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La présente invention a trait à un médicament nouveau
remarquable par ses propriétés de stimulation de l'immunité non
spécifique.
L'invention a également trait à un procédé pour la
préparation de ce médicament.
La présente invention se propose de fournir à titre de
produit nouveau, un médicament stimulant de l'immunité non spéci-
fique, représenté par un extrait purifié d'origine bactérienne,
de nature protéique et physico-chimiquement définie.
0 On sait déjà, notamment d'après le brevet US 3.483.290,
qu'il est possible d'obtenir des préparations stimulantes de
l'immunité par extraction au phénol de matériaux bactériens et
notamment protoplasmiques, notamment d'escherichia coli, cet extrait
étant débarrassé du phénol par précipitation alcoolique. Cepen-
dant le procédé décrit ne permet pas d'éliminer de fa~con suffisante
l'endotoxine lipopolysaccharidique ce qui entraîne des effets
pyrogènes et toxiques empêchant de parvenir à un véritable
médicament. Certes le procédé du brevet US précité cherche à
limiter la contamination par l'endotoxine en partant principalement
du protoplasme après broyage des cellules. Ceci ne suffit cepen-
dant pas à assurer une élimination suffisante car la contamination
subsiste même si le taux d'endotoxine est relativement faible.
En outre ce procédé aboutit à un extrait par définition
insoluble dans l'eau, ce qui empêche en fait d'obtenir une puri-
fication ultérieure suffisante et interdit la préparation de
médicaments véritablement contrôlables.
La présente invention se propose donc d'aller bien au-
del,~ de cet enseignement et de fournir un nouveau médicament
pratique, sûr et contrôlable.
Ce médicament offre aussi bien à la médecine humaine
que vétérinaire une arme susceptible d'être utilisée dans le
domaine très large des luttes contre les agents infectieux, et
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chaque fois qu'il s'agit d'augmenter le niveau de résistance des
défenses immunitaires, par exemple contre les affections tumorales.
Il peut également être associé à d'autres moyens de lutte contre
les agressions, par exemple pour augmenter l'activité des vaccins,
pour renforcer l'activité des antibiotiques en diminuant leurs
doses ou pour agir en synergie avec certains agents antitumoraux.
Ce médicament ne possède qu'une tox cité suffisamment
faible pour être négligeable aux doses efficaces et permettre les
traitements répétitifs.
En outre, le médicament selon l'invention présente une
grande stabilité, facilitant ainsi la conservation et l'usage.
Il peut être stérilisé par exemple par filtration et/ou chauffage.
Enfin, l'invention se propose de fournir un procédé
pour la fabrication de ce médicament, ledit procédé présentant
l'avantage d'être simple, peu coûteux, facile à mettre en oeuvre
et susceptible de faire très facilement l'objet de nombreuses
variantes, procurant ainsi une grande adaptabilité du procédé.
L'invention a pour objet un nouveau médicament stimulant
de l'immunité non spécifique contenant un extrait phénolosoluble
de microorganisme caractérisé par le fait qu'il comporte l'extrait
phénolosoluble, ou une fraction de cet extrait, d'un ou plusieurs
des microorganismes monocellulaires suivants : bactéries, levures
et protozoaires, ledit extrait ou fraction étant rendu hydroso-
luble et exempt d'endotoxine et étant sensiblement exempt de
phénol et dosé à une quantité stimulant l'organisme receveur.
Dans une première forme de réalisation, le médicament
comporte un extrait, ou une fraction d'extrait, phénolosoluble de
- bactéries ou de mycobactéries.
Parmi les bactéries, on préfère :
Neisseria meningitidis, Proteus nirabilis, Bordetella
Pertussis, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter anitratus,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Brucella abortus,
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corynebacterium pseudodiphteria, Corynebacterium parvum,
Staphylococcus aureus.
De fa~on particulièrement préférée, le médicament peut
comporter un extrait de Neisseria meningitidis serogroupe A,
Neisseria meningitidis serogroupe C, Proteus mirabilis ou Kleb-
siella pneumoniae.
