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3~
La présente in~ention concerne un procédé destiné
à maltriser la productivité des plantes cultivées.
Il est établi depuis longtemps qu'il existe entre
les plantes supérieures et les microorganismes du sol un
ensemble d'interactions très complexes qui agit directement
ou indirectement sur la productivité des plantes.
Parmi les plus connues de C8S interactions, il faut
citer en tout premier lieu la syr~iose obligatoire existant
entre les bacteries du genre Rhizobium et les légumineuses.
Ces bactéries, présentes dans les nodules des légumineuses,
permettent aux légumineuses, à la di~férence des autres plantes,
d'utiliser comme source d'azote l'azote moléculaire de l'at-
mosphère.
Il existe un grand nombre d'autres interactions entre
les microorganismes telluriques et les plantes, mais ce sont
les associations symbiotiques fixatrices d'azote che~ les
légumineuses qui ont été les plus étudiees.
Les études sur ces symbioses ont conduit depuis une
cinquantaine d'années au developpement de préparations com-
merciales contenant des Rhizobium destinées à " bactériser"
les graines de légumineuses ou à être inoculées dans le sol
et à, ainsi, augmenter le rendement en azote des légumineuses.
Ces préparations commerciales se présentent, soit
sous forme de suspension bactérienne liquide, soit sous forme
de suspension bactérienne adsorbée sur des supports solides
tels que la tourbe, la diatomite, etc.
Ce type de préparation présente deux inconvénients ~'
majeurs qui, jusqu'à présent, n'ont pu être supprimés ou même
atténués:
13 le taux de survie des microorganismes inocules
est très faible en raison de l'intervention de processus
d'antagonismes tels que compétition, predation, antibiotisme,
~: r ~
1~!'3 ~
ou de facteurs physico-c~imiques tels que acidité, temperature
excessive, dessiccation;
2) le contact entre les microorganismes inocules ~;
et le système racinaire de la plante est très aleatoire;
3) la conservation et la manipulation de ce genre
d'inoculums sont delicates et les temps de conservation sont
en général assez limités.
Il Eaut, en effet, bien concevoir que l'introduction
dans un sol non sterile de microorganismes etrangers provoque ~-
une reaction de la microflore et de la microfaune de ce sol
qui va tendre à eliminer les " intrus" qui, dans la plupart
des cas, ne pourront survivre ou seront la proie des micro-
organismes autochtones. En outre, il est assez rare que le
microorganisme inocule trouve dans le sol l'ensemble des con-
ditions physiques et chimiques qui lui permettent de se de-
velopper et meme parfois de survivre.
Enfin, dans ce type de preparation, les microor-
ganismes une fois inocules dans le sol, s'ils survivent,
tendent à se repartir dans le sol et ne restent pas au contact
des racines de la plante d'où de grandes variations dans les
résultats observes sur les plantes.
La Demanderesse a decouvert un procede permettant
de pallier les inconvenients cites precedemment~ .
;;, .
L'invention concerne un procede microