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NO W EAUX SUPPORTS POR~EURS DE CHAINES LATERALES, PROCEDES D'OBTEN-
TION DE CES SVPPORTS, PROCEDES DE FIXATION DE COMPOSES ORGANIQUES
COMPORTANT UN RESIDU GLUCIDIQUE SUR LESDITS SUPPORTS, PRODUITS ET
REACTIFS RESULTANT DE LADITE FIXATION CHIMIQUE.
La présente invention est relative à de nouveaux supports
solides insolubles porteurs de cha~nes latér~les portant au moins
un -NH2 réactif 3 leurs proc~d~s d'obtention, ~ un proc~dé de fixa-
tion chimique de compos~s organiques comportant un résidu glucidi-
que sur ces supports, ainsi qu'aux produits et aux réactifs r~sul-
t~ de ladite fi~ation chimique.
Il est connu de fixer des protéines biologiquement actives
(telles qu'hormones~ antig~nes, enzymes, par exemple) sur des 8Up-
ports solides insolubles constitués par des sph~res de latex por-
teuses de chaines latérales se terminant par une fonction amine pri-
maire, par ré!action des groupements actifs des acides amin~s de la
cha~ne proté!ique, avec les fonctions amine primaire du support. Il
a également éte proposé d'utiliser des antigènes fixés de la manière
qui vient d'etre très succinctement décrite, en tant que réactifs
biologiques, mais en association avec des révélateurs.
La technique qui vient d'atre mentionnée est décrite, notam-
ment, par R.S. MOLDAY, W.J. DREYER, A. REMBAUM et S.P.S. YEN dans
"The Journal of Cell Biology", Vol. 64 (1975) 75-88 et par R.W.LIM,
R.S. MOLDAY, H.V. HUANG et SHIADO-PI~ S.YEN dans "Biochimica et
Biophysica Acta" 394 (197S), 377-387, qui préconisent la fixation
d'anticorps sur des sphères de latex, par couplage des anticorps par
l'intermédiaire de leurs fonctions amine primaire par liaison de co-
valence sur des sphè~res de latex, sur les~uelles ont préalablement
é!t~ fixé!es des chaines laterales se terminant par une fonction amine
primaire activée par action d'activateurs tels que glutarald~hyde,
bromure de cyanogène ou carbodiimide hydrosoluble.
Un tel procédé de couplage des protéines par l'intermédiaire
, ~ ., . . ~. : . .
.
5~)8
de leurs acides amin~s, pr~sente tDutefois l'inconvénient de faire
appel, pour la réalisation du couplage, aux groupemsnts biologi-
quement actifs des acides amin~s de la chaine protéiqus et de ré-
duire, de ce fait, dans certains cas, l'activit~ biologique de la
molécule protéique fix~e. De surcroft, les proc~dés préconisés,
notamment, par R.S. MOLDAY et Collaborateurs, donnent lieu ~ des
couplages relativemen~ peu stables et à des rendements relativement
faibles, qui réduisent encore lsur intér8t technique et économique.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de
pourvoir à un procédé de fixation chimique de protéines biologique-
ment actives, sur un support porteur de cha~nes latérales portant
au moins un -N~2 réactif, et ne faisant pas appel, pour la réalisa-
tion du couplage, aux groupements biologiquement actifs des acides
aminés de la chaine protéique. En effet, les protéines, telles
qu'anticorps, antig~nes et un certain nombre d'hormones et d'enzy-
mes, dont la fixation par couplage chimique sur des supports a été
décrite dans l'~rt antérieur, sont des glycoprotéines dont le grou-
pement prosthétique, à savoir le résidu glucidique, ne contribue
en aucune manière à l'activité biologique de la molécule.
Le Demandeur a développé, de façon surprenante, un procédé
de fixation chimique de compos~s organiques co~portant un résidu
glucidique, sur un support, par l'intermédiaire dudit résidu, qui,
outre qu'il ne fait appel à aucun des groupements actifs du compos~
organique fixé, réalise une fixation d'une très grande stabilité,
avec des rendements satisfaisants, sans réduire, dénaturer, ni inac-
tiver l'activité spécifique du composé organique fix~. L'on vient
de se référer dans ce qui précède à la fixation d'un "composé orga-
nique comportant un résidu glucidique", et non plus seulement à la
fixation d'une glycoprotéine : en effet, en permettant de réaliser
la fixation chimique du composé en cause par l'intermédiaire de
son résidu glucidique, le procédé qui fait l'objet de la présente
invention a une portée plus étendue que les procédés préconisés dans
~t~8350~ lf
l'Art ant~rieur, en ce qu'il est applicable non seulement aux
glycoprot~ineq, mais ~ tous autres compos~s organiques biologi-
quement actifs ou pr~sentant un int~r~t industriel, lor~qu' il8
sont couplés avec un ~upport tel que défini plu8 haut, à condition
que Ceff~ compos~s organiques comportent un résidu glucidique. Parmi
de tels "compos~s organigues comportant un r~sidu glucidique" on
peut ranger, entre autres, non seulement les glycoprotéines, mais
aussi les polysaccharides et les glycolipides.
L'invention a pour objet un procédé de fixation chimique
de composés organiques comportant un résidu glucidique, sur un sup-
port comportant au moins un -NH2 réactif, lequel proc~dé est carac-
t~risé en ce que l'on transforme, au cours d'un premier stade, au
moins un groupement -CH20H du résidu glucidique du composéf organi-
que, en un groupement -CH0, par oxydation, et en ce que 1' on fait
réagir, au cours d'un second stade, le(s) groupement(s) -CH0 obte-
nu(s), au moins avec un -NH2 réactif porté par deff chaines latéra-
les fixées sur un support solide insoluble, réfalisant ainsi la
fixation chimique du compos~ organique sur ledit support, et, dans
le cas où le -~H2 est une fonction amine primaire, 1'on stabilise
la base de Schiff formée, par réduction chimique.
Selon un mode de réalisation avantageu* du proc~dé! qui fait
l'objet de l'invention, l'oxydation du groupement -CH20H en groupe-
ment -CH0 est r~alis~e à l'aide de periodate de sodium.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procéd~ qui
fait l'objet de la présente invention, l'oxydation du groupement
-CH20H en groupement -CH0 est r~alisée par voie enzymatique.
Selon encore un autre mode de r~alisation avantageux du pro-
céfdé qui fait l'objet de la pr~sente invention, le composé organi-
que comportant un r~sidu glucidique est soumis, pr~alablement à
la transformation d'au moins l'un de ses groupements -CH20H en un
groupement -CH0, par oxydation, ~ un traitement par la neuramini-
dase, lorsque le résidu terminal des chaines glucidiques est un
".~ "
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acide sialique, lequel traitement ~limine ledit acide sialique.
Selon un mode de r~alisation avantageux du stade d'oxydation
du groupement -CH20H en groupement -CH0 par voia enzymatique, llen-
zyme mise en oeuvre est choisie, en fonction de l'avant-dernier
r~sidu de la cha~ne glucidique, dans le groupe qui comprend les
oxydases qui oxydent les sucres, telles que, notamment, la glucose-
oxydase, la fucose-oxydase et la galactose-oxydase, si l'avant-
dernier résidu de la cha~ne glucidique 0st r~spectivement du gluco-
se, du fucose ou du galactose.
Conformément ~ l'inJention, lorsque la chaine latérale du
support susdit porte une fonction amine primaire terminale, la
r~action entre le groupement -CH0 du composé ~rganique ~ fixer sur
le support et ladite fonction -NH2 , donne lieu à une base de Schiff,
qui est stabilisée, au cours d'un troisième stade du proc~dé qui
fait l'objet de la présente invention, par r~duction chimique,
l'agent réducteur mis en oeuvre étant de pr~férence le NaBH4.
Une telle stabilisation n'est pas n~cessaire dans le cas où
les cha~nes latérales se terminsnt par un groupement -NH-NH2, qui
forme en pr~ésence du groupement -CH~, une hydrazone stable, ni dans
le cas où elles comprennent en même temps un -NH2 et un -SH, qui
forment en présence du groupement -CH0, un hé~rocycle, qui est un
cycle thiazolidine dans le cas où le -SH est en position ~- par
rapport au -NH2.
Le procédé de fixation chimique de composés comportant un
résidu glucidique, sur des supports solides, insolubles,porteurs de
cha~nes latérales comportant au moins un -~H2 réactif, qui fait
l'objet de la présente invention, donne lieu à des produits de cou-
plage qui sont utilisables,- en particulier, en tant que r~actifs
biQlogiques.
Le Demandeur a pu établir de facon surprenante que la r~ac-
tivité et la stabilité des produits de couplage obtenus est d'autant
plus grande que le compcsé organique est coupl~ au support par une
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cha~ne lat~rale suffisamment lo~gue. Il a pu ~tablir également, de
façon surprenante, que les r~actifs de diagnostic constitu~s par
les produits de couplage susdits, pr~sentent des qualités de sensi-
bilité et de précision que ne présentent pas les réactifs de diag-
nostic du meme type proposés conformément à l'Art ant~rieur.
Les supports utilisables pour fixer chimiquement des com-
posés organiques porteurs d'au moins une fonction -CH0, sont des
supports solides, insolubles, pris notamment dans le groupe qui
comprend des sphères de latex, des billes de gel d'agarose ou de
dextrane, des billes de verre activ~es, ou analogues, sur lesquels
sont fixées par covalence des chaines latérales portant au moins
un -NH2 réactif, provenant de la fixation sur ledit support d'un
composé choisi parmi les amines, les polyamines, les diacides, les
acides aminés, les hydrazines (aliphatiquesou aromatiques)compor-
tant éventuellement une fonction acide.
Parmi ces supports, sont nouveau~ et font partie de la pré-
sente invention les supports sur lesquels sont fixées par covalen-
ce des chaines latérales portant au moins un -~H2 r~actif provenant
de la fixation sur lesdits supports, a~ un composé choisi parmi les
amines aromatiques, les polyamines autres que les diamines, les
acides aminés ramifiés, les hydrazines (aliph~tiques ou aromatiques)
comportant eventuellement une fonction acide.
Selon une disposition particulièrement avantageuse de l'in-
vention, les chafnes laté!rales portées par les supports, qu'il
s'agisse de supports connus en eux-mêmes ou des nouveaux supports
conformes ~ la présente invention, sont couplées, par l'intermédiai-
re de leur -NH2 réactif, avec un composé! azoté comprenant également
au moins un -NH2 réactif et choisi notamment parmi les amines ali-
phatiques ou aromatiques, les hydrazines aliphatiques ou aromati-
ques, ou les acides aminés, notamment les acides aminés comportanten même temps un groupement -SH et un groupemant -NH2 susceptibles de former un hétérocycle en présence du groupement -CH0 du composé
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organique ~ fixer. --
Selon un mode de réalisation avantageux des support~ objetde la pr~sente invention, le support solide insoluble sur lequel
sont fixées les cha~nes latéralss susdites, porte des groupements
carboxyle par l'interm~diaire desquels les chatnes lat~rales sont
fixées sur ledit ~upport.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des supports
objet de la présente invention, le support solide insolbule porte
des groupements -NH2 par l'intermédiaire desquels les chaines la-
térales susdites sont fixées sur ledit support.
