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la~8~3 1 .,
La présente invention concerne un procédé de mesure
en continu de l'activité enzymatique dans les stations d'épura-
tion biologique des effluents urgains et industriels, et un
dispositif pour l'application dudit procéde.
L'efficacité des stations d'épuration est conditionnée
par le maintien d'un niveau suffisant de l'activité des popula-
tions microbiennes ou biomasse au contact de l'effluent en
cours de traitement. Il importe donc de savoir mesurer à tout
moment l'activité en question par un procédé à mise en oeuvre
rapide. C'est à cette condition seulement que les variations
du niveau d'activité seront connues à temps pour en corriger
l'évolution par des moyens appropriés. Il est notamment
primodial d'intervenir lorsqu'un processus de réduction
d'activité s'amorce, le risque d'inhibition de la biomasse
devenant alors important.
Lorsqu'une telle inhibition se manifeste, conséquence
d'une véritable intoxication des populations bactériennes, un
arrêt prolongé de la station devient inéluctable.
Les méthodes utilisées jusqu'alors sont fondées sur
la détermination des matières en suspension (MES) ou des
matières volatiles en suspension (MVS). Cette dernière mesure
englobe non seulement les microorganismes vivants mais aussi
les microorganismes morts, ainsi que les matières en suspension
volatiles non biologiques. Ces tests sont donc insuffisants
pour donner une idée précise de l'état de la biomasse et de
son activité à un instant donné.
Les méthodes respirométriques, par la détermination
de la vitesse de consommation de l'oxygène, donnent une informa-
tion directe sur l'activité de la fraction vivante de la
biomasse, elles sont cependant d'une application directe
délicate et difficile à programmer dans le cadre d'un système
de mesure en continu.
-- 1 --
~k
lQ~
Le dosage des déshydrogénases des boues activées
a été envisagé en 1964 à la Seconde Conférence Internationale
pour la recherche sur la pollution des eaux à Tokyo par M~. G.
LENHARD, L. NOURSE et H.M. SC~ARTZ.
L'emploi du chlorure de triphényl - tétrazolium, en
abrégé TTC, incolore, r-éduit en triphényl formazan, en abrégé
TF, rouge, sous l'action des déshydrogénases, a été préconisé
par différents auteurs, notamment par PHILIP H. JONES et D.
PRASAD dans Journal of Water Pollution Control Federation
(Novembre 1969 - pp. R 441-R 449) Editor . Peter J. PIECUCH -
3900 ~ISCONSIN Av. N.W. WASHINGTON D.C. 20016.
Les mesures réalisées jusqu'ici ont cependant conduit
à des résultats discordants et généralement ne représentant
pas de façon exacte l'évolution des réactions d'oxydation de
la biomasse.
Dans le brevet francais N~ 2 302 281 du 28 Février
1975, Roger BEN-AIM et Jean-P1erre LEGERON préconisent dans le
cadre d'une méthode différentielle, l'emploi de TTC en propor-
tion limitée pour éviter les interactions éventuelles entre
le TTC et le TF et la biomasse elle-même, le dosage étant
réalisé à l'abri de la lumière et hors de la présence de
substrats qui seraient susceptibles de modifier le milieu
réactionnel. Dans de telles conditions opératoires, mesures
en discontinu, les mesures peuvent difficilement être obtenues
avec les délais compatibles avec la nécessité d'une interven-
tion rapide sur les installations industrielles.
La présente invention permet de surmonter ces diffi-
cultés en définissant l'activité enzymatique par la quantité
de TTC réduite dans des conditions définies.
En effet, le TF étant insoluble dans l'eau, la
quantité de TTC réduite est directement proportionnelle ~ la
concentration en déshydrogénases réductrices vis-à-vis du TTC,
-- 2
~ . ~ . .... .
~9~3~3~
c'est-à-dire en déshydrogénases de potentiel rédox inferieur
à -80 millivolts.
L'activité peut donc se définir par la quantité de
TTC réduite dans certaines conditions, pour cela on extrait
le TF insoluble dans l'eau dans un solvant organique dont on
peut mesurer la densité optique.
Afin de définir une grandeur proportionnelle à la
concentration des microorganismes, c'est-à-dire en déshydro-
génases, il est nécessaire de définir les conditions standards
d'incubation, c'est-à-dire les conditions qui peuvent être
appliquées aux boues du système d'épuration biologi~ue quelle
que soit la charge, notamment : la concentration en oxygène,
l'addition d'éléments réducteurs, le pH de l'effluent.