Dans une autre forme de réalisation, le médicament peut
comporter un extrait, ou fraction, de mycobactéries, et de préfé-
rence Mycobacterium phlei, Mucobacterium I~ansasii, M.scrofulaceum,
M.intracellulare, M.fortuitum.
Dans le cas où le médicament comporte un extrait phéno-
losoluble de levure, on préfère des extraits de Saccharomycès
Cerevesiae.
Le médicament selon l'invention peut être assoclé à
d'autres produits ou compositions pharmaceutiques, tels que cory-
nebactérium parvum, antibiotiques, antimitotiques, corticoides,
vitamines et également à des vaccins divers, par exemple contre
la grippe, contre la coqueluche, la poliomyélite, la rougeole, la
rubéole, les anatoxines tétaniques et diphtériques, les polysac-
charides méningococcyques, soit seuls soit associés.
Le médicament selon l'invention peut se présenter de
différentes manières, par exemple sous forme injectable, par
exemple sous forme d'une solution ou suspension dans une eau physi-
ologique ou dans un excipient huileux ou encore d'une émulsion
huile-dans-l'eau ou eau-dans-l'huile, soit sous forme lyophilisée
soit sous forme d'aérosols, soit sous forme buvable, soit sous
forme administrable par voie rectale. I1 peut avantageusement
comporter un adjuvant sur lequel il est de préférence adsorbé, par
exemple sur hydroxyde d'aluminium.
3b Le médicament peut également se présenter sous forme de
pommade à l'aide d'un excipient habituel convenable.
Les doses à administrer dépendent de l'affection à
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traiter, de la nature du traitement et de l'organisme qui subit
le traitement. Cette dose peut être laissée sans difficulté ~
l'appréciation du médecin ou du vétérinaire comme cela se fait,
de fac,on bien connue, dans les traitements de stimulation de
l'immunité.
A titre d'exemple, la dose peut comporter de 10 à 1000
microgrammes en poids sec d'extrait et pour le traitement humain
une dose convenable peut être de l'ordre de 400 microgrammes.
L'administration du médicament peut notamment se faire
par voie externe, par exemple sous forme de pommade ou de pulvé-
risation, par voie sous-cutanée, intradermique, parentérale,
intrapéritonéale, ou intramusculaire ou encore par inhalation
sous forme d'aérosol, ou par voie orale ou rectale.
Le médicament selon l'invention est adapté notamment
au traitement par stimulation de l'immunité non spécifique des
brûlés, des traumatisés, ou des organismes sans défense immuno-
logique. Il peut également être utilisé à titre préventif ou
curatif dans un environnement infectieux, par exemple pour les
infections banales ou pour éviter des complications subséquentes
à des affections virales ou tumorales.
Le médicament selon l'invention ne présente qu'une
toxicité faible variant assez peu en fonction du microorganisme
utilisé, comme le montrent le test du gain de poids chez la souris,
l'étude du pouvoir sensibilisant chez le lapin et le cobaye et
les essais de toxicité chronique sur les porcelets, les veaux et
les bovins adultes.
Le médicament selon l'invention agit notamment par la
stimulation du système immunitaire non spécifique. Il présente
une activité antibactérienne notable ainsi qu'une activité anti-
virale. Il présente une excellente protection contre les surin-
fections bactériennes au cours d'une affection virale. Il possède
un pouvoir inducteur d'interféron. Il provoque une montée impor-
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tante du taux d~anticorps circulants hétéxologues~
Il présente également une lm~ortante actiVité cellu-
laire, La phagocytose est f~ortement stimulée et on note une ex-
haltation de la réaction du greffon contre l'hôte et un effet
mitog8ne notamment sur le lymphocyte humain.