Conformément à l'invention, les amines ou polyamines fix~essur le support solide insoluble sont choisies parmi les diamines
aromatiques, le~ polyamines autres que les diamines aliphatiques et
les acides aminés ramifiés.
L'on fixe avantageusement sur le support susdit :
- des diamines aromatiques ;
- ou des polyamines contenant des groupements amine primaire et
secondaire, répondant, par exemple, aux formules suivantes :
NH2 (CH2 ) X~H (CH2 ) y,NH2
où x>~ 3 et y ~3
NH2(CH2)xNH(CH2)yNH(CH2)zNH2
où x ~3, y~4 et z~ 3
- ou des acides aminés ramifiés appropriés, au nombre desquels
l'on compte, entre autres, la cysté;ine de formule :
C~ -SH
CH-NH2
~OOH
Conformément ~ un mode de réalisation avantageux de l'objet
de l'invention, les chaines lat~rales fixées sur le support ré;sul-
tent du couplage d'une amine aliphatique ou aromatique, telle quediamine, polyamine, acide amin~, avec d'autres amines aliphatiquesou aromatiques telles, en particulier, que : diamines, polyamines,
- - :
108;~50~3
hydrazines aliphatiques ou aromatiques ou leur~ d~riv~s.
Selon un mode de réalisation particu1iarement avantageux de
l'objet da la pr~sente invention, le ~upport ~olide insoluble porte
des cha~nes d'hexaméthylènediamine (HMD) avantageusement couplées
par l'intermédiaire de leur -~H2 r~actif, au dihydrazide adipique,
à l'acide p-hydrazino-benzo~que ou analogues.
Selon un autre mode de réali~ation particuli~rement avanta-
geux de l'objet de la présente invention, le support soliae insolu-
ble porte des chaines de polyamine, telles que la spermidine, la
diaminopropylamine, la spermine, par exemple, avantageu~ement cou~
plées par l'intermédiaire de leur -~2 r~actif, au dihydrazide
adipique, à l'acide p-hydrazino-benzo~que ou analogues.
Selon encore un autre mode de r~alisation particuliarement
avantageux de la pr~sente invention, le support solide insoluble
porte des cha~nes latérales constituées par un acide aminé! tel que
la ~-alanine ou l'acide ~-amino-capro~que, par exemple, avantageu-
sement couplé au diaminopropane, au dihydrazide adipique, a l'acide
p-hydrazino-benzo~que ou analogues.
Conformément à un autre mode de réalisation avantageux du
support conforme à l'invention, le support solide insoluble porte
des cha$nes latérales se terminant par un acide amin~ comportant
un groupement -SH, comme la cysteine par exemple.
Conformément ~ une disposition avantageuse de ce mode de
r~alisation, l'acide aminé comportant un groupement -SH est cou-
plé! à une diamine aliphatique ou aromatique.
La pr~sente invention a également pour objet un procé~dé de
fixation de chalnes latérales comportant au moins un -~H2 ré!actif,
sur un support solide insoluble pris dans le groupe qui comprend
notamment les sphères de latex, les billes de gel d'agarose ou de
dextrane, les billes de verre activé!es, ou analogues, qui est ca-
ractérisé en ce que la fixation desdites chaines l~té~rales sur le
support est r~alisée en pr~sence d'un agent de condensation appro-
~.: ~ .. .
~8:3S08
pri~, ledit proc~d~ de fixation incluant, le cas ~ch~ant, un ~tade
subs~quent de couplage desdites chatnes lat~rales avec des compo-
8~ azot~s avantageusement choisis, en particulier, parmi le~ ami-
nes, les hydrazin~s aliphatiques ou aromatiques, les acides aminés,
lequel stade de couplage est ~galement avantageusement r~alis~ en
pr~sence d'un agent de couplage appropri~, tel que carbodiimide ou
N-hydroxyl-succinimide.
Conform~ment à l'invention, l'on utilise avantag~usement
comme agent de condensation et/ou de couplage, le glutarald~hyde
ou un carbodiimide totalement ou partiellement hydrosoluble, de
formule g~n~rale :
R-N=C=~-R
dans laquelle :
~ R repr~sente notamment un ~adical alcoyle comprenant de 2
~ 12 atomes de carbone, en particulier un radical ~thyle,
n-propyle, isopropyle, n-butyle, sec-butyle, tert-butyle,
isobutyle, amyle, hexyle, heptyle, octyle, nonyle, décyle,
und~cyle et dod~cyle ; un radical cyclo-alcoyle compre-
nant de 5 à 6 atomes de carbone ; un radical alcoyle infé-
rieur monoaryl- substitu~ tel que, par exemple, un radi-
cal benzyle,o~- ou ~-phényléthyle ; un radical monoaryl
tel que, par exemple, un radical ph~nyle, morpholino-,
pipéridyle ; un radical alcoyle inf~rieur substitu~ par
un rest~ morpholinyle, tel que, par exemple, un radical
éthylmorpholinyle ; un radical alcoyle inf~rieur substitué
par un reste pipéridyle, tel que, par exemple, un radical
éthylpip~ridyle ; un radical dialcoylamino-inf~rieur ; un
radical alcoyle inf~rieur substitu~ par un reste pyridyle,
tel que, par exemple, un radicalo<-, ~- ou r-méthyl- ou
~thyl-pyridyle ; leurs sels d'addition avec des acides et
leurs sels d'ammonium quaternaires, les deux radicaux R
pouvant être identiques ou diff~rents.
lV83S08
Selon un mode de r~alisation préféré du proc~dé objet de
la présente invention, la r~action de fixation par covalence des
cha~nes lat~rales sur le support est ré!alisée dans un tampon ne
contenant pas de groupements -NH2 libres et d~pourvu~ de propri~-
tés agglutinantes, de pH 6,0-8,8.
Selon encore un autre mode de r~alisation préfér~ du pro-
c~d~ objet de la présente invention, la reaction de fixation par
covalence est suivie d'une dialyse contre 1~ même tampon que celui
utilisé pour la réaction de fixation.
Les qupports solides insolubles port0urs de chaines latéra-
les, obtenus conform~ment à la pr~sente invention, constituent des'~
produits nouveaux en eux-mêmes, qui sont susceptibles de nombreu-
ses applications industrielles.
L'une de ces applications consiste à les utiliser comme
supports de compos~s organiques portant au moins une fonction
-CH0, fix~s chimiquement sur lesdits supports par ré~action entre
leur fonction -CH0 et le -NH2 réactif des chatnes latérales des-
dits supports.
Cette application pr~sente un intér~t particulier dans le
cas de la fixation de composés organiques comportant un résidu
glucidique, qui est réalis~e par l'interm~diaire dudit résidu glu-
cidique, en modifiant tout d'abord par oxydation deux groupements
fonctionnels adjacents portés par ce dernier, en fonctions -CH0,
pUi8 en amenant lesdites fonctions -CH0 à réagir au moins avec un
-NH2 réactif des chatnes latérales fixées au support solide inso-
luble.
Suivant la présente invention, la r~action d'oxydation du
r~sidu glucidique du composé organique à fixer sur le support,
est réalisé!e aux environs de pH 6.
Suivant une disposition avantageuse du proc~dé de fixation
du compos~ organique sur ledit support, l'excas d'agent oxydant
est ~limin~, à la fin de la r~action d'oxydation susdite, par
.
- . .. . , : . .. . . .. .
~08350~
tous moyens approprié~, tels ~ue dialy~e ou addition d~un agent
capable d'~tre oxydé par l'agent d'oxydation, tel que ~ulfite de
sodium, glyc~rol, glucose et analogues.
L' int~rat de l'application susdite est accru lorsque les
composés organiques comportant un ré!~idu glucidique au moins
partiellement oxydé~ en ~onction ald~hyde, fixés sur les supports
conformes à la pr~sente invention, font partie du groupe qui com-
prend les glycoprotéines, les polysaccharides et le~ glycolipides :
en effet, les antig~nes, les anticorps, un certain nombre d'enzy-
mes et d'hormones, appartiennent au groupe des glycoprotéines etleur fixation au support solide insoluble par l'intermédiaire de
leur r~sidu glucidique préalablement oxyd~ en fonction ald~hyde,
permet d'utiliser leur partie protéique libre ou leur partie lipi-
dique libre (pour les glycolipides) pour la ré!alisation de test6
permettant des détections précises, d'une grande sensibilité, qui
est de l'ordre du nanogramme d'antigène aétectable, à l'aide des
agents de diagnostic insolubles ré,alisé!s de la sorte.
Conform~ment à la présente invention~ on am61iore encore
; la facili ff d'emploi des réactifs biologiques qui font eux aussi
~20 l'objet de la présente invention, en couplant chimiquement les
glycoprotéines, les glycolipides ou les polysaccharides avec des
~: .
supports solides, insolubles, porteurs de chatnes latérales com-
portant au moins un - ~ ré!actif, choisies parmi les colorants
basigues.
On obtient ainsi des réactifs biologiques color~s qui per-
mettent la mise en évidence de réactions immunologiques (avec des
antigène~ ou des anticorps en particulier) par réaction directe,
notamment dans les réactions d'agglutination, sans avoir désormais
à recourir à l'intermédiaire des globules rouges, la lecture des
rélsultats des réactions d'agglutination se trouvant ainsi grande-
ment facilit~e.
Conformément à l'invention, ces supports solides, insolu-
10.
~ 33~;08
bles, colorés, sont pr~par~s par fixation des chaines lat~rales
sur le~ supports, dans un tampon appropri~, en présence d'un
agent de couplage et/ou de condensation, ajout~ en deux étapes
successives, pris dan~ le groupe qui comprend, notamment, le
glutarald~hyde, le N-hydroxyl-succinimide et les carbodiimides,
ce processus de fi~ation étant suivi d'un processus de d~sorption
des r~actifs subsistants non couplés.
Selon un mode de r~alisation avantageux du procédé de pr~-
paration de ces supports color~s, ceux-ci sont conservé~s, avant
utilisation, dans un tampon non-agglutinant.
De nombreux réactifs biologiques peuvent 8tre pr~parés en
mettant en oeuvre les dispositions de la pr~sente invention, les-
quels r~actifs se distinguent par leur excellente stabilit~ et
leur tr~s grande sensibilit~.