La concentration en oxygène doit rester constante
dans le milieu. En effet, le schéma géneral d'une chaîne
respiratoire montre qu'il existe une compétition entre la
co-enzyme Q et le TTC, pour l'oxydation de la Flavine Adenine
Dinucléotide en forme réduite ou en abrégé FADH2. E. KUN et
L.G.ABOOD dans la revue SC~ENCE, pages 107, 144, année 1949
"Colorimetric estimation of succinic deshydrogenasses by
triphenyl - tetrazolium chloride", ont montré cette compétition
en étudiant en aérobie et en anaérobie la cinétique de la
réduction du TTC par la succinate déshydrogénase extraite du foie
du rat. Le dosage ne peut donc être reproductibe que dans la
mesure où le rapport :
CO-enzyme Q oxydée / TTC est constant
Cette condition sera remplie, si, par l'effet d'addi-
tifs procurant un tel résultat, le pourcentage d'oxygène au
début de l'incubation est annulé. En ef~et, pendant l'incuba-
tion, le pourcentage de TTC restera alors très grand par rapport
au pourcentage de CO-enzyme Q oxydée. Le TTC devient alors
l'accepteur final d'électrons.
-- 3
. .
l~s~a3~
Ainsi, nous pouvons définir le dosage de l'activité
comme la mesure d'un flux d'électrons. Ce flux d'électrons
est proportionnel à la concentration en Nicotinamide Adénine
Dinucléotide réduit ou NADH2. Comme la concentration en NADH2
dépend de la concentration en enzyme (déshydrogénases) et en
substrat assimilable, dit le substrat (par exemple le lactose),
ce n'est que lorsque ce substrat est en excès que le flux
d'électrons est proportionnel à la concentration en déshydro-
génases.
Ainsi, en présence d'un excès de substrat, nous
mesurons un potentiel d'activité qui traduit une concentration
en enzyme dans les boues à un instant donné, indépendamment de la
concentration en substrat à ce même instant.
Il est connu que l'activité enzymatique est fonction
croissante du pH, il est nécessaire de fixer la valeur de ce pH,
ne serait-ce que pour pallier le fait que la réduction du TTC
en TF s'accompagne d'une acidification du milieu. Une solution
tampon de pH = 7,5 correspond aux pH les plus couramment
rencontrés dans les systèmes d'épuration biologiques.
Telles sont les trois conditions générales et standards
d'incubation qui caractérisent le procédé, suivant l'invention,
de mesure en continu de l'activité enzymatique de la biomasse.
Le temps d'incubation et les conditions d'arrêt de l'incubation
font l'objet de préconisations particulières.
Dans un tel procédé de mesure en continu de l'activité
enzymatique dans les systèmes d'épuration ~iologiques, on
prélève de fa,con continue un échantillon de l'effluent, et on
place ledit échantillon en condition standard.
Une boue activée représente un milieu hétérogène où
cohabitent différentes espèces de bactéries, chacune étant
caractérisée par un temps de génération minimum qui peut varier
de 16 minutes pour "Escherichia Coli" a 5 heures 30 minutes
' 10~3431
pour "Rhizobium Japinicum". Cependant, dans la majorité des
cas, le temps de génération est de l'ordre de 20 minutes.
Ainsi, il semble nécessaire de choisir un temps
d'incubation inferieur, soit 15 minutes, afin de mesurer une
activité caractéristique d'une géneration de bactéries.
Le fait de substituer le TTC à l'oxygène comme
accepteur final d'électrons bloque le processus de la phosphori-
lation oxydative génératrice d'Adénise Triphosphatée ou ATP,
produit qui sert au stockage de l'énergie au niveau de la
cellule. Cet ATP est réutilisé pour l'anabolisme dont dépend
la croissance et choisir un temps d'incubation plus long
reviendrait à mesurer une activité résultant d'une croissance
perturbée.
En 15 minutes, on peut mesurer un potentiel d'activité
correspondant à une génération de bactéries et proportionnel
leur concentration.
Le procédé sera mis en oeuvre à une température corres-
pondant au maximum d'activité des microorganismes présents dans
le milieu.
Dans le même procédé suivant l'invention:
- on provoque la fragmentation de l'échantillon dans les conduits
par injection d'un gaz inerte dans des conditions de tempéra-
ture optimale pour l'activité enzymatique d'une population
bactérienne de l'effluent considéré et pendant un intervalle
de temps donné,
- on fait circuler l'échantillon dans lesdites conditions
optimales de température pour l'activité enzymatique pendant
un temps déterminé, suf~isant pour que les conditions
standards d'absence d'oxygène et de milieu tamponné soient
réalisées de fa,con homog~ne,
- on ajoute à l'échantillon un substrat, tel que le lactose,
assimi~able par la population bactérienne présente dans la
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-
l~q~31
biomasse et un indicateur d'oxydoréduction dosable susceptible
de se transformer par réduction en un produit dosable par
colorimétrie par exemple,
- et on déplace d'échantillon à la même température optimale
pendant un temps déterminé, dit temps d'incubation.