L'in~ention a agalement pour objet un procédé de pré-
paration du médicament selon llinvention, caractérisé par le
fait que l'on effectue sur au moins un microorganisme choisi dans
le~ groupe constitué par les bactéries, levures et protozoaires,
en présence dleau, une extraction a l'aide de phénol liquide
o a la température d~extraction, inférieure a 70C, et qu'apres
avoir recueilli Ia phase phénolique, on élimine ce phénol, puis
on rend l'extrait hydrosoluble à l~aide d'un agent tensioactif
ou basique.
Parmi les phénols, on préf8re le phénol lui-même ou
éventuellement les crésols et notamment le métacrésol ou le
méthyl-3 chloro-4 crésol.
La température est de préference inférieure à 70C et
de préférence supérieure a 0C. On peut avantageusement opérer
~ une température comprise entre 60 et 67C.
La durée de l'extraction peut être comprise entre quel-
ques minutes et quelques heures. De préférence, elle est
comprise entre 30 minutes et 3 heures.
La quantité de phénol par rapport a la quantité d'eau
de la suspension initiale peut être quelconque, elle peut être
par exemple comprise entre lS et 85%. Cependant on-préfère
utiliser la proportion de phénol donnant l'émulsion la plus
satisfaisante. Dans le cas du phénol C6H5 OH lui-même, cette
proportion préférée est de 45% de phénol.
Dans le cas des bactéries gram - on peut effectuer
l'extraction directement sur une suspension bactérienne. Dans le
cas des bactéries gram ~ou des mycobactéries, on effectue
~ 5 -
B
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d'abord un broyage ou une lyse bactérienne avant de ~rocéder
llextraction.
De-préf~rence~ l~extraction se fait en presence d'un
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détergent anionique tel que du dodécylsulfate de sodium par
exemple. La présence d'un détergent a pour effet de faciliter
les opérations et également de faire disparaître certaines activités
sensibilisantes et notamment les endotoxines.
Le pH est pratiquement indifférent, mais on peut faire
agir le phénol sur une suspension à pH sensiblement neutre pour
des raisons de simplicité.
La séparation entre la phase phénolique et la phase
aqueuse peut s'effectuer de facon classique, par exemple soit par
centrifugation, soit par séparation directe après décantation,
par exemple à l'aide d'une pipette.
La séparation entre phase aqueuse et phase phénolique
peut être avantageusement rendue plus aisée et plus complète par
addition de sels tels que par exemple MgC12 ou NaCl à concentra-
tion élevée. Le sel peut être ajouté soit sous forme cristallisée
soit sous forme de solution concentrée et cette addition peut
intervenir aussi bien au premier temps de l'extraction qu'après
rupture de l'émulsion phénol/eau sur la phase phénolique déjà
décantée afin de la débarrasser de l'eau de saturation. La phase
phénolique obtenue, limpide et colorée,peut ~galement être lavée
plusieurs fois à l'eau.
Ces opérations permettent d'éliminer pratiquement la
totalité des endotoxines, même dans le cas de bactéries gram-
comme E. coli, qui sont fortement contaminées.
Ce qui est remarquable c'est que le procédé peut être
mis efficacement en oeuvre par une extraction dans des limites
extrêmement larges de température, de concentration entre la
phase phénolique et la phase aqueuse, de pH, de force ionique.
En outre, les résultats positifs observés pour les
extraits des très nombreux microorganismes testés dans le cadre
de la présente invention permettent de penser que ces extraits
autorisent la préparation de médicaments quelle que soit la
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souche de bactéries, mycobactéries, ou levures, utilisée.
Après l'extraction on procède à l'élimination du phénol
afin de récupérer le matériel actif de nature protéique, dissous
dans la phase phénolique. En raison de la grande stabilité physi-
cochimique de cet extrait, cette élimination peut être effectuée
par de nombreux moyens différents.
Ainsi, dans un premier mode de mise en oeuvre, on peut
effectuer une précipitation alcoolique et recueillir le précipité.