Les produits de couplage résultant de la fixation chimique
de compo~és organiques comportant un résidu glucidique, sur des
supports solides, insolubles, porteurs de chaines latérales com-
portant au moins un -N~ réactif, conformément à la présente in-
vention, peuvent ~galement 2tre utilisés en tant que cataly~eurs
dans de nombreuses r~actions chimiques, biochimiques et biologi-
ques.
Outre les dispositions qui pr~cèdent, 1'invention comprend
encore d'autres di~positions, gui ressortiront de la description
qui va suivre.
L'invention vise plus particuliarement les procéd~s de fixa-
tion chimiqu~ de composés organiques comportant un résidu glucidi-
que, sur un support comportant au moins un -NH2 r~actif, conformes
aux dispositions quipréc~dent, ainsi que les produits, les réac-
tifs et les catalyseurs constitués par les produits de couplage
obtenus en mettant ces procéd~s en oeuvre, et les moyens propres
à la mise en oeuvre de ces proc~dés et ~ la r~alisation desdits
produits, r~actifs et catalyseurs.
. .
- .
~0~3~0~
L'invention 3era mieux comprise ~ l'aide du compl~ment ds
description qui va ~uivre, qui se r~fare ~ des exemple~ de r~ali-
sation des supports et des produits nouveaux con~ormes ~ la pr~-
sente invention, ainsi qu'~ des exempleq de pré~paration d'agents
de diagnostic conformes ~ la pr~sente invention, dont les tras
grandes sen~ibilité~ et précision sont d~montr~es dans le cadre
d'essais par agglutination, par radio-activit~ et par n~ph~lo-
m~trie.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont
donnés uniquement ~ titre d'illustration de l'objet de l'invention
dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLES
~ . .
I - EXEMPLES DE PREPARATION DE SUPPORTS SOLIDES INSOLUBLES
CONFORMES A L'I~VENTION
A.- ExemDles de ~ré~aration de suE~orts soliaes_insolubles
~orteurs de cha$nes laté!rales ~ro~res à atre cou~l~es
_____________________________ __ ______________ ____
avec un autre com~osé azoté Dorteur d'un -N~ réactif.
_________________ __________ ___ ___________ ________
A.1- Pr~Daration de suD~orts en ~olystyrè~ne carboxyl~
___ _____________ _________ __ __ ___________ __
sph~rigue et calibré Porteurs de chaines latérales com-
____ ______________ _________________________________
Portant un -NH2 ré~actif.
_____________ ________
EXEMPLE 1 - PréDaration d'un support Dortant des chaines lat~rales
constitu~es par des hexam~thvl~nediamines
A 12 mg d'"ESTAPOR PSI68" (marque déposée par Rhône-Progil
pour d~signsr un polystyrène carboxyl~ sph~rique et calibré de
diamètre de l'ordre de 0,22 ,u) co~portant des groupements -COOH
libres, en suspension dans du tampon borate de composition
0,14M ~aCl-0,01M Borate-HCl, pH 8,1 (BBS), on ajouts 80 ,umoles
d'hexaméthyl~nediamine (HMD). Le m~lange est agité ~ 20~C pendant
3 heures en pr~sence de 0,02M d'1 éthyl 3-(3-diméthylaminopropyl-
carbodiimide)chlorhydrate ~EDC). Au bout de ce temps, la suspension
est dialisée contre le tampon BBS jusqu'~ ce que sa D.O ~ 230 nm
soit ~gale ~ zéro. L'on obtient un support en "Estapor" carboxyl~-
12
... .
.. . .
i08
hexam~thyl~ne diamine ("Estaporn-HMD).
EXEMPLE 2 - Pr~paration d~un suPPort ~ortant des chaines lat~ra-
les constitu~es par des polYamines
L'on procède comme d~crit ~ l'Example 1, sauf en ce qui
concerne l'HMD, qui est remplac~e par la spermine.
BXEMPLE 3 - Fixation sur un suPport insoluble a lune cha~ne lat~-
rale constltuée Par un acide amin~
A 20 mg d'"ESTAPOR PSI42" portant des groupement~ -COOH
libres, en suspension dans du tampon BBS pH 8,1, on ajoute
20 pmoles d'acide ~-aminocaprotque~ dont le groupement amine pri-
maire n'est pas en positiono~-. Le m~lange est agit~ pendant 3
heures ~ 20~C environ, en pr~sence de 0,02M de EDC. Au bout de
ce temps, la suspension est dialys~e contre ~ tampon BBS jusqu'à
ce que la D.O à 230 nm soit ~gale à z~ro. La fixation de l'acide
aminé sur le support est réalisée par l'intermédiaire des groupe-
ments CONH(CH2~4COOH qui ~e forment au niveau des groupements
-COOH libres du support.
EXEMPLE 4 - Fixation de violet de _E~s~e
A 10 mg d"'ESTAPOR" (marque de fabrique d~pos~e par
Rhône-Progil pour désigner un polystyr~ne carboxylé~) comportant
des groupements -COOH libres, en suspension dans 5 ml de
0,14M NaCl-0,01M Borate-HCl,pH 8,1 [BBS], on ajoute une solution
de violet de Crésyle obtenue par filtration sur filtre "Millipore"
0,22 ~u d'une suspension de 20 mg de violet de Crésyle ultrasonn~e.
Le m~lange est agit~ pendant 12 heures à 20~C en présence de
0,05M de 1 éthyl 3-(3-dim~thylaminopropylcarbodiimide) chlorhydrate
[EDC]. A la fin de cette période, on renouvalle l'addition d'EDC
et on poursuit l'agitation durant 12 heures.
Au bout de ce temps, la suspension est centrifugée ~
20 000 g durant 1 heure et le culot est repris dans un tampon
ac~tate 0,1M ~ pH=5,5, et on recentrifuge pour ~liminer l'excès
de violet de Crésyle. Cette opération est ré~p~tée jusqu'~ ce que
~U8;~S08
le surnageant soit clair. On élimine ensuite l'ac~tate par for-
mation de chlorhydrate par trois lav~ges successifs par HCl 0,1~,
~uivis de deux lavages NaOH 0,1~, afin de r~g~n~rer les fonctions
amines, puis de deux lavages en BBS pH 8,8 pour ~liminer l'excas
de soude.
Le produit obtenu est conservé en tampon phosphate 0,1M,
pH 7.
EXEMPLE 5_- Fixation de la fuchsine basique
On procade comme d~crit dans l'Exemple 4, mais à la place
~0 ~e 20 mg de violet de Crésyle, on ajoute 2 ml d'une solution satu-
rée de ~uchsine basique.
EXEMPLE 6 - Pr~Paration de supports en polystYrène carboxYl~
DOW 816 .
Les r~actions de couplage d~crites pr~c~demment sur les
polystyranes carboxylés "Estapor" en provenance de ~HONE-PROGIL,
ont également ~té effectu~es sur des sph~res de polystyrène car-
boxyl~ DOW 816 en provenance de DOW CHEMICAL CORPORATION, en pro-
cédant à des adaptations des modalités de mise en oeuvre du pro-
cé!dé de couplage des chaines lat~rales sur lesdites sphares, en
tenant compte du nombre de -COO~I disponibles sur ces sph~res par
rapport aux sph~res d'"ESTAPOR".
A 180 mg de particules DOW 816, on ajoute 560 mg
d'hexaméthylènediamine (HMD) dans 20 ml final de 0,14M NaCl,
o~o1M borate-HCl, p~ 8,1. Du 1-éthyl 3-3 dim~thylaminopropyl-
~ carbodiimide (EDC) est ajout~ ~ une concentration finale ds
0~05M en deux additions successives. Apr~s agitation à 4~C pen-
dant 18 heures, le~ sph~res de DOW ont ~té lavées par trois cen-
trifugations successives ~ 20 000 g pendant 30 minutes avec le
m~me tampon et suspendues finalement dans 13 ml du tampon phos-
phate 0,1M pH 6.
14
. : ~
~083SO~
A.2- Pr~aration de-su~ort~ en bllles de verr_s Porteurs
de cha~ne~ lat~rales comportant un -NH r~actif
_____ ____________ 2
EXEMPLE 7 - Fixation d'une cha~ne lat~rale de HMD sur billes de
verre
A 1g de billes de verre comportant de~ groupement~ -COOH
libre~ (vendues sou~ la d~nomination commerciale "~PG/carboxyl"
par CORNING GLASS WORKS) (dimension des pores : 550 A ; diamètre:
177-840 microns), l'on ajoute 5 ml de 0,1M de ~ampon phosphate
pH 7,0 et la ~uspension est dégaz~e sou~ vide. On ajoute 50 ~moles
d'HMD en solution dans le m~me tampon, at le m~lange est agit~
doucement à 4~C pendant 18 heures en pr~sence de 0,05M d'EDC. Au
bout de ce temps, les billes de verre sont lav~es avec le tampon
phosphate .
Les ~roupements -~H~ terminaux des chaines latérales d'HMD
fix~es sur les billes de verre sont couplés ~ une hydrazine en
mettant en oeuvre là technique décrite à l'Exemple 11 ci-dessous
8~il s'agit d'une hydrazine aliphatique, ou la technique d~crite
à l'Exemple 13 ci-dessous s'il s'agit d'une hydrazine aromatique.
EXEMPLE 8 - Fixation d'une polYamine sur une cha~ne lat~rale se
terminant Par un qroupement N-hydroxyl-succinimide
port~ par des billes de verre '
Llon utilise 2 g de billes de verre du commerce connues
sous la dénomination commerciale de "CPG/N-OH succinimide" (ven-
dues par CORNING GLASS W~RK$), représentées par la formule :
H O O O
I n n ~
(V)--CH2--CH2--CH2--N--CCH2 CH2 ~ ~J
O .
en suspension dans 10 ml de tampon BBS pH 8,2 et dégaz~s sous vi- ;
de, auxquelles on ajoute 40 ~moles de spermine. Le m~lange est
agit~ doucement pendant 16 heures ~ 4~C, puis lav~ avec du tampon
BBS pour ~liminer les produits de la r~action.
Les -NH2 terminaux des r~sidus polyamines sont eux-mêmes
83S08
coupl~s à des hydrazines ~liphatiques ou aromatiques selon les
techni~ue~ d~crites respectivement aux Exemple~ 11 et 13 ci-
dessous .
A.3- Pr~E~rati~n de suE~ort en_billes de ~el d'a~aroqe
~ortant des cha~nes lat~rale~ com~ortant un -NH2
reactif
_ __ __ _ _ .