Ayant observé que les réactions enzymatiques ne sont
pas totalement bloquées par l'addition de l'alcool utilisé pour
l'extraction, deux dispositifs ont été utilis-és avec succès,
l'un utilisant l'effet d'un choc thermique et l'autre une
modification brutale de pH, pour mettre fin à l'activité
enzymatique de la population bactérienne.
Dans le même procédé selon l'invention :
- on extrait ensuite le produit résultant à l'aide d'un solvant
et ainsi on localise ledit produit resultant dans la phase
liquide,
- on sépare les boues par décantation,
- et on mesure enfin l'intensité colorimétrique de la phase
liquide.
Dans un tel procédé, il est préféré d'utiliser comme
indicateur d'oxydo-réduction le chlorure de 2, 3, 5 triphényl-
tétrazolium qui est réduit en triphényl formazan.
Dans un mode préférentiel d'application, on met
l'échantillon en conditions standards d'un milieu réducteur , à
pourcentage d'oxygène nul, par une addition de sulfate de soude
et de chlorure de cobalt.
D'une façon générale, on déplace l'échantillon dans
des conditions d'une température optimale choisie en fonction
des souches bactériennes présentes.
On met fin à l'activité enzymatique de la population
bactérienne soit en portant la température à une valeur supéri-
eure à 65~C et en l'y maintenant pendant un certa1n intervalle
de temps, soit par modification du pH (addition d'acide sulfuri-
-- 6 --
1(3!~8~31
que par exemple).
Dans diverses réalisations, on extrait le produitrésultant et on le localise dans la phase liquide de l'effluent
à l'aide d'un alcool tel que l'alcool éthylique.
Egalement, le substrat, assimilable par les bactéries,
ajouté à l'échantillon avant l'incubation, est un sucre, notam-
ment du lactose.
Un dispositif suivant l'invention de mesure en continu
de l'activité enzymatique des systèmes d'épuration biologiques
comprend un premier conduit tubulaire à très bon coefficient
de transmission de chaleur, immergé dans un bain à une tempéra-
ture choisie, ledit conduit comportant une première partie de
longueur,section et tortuosité telles que ladite première partie
constitue un mélangeur homogénéiseur, alimenté à l'aide d'une
pompe proportionnante, en biomasse, en additifs réducteurs
d'oxygène et en gaz inerte de fractionnement, ledit conduit
comportant une seconde partie de longueur, section et tortuosité
telles que le temps de parcours par l'échantillon, fonction du
débit de la pompe proportionnante est fixé entre 15 et 20
minutes.
Le même dispositif, à la suite du premier conduit
tubulaire, comprend un second conduit tubulaire à très bon
coefficient de transmission de la chaleur, immergé dans un
bain à une température choisie (entre 65 et 80~) centigrades,
le second conduit tubulaire étant pourvu à son début d'un
ajutage pour l'arrivée d'un débit de solvant, ledit second
conduit tubulaire étant suivi d'un decanteur muni de deux
orifices d'évacuation, un premier orifice pour l'évacuation
des boues extraites et un second orifice pour le passage de
la phase liquide dans un conduit qui aboutit à un appareil
de mesure colorimétrique.
Dans un autre mode de réalisation, un dispositif
109~3~31
suivant l'invention de mesure en continu de l'activité
enzymatique des systèmes d'épuration biologiques comprend un
premier conduit tubulaire à très bon coefficient de transmission
de la chaleur, immergé dans un bain à une température choisie,
ledit conduit comportant une première partie de longueur,
section et tortuosité telles que ladite première partie consti-
tue un mélangeur homogénéiseur, alimenté à l'aide d'une pompe
proportionnante en biomasse, en additifs réducteurs d'oxygène
et en gaz inerte de fractionnement, ledit conduit comportant
une seconde partie de longueur, section et tortuosité telles
que le temps de parcours par l'échantillon, fonction du débit
de la pompe proportionnante est fixé entre 15 et 20 minutes.
Le même dispositif, à la suite du premier conduit tubulaire
cmprend, après un premier ajutage pour l'arrivée d'un produit
arrêtant toute activité des bactéries, un second ajutage pour
l'arrivée du solvant, ledit second ajutage étant suivi d'un
décanteur muni de deux orifices d'évacuation, un premier
orifice pour l'évacuation des boues extraites et un second
orifice pour le passage de la phase liquide dans un conduit
qui aboutit à un appareil de mesure colorimétrique.