Dans un deuxième mode de mise en oeuvre la phase phéno-
lique est traitée par un agent précipitant tel que par exemplele polyéthylèneglycol en solution phénolique. Un premier stade
de purification peut être obtenu en fonction de la concentration
en polyéthylèneglycol qui permet de fractionner la population
moléculaire en groupes différents.
Dans un troisième mode de mise en oeuvre l'élimination
du phénol peut être effectuée par distillation sous vide.
Au terme des différents procédés précités le produit
obtenu est pratiquement exempt de phénol et insoluble dans l'eau.
Après d'éventuels lavages et/ou dialyses pour éliminer les
dernières traces de phénol il peut être remis en suspension et
homogénéisé dans l'eau ou dans un tampon ou un sérum physiologi-
que.
Il supporte un traitement à haute température en auto-
clave, par exemple à + 115C durant 30 minutes, aussi bien sous
forme de suspension aqueuse que de lyophilisat desséché.
Il peut alors être soumis à un traitement destiné à le
rendre hydrosoluble et à le purifier davantage.
Un tel traitement peut comporter diverses étapes,
notamment des mises en solution, par exemple à l'aide d'agents
tensio-actifs, l'élimination de certains composants toxiques,
par absorption sur divers supports tels que charbon activé,
silice, argile ou de préférence sulfate de barium, d'élimination
1(~9158Z
des tensio-actifs en excès, par exemple par traitement au
chlorure de potassium suivi de centrifugation, de fractionnement
par toutes méthodes utilisées en biochimie, telles notamment
que les divers types de chromatographie ou d'électrophorèse.
Le produit soluble et purifié obtenu peut être avanta-
geusement mélangé à un support finement particulaire par exemple
de l'hydroxyde d'aluminium, du phosphate d'aluminium ou du
phosphate de calcium, ou être complexé à une macromolécule par
exemple à un polycation tel qu'une albumine méthylée ou un
DEAE Dextran.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, la phase phénoli-
que recueillie est dialysée, de préférence contre un tampon
alcalin pour des questions de rapidité. Si un culot subsiste
on l'élimine, après quoi le produit recueilli hydrcsoluble
peut subir une ou plusieurs des opérations de purification et de
concentration et recevoir éventuellement un adjuvant ou un gel
ou être complexé à une macromolécule comme précité.
D'autre avantages et caractéristiques de l'invention
apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à
titre d'exemple non limitatif.
I. EXTRACTION
EXEMPLE 01 : Extraction au phénol.
On mélange 10 g de cellules sèches de bactéries ou de
levures, avec 350 ml d'eau distillée, et l'on amène ce mélange
à une température de 65C. On ajoute ensuite 315 ml de phénol
pur préalablement chauffé à 65C et 35 ml de SDS (dodécylsulfate
de Na) à 6,66 % chauffé à 65C. La concentration finale en
phénol est de 45 % et en SDS de 3,125/oo .
Ce mélange est agité pendant une heure en restant
maintenu à la température de 65C, puis il est refroidi entre 0
et ~ 4C et laissé au repos une nuit à 4C.
On obtient une phase phénolique inférieure et une phase
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l~9~S~32
aqueuse supérieure avec une interphase comprenant de gros débris.
On élimine l'interphase et la phase aqueuse puis on centrifuge
de préférence la phase phénolique décantée à 35.000 g pendant une
heure à + 10C. L~interphase et la phase aqueuse obtenues sont
éliminées et l'on conserve une phase phénolique limpide colorée.
Le même procédé d'extraction peut être utilisé pour
tous les microorganismes entrant dans le cadre de l'invention.
EXEMPLE 02 : Extraction au métacrésol.
Une suspension contenant 10 g de germe sec dans 500 ml
d'eau distillée est chauffée à 37C puis mélangée à 500 ml de
métacrésol chauffé à 37. Après 3 minutes d'agitation,à 37C,
le mélange est centrifugé et la phase aqueuse et l'interphase
sont éliminées.
EXEMPLE 03 : Extraction au phénol.
On mélange 10 g de bactéries sèches avec 400 ml d'eau
distillée et l'on amène la température du mélange à 40C. On
ajoute ensuite 350 ml de phénol à 90 % à 4C. On agite le mélange
pendant 6 heures à 4C et on laisse décanter une nuit à 4C. On
élimine ensuite la phase aqueuse et l'interphase par centrifuga-
tion.EXEMPLE 04
On mélange 10 g de germe sec avec 350 ml d'une solution
à 30 % de NaCl et on amène à 65C. On ajoute 315 ml de phénol
pur préalablement chauffé à 65C et 35 ml d'une solution à 0,2 M
de SDS chauffée à 65C et on agite 1 heure à cette température.
On refroidit à 25C.
On effectuc ensuite une ccntrifugation et on obtient
une phase phénolique supérieure qu'on décante. On la mélange
avec un volume égal d'eau distillée apyrogène à 25C, on agite
pour former l'émulsion pendant 30 minutes à 25C puis on centrifuge
pour briser l'émulsion et recueillir la phase phénolique ainsi
lavée après décantation de la phase aqueuse surnageante.
~)9lS8Z
EXEMPLE 05 : Extraction au phénol.
Le mélange est préparé comme dans l'exemple 01 et le
mélange est agité, comme dans cet exemple pendant 1 heure en
restant maintenu à la température de 65C. Le mélange est ensuite
refroidi à + 5C et on ajoute alors du NaCl cristallisé en quantité
suffisante pour porter la concentration de la phase aqueuse à 30 %,
soit 115,5 g. On agite pendant 30 minutes à + 20C puis on centri-
fuge et on recueille la phase phénolique surnageante.
II. ELIMINATION DU PHENOL
EXEMPLE'l :
La phase phénolique obtenue à l'exemple 01 précédent est
mélangée avec 5 volumes de méthanol prérefroidi à 20C. On peut
avantageusement ajouter 0,01 volume d'une solution méthanolique
saturée d'acétate de sodium.
Le mélange est ensuite placé au repos plusieurs heures,
par exemple une nuit, à basse température, par exemple 4C.
On procède ensuite à la décantation de la phase métha-
nolique surnageante, puis à la centrifugation du sédiment à
15.000 g pendant environ 30 minutes.
2~ Le culot peut être conservé tel quel, pour subir un
traltement de solubillsation et de précipitation ultérieur ou
immédiat.
Il peut être lyophilisé, ce qui permet également de
parfaire l'élimination du phénol et de le conserver à l'état sec
durant de longues périodes. La suspension ou le lyophilisat peuvent
être chauffés à l'autoclave.
Il peut également être lavé ou dialysé pour éliminer
le phénol résiduel et être par exemple repris en eau physiologique.
I1 est par exemple repris en eau distillée ~ raison de
deux fois le volume de la phase phénolique traitée et on effectue
ensuite une dialyse sous agitation contre 50 volumes d'eau dis-
tillée à ~ 4C, pendant plusieurs heures, par exemple une nuit.
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lO91S8Z
Cette dialyse est ensuite reprise une seconde fois
contre de l'eau physiologique tamponnée à pH 7.
On obtient enfin une fraction S insoluble dans l'eau.
Cette fraction S peut être stériliése par chauffage en
autoclave par exemple à 115C durant 30 minutes.
EXEMPLE 2
A la fraction S précédente ou au culot simplement remis
en suspension dans l'eau, dispersée dans un volume d'eau à une
concentration de 4 à 5 milligrammes de protéine par ml on ajoute
0,1 volume de SDS 0,2 M, goutte à goutte sous agitation à tempé-
rature ambiante pour dissoudre la fraction.
