS 24.367
pour la produetion du 31 559 RP peuvent varier dans une lar~e
mesure et être adaptées ~ chaque nécessité particulière.
~ e 31.559 ~P peut 8tre isolé des mo~ts de ferme~tation
de la manière ~uivante:
~e mo~t e~t ~iltré ~ un pH acide~ généralement compris
entre 3 et 6 et de préférence voisin de 5. ~activité retenue
dans le ~teau de filtration en est extraite à llaide d!un sol-
v~nt approprié, alcool inférieur, par exemple le m~thanol ou un
~olvant chloré tel que le chlorure de méth~lène.
Aprbs un traitement alcalin approprie le 31.559 RP peut
~txe isolé SOU5 ~orme de sel de sodium à partir de~ solutions
mentionnées ci-dessus par cri~tallisatlon~ après concentration
sou8 pressio~ réduite éventuellement suivie d!une dilution par
un non-solvant on un mauvais solvant et d'un séjour en chambre
~roide.
~e 31 559 RP ou son sel de sodium peut être purifi~
par le~ méthodes classiques en usa~e, telle que la cristallisa~
tion, la chromato~raphie sur diver~ a~ents adsorbants ou la dis-
tribution à contre-courant.
~exemple suivant, donné à titre non l~mitatii, montre
comment llinvention peut être mi~e en pratique.
Exem~le-
~) - Fermentation
On char~e dans un fe~menteur de 170 litre~:
30 - peptone 1200 g
- extrait de levure ... 600 g
.
.
- 1~3~3786
- -glucose monohydraté 0.. 1200 g
-g~lose ~O~ 240 g
-eau de ville compl~ment pour .................. 110 litres
~ e pH est ajusté à 7~30 par addition de 70 cm3 de
coude 10 No On ~térilise le milieu par barbotage de ~apeur ~
122~ pendant 40 mlnutes. Après refroidi~sement, du fait de la
condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volu-
me du bouillon est de 120 l~tres et le pH est de 6,85. On ense-
me~ce alor3 avec 290 cm~ d'une culture en erlenmeyer agité du
Streptomyce~ hygroscopicus DS 240367. ~a culture est developpée
27-C penda~t 25 heures en agitant et en aérant avec de l'air
~térile; elle e~t alors convenable pour l'ensemencement de la
culture productrioe.
~ a culture produ¢trice est e~fectu~e dans un ~er-
me~teur de 800 litre B chargé a~ec les substances suivantes:
- dlstiller~' solubles .0O 2 kg
- haricot~ en grains ... 10 kg
- glycérlne ... 6 kg
- ohlorure de sodium ... 2 kg
- solutlon de chlorure de cobalt hexa-
~y.draté, à 20 g/l ... 0,4 litre
- eau de ville qOs.p.......................... .365 lltres
~e pH du milieu est a~usté a 7,50 par addition
de 200 cm3 de soude 10 N, puis on st~rilise le bouillon par
barbotage de ~apeur à 122C pendant 40 minutes. Après refroi-
di~sement, du ialt de la condensation de la vapeur au cours de
1~ et~rilisation~ le volume du ~ouillon est de ~90 litres; il
est complété à 400 litres par addition de 10 litres de ~olu- . .
t~o~ aqueuse stérile contena~t: :
~ gluco~e mo~ohydrat~ ,.0 4 kg :
~e pH du milieu e~t égal à 6,65; on ensemence
avec 40 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 li-
., ,
1()38786
~xes décrite ci-desæu~O La cultur~ est developpée A 27C durant
~13 heure~ en agitant avec une turbine tournant ~ 205 tourg/minute
et en aérant avec un volume d'air ~térile de 20 m3/hO En fin d'o-
p~ration, le pH de la culture est de 7,65 et le volume de 380 li-
tres.