EXEMPL~ 9 - Le "CH-SEPHAROSE" (marque d~po~e par PHARMACIA,
Upqala, Suede, pour désigner des bil~es de gel d'asarose) dispo-
nible dans le commerce comporte dé!jà des chaines lat~rales
d'aciae ~-amino-capro~que~
B.- Exem~les de ~ré~aration de su~orts solides insolubles
____ _______ __ _____________ ________~______________
~orteurs de chatnes lat~rales susce~tibles de réa~ir
__________________________________ _____________ __
avec les ~rou~ements -CHO des com~oses ~ fixer sur
lesdits ~u~orts
B.1- Fixation de ~rou~ements fonctionnels terminaux cons-
titués ~ar des hydrazines
_______ ________ ________ ,, .
B.1.1- Par des hydrazines aromatigues
EXEMPLE 10 - Pr~aration d'un sup~ort en "Estapor"-HMD-p-hYdrazino-
benzoate
4 m~ de l'"Estapor"-HMD de 0,22 ~ de diamatre sont mis en
suspension dans 2 ml de tampon borate comprenant 0,14M ~aCl,
0,01M Borate-HCl, pH 8,8. A cette suspension sont ajouté!es
~ ~2 ~moles d'acide p-hydrazino-benzo~gue dissous dans du BBS. Le
volume est ajust~ ~ 4 ml avec du BBS. Après l'addition de 10 mg
de 1-~thyl-3-(3-dimethyl-amino-propyl)-carbodiimide, le tube est
agit~ à la température du laboratoire (20~C) pendant 2 heures.
_ Son contenu est en8uite transfér~ dans un sac ~ dialyse et dia-
lys~ ~ la tempé~rature du laboratoire pendant 24 heures contre
300 ml de BBS (trois-changement~). L'on obtient ainsi un support
en "ESTAPOR-HND-p-hydrazino-benzoate. ~-
~6
~083506~ ,~
EXEMPLE 11 - ~ixation sur un support in~oluble d~une cha~ne lat~-
rale constitu~e par une Polvamine couplée ~ une_
hydrazine aromatiaue
A 7 mg d'"Estapor"-~permine pr~par~ ~ l'Exemple 2 ci-
dessus, de formule :
O H
EsTApoR"-c-N(cH2)3NH(cH2)4NH(cH2)3NH2
en suspension dans 15 ml de tampon BBS pH 8,1, l'on ajoute
100 ~ oles d'acide p-hydrazino-benzotque en solution aqueu~e. Le
m~lange eqt agit6 pendant 24 heures, à la temp~rature ambiante
(20~C environ) en pr~sence de O,OSM d'EDC. Au bout de ce temps,
la suspenqion est dialys~e contre du tampon BBS pH 8,8 jusqu'à ce
que la D.O ~ ~30 nm soit égale à zéro.
EXEMPLE 12 Fixation d'hvdrazine aromatique
A 10 mg d"'ESTAPOR" sous forme -NH2 (amine aromatique) en
suspension dans 10 ml de phosphate 0,1M pH 7, on ajoute 50 ~moles
d'acide p-hydrazinobenzo~que en solution dans du borate 0,1M pH 8.
Le m~lange e~t agité à 20~C pendant 12 heures en pré,sence de
O,OSM d'EDC. A la fin de cette période, on renouvelle l'addition
d'EDC et on poursuit l'agitation durant 12 heures. A la fin de
cette seconde période, la suspension est centrifugée ~ 20 000 g
pendant 1 heure et le culot est repris dans du borate 0,1M pH 8,1
et recentrifugé pour éliminer l'acide p-hydrazinobenzo~que non
couplé. Ce lavage est suivi de deux autres lavages (borate
0,01M pH 8,1), puis de deux lavages au phosphate 0,1M pH 7. Le
produit obtenu est conservé dans ce ternier tampon.
-
- ~OB3SOB
B.1.2- par des hydrazines_ali~hati~ues
EXEMPLE 13 - Fixation sur un suPport insoluble d'l~ne cha~ne lat~-
rale Qonstitu~e par une diamine aliphatique c upl~e
~ une hydrazine aliphatique
6,0 mg de l'"ESTAPOR"-HMD préparé à l'Exemple 1 ci-dessus,
de formule : O H
~ESTApOR''--C-l-(CH2)6NH2
en suspension dans 0,1M de tampon phosphate pH 7, sont agités ~
20~C pendant 1 heure en présence de glutaraldéhyde à une concen-
tration finale de 1,25 %. Au ~out de ce temps, la suspenRion
est dialysée contre 0,1M de tampon phosphate pH 7,0 pendant 18
heures. A la suspension obtenue après dialyse, sont ajouté~s
20 ~moles de dihydrazide adipique en solution aqueuse. Le mélan-
ge est agit~ pendant 16 heures à 20~C, puis dialys~ pour éli-
miner l'excès de dihydrazide adipique.
B.2- Fixation de ~rou~ements fonctionnels terminaux cons-
titués ~ar une fonction amine ~rimaire
_______ ______________________ _______
EX~MPLE 14 - Fixation sur un suPport solide insoluble d'une
cha~ne lat~rale constituée par un acide aminé
couPlé à une diamine
L'on fixe sur les billes d'Estapor sur lesquelles a été
fixé de l'acide ~-aminocapro~que conformément à l'Exemple 3 ci-
dessus, du diaminopropane, en procédant comme suit :
Le contenu du sac de dialyse contenant la suspension de
billes d'Estapor sur lesquelles est fixé l'acide ~aminocaproique
est transf~ré ~ un tube contenant 25 ~moles de diaminopropane.
Le mélange est agité pendant 3 heures à 20~C, en pré!sence de
O,OSM d'EDC, puis dialys~ contre du tampon BBS comme dé!crit à
l'Exemple 1 ci-dessus, ~ la suite de quoi le diaminopropane est
coupl~ à l'acide ~-aminocapro~que fixé sur le support insoluble.
18
, ' ' .
lt)835(~8 A
EXEMPLE 15 - Couplaqe d~HMD sur des billes de qel d'aqarose
portant des cha~nes latérales d'acide ~-amino-
capro~que
Le couplage de la ~MD sur les billes de Sepharo~e subs-
tituées de l'Exemple 9 est r~alisé en se conformant aux moda-
lités déorites ~ l'Exemple 7 ci-dessus.
Les -NH2 terminaux du substituant HMD de la cha$ne lat~-
rale d'acide ~-aminocapro~que sont eux-m8mes couplé~s avec une
hydrazine aliphatique ou aromatique qui est substituée cur les-
dits groupements -NH2 terminaux, en se conformant aux techni- ~ :
ques décrites respectivement aux Exemples 11 et 13 ci-dessus.
B.3- Fixation sur un sup~ort solide insoluble de chatnes
__________________ _______________________________
lat~rales comportant des ~roupements fonctionnels
_____________ __________ ___ ___________________
terminaux constitu~s par des ~rouPements
____________ . .
-SH-CH2-CH-NH2_~u_~_ptibl_~_d_ form~r_un_derivé
thiazolidine en ~résence du ~rouPement -CHO du
~________________ ___________ ___ ______________ ,
composé à fixer
___ _~_________ ,
EXEMPLE 16 - Fixation sur un suPPort insoluble comPortant des
qroupements ~H2 libres, d'un acide amin~ comportant
un qrouPement -SH
A 2 mg d'"EST~POR"-~H2 en suspension dans du tampon
phosphate pH 6,5, on ajoute 6 ~moles de cy t~ine chlorhydrate
de formule HSCH2CH NH2 COOH,HCl dissoutes dans de 1'eau. Le
mélange est agité/ ~ 20~C pendant 16 heures, en présencs ae
0,05M d'EDC. Au bout de ce temps, les sphères d'"ESTAPOR" sur
lesquelles est fixee la cysteine, sont lavées sur filtre Milli-
pore 0,22 ~ pour é~liminer l'excas de cystéine et les produits
de la réaction. Les sphères modifiées de la sorte sont remises
en suspension dans 2 ml de tampon phosphate pH 6,5.
,.. ~,;: , .- : . : .
: . : . - .
10~3S08
EXEMPL~ 17 - Fixation de cyst~ine sur du ~olYstyr~ne carboxyl~
DOW~
A la suspenqion de poly~tyrane carboxyl~ DOW 816-HMD
obtenue ~ l ' Exemple 6 ci-de~sus, on a a jout~ 18 mg de cy~-
t~ine-HCl dissous dans 2 ml de tampon phosphate 0,1M pH 6,
puis de l'EDC ~ une concentration finale de 0,05M. Apr~s 18
heures à 4~C, les sphères ont ~t~ lavées comme d~crit dans
l'Exemple 6 ci-dessu~.
II - EXEMPLES D ' OXYDATION DES COMPOSES A FIXER SUR LES
1 O SUPPORTS
La nécessit~ du rôle d~terminant de l'oxydation conforme
~ l'invention, dans la fixation sur les supports est d~montrée
à l'Exemple 18 ci-dessous.
EXEMPLE 18 ~ Mise en évidence du role d~tsrminant des qroupe-
ments -CHO libres des qlobulines dans la fixation
de ces.derniers sur un suPPort insoluble
Des gammaglobulines ont ét~ oxyd~es comme d~crit aux
Exemples 19 à 27 ci-de~sous, mais pr~-réduites en pr~sence de
~aB3H4 de maniare à ~tre marquées au tritium et à ne pa~ com-
porter de group~ments -CHO libres. Des aliquots de ces gamma-
globuline~ (0,3 ml) contenant 8400 cpm ont ~té mis en contact
avec les ~chantillon~ cit~s dans le Tableau ci-dessou~ en pré~-
sence du tampon 0,1M P04 pH 6,0. Apr~s 16 heures à 4~C, les
~chantillons ont ~té filtr~ sur filtres Millipore 0,22 lu, la-
vés quatre fois avec 5 ml du tampon suivant :
0,1 % S~rum Albumine Bovine
0,1 % Triton X 100
0,14M NaCl, 0~01M Borate-HCl pH 8,8
~083503~
Echantillon Quantité Volume cpm retenus sur
filtre
A ) Tamp~n 2 319
B) Estapor 68 500 yg 2 311
C) Estapor NH2 500 ~g 2 276
D) Estapor NH-NH2 500 ~g 2 204
Il ressort des r~sultats regroup~s dans le Tableau
ci-dessus que (1) une certaine quantité de radioactivité est
retenue sur filtre ; (2) le lavage par le tampon ci-dessus
r~duit consid~rablement l'adsorption sur les filtres eux-m8mes.
Dans ce cas l'adsorption sur les filtres due aux gammaglobulines
tampon seul représente environ 20 % de la radioactivité tota-
le de l'aliquot (1680 cpm) mis sur le filtre : (3) la quantit~
de radioactivité retenue sur filtre n'a pas augmenté de façon
significative en présence d'Bstapor 68-COOH, d'Estapor 68-NH2
ou d'Estapor ~H-NH2. En effet les valeurs sont égales ou infé-
rieures aux r~sultats obtenus avec le tampon seul (319 cpm).
Donc il n'y a paq d'ad~orption des gammaglobulines sur les
trois types d'Estapor utilisés. De plus pour que cette techni-
que de filtration soit ~ignificative, il faut que la radio-
activité coupl~e aux supports insolubles en pr~sence des gamma-
globulines oxydées d~passe les 20 % trouves avec les gamma-
globulines non oxydées.
l¢J~3S()~
COMPAR~ISON DU TAUX DE- RADIOACTIVITE: ASSOCIEE AUX
ESTAPOR NH2 AVEC LES GAMMAGLOBULINES OXYDEES ET
~ON OXYDEES APRES REDUCTIO~ PAR Na~H
REACTIFS MIS EN I VOL~MES
O I OXYDEE ~ ~ON O~DEE
PRESENCE Iml
t 1 t
E~tapor NH2 dans 0,1M l l l
P04 pH 6,0 ¦2,00 j 1 mg 11 mg
gammaglobulines cheval
oxyd~e 10,10 1 2 mg
gammaglobulines cheval I I t
non oxyd~e j 0,10 j - I2 mg
0,1M Borate pH 8,8 j 0~90 ! + j +
NaB3H4 dans H20 1 __________ l______ ___¦__________ __
_________________________ __ _
Apr~s un temps de contact de 18 heures ~ 4~C, le contenu
de chaque sac est dialysé 5 jours durant contre du BBS pH 8,8
avec trois ou quatre changements par jour, ju~qu'~ ce que le
liquide d~ dialyse ne contienne plus de radioactivité. Un ali-
quot de chaque préparation est ensuite filtr~ sur Millipore
0,22 ~ et lavé avec le tampon 0,1 % SAB, 0,1 % Triton X 100,
BBS pH 8,8.
Sur un autre aliquot la densité opti.que à 550 nm est
mesurée afin de déterminer la concentration d'Estapor.
t
E:CHANTII~ON j CPM/mg
Estapor 68-NH - gammaglobuline
oxyd~e 2 1 62 466
Estapor 68-~H2- gammaglobuline
non oxyd~e 1 11 135
____________________________ ____~______________________________
La radioactivité trouvée avec l'Eqtapor 68-NH2 en pré-
sence de gammaglobulines non oxydées ne représente que 17,8 %
22
; , . . . . .
.. . . .. . . . . . .
~V83508
de celle trouvée associ~e à l'Estapor 68-NH2 en pr~sence de
gammaglobulines oxyd~es (cette valeur est du m~me ordre de
grandeur gue celle due à l'adsorption sur filtre des gamma-
globulines en absence d'Estapor).
Par contre avec le~ gammaglobulines oxydées la quantité
de radioactivité associée à l'Estapor NH2 augmente cinq foi~.
On donnera ci-apr~s quelques exemples d'oxydation de
divers compos~s comportant un résidu glucidi~ue, par oxydation
d'au moins un de leurs groupements -CH20H en groupements -CHO.
A/ OXYDATION DE GAMMAGLOBULINES
EXEMPLE 19 - Oxydation chimique des qammaqlobulines
Des gammaglobulines en provenance de la chavre, du la-
pin et du cheval ont ét~ purifiées par précipitation à l'aide
de (~H4)2S04 suivie d'une chromatographie sur DEAE-cellulose.
A 60 mg d'immunogammaglobulines de cheval (contenant des
anticorps antipolyamines) en solution dans 2 ml de 0,1M de
tampon phosphate pH 6, l'on ajoute 0,2 ml de 0,15M de NaI04
soluble dans l'eau.
Le mélange est laiss~ à 4~C à l'abri de la lumiare pen-
dant 3 heures, puis dialysé contre le tampon 0,14M NaCl-0,1M
P04 pH 6 pendant 1 heure, avec trois cha~gements. A ce pH,
le risque de formation de ponts de Schiff est amoindri entre
les fonctions aldéhyde r~actives obtenues par oxydation par
le NaI04, et les groupements -NH2 soit de la lysine, soit des
groupementc terminaux des prot~ines.
EXEMPLE 20 - Oxvdation chimique d'anticorPs antiqamma-
qlobulines
A 520 ~g ds gammaglobulines de chavre anti-lapin dans
0,1 ml de BBS est ajouté 0,1 ml de NaI04 0,03M. Le mélange est
laiss~ à 4~~ ~ l'abri de la lumiare pendant 3 heures et est
ensuite dialysé contre du BBS pendant 2 heures avec trois
changements de tampon.
~, . .
.
~0~5OB
EXEMPLE 21 - Oxydation chimi~ue de qammaqlobulines
A 60 mg d'immunoglobulines de cheval en solution dans
2 ml de tampon de phosphate 0,1M, pH 6, l'on ajoute 0,2 ml
de NaI04 0,15M soluble dans l'eau.
Le mélange e~t lai~sé ~ 4~C à l'abri de la lumière pen-
dant 3 heures, au bout desquelles on arr~te l'action du NaI04
par addition de glycérol ~ 0,15M final. Apr~s 30 minutes à
4~C , les produits de la réaction sont dialys~s pendant 18
heures ~ 4~C avec plusieurs changement~ contre du tampon phos-
phate 0,1M, pH 6.
~/ OXYDATION DE VIRUS
EX~MPLE 22 - Pré~paration de virus de la rouqeole oxyd~
A 5 ml d'une préparation antigénique de virus de la
rougeole contenant 16 mg de protéine, on a ajouté 0,5 ml de
NaI04 0,15M dans du tampon phosphate de sodium 0,1M à pH 6.
Ce mélange est laisse à 4~C à l'abri de la lumiè,re pen-
dante 3 heures. ,
L'on ajoute ensuite.0,5 ml de Na2S03 0,15M afin d'arr~-
ter l'action du ~aI04.
Apr~s 30 minutes ~ 4~C, le m~lange est dialys~ pendant
18 heures à 4~C afin d'~liminer l'excas de produits d'oxyda-
tion.
EXEMPLE,23 - PréParation de v rus.de la maladie de Carré
La technique mise en oeuvre pour oxyder le virus de la
maladie de Carré est celle dé!crite à l'Exemple 22 ci-dessus.
EXEMPLE 24 - PréParation de virus de la qriPPe ox~dé
La technique mise en oeuvre pour oxyder le virus de la
grippe est celle d~crite à l'Exemple 22 ci-dessus.
,EXEMPLE 25 - PréParation de virus de la rubé le oxYd~
La technique mise en oeuvre pour oxyder le virus de la
rub~ole est celle d~crite ~ l'Exemple 22 ci-dessus.
24
S~I~
C/ OXYDATION D'HORMONES
~XEMPLE 26 - Pr~paration de la qpnadotrophine chorioni~ue
humaine oxyd~e
La techni~ue mise en oeuvre pour oxyder cette hormone
est celle d~crite aux Exemples 19 et 20 ci-dessus.
III - EXEMPLES DE COUPLAGES DE COMPOSES COMPORTANT UW REgI~U
GLUCII)IQUE DONT_AU MOINS UN GROUPEMENT --CH20H A ETE
OXYDE EN GROUPEMENT --CHO, SUR DE:S SUPPORTS CONFORMES A
L' INVENTION
EXEMPLE 27 - Exemple de couplaqe effectu~ sur un -NH~ termi-
nal : pr~paration d'un r~actif "ESTAPO~HMD-
anticorps antipolvamines, par fixation d'anti-
corps sur le sup~ort
Pour préparer un re!actif conforme à l'invention utili-
sant les anticorps antipolyamines qui sont mis en oeuvre par
ailleurs pour la recherch~ et le dosage des polyamines dans le
sang des malades, l'on fixe ces anticorps par chromatographie
dlaffinit~ de sub~trat sur des supports de verre contenant de
la spermine, pui~ on les oxyde par une solution 0,06M NaI04.
Apras 30 minutes ~ 4~C dans l'obscurité, les anticorps sont
lavés dans du BBS pH 8,8 afin d'éliminer'l'excès de NaI04.
2 ml de l'"Estapor"-HMD (10 mg) (pr~par~s comme indiqué~
~ l'Exemple 1 ci-dessus) sont m~langés avec les anticorp~ oxy-
dés comme d~crit aux Exemples 19 ~ 21 ci-dessus. La suspension
est agitée doucement par un mouvement rotatoire à 4~C pendant
14 heures. Les bases de Schiff form~es sont stabilis~es par
un traitement de S heures ~ 4~C avec du NaBH4 (3 Jumole~) sous
une agitation intermittente. La suspension est centrifugée à
10 000 tours/minute pendant 5 minutes. Le surnageant est r~-
cup~r~, le culot est relavé quatre fois avec du BBS et tousles surnageants sont réunis.
. .. ~. . .
. .
lVB350B ,;
EXEMPLE 28 - Bxemple de sou~laqe effectu~ sur une hYdrazine :
Préparation d' un r~actif "Esta~orn-HMD-P-
hYdrazino-benzoate-anticorps anti IqG
L'on prépare de l'"Estapor"-anticorp-~ anti IgG de
lapin, qui constitue un mod~le d'utilisation des anticorps
libres en solution. La préparation finale pré~ente un tras
large spectre d'utilisation car elle permet par voie indi-
recte de détecter toutes les réactions immunologiques dans
lesquelles on utilise des IgG de lapin, en vue de leur mise
en évidence par la méthode indirecte.
O,1 ml de la solution de gammaglobulines oxyd~es ob-
tenue à l'Exempl~ 20 (260 ~g) sont ensuite ajout~s ~ 1,7 mg
d'"Estapor"-HMD-p-hydrazino-benzoate. Le m~lange est agit~
pendant 3 heures à 4~C.
Dans l'Exemple 27 ci-dessus, après le traitement dé-
crit, les billes d'"Estapor" contenant les anticorps sont la-
vées et concentrées par s~dimentation sur une couche de sac-
charose ~ 60 % a travers une solution de saccharose à 10 %
(~00 000 g 1 heure à 4~C). L'"Estapor" concentr~ ~ l'inter-
phase est dialysé pour éliminer l'excès de ~accharose.EXEMPLE 29 - Exem~le de cou~laqe effectué sur un -SH terminal :
Couplaqe d'un suPPort insoluble comPortant des
qroupements terminaux libres -SH aux qroupements
-CHO de qammaqlobulines oxydéles
A 2 mg d'"Estapor-SH", on ajoute ~ mg de gammaglobuli-
nes oxydé!e~ comme d~crit ~ l'Exemple 19. Aprèls 30 minutes de
contact a 4~C, on observe la floculation de particules
d'"ESTAPOR-SH" par formation de thia~olidines. Cette flocu-
lation ne se produit ni avec l"'ESTAPOR-NH2" ni avec
l'"ESTAPOR-SH" sur lequel.ont ~t~ fix~es des gammaglobulines
non oxyd~es.
26
.. .. -.
1~8350~
IV - EXEMPLES DE MARQUAGE IS~OPIQUE DES PRODUITS OBJET
DE L ' INVENT ION
EXEMPLE 30 - Pr~paration_de Produit3 de couDlaqe conformes
l'invention radi~a5~ par pr~marquaqe du
support de latex à l'~thanolamine 3H ou 4C
Les billes d'"Estapo~'sont rendues radioactives en
fixant par liaison covalente l'éthanolamine 3H ou 14C. A
20 mg de l"'Estapor" en suspension dans du BBS sont ajout~s
0,05 ml ds 14C éthanolamine 10 ~Ci (1,6 ~mole) et 6,0 mg de
~-éthyl-3-(3-dim~thyl-aminopropyl)-carbodiimide dans un vo-
lume total de 4,0 ml. Après une agitation rotative de 2 heu-
res à 20~C, 20 ~moles de HMD et 20 ~moles de 1-éthyl-3-
(3-diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide sont ajoutés. L'agi-
tation est maintenus pendant 2 h~ures puis le contenu du tu-
be est dialys~ contre du BES ~usqu'à l'élimination de la
radioactivité libre.
Le produit obtenu a une radioactivité d~ 2,2 x 106cpm
par mg de l'"~stapor".
La fixation des anticorps est effectuée comme décrit
~ l'Exemple 27. Le produit obtenu correspond donc à une pré-
paration des anticorps hautement radioactifs danQ laquelle
les anticorps n'ont subi aucune manipulation chimique autre
~ue la fixation au latex par la partie glucidique. Le produit
peut ~tre utilisé dans toutes les applications des dosages
radio-immunologiques en mettant en oeuvre soit la méthode di-
recte ~oit la m~thode indirectc. La mesure de la réaction
s'effectue par d~termination de la radioactivité soit du com-
plexe antig~nes anticorps agglutin~s, soit des billes n'ayant
pas réagi, la séparation ~tant faite par centrifugation ou
filtration.
Ces réactifs (radioactifs) permettcnt de mesurer quan-
titativement les antiganes ~ la surface des cellules, en
:':; ' ' . . ' '
~V8~501~ ~
comptant la radioactivit~ e sur les lamelles. Ainsi il
est possible de quantifier les donn~es obtenues pr~c~demment '
par visualisation au microscope ~lectronique à balayage, de
ces bille~.
Pour autant qu'il s'agit des produit~ de couplage
glycoprot~ines- et plus particuli~rement anticorps-support
comportant au moins un -~H2 r~actif, par l'interm~diaire du
r~sidu glucidique, qui ont ~té d~crits ~ titre non limitatif
dans les Exemples 27 et 28, l~on dispose, gr~ce ~ la pr~ente
invention, d'une gamme de billes contenant des anticorps
sp~cifiques contre diff~rents antig~nes int~res~ant la patho-
logie m~dicale, qui devrait permettre un s~ro-diagnostic ra-
pide et facile de diverses maladies. L'utilisation des billes
contenant des anticorps antigammaglobulines élargit encore les
pos~ibilit~s d'emploi en introduisant le procédé indirect. La
,, .
guantification est facile et precise soit par methode de di-
lution directe soit par la m~thode de compétition.
Le proc~dé peut ~tre appliqué ~ tous les dosages (hor-
mones, médicaments etc...) basés sur une r~action immunolo-
gique. L'utilisation des billes radioactives rend le proc~d~aussi sensible que toutes les autres m~thodes radioimmunolo-
giques tout en diminuant le risque de modifier les anticorps
ou antiganes au cours de l'iodination.
La mélthode décrite pr~sente, par rapport aux procéd~s
couramment utilisés (dosage radioimmunologique, fluorescence,
recherche de radicaux libres, dosages immunoenzymologiques,
etc...), les avantages suivants : - facilit~ d'utilisation ne
n~cessitant pas d'équipement particulier ; - mode d'emploi
simple donc apprentissage rapide ; bonne sensibilité ; -
stabilité des r~actifs qui peuvent être conservés plusieursmois ; - très faible prix de rsvient.
.. .
~083~08
EXEMPLE 31 - Pr~paration de produxts de couplaqe marqu~s
par marquaqe isotopi~ue des anticorPs
I.- Maryuaye au tritium :
A 1,5 mg de gammaglobulines de chèvre anti-polyamines
dans 2 ml de 0,14M NaCl, 0,02M tampon phosphate pH 6, on
ajoute 0,65 ml de 0,06M NaI04 en solution dans du tampon
phosphate pH 6 (conc~ntration finale de NaI04 : 0,015M).
Le méIange est laissé à 4~C ~ l'abri de la lumi~r~
pendant 3 heures et est ensuite dialys~ contre le tampon
o,14M NaCl, 0,02M phosphate pH 6 pendant 1 heure avec trois
changements pour ~liminer l'excè-R de NaI04 (vérification à
l'aide de papisr amidonné-iodur~é). A ce pH, le risque de for-
mation de ponts de Schiff est amoindri entre les groupements
-CH0 r~actifs ainsi formés et les groupements -NH2, soit de
la lysine, soit de groupements N terminaux des prot~ines.
Le contenu du sac à dialyse est en~uite transf~ré
dans un tube.
Un excès de ~aB3H4 cristallin (100 mCi/mMol) en prove-
nance de New England Nuclear) est alors ajouté, suivi d'1 ml
de tampon 0,1M borate-HCl pH 8,8 (ce changement de pH favo-
rise la réduction des groupements -CH0 en -CH20H). Après un
temps de contact de 16 heures à 4~C, 80US une hotte bien
ventilée, le contenu du tube est transféré dans un ~ac ~ dia~
lyse et dialys~ jusqu'à ce que le liquide de dialyse soit
exempt de toute radioactivité~. ~'on obtient ainsi un marquage
pour les anticorps anti-polyamines de 670 c.p.m. par ~g de
protéines.
Il est é!galement possible d'augmenter l'activité spé-
cifique des anticorps en procédant de la façon suivante :
à 1,5 mg de gamma globulines oxydées on ajoute 20 ~uCi d'étha-
nolamine 3~ ~3,8 Ci/mMol) ~ pH 8,8 ; les ponts de Schiff ain-
si formés sont ensuite stabili~és par réduction ~ l'aide de
29
~083~0~
Nas3~4 (5 mCi) pendant 18 heures à 4~C. L'exc~s de NaB H4
est élimin~ par dialy~e. Ceci a permis d'ohtenir des gamma-
globuline~ anti-polyamines ayant une activit~ spécifique ds
1807 c.p.m./~g.
On peut obtenir, de m~me, des anticorps marqu~s au
4C en utilisant de l'éthanolamine 14C et en procédant à
la r~duction à l'aide de NaB H4.
II.- Coupla~e d'un su~ort insoluble comportant des chaines
__térales_portant_au_moin__un__NH2 reactif aux qroupe-
ments -CHO des qammaqlobulines oxydées et stabilisa-
tion des ~onts de Schi~f par r~duction au ~aB3H4
La technique mise en oeuvre est celle d~crite aux
Exemples 27 et 29 ci-dessus.
L'on obtient ainsi des r~actif~ dont la stabilité es~
très longue, qui n'~mettent pas de rayonnement gamma (con-
trairement aux proc~dés connus qui réalisent le marquage
par iodination des groupements tyrosine sur la chaine pro-
tei~ue, à l'aide d'iode radioactif) et dont l'activité bio-
logique est inaltérée.
2 0 V -- EXEMPLES_ D ' IMMllNOREACT I FS
EXEMPLE 32 - PréParation d'un r~actif de diaqnostic de la
rouqeole constitu~ par le produit de la r~action
d'un support substitué, avec le virus oxvdé de
la rouq~ole
I.- PreParation du sup~ort substitué
a) La fixation dlune chaine latérale portant des
groupements -NH2 terminaux, constituée par une
diamine, est ré/alisée conformément aux modalités
décrites ~ l'Exemple 1 ci-dessus.
b) La fixation sur l'"ESTAPOR-NH2" obtenu au stade
précédent, d'un acide aminé comportant un grou-
pement -SH est réalis~e en mettant en oeuvre les
, . , ! ~ ' ' ~
1083S~
modalit~ d~crites a 1'Exemple 16 ci-dessus.
II.- Pr~paration de virus de la rouqeole oxyd~
___ __________ _______________ ____ __
L'oxydation do ce virus est réalis~e comme d~crit
l'Exemple 20 ci-dessus.
III.- Coupla~e du virus de la rouqeole oxyd~, sur
___ __ ____________________ _______ __
l'"ESTAPOR-SH"
______________
A 20 mg d'"ESTAPOR-SH" obtenu au ~tade Ib) ci-dessus,
en suspension dans du tampon phosphate 0,1M, pH 6,0, on
ajoute 10 mg de virus de la rougeole oxydé comme décrit en
II ci-dessus.
Le mélange est soumis ~ agitation à 4~C, pendant 18
heures. Il est ensuite centrifugé à 6000 g pendant 60 minu-
tes. Le surnageant est r~cueilli et le culot est lavé à deux
reprises par du tampon phosphate, pH 6,0.
Le dosage des prot~ines subsistant dans le Rurnageant
permet de d~terminer qu'il y a 130 ~g de proté~ines virales
fixées par mg d'"ESTAPOR-SH".
EXEMPLE 33 - Préparation d'un réactif de diaqnostic de la
maladie de Carré, constitué par le ~roduit de
la réaction d'un suPport substitué avec le vi-
rus ox~dé de la maladie dè Carré
La préparation de ce réactif de diagnostic est effec-
tu~e en procédant comme d~crit ~ l'Exemple 32 I-II-III.
EXEMP~E 34 - Pré~aration_d'un r~actif de diaqnostic sPhères
de latax-virus de la ~rippe
La technique mise en oeuvre pour la préparation de
ce réactif est celle décrite à l'Exemple 32 ci-dessus, le
virus de la rougeole étant toutefois remplacé par des virus
de grippe.
1083S015~
EXEMPLE 35 - Préparation d'un réactif de diaqno tic sph~res
de latex-virus de la rubéole
On utilise, pour pr~parer ce r~actif, la m~me techni-
qus que celle d~crits dans l'Exemple 32 pour la pr~paration
du r~actif de diagnostic de la rougeole, en remplaçant toute-
fois, le virus de la rougeole par le virus de la rubéole.
EXEMPLE 36 - Préparation d'un réactif de diaqnostic sphares
de latex-virus cytom~qali~ue
L'on utilise, pour pré~parer ce réactif, la m~me tech-
nique que celle d~crite ~ l'Exemple 32~ en remplaçant tou-
tefois le virus de la rougeole par le virus cytomégalique.