L'agitation est poursuivie jusqu'à dissolution complète
à la suite de quoi on ajoute 0,5 volume d'une suspension de BaS04
à 1~3,75 % dans l'eau. Après 2 heures d'agitation à température
ambiante on centrifuge à 15.000 g durant 30 minutes. Le culot est
éliminé et on ajoute au surnageant 0,05 volume de KCl saturé afin
d'éliminer le dodécylsulfate qui précipite. On effectue ensuite
une centrifugation à 15.000 g pendant environ 30 minutes. Le
culot est éliminé et l'on recueille le surnageant limpide. Celui-
ci est ensuite dialysé contre de l'eau physiologique tamponnée à
pH 7, à raison de 3 fois 50 volumes jusqu'à élimination du phénol
résiduel ou du KCl résiduel.
On effectue enfin une filtration sur filtre Millipore
0,45u, puis 0,22u, obtenant la fraction SS qui, contrairement à
la fraction S, est soluble.
De préférence, on ajoute à cette fraction un adjuvant
tel que de l'alumine ou un autre gel ou de DEAE Dextran ou une
albumine méthylée.
EXEMPLE 3 :
La phase phénolique obtenue par extraction selon
l'exemple 01 est mise en dialyse contre de l'eau distillée avec
agitation du boyau de dialyse, jusqu'à élimination du phénol,
~091S8Z
ce qui nécessite trois dialyses à 50 volumes.
On effectue ensuite une dialyse contre tampon phosphate
Na à pH 8, à température ambiante avec agitation du boyau jusqu'à
dissolution. Cette dialyse est effectuée deux fois à 50 volumes.
La durée totale des dialyses est de plusieurs heures par
exemple d'environ 48 heures.
S'il existe un culot on effectue une centrifugation à
15.000 g pendant 30 minutes, et on élimine le culot. Cependant,
pour un grand nombre de bactéries, on n'observe pas de culot.
Le surnageant limpide subit une dialyse contre de l'eau
physiologique tamponnée à pH 7, à raison de deux dialyses à
50 volumes. On obtient alors une fraction SSp plus active encore
que la fraction SS précédente.
On peut continuer la purification en abaissant le pH
à 4 par HCl sous agitation, ce qui conduit à une précipitation.
On effectue ensuite une centrifugation à 15.000 g pendant 30
minutes, permettant d'éliminer le surnageant.
Le précipité est repris en eau distillée à raison de
1 volume pour 1 volume de précipité par abaissement du pH et
l'on effectue enfin une dialyse contre de l'eau physiologique
tamponnée à pH 7, jusqu'à dissolution complète à raison de trois
opérations à 50 volumes.
On obtient alors une fraction désignée SSpH, sous
forme de solution.
EXEMPLE 4 :
L~extrait phénolique obtenu selon l'exemple 1 subit une
précipitation par adjonction de polyéthylèneglycol de poids
moléculaire compris entre 1.500 et 20.000 et de préférence de
l'ordre de 6.000.
Le précipité est ensuite centrifugé et recueilli. Il
est ensuite remis en suspension dans de l'eau, de préférence physio-
logique.
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Les fractions obtenues ont toutes la même activité et
ne sont pas solubles. On peut cependant lesirendre solubles par
des procédés analogues à ceux des exemples 2 et 3.
Afin de mettre en évidence l'activité de stimulation
non spécifique de l'immunité on a soumis un nombre très important
de souris à des épreuves sévères d'infections bactériennes en
utilisant comrne bactéries d'épreuve Salmonella, Pseudomonas,
Escherichia coli, Staphylocoques, Neisseria meningitidis sero-
groupe A, B, C Klebsiella pneumoniae et Brucella Abortus.
En se référant au tableau I ci-après on peut voir les
doses protectrices 50 % des divers extraits de 12 origines
différentes avant chauffage et après chauffage à 115C durant
30 minutes. L'agent d'épreuve était Salmonella.
Le tableau II ci-après montre les résultats cumulés
obtenus avec différents extraits de Neisseria et de Proteus,
exprimés en pourcentages de survie, pour différentes doses
adressées à des souris en microgrammes de poids sec.
Le tableau III ci-après montre les résultats, en fonction
des doses adrninistrées à des souris, de la protection d'extraits
selon l'invention contre l'épreuve meningitidis serogroupe A, B
et C.