B) - Extraction
_________
400 litres de mo~t obtenu comme indiqu~ précédemment
sont amenés ~ pH 5 par addition de 2,8 litres d'une solution d'a-
cide cblorhydrique 6 ~ puis agité~ pendant une demi-heureO Après
addition de 20 k8 d'ad~u~art de filtration~ le mo~t est filtré
sur ~iltre-preaee et le gateau d~ filtration est lavé sur le filtre
par 100 litre~ d'eau dont le pH est a~usté ~ 5 par une ~olutio~
d'aclde chlorhydrique 6 N. Le iiltrat et le lavage sont élimin~s.
~e gâteau de filtration est délité dans 300 litre~
de m~thanol~ le mélange obtenu a~usté à pH 7 par addition de 200
cm3 de ~oude 6 N et agité pendant une demi-heure.
~e mélange est filtré sur filtre-pre~se et le g~teau
de iiltration la~ sur le filtre par 80 litres de méthanol. ~e
~lltrat et le la~age sont r~unis et concentrés sous pression r~-
dulte (5 à 10 mm de mercure) de façon à obtenir 30 litres de con-
oentrat aqueux. Ce concentrat est a~usté ~ pH 3 par addition de
290 om3 d'acide chlorbydrique 6 N~ puis agit~ pendant 10 minutes
en présence de 30 litres de chlorure de méthylène. ~es deux phases
~ont s~parées. On extrait encore deu% fois selon ce procédé la
phase aqueuse par 30 litres de ohlorure de méthyl~ne ~ chaque rois.
~es trois e~traits chlorométhyléniques sont r~unia
et agités avec 9 litres d'eau~ e~ acidifiant ~u~qu'à obtention de
pH 3 dans la pha~e aqueuse (20 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N)o Ia
pha~e org~nique est séparée et lavée par 18 litre~ d'eau, en ajou-
tant de la soude jusqu'~ obtentio~ de ~H 9,5 dans la phase aqueuse
( 20 cm3 de soude 6 N).
Ia pha~e chlorom~thyl~niqu~ est concentrée 80us pre~-
-21-
.. ,....... , . ,. , " ., , .. -,. ., ,.. , - , . .. . .
:1~3~786
sion r~duite ( 5 à 10 mm de mercure) ju~qu'au volume~d~ 1 litre.
C) - Purification
___________
~ e concentr~ chlorom~thyl~nique obtenu pr~c~dem-
ment est vers~ lentement dans 10 litres d'hex~ne ~ la tempéra-
ture amblante.
~ a solution est filtrée, on sépare ainsi 6~ g d'un
insoluble ~nacti~.
~ e ~iltrat est concentré 80U8 pression réduite
( 5 ~ 10 mm de mercure) ~u~qu'à un volume de 0,5 litre environ.
Cette solution est agitée pendant 2 heures à la température de
oa pu18 on laisse reposQr 24 heures à +4C.
~es cristaux obtenus sont isolés par centrlfuga-
tion de la solutlon puis la~és par 250 cm3 d'hexane ~ +4C et
s~ohés sous pression r~duiteO
On i601e ainsi 103 g du sel de sodium du 31.559 RP.
D) - Recri~tallisation
_________________ .
57 B du ~el de sodium du 31~559 RP préc~demment
obtenu sont mis en solution dans 1~2 litre d'ac~tone et agit~s
, pendant 15 minutes. On a~oute 2~5 g de noir décolorant lavé ~
l'aoide chlorhydrique, pUi8 agite à nou~eau pendant une demi-
heure et enfin s~pare le noir décolorant par filtration.
~e filtrat agité lentement ast add~tionné de 750
om3 d'eau di~till~e. ~e sel de sodium du 31.559 RP cr~tallise
lentement à la température de 0C~
~es cristaux so~t 1#ol~8 par ~iltration? lav~s
par 150 cm3 du m~lange acétone/eau (50-50 en volumes) et ~ch~s
~OUB pres~ion r~duite à 35C.
On obtient 35 g du sel de ~odium du 310559 RP-
Par concentration de~ eaux-mères ~ la moitié de
leur volume init~al, puis re~roidi~sement ~ 4C~ on obtient
nou~esu 13,2 g de se,l de sodium du 310559 RPo
~n autre ob~et de la prése~te inventio~ est cons-
-22-
: , . . . ., ., .. .. , , : ; .,~ . . ., :
~ 38786
titué par les compositions anticoccidiennes qui contiennent le
31.559 RP ou se~ sels métalliques ou ~els avec les bases azotée~
et, plu~ particuli~rement, par le~ aliments mixtes pour animaux
ou le~ m~langes concentr~ pour l'ali~entation animale renfer-
mant le 31.559 RP ou ses ~els métalliques ou ~els avec leR base~
azotée~, éventuellement en présence d~un autre agent anticocci-
dien. Ce~ compositions sont particuli~rement utiles pour lutter
contre la coc¢idiose des volatile~ et plus spéci~lement de la
volallle,
~a do~e néces~aire pour produire un e~fet convena-
ble peut naturellement varier dan8 dla~sez large# limites sui-
~ant la valeur des aliments eux-memes,
D~une façon g6nérale, $1 ~uiilt que les rations ali-
menta~re# misesà laaisposition des animau~ cont~e~nent de 0,005
0,04 % en poids de 31.559 RP ou de ses sels métalliques ou ~els
~oc les bases azotées.
~e 3~0559 RP ou ses sels métalliques ou sels avec
le~ bases azoté~s peut être réparti en disper~ion uni~orme dans
le~ aliment~ ¢omposés complets aux doses ci-dessus,
I1 peut atre répartl da~s les aliments ¢omplémen-
talres ~ une dose de 09025 à 1%, le plu8 souvent ave¢ d~autres
addltifs tels que ~itamines et sels min~rauxO Ces aliment~ com-
plémentalres peuvent etre soit mélangés à la ration~ soit con-
so~més tels guels~ et représentent habituellement 5 à 20% de la
ration.
~es "prémixes"~utilisés pour la préparstion de~ ra-
tions ¢omplbtes ou des aliments complé~entaires contiennent ha-
bituellement de 0~05 ~ 20% de 31.559 RP ou de ses sels métalli-
queo ou sels avec les bases azotées dilu~ dan~ u~e charge alimen-
taire. Il~ con~tituent un intermédiaire commode facilitant la ré- ;
partition uniiorme du produit actii dans les aliments. ~es pré-
mixes eux-même3 eont généralement obtenu~ ~ partir de concentré 9
-23-
387 8 6
qui ~ontien~lent de 99,9 ~ 20% de 31,559 RP ou de ~e~ sels m~-
talliques ou sels avec le~ bases azotée~ additionn~ de dénatu-
rant~ comestibles telæ que colorants alimentaires, aromatisants,
agents dispersant~ ou évitant l'agglomération et charges alimen-
ta~res.
~es concentr~s et prémixes sont généralement pul_ -
véxulents. Les aliments complémentaires et le~ aliments composés
complet~ peuvent être soit pulvérulent~, soit sous ~orme de Bra-
nulé~ pr~parés ~elon les technique~ habituelles.
~exemple ~uivant, donnée à titre non limitatif,
illu~txe une campo~ition selon l~invention.
_ emple A:
On prépare un ali03nt ayant la composition suivante:
- farine de~s is~ue~ de céréales 0-- 13~41%
- farine d~orge ... 13,41~
- ~rine de mais ..- 13~41%
- farine de blé ... 31,32%
- ~axine de poi~on 0O. 8~9~%
- ~arlne de so~a ... 8,92%
- farine de ~ourrage déshydraté- ... 4~56%
- extrait~ de levure ... 2,33%
- lait ~ec en poudre ... 2,68%
- ~hlorure de sodium Ø 0.09%
- chlorure de calcium ... 0~89%
- élément~ minéraux ... 0~06%
- complexe vitamlniques
vitamine A ... 4000 UI/kg
vitamine D3 0.. 1000 ~I/kg
chlorure de choline O.. 11,5 mg/kg
ribo~lavine 0.. 2,24 mg/kg
-24-
,
1~38786
A cet aliment9 on ajoute et r~partit uniformément
0,02% de sel de sodium du 31.559 RP.