EXEMPLE_37 - Préparation d'un reactif de diaqnostic
"ESTAPOR"-anticorps
I.- Pré~aration du su~ort substitue
La fixation sur le~ billes de latex d'une chaine
lat~rale portant des groupements -NH2 terminaux et la fixa-
tion sur cette chaine d'un acide aminé comportant un groupe-
ment -SH sont effectuées comme décrit à l'Exemple 28 ci-
dessus.
II.- L'oxydation chimi~ue des gammaqlobulines est effectuee
comme d~crit à l'Exem~le 21
Cou~a~e des_~amma~lDhulines_oxyd~e~ sur l'"ESTAPOR"SH
obtenu au cours du stade I
Ce couplage est réalisé en mettant en oeuvre la tech-
nique décrite ~ l'Exemple 29 ci-dessus. L'on a réalisé de
cette mani~re le couplage de gammaglobulines contenant des
_ anticorps antipolyamines, de gammaglobulines-antiproduits de
la dégradation du fibrinogène (FDP), des gammaglobulines
anti IgG humaine, des gammaglobulines anti IgM humaine, des
gammaglobulines anti IgG de lapin et des gammaglobulines
anti IgG de cobaye.
~ . .
:: ,~ ., , ' : . '
~83S01!~
EXEMPLE 38 - Pr~paration d'un r~actif sphères de~latex
qonadotrophine chorionique_humaine ~GCH)
I.- Pr~aration d'Esta~or substltué
- La fixation sur les bille~ de latex, d'une chaine
lat~rale portant des -NH2 r~actifs ~t la fixation sur cet-
te chaine d'un acide amin~ comportant un groupement -SH
sont effectuées comme d~crit à l'Exemple 16 ci-dessus.
II.- Pré~ar~ation de la ~onadotro~hine chorionigue humaine
oxydée
L'oxydation a é~té effectuée comme d~crit à l'Exemple
26 ci-dessus.
III~- Couplaqe d'Esta~or-SH a la ~onadotro~hine chorionigue
Ce couplage a ét~ réalisé en mettant en oeuvre la
technique d~crite dans l'Exemple 29 ci-dessus.
L'efficacité des réactifs de diagnostic ainsi obte-
nus est démontrée dans le Chapitre VI ci-après.
VI.- EFFICACITE DES IMMU~OREACTIFS CONFORMES A L'INVENTION
La réaction antigène-anticorps est effectuée dans les
! conditions de température, durée de contact, etc.... les plus
appropriées ~ chaque cas particulier. La réaction positive
se manifeste par l'agglutination des b'illes ou sphères. La
lecturs des résultats S8 fait en estimant l'agglutination
soit simplement par macroagglutination, soit par microagglu-
tination sur plaques alvéolaires.
Il est possible de quantifier la réaction par une
lecture n~phélométrique directe ou en séparant les com-
plexes formés soit par filtration, soit par centrifugation
et lecture de la densité optique des sph~res de latex res-
tantes, ou par mesure de la radioactivité dans le cas de
latex marqu~s présents sur les filtres ou dans le culot.
.
~ 3S08 ~
A/ TESTS PAR ~CRO~GGLUTINATION SUR PLAQUE:S
DE VERRE
EXEMPLE 3g - Test d'activit~ aqql.utinante d~"E~taPor-SH"
virus de la rouqeole oxyd~
Le~ dilution~ d'antisérum ont été effectu~es dans
le tampon suivant : 1% sérum albumine bovine,
0,14M NaCl ; 0,01M Tris-HCl, pH 8,2.
Le r~actif latex-virus de la rougeole conforme à l'inven-
tion a ~t~ utilisé, dans ce test, à raison de 4 ~g/ml.
Les résultats obtenus par macroagglutination du
réactif conforme ~ l'invention sur plaques de v~rre sont
.,.~1,; illustrés à la figure~ dans laquelle le résultat obtenu
avec le témoin (s~rum de lapin anti-VSV) se trouve dans la
partie gauche de la figure; et le résultat obtenu avec le
sérum de lapin anti-rougeole se trouve dans la partie
droite de la figure.
EXEMPLE 40 - Test d'activité aqqlutinante d'"EstaPor-SH"-
virus de la maladie de Carré oxydé
Ce réactif a ~té testé dans les conditions rappor-
tées ~ l'Exemple 39 ci-dessus.
Des r~sultats similaires ont été obtenus en présence
de s~rum de lapin anti-VSY comme témoin, et de sérum de
lapin anti-virus de la maladie de Carré comme essai. ~. :
EXEMPLE 41 - Test d'activité aqqlutinante d'Estapor-GCH
- par macroaqqlutination sur plaque
R~sultats : la réaction est positive avec un sérum
de lapin anti-GCH dilué jusqu'~ 1/160. A cette dilution
l'inhibition de la r~action a ét~ obtenue avec l'urine de
la femme enceinte.
34
1(~8;~S~
EXEMPLE 42 -_Test d'activi~ a~lutinante du ré!actif sph~-
res de latex pOW-antifibrinoq~ne par macro-
aqqlutination sur pla~ues
Les sphares de DOW anti-FDP ont ~té mise8 an suspen-
sion dans le tampon suivant : 1% sérum albumine bovine,
0,14M NaCl, 0,1M Tris-HCl pH 8,2, o~oo1sM azi~e de soude,
raison de 8 mg/ml.
La réaction est positive avec le fibrinogène humain
jusqu'a 4 pg/ml~ ainsi que cela ressort de la figure 4
annexée, et avec le sérum humain dilu~ à 1/10.
EXEMPLE 43 - Dosaqe de Polvamines dans l'urine par macro-
aqqlutination ~ur plaques de verre
Les billes d'Estapor-polyamine pr~par~es conformé-
ment ~ l'Exemple 3 ci-dessus, sont mises en suspension dans
un tampon contenant 1% de s~rum d'albumine bovine, 0,14M
NaCl, 0,1M Tris, pH 8,3, 0,0015M d'azide de sodium, ~ rai-
son de 4 mg de latex/ml.
Une agglutination positive a été obtenue avec le
s~rum de chè~vra antipolyamines dilu~ au 1/30ame dans C8
même tampon ; la réaction négative a ~t~ obtenue avec ce
meme sérum de chèvre, avant immunisation.
Dans ces conditions, la r~action positive a ét~
inhib~e par l'urine de la femme enceinte.
B/ TESTS PAR MICROAGGLUTINATION SUR PL~QUES
ALVEOLAIRES
EXEMPLE 44 - Test de l'activit~ de microaqqlutination de
l'"Estapor-SH"-virus de la rouqeole oxYd~
f~ ~ Les r~sultats obtenus sont illustrés ~ la figure
des dessins annexés, ~ partir d'Estapor color~ suivant
l'Exemple 4.
Las dilutions d'antisérum ont ~té effactu~es dans
- le tampon suivant : 0,14M ~aCl, 0,01M borate-HCl, pH 8,1.
, ~ : -. ........................ ~ ;
- . ~: . ,
A : S~rum de lapin J anti-rougeole pr~paré sur cellules
V~ro ;
B : S~rum de lapin M anti-rougeole pr~paré sur cellules
v~ro ;
C : Sé,rum de lapin C anti-VSV (VSV = Vesicular Stomatitis
Virus) utilisé comme té~moin.
La dilution du sérum est la suivante :
Rangée 1 : 1/10 Rangé~e 5 : 1/160 Rangée 9 : 1/2560
- 2 : 1/20 - 6 : 1/320 - 10 : 1/5120
_ 3 : 1/4Q - 7 : 1/640 - 11 : 1/10240
_ 4 : 1/80 - 8 : 1/1280
La rang~e 12 ne contient que du tampon.
Le réactif latex-virus de la rougeole conforme à
l'invention a ~té utilisé ~ raison de 675 ~g/ml.
La réaction est positive de A1 à A6 et négative de
7 A12-
La réaction e~t positive de B1 à B5 et négative de
B6 à ~12' La ré,action est négative de C1 à C~2. ~ '
'4'~ Il ressort du test illustré à la figure i~ que les :- '
~ 1 ~1i, 1 _ t ~
s A12, B12, C12 sont négatifs et qu'il n'y a
pas de réaction non spécifique avec l'e sérum C.
La sensibilité de la réaction a été' augmentée en
soumettant les sph~res de latex-virus de la rougeole con-
formes à l'invention à un traitement préalable au tri_ium
X-100 à 1 % : avec ce latex-rougeole tritié, la r~action
négative avec le s~rum J ne commence ~u'à A10 et avec le
s~rum M à B6. La réaction avec le sérum C est totalement
n~gative. Cette ~p~cificit~ de réaction a ~té controlée
par des essais avec latex-V~ro (c'est-~-dire un extrait de
cellules V~ro utilisées pour préparer le virus de la rou-
geole, et couplé au latex dans les conditions décrites
à l'~xemple 32. On n'a observé aucune réaction entre le
36
,
~ 350~ 1
r~actif latex-V~ro et les sérums J, M ~t C, ce qui per-
met de conclure que la réaction avec le réactif latex-
rougeole conforme ~ l'invention est sp~cifigue ~t d'une
tras grande sensibilitél.
C/ QUANTIFICATION DE L~ REACTION DE DIAGNOSTIC
PAR LECTURE NEP~ELOMETRIQUE DIRECTE
.
EXEMPLE 45 - Mesure directe Par n~Ph~lom~trie pour des
qammaqlobuline oxYd~es couplees à des suP-
ports conformas ~ l'invention
Pour r~aliser une r~action airecte d~agglutination
de supports antipolyamine~ avec des antigènes, on ajoute
a une quantité fixe du r~actif ci-dessus ("ESTAPOR"-anti-
polyamines), ~ savoir 2 ~g/ml dans 0,1 % de Triton X100-
tampon BBS pH 8,1, dec quantités croissantes (de 1~ à
500 nanogrammes/ml d'antigènes). Le mé~lange est lai~sé
45 heures en pr~sence. La lumi~re diffus~e à 90~ par le
m~lange est mesurée. Les résultats obtenus sont repr~-
sent~s à la figure 1 par la courbe I pour des gammaglo-
bulines de lapin normal utilisées comme antiganes et par
la courbe II pour l'acide Poly L glutamique spermine uti-
lisé co~me autre antigène, les quantit~s a 'antigane in-
troduites ~tant port~es en abcisse et la lumi~re diffusée
à 90~ en ordonn~e : la sensibilité et la précision de la
mesure sont de l'ordre du nanogramme.