A titre d'exemple on a représenté sur la figure 4 un
graphique sur lequel sont porté en abscisse l'intervalle de temps
séparant la stimulation de l'épreuve et en ordonnée le pourcen-
tage de survie. Les doses sont administrées aux souris par voie
interpéritonéale.
La courbe 1 représente la cinetique chez des souris
stimulées par 50 microgrammes d'extraits S de Méningo M 21 à la
suite d'une épreuve Salmonella. La courbe 2 représente la cinéti-
que liée à une stimulation de 10 microgrammes d'extraits SS, adjuvésAl de Méningo M 29 contre une épreuve .Staphylo.
La courbe 3 représente la cinétique liée à une stilula-
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tion de 10 microgrammes d'extraits SS + Al de Pertussis Bp pour
une épreuve Staphylo. On voit que la stimulation s'établit en un
jour, atteint son plus haut niveau en deux à trois jours et reste
significative pendant deux à trois semaines.
Le tableau IV montre les résultats obtenus pour des
extraits de Neisseria et de Proteus en fonction de la durée séparant
l'administration à la souris des extraits selon l'invention et
l'épreuve ultérieure par N.meningitidis serogroupe A, B et C.
Le tableau V représente les résultats obtenus par une
stimulat~ion par un extrait SS ~ hydroxyde d'aluminium de Neisseria
tout d'abord à la suite d'une stimulation unique suivie d'une
épreuve Salmonella 3 jours après et une épreuve Pseudomonas
17 hours après ainsi qu'après stimulation multiple à 0,7, 15, 21
et 28 jours et épreuve Salmonella aux 3è, 10è et 18è jour puis
Pseudomonas le 24è jour et coli le 31è.
Le tableau VI représente la protection contre des épreuves
mixtes par l'extrait Neisseria. L'agent d'épreuve était constitué
d'un mélange de quatre espèces bactériennes Salmonella, Pseudo-
monas, Staphylocoques et coli.
L'effet de stimulation répété figure sur le tableau VII.
Le tableau VIII représente les résultats obtenus lors
de la protection par extrait de Neisseria contre des épreuves
virales EMC. (Virus de l'encéphalomyocardite de la souris) et SF
(Virus Semliki-Forest).
De même on a pu établir pour les médicaments selon
l'invention une notable activité protectrice contre une surinfection
bact~rienne au cours d'une infection virale. L'essai a ~t~ fait
sur des souris soumises à une épreuve virale recevant une dose
Dl 50, et soumises trois jours plus tard à une épreuve bactérienne
à une dose supérieure à IDMM.
Le tableau IX représente l'activité d'un extrait
Neisseria contre la surinfection bactérienne au cours d'une infec-
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lO91S82
tion virale EMC, la grande flèche représentant la date d'adminis-
tration du médicament et la petite flèche représentant la date
d'administration de l'agent d'épreuve, dans le premier cas unique-
ment EMC, dans le deuxième uniquement coli, dans le troisième
cas une épreuve double EMC puis coli.
On constate qu'une seule injection d'extrait SS de
Neisseria avant ou après l'infection virale assure une excellente
protection.
Les tests effectués sur plus de 20.000 souris, ont
montré que les souris stimulées grâce au médicament selon l'inven-
tion résistaient bien malgré la sévérité des épreuves. Les médica-
ments les plus efficaces se sont avérés être ceux contenant des
extraits de Neisseria et Proteus et dans une moindre mesure
Klebsiella.
L'excellente activité des extraits de Neisseria
meningitidis a été également confirmée sur divers modèles expéri-
mentaux mettant en jeu de gros animaux, porcs et bovins. Ces
extraits ont pu par exemple protéger le porc contre une épreuve
de Rouget sufficante pour amener chez les témoins non stimulés
la généralisation des lésions.
D'une façon générale les meilleurs résultats ont eté
obtenus pour les fractions SS et parfois pour les fractions SSp.