Un autre objet de la pr~sente invention est consti-
tué par les compositions utilisables comme facteur de croissance
chez les ruminant~ (bovins, ovin~ caprin~) et comme agent de lut-
te contre la dysenterie des porcs.
Ce~ compositions æont constituées par les aliments
mixtes pour les ruminants et les porcs et par les méla~ges
concentr~ pour l'alimentation animale renfermant l'antibiotique
31.559 RP ou ses sels.
~ a dose nécessaire pour produire un e~fet convenable
peut naturellement ~arier dans de larges limites sui~ant les es-
pè¢es animales et suivant la valeur nutriti~e des aliments eux-
m~mesO
Il est particulièrement avantageux de mettre 8 la
disposition des snimaux une quantité Journslière d'antibiotique
31.559 ~P compri~e entre 50 et 250 mg psr t~te d'snimal.
De préférence l'antibiotique 31.559 RP e~t réparti
dans des aliments complémentaires qui en contiennent de 0,01 a
0~1%,1e plus sou~ent avec d'autres additifs tel~ que vitami~es et
sele minérauxO Ces aliments complémentairee peuvent etre soit mélan-
gés ~ laration soit consomméstels quel~ et ils représentent habi-
tuellement environ 1 à 10% de la ration Journalière; le 310559 RP
oorrespond à 0,0001-0,01% en poids de la ration journalière,
~ es"prémixes", utilisés pour la pr~paration des ra-
tions compl~tes ou des aliments complémentaire~ contiennent géné-
ralement de 0~1 à 5% d'antibiotique 31.559 RP dilué dans une char-
gè alimentaire~ Ils constituent un intermédiaire commode facili-
tant la r~partition u~iforme de l'antibioti~ue 31.559 RP dans
30 ~ le~ aliments ~es "prémlxes" eux-mames sont généralement ob-
_25-
.. . ... . . . . . . .
~38786
tenus ~ partir de concentr~ qui contiennent 99,9 ~ 5% d'anti-
biotique 31~559 RP additionné de d~naturants comestibles tels
que colorant~ alimentaire~, aromatisants, agents dispersants ou
itant l'agglom~ration et charges alimentaires.
~es concentré~ et "prémixes" ~ont généralement
pulvérulent~, ~e~ aliments complémentaires peuvent être soit
pulvérulents soit 50US foxme de granulé~ préparés ~elon les tech-
niques habituelle~ Dans ces compositio~s, l'antibiotique
31,559 RP ou ses sels peut 8tre sous forme de fine~ particules
libres ou recouvertes d'un enrobage.
~exemple suiva~t, donné ~ titre non limitatif,
montre l'utili~ation de ~antibiotique 31.559 RP comme facteur
de croissance:
Exemple BL
Douze ~eunes boeuf~ de race Holstein sont placés
aans des oellules individuelles dont la ~urface moyenne est de
48 m puis so~t pesés.
~es aliment~ à étudier sont dlstribués à partlr
du Jour 0, Jour de la mise en place de l'sssai.
~es boeufs sont en~uite pes~s au bout de 28 ~ours
pUi8 de 56 Jours et le poids des aliments consommés pendant
oette période est déterminé.
~e~ moyennes des gains de poids et de taux de con-
verslon alimenbalre so~t déterminés pour cha~ue allment étUdié
aans le~ i~tsrvalles 0-28 Jours et 28-56 Jours.
~e~ anlmaux reçoivent leur nourriture deux fois
par Jour. ~a ration Journalière est d~terminée de telle ~orte
''
.,~.
,;.
~ p - 26 -
, .
.. `` ., ' ' - . . ' .... ~ . ' , . : , ' . '. !- ' . . ' ' .
1~3~7~6
que les boeufs absorbent le maximum de nourritl~re sans en laisser.