L'invention sera mieux comprise dans la description
des figures suivantes données à titre non limitatif des schémas
d'installations industrielles:
Fiqure 1 - Schéma d'un dispositif de mesure avec arrêt de
l'activité enzymatique par le moyen d'un choc
thermique.
Fiqur_ 2 - Schéma d'un dispositif de mesure avec arrêt de
l'activité enzymatique par modification de pH.
En se référant à la figure 1, on distingue un conduit
1 dont une extrémité la constitue une prise d'échantillon
continue, sur un canal non figuré dans lequel se déplace de
façon continue un échantillon de biomasse, et dont l'autre
extrémité lb est une ouverture de rejet. L'extrémité de la
conduite est directement reliée à une pompe proportionnante 2
telle qu'une pompe péristaltique d'un modèle connu en soi; au
travers de laquelle le conduit 1 est constitué par un élément
lc de conduit réalisé en matériau élastique tel qu'un élastomère.
La pompe proportionnante 2 est reliée par un élément de conduite
ld à un élément suivant, composé de deux parties le et lf
connectées, lf ~ la suite de le, et toutes deux plongées dans
un bac thermostatique 3. Dans l'élément de conduite ld débou-
chent plusieurs ajutages pour l'arrivée de divers additifsnotamment un ajutage 4 pour l'arrivée de Na2S03, un ajutage 5
pour l'arrivée de CoC12 et un ajutage 6 pour l'arrivée d'un
gaz inerte tel que de l'azote.
Ces différents ajutages 4, 5 et 6 sont reliés par des
conduits 4', 5' et 6' à des moyens non figurés de stockage ou
d'alimentation pour les différents additifs par le moyen de
conduites passant par autant de sections de la pompe propor-
tionnante 2, lesdites sections comportant les moyens appropriés,
non figurés, pour procurer à chacun des additifs une vitesse
d'écoulement donc un débit déterminé.
Les parties le lf du conduit sont faites d'un tube
en materiau à très bon coefficient de transmission calorifique,
par exemple un alliage métallique choisi dans une composition
ayant une très bonne résistance à la corrosion.
La partie le du conduit a une section, une longueur
et une tortuosité telles que, à l'issue de cette partie le du
conduit, le mélange peut être considéré comme homogène au point
de vue temperature, composition chimique et état biologique.
Au passage entre les parties le et lf du conduit
débouche un ajutage 7 pour l'arrivée d'un composé assimilable
par les bactéries de la population bactérienne présente dans
l'échantillon et d'un indicateur d'oxydo-réduction. L'ajutage
431
7 est relié à des récipients contenant séparément le composé
assimilable et l'indicateur par le moyen d'un conduit 7'
passant par une section de la même pompe proportionnante 2.
La partie lf du conduit a une section, une longueur et
une tortuosité telles que l'effluent avec la vitesse qui lui
a été imprimée par la pompe proportionnante et avec les débits
qui ont été imprimés par la même pompe proportionnante aux
différents additifs met un temps déterminé à parcourir ladite
partie lf.
L'extrémité de la partie lf du conduit est reliée par
un élément de conduit lg à un élément de conduit lh plongé
dans un bac thermostatique 8 dans lequel règne une température
notablement plus élevée que dans le bac 3 et interdisant toute
activité enzymatique à la population bactérienne de l'effluent.
L'élément de conduit lg comporte un ajutage 9 pour
l'arrivée d'un solvant du produit coloré dans lequel s'est
transformé l'indicateur d'oxydo-réduction. L'ajutage 9 est
relié à un récipient, non figuré, par le moyen d'un conduit 9'
passant par une section de la même pompe proportionnante 2.
Les solvants utilisés sont choisis parmi les alcools tels que
2 5
L'élément de conduit lh réalisé dans le même matériau
que les parties de conduit le et lf a une section, une longueur
et une tortuosité telles que l'effluent met un temps déterminé
le parcourir.
L'élément de conduit lh est relié par un élément de
conduit li à un dispositif débulleur 10 d'un modèle connu en soi
d'oû sont issus un conduit 11 pour la phase gazeuse orientée
vers le rejet et un conduit lj aboutissan-t à un décanteur 12
d'un modèle connu en soi.
Du décanteur sont issus une conduite 13 pour l'extrac-
tion et le transport des boues vers un rejet et un élément de
-- 10 --
~C~Y431
conduite lm pour conduire la phase liquide à l'entrée d'un
colorimètre enregistreur 14 d'un modèle connu en soi tant
pour le colorimètre proprement dit 14 que pour l'enregist~eur
éventuellement distinct 14'.