L'activité immunostimulante se trouve notablement
augmentée en utilisant un adjuvant tel que A1203, Al Po4, du
latex, de l'aérosil, du DEAE Dextran, une albumine méthylée.
Les essais ont également montré qu'une certaine stimula-
tion anti-virale était obtenue. Ainsi par exemple l'extrait de
Neisseria à la dose de 5 microgrammes par souris par voie intrana-
sale protège 8 souris sur 10 contre le virus grippal également
par voie d'aérosol.
La figure 1 représente un graphique avec en abscisse le
nombre de jours séparant la stimulation de l'épreuve virale EMC
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~V9158Z
et en ordonnée le pourcentage de survie. La courbe A correspond
aux souris ayant re,cu par voie intrapéritonéale une dose de 225
microgrammes d'extraits de Neisseria et 150 microgrammes d'hydro-
xyde d'aluminium. La courbe B représente des témoins qui n'ont
re,cu, à la place de la stimulation qu'une administration intra-
péritonéale de 150 microgrammes dlhydroxyde d'aluminium et la
courbe C représente les témoins ayant subi une simple adminis-
tration d'eau physiologique.
La figure 2 représente un graphique similaire à celui
de la figure 1 pour une administration par voie sous-cutanée.
Il a été également établi dans les modèles d'affections
tumorales chez la souris une action synergique de l'association
entre les médicaments préparés selon l'invention et certains
agents anti-tumoraux, par exemple le corynebactérium parvum,
synergie particulièrement remarquable lorsque le traitement
l'aide d'une telle association est instituée à titre curatif.
On a également pu établir que les médicaments selon l'in-
vention assuraient une stimulation non spécifique des anticorps
circulants hétérologues ainsi qu'une stimulation du nombre de
cellules lymphoides sécrètrices. Du point de vue des activités
cellulaires, on obtient une stimulation de la phagocytose, une
stimulation des organes du système réticulo-endotélial, une
exhaltation des réactions d'hypersensibilité retardée chez le
cobaye, l'exhaltation de la réaction du greffon contre l'hôte et
une stimulation de la synthèse d'ADN dans le lymphocyte humain
activité in vitro.
La figure 3 illustre graphiquement l'effet adjuvant
obtenu chez la souris vis-à-vis des anticorps antigrippaux après
immunisation par un vaccin grippal bivalent A et B. En abscisse
figure le logarithme de la dose en microgrammes d'extrait de
Neisseria avec l'hydroxyde d'aluminium et en ordonnée le Log du
Titre IHA. La courbe A représente l'effet du vaccin grippal
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lO91S82
valence A non adjuvé alors que la courbe Al représente le cas
de ce vaccin adjuvé par l'extrait selon l'invention.
La courbe B correspond au vaccin valence B non adjuvé
et la courbe Bl au vaccin valence B adjuvé.
D'une fa~on générale les différentes fractions S, SS,
SSP, SSH, SSpH montrent toutes un haut niveau d'activité.
Dans la plupart des cas on préférera donc utiliser
l'extrait SS dont l'innocuité et la stérilisation sont plus
faciles à contrôler que l'extrait S lequel en plus n'est pas
solubler et dont la fabrication est plus facile que celle des
extraits SSp et SSH.
Le médicament selon l'invention est de préférence adsorbé
sur un adjuvant, et de préférence l'alumine et il est de préfé-
rence lyophilisé.
Sous forme dessèchée il peut avantageusement être chauffé
en autoclave par exemple à 115 permettant encore une nette
atténuation des réactions toxiques qui pourraient subsister.
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EMC puis Coli J - 3 JO J3
EMC ~ ~Coli 60/60100 %
M 2 , EMC y , ~ 39/40 97,5 %
J - 3 JO 31 J3
PROTECTION CONTRE UNE SURINFECTIOY BACTERIENNE
AU DECOURS D'UNE AFFECTION VIRALE
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