EXEMPLE 46 - Test d'activité d'un r~actif de diaqnostic
"Estapor"-anticorps_Par n~phélom~trie
Les dilutions d'antig~nes et de latex-anticorps
anti-polyamines sont effectu~es au tampon "Borate BBS"
filtr~ sur filtre "Millipore" 0,22 ~ (Borate Buffer
Saline = o~o1M Na2B407 0,15M NaCl, HCl pH 8,1). Après la
mise en contact des réactifs, les échantillons et les
témoins ~ont incub~s 1 h à 37~C, puis à la temp~rature
~mbiante.
37
~83~i08
L'~quilibre est d~j~ atteint à la 45ème heure
d'incubation, dans le cas de 0,1 nmole de ~permine cou- ''
pl~e ~ des mol~cules d'acide poly-L-glutamique ~P~L~G~
Spm) en présence de 2 ~g ae latex-antipolyamine (latex
couplés à de~ anticorps de ch~vre immunis~e contxe les
polyamines).
La sp~cificité de cette r~action a eté mise en
~vidence par comparaiRon des réactions d'agglutination
obtenue en pr~sence de l'antigène PoL~G~ Spm avec les
latex-antipolyamines et des latex contrôles coupl~s ~ des
globulines de lapin témoin.
L'application au dosage d'un antig~ne n~cessite la
détermination du point d'~équivalence : maximum de l'aug-
mentation d'intensité lumineuse diffusée en fonction du
rapport latex-anticorps sur antigène.
Ce rapport au point d'équivalence est une constante
pour un lot de latex-anticorps donné~. Il permet, connais-
sant la concentration de latex-anticorps au point d'équi-
valence, de déduire la concentration inconnue d'antigane
présent.
Dans la pratique, devant une préparation d'anti-
gè,ne de concentration inconnue, il est préférable de faire
une gamme de concentrations de latex-anticorps.
L'on prépare une s~rie té!moin, et une s~rie rece-
vant une quantité constante d'antigène.
I est l'intensité, lumineuse diffusé!e par les témoins.
I' est l'intensité lumineuse diffusé!e par les essais con-
tenant l'antigène.
I est une fonction linéaire de la concentration de latex-
anticorps dans le domaine explor~ : de 62,5 ng à 8 ~g/ml.
A cha~ue point de la gamme le rapport I'/I % tra-
duit le phénomè!ne d'agrégation des sphè,res de latex en
38
, ~ .. . .
10~3S~8
pr~sence de l'antig~ne correspondant.
Dans le cas d'une préparation de latex coupl~
des globulines de chèvres immunis~es contre le fibri-
nogane humain : pour 0,35 ng de fibrinog~ne humain, en
présence de concentrations variables de latex-antifibri-
nog~ne, le point d'équivalence est atteint pour 200 ng
de latex anti-fibrinog~ne, ce qui correspond ~ un rap-
port latex-anticorps/antig~ne de 570. Cette préparation
permet de doser avec une précision suffisante jusqu'à
un minimum de 70 pg de fibrinogène humain.
Le rapport au point d'équivalence n'~volue pas de
façon notable au cours du stockage d'une préparation de
latex-anticorps plusieur~ mois durant, à 4~C. Ceci est
probablement d~ à la liaison covalente des anticorps au
latex et à l'élimination apras couplage des anticorps
simplement adsorbés.
D/ QUA~TIFICATION DE LA REACTIO~ DE DIAGNOSTIC
PAR LECTURE_DE_LA
EXEMPLE 47 - Pour réaliser une r~action directe d'agglu-
tination de l'"Estapor"-antipolyamines avec des polya-
mines, l'on a~oute à une quantité fixe d'"Estapor"-anti-
polyamines (6 ~g), préparé conformé!ment à l'Exemple 17
ci-dessus, des quantités croissantes (de 31 à 2000nmoles)
d'antigènes (spermine, spermidine, putrescine li~e à
l'acide poly-L-glutamique et lysine HCl). Le mélange est
laissé 30 minutes à 25~C puis une nuit ~ 4~C. Après cen-
trifugation à 3000 tours/minute pendant 15 minutes pour
s~dimenter les billes d'"Estapor" et l'antig~ne qui s'y
est fixé, la densité optique du surnageant est mesur~e
la ~g~-rc
à 230 nm. Les résultats obtenus sont pr~sentés dans ~
2 C/fs C~ s 4~7~7e~és,
de &~ annex~, qui repr~sente, dans 1'ordre de r~action,
les courbes I pour la spermine, II pour la spermidine,
39
.
:1083S08 ~
III pour la ly~ine, IV~pour la putrescine et V pour le
témoin, avec une limite de d~tectab~lité pour la sper-
mine de 32 nmoles, la densit~ optique ayant ~té port~e :
en ordonn~e et les quantit~s de nmoles d'antig~nes~ajou-
t~es, en abcisse.
E/ QUANTIFICATION DE_L~ REACTION DE DIAGNOSTIC
PAR MESURE DE LA RADIOACTIVITE DE LATEX MARQUES
EXEMPT~ 48 - L'excellente sensibilité! de~ réactif~ con-
formes ~ la présente invention a é~té mise en ~vidence
dans le cadre d'une é!tude comparative d'agglutination
r~alisée respectivement avec le~ produits de couplaage
tels que décrits par R.S. MOLDAY et Collaborateurs dans
l'Art antérieur (r~fé~rences citées plu8 haut), et les
produits de couplage radioactifs obtenus conformément.à
l'Exemple 30 ci-dessus et dont il sera rendu compte ci-
après.
ETUDE COMPARATIVE D'A~GLUTINATION DES PRODUITS
______________________________________________ .
DE COUPLAGE SELO~ MOLDAY ET COLLABO~ATEURS D'UNE :-
________________________________________________ ,
PART ET SELO~ L'INVENTIO~ D'AUTRE PART
______________________________________
I.- Des billes de polystyrane carboxylé sph~ri-
que de 0,3 lu (r~férence PSI 68 de ~HONE-PROGIL), trai-
tées par l'~thanolamine marquée 14C sont substituées con-
formé!ment à l'Exemple 1 ci-dessus, par de l'hexamé!thylène-
diamine, puis activé!es par réaction avec le glutaraldé!hyde
1,25 % pendant 1 heure ~ la température du laboratoire
(20~C), aprè~s ~uoi l'on procède ~ des dialyses prolon-
g~es pour ~liminer l'excès de glutaraldé!hyde.
Les billes substitu~es obtenues de la sorte, sont
évalu~es ~ 560 microgrammes de billes par ml et leur ra-
dioactivité! est de 95 000 cpm par ml.
On leur ajoute 520 microgrammes d'anticorps anti-
gammaglobulines de lapin provenant de chèvres, et on
~0~3~V~
laisse en contact sous ~gitation pendant 5 heures
la température du laboratoire ~20~C~
II.- Des billeQ PSI 68 de 0,30 ~ pr~filtr~e~ ~ur
filtre et marqu~es ~ la 4C ~thanolamine ~ont substi-
tuées, conform~ment à l'Exemple 10 ci-dessus, par de
l'hexam~thyl~nediamine et de l'acide p-hydrazinobenzo~-
que. L'on obtient 560 microgrammes de billes substituées
de la sorte, par ml et leur radioactivit~ est évalu~e
à 87 00~ cpm par ml.
On leur ajoute 0,15 ml (soit 520 microgrammes)
d'anticorps antigammaglobulines de lapin, provenant de
chavres, pr~alablement oxyd~s par du periodate de so-
dium, conformément ~ la présente invention.
Dans les deux cas, les complexes billes-anticorps
ont été séparés des anticorps libres par centrifugation
travers une couche de 10 % de saccharose, l' excas ae
saccharose étant éliminé par dialyse.
III.- Etude comparative proprement dite
Les préparations I et II ci-dessus ont alors été
traitées comme suit :
A/ ~ 0,15 ml de chacune de ces deux préparations ont
été ajoutés :
0,25 ml de 2 % de sérum de veau décomplément~
o,1 ml de sérum de lapin aux dilutions suivantes :
1/500
1/1000
1/5000
1/1 oooo
B/ La composition des contrôle~ a ~t~ la suivante :
0,15 ml de chacune des pr~parations I ou II
0,25 ml de 2 % de sérum de veau d~complé!menté
0,1 ml de tampon BBS, pH 8,8.
4~
~083S01~
Les quatre tubes, l'E~sai A et le contrale B pour cha-
que préparation I et II, sont incubés à 4~C pendant 48 heures,
puis l'on filtre 0,4 ml de chaque tube ~ travers un filtre
Millipore 0,80 ~ présatur~ avec 2 % de s~rum de veau d~complé-
ment~. Les filtres sont lavés avec 4 x 2 ml de 2 % de s~rum de
veau, suivis de 10 ml de tampon BBS, puis suivi3 de 4 x 2 ml de
tampon BBS.
Les filtres sont comptés dans 10 ml du mélange
tr.iton x 100 / toluène 1:2 vol/vol.
Les résultats obtenu~ sont consignés dans le Tableau
ci-dessous :
, , , . ': ' ~
S . i I I . .
~o~ ~ - - ~ 1
-,--I-T~
s ~ ~ ~
~ !; ~ - -
~ ~ ~ a a
43
,
1083S08
Il ressort de ce Tableau que :
- comparativement au proc~d~ de fixation qui fait l'o~jet de
la pr~sente invention, pour lequel on a o~tenu un point
d'~quivalence de ~/5000, la fixation des anticorps sur les
particules de latex conform~ment ~ la technique de MOLDAY et
Collaborateurs, pour laquelle on a obtenu un point d'~quiva~
lence de 1/500, implique que la réalisation du couplage par
cette derni~re technique provoque une perte importante de
sensibilité.
Il résulte de ce qui pr~cède que, quels que soient les
modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adop-
t~s, l'on obtient des produits r~sultant du couplage de compo-
sés comportant un residu glucidique, par l'intermédiaire de
leur(s) groupement(s) -CH0, av~c des supports solides, insolu-
bles comportant des cha~nes latérales portant au moins un -NH2
réactif qui r~agit avec le groupement -CH0 susdit, pour réaliser
le produit de couplage susdit, lesquels produits sont utilisa-
bles, en particulier en tant que réactifs de diagnostic présen-
tant une grande stabilit~ et une très grande sensibilité.
Ainsi que cela ressort de ce qui pr~c~de, l'invention ne
se limite nullement à ceux de ses modes de'mise en oeuvre, de
réalisation et d'application qui viennent d'~tre décrits de fa
çon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les
variantes qui peuvent venir ~ l'esprit du technicien en la ma-
ti~re sans s'écarter du cadre, ni de la port~e, de la pr~sente
invention, et elle s'~tend en particulier ~ d'autre~ systèmes
anticorps-antigènes que ceux qui ont ~t~ décrits, à titre d'exem-
ples non limitatifs, dans les Exemples.
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