Dans l~essai~ les jeunes boeufs sont répartis en 3
groupes. Chaque animal re~oit un aliment de ~ase qui est constitue
de mais, de foin et d'un supplement proteique.
Chaque animal du groupe I reçoit l'aliment de base.
Chaque animal du groupe II rec,oit l'aliment de base
dans lequel le supplement proteique contient 100 mg d'antibiotique
31.559 RP.
Chaque animal du groupe III reçoit l'aliment de base
dans lequel le supplement proteique contient 200 mg d'antibiotique
31.559 RP.
La ration journalière moyenne par animal a la composi-
tion suivante:
_ _
~ _ Groupe IGroupe II_Groupe III
mais 8,86 kg8,96 kg 8,91 kg
foin 1,46 kg1,45 kg 1,47 kg
supplément proteique~ 0,49 kg 0,5 kg 0,Sl kg
antiblotique 31.55g RP I100 mg 200 mg
~Le supplément protéique utilisé est le "PRO BLEND 50" marque de
commerce de la Société Landmarck, Inc., qui se compose en parti-
culier de:
~quivalent protéique total7/50% ,
lipides 71%
fibres végétales ~9
vitamine A -765.000 unites/k~
Les résultats obtenus sont rassembles dans les
tableaux suivants:
- 27
1~)38786 ;
I - Poids mo~en en kg (par animal)
,
,. .
au ~our 0 à 28 ~our~ ~ 56 jour~ ~:~
. __ ~ -' ~ . '
Groupe I 285,1 325,2 374,5 :~
.- . .... _ ... .
Groupe II 284,9 325,2 381,1
. .
Groupe III 286,6 333 387
II - Variatlon du ~oids mo~en et taux de conversion
. _ ,
0-2l Jourl A .__ _ 28-5i jour3 0-56 Jour~ _
Groupe Groupe ~roupe Gr~e Gr~4~ Gro~ Groupe Groupe Gro~e
. I II ~I I II III I II III
__ . . .
G~ln de poid~
mo~en en kg
par anlmal 40,1 40,3 46~4 49,3 55,9 54 89,4 96,2 100,4
..
Gain de poids
moyen en kg
par ~our par :- :-
. anlmal 1~43 1~44. 1~65 ~76 1,99 1~93 1~59 ~72 1,79
_ ...... . , ' '
Consommation . ;
mo~enne en
kg par Jour . . ~ .
3o par animal 9~83 9~76 9,84 11,78 12,5 ~1,94 10,81 lO,9 I0,89 :~ _ . __ __
~aux de .
conver~ion 6~86 6,77 5,94 6,70 6,04 6,19 6,77 6,34 6,08
.:.
.
_28-
.
. .
1~3~7~36
Ainsi pendant le~ 28 premiers jours, les animaux
rece~ant 100 mg par tate et par ~our de 310559 RP ont un gain
de poids de 3% ~up~rieur et un taux de con~ersion de 1,3~ ini~-
rieur à ceux des animaux témoin~ et ces pourcentage~ sont respec
tivement de 15~3% et 13,4% pour les ~nimaux recevant 200 mg par
t~te et par ~our de 31O559 RPo
Pendant la seconde p~riode (28-56 ~ouræ), les zni-
mau~ recevant 100 .m8/~our de 31.559 RP dépaæ~ent ceux recevant
la dose la plu~ ~orte. ~es gains de poids 80nt alors de 13,4%
supérieur~ et les taux de conversion de 9,8% iniérieurs ~ ceux
des t~moins ~ la dose de 100 mg/~our et ce~ pourcentages sont
respectivement de 9~6% et 7~6% pour la doæe de 200 mg/Jour.
Sur la période totale de l'essai (56 jouræ), les
gains moyen~ ~ournaliers sont améliorés de 7,8% et 12,2% et les
tBUX de converaion de 6~4~ et 10~2% par rapport aux témolns, aux
do~e~ re~pectl~es de 100 et 200 m ~ ~our de 31.559 RP.
, .
.
-29~