L'élément de conduite lm se poursuit à l'issue du
colorimètre par un élément de conduite ln aboutissant au rejet
lb.
La conduite 12 et les éléments de conduite lm et ln
afin d'assurer la continuité du déplacement des effluents
transportés passent par autant de sections de la pompe propor-
tionnante 2. ~:
. Sur la figure 2, on retrouve les mêmes éléments avec
les memes références numériques à l'exception de l'élément de
conduite lh et du bac thermostatique 8 qui ont été remplacés
par un dispositif mélangeur de référence 8' muni d'un ajutage
15 pour l'arrivée d'un produit inhibiteur de l'activité
enzymatique de la population microbienne, produit tel que de
l'acide sulfurique et de l'ajutage g.
Le fonctionnement de l'appareil est le suivant: la
pompe proportionnante 2 comporte un nombre de sections de
.~ passage séparées, suffisant pour mettre en mouvemen-t l'éc~han-
tillon et les différents additifs et reprendre la phase liquide
et les boues à la suite du décanteur 11 afin de les mettre en
mouvement, pour la phase liquide vers le colorimètre 13 et pour
les boues vers le rejet.
Le traitement de l'échantillon préalablement à son.
admission à l'entrée du colorimètre enregistreur est caractérisé
par les phases suivantes:
- l'échantillon reçoit les additifs Na2S03 et CoC12 dans des
proportions telles que l'oxygène libre est entièrement
éliminé et que le pH est fixé par exemple à 7,5 (milieu
tamponné),
- 11 -
101~8~31
- l'effluent parcourt une partie du conduit le immergée dans un
bac thermostatique où se trouve maintenue une température
optimale pour l'activité enzymatique, température générale-
ment fixée à 37~C par exemple. A l'issue de ce parcours,
l'échantillon est homogène en température et composition
chimique et biologique,
- l'échantillon recoit alors l'addition par l'ajutage 7 d'un
composé hydrocarboné assimilable par les bactéries, par
exemple du lactose et d'un indicateur d'oxydo-réduction,
l'indicateur choisi est le chlorure de 2, 3, 5 triphényl _
tétrazoluum ou TTC.
- l'échantillon parcourt alors une partie de conduit ~f pendant
un temps déterminé, par exemple 15 minutes, ~ la température
choisie dans des conditions de milieu telles que le pH
reste constant (milieu tamponné) et la concentration en ~2
reste nulle et dans ces conditions le TTC est l'accepteur
final d'électrons, ce qui place le dosage dans des conditions
de reproductibilité.
Sous l'action des déshydrogénases, le chlorure de
2, 3, 5 triphényl - tétrazolium (TTC) est réduit en triphényl
formazan (TF) suivant la réaction :
~ N-N - C6H5 ~ N-NH-C6H5
6 5 \ + 2H- ' C6H5-C \ +H + Cl
N=N - C6H5 N=N-C6H5
+
Cl
(incolore) (rouge
A l'issue de son parcours, la partie de contuit lf
recoit l'adjonction d'un solvant du triphényl formazan, par
exemple du C2H50H.
L'échantillon est ensuite orienté sur un dispositif
assurant le blocage de la réaction enzymatique. Ceci peut être
obtenu soit par un choc thermique (figure 1), soit par l'addition
- 12 -
1(~9~3~31
d'un composé inhibiteur tel que l'acide sulfurique (figure 2).
Après un débullage, l'échantillon est alors dirigé
sur un décanteur 12 où les boues, débarrassées du triphényl
formazan rouge qui s'était rixé sur les particules solides,
sont séparées et envoyées au rejet et la phase liquide contenant
tout le triphényl formazan résultant de l'activité enzymatique
pendant le temps d'incubation dans la partie de conduit lf, est
orientée sur l'entrée du colorimètre enregistreur.
Ce procédé de dosage et le dispositif d'application
permettent de mesurer l'activité enzymatique dans tous les
systèmes de fermentation, aérobie et anaérobie.
Ce procédé est particulièrement adapte à la détermi-
nation de la traitabilité des effluents industriels sur pilote
de laboratoire.
Lorsqu'on équipe le dispositif d'un moyen de broyage
des matières en suspension non biologiques, il permet d'enre-
gistrer en continu l'activité de la biomasse d'un aérateur.
Si le dispositif est placé en amont d'une station
et alimenté par l'effluent à traiter et par la biomasse
réceptrice, il permet de dérecter les possibilités d'inhibi-
tion de la biomasse, par exemple par un produit toxique, et
de la prévenir.
- 13 -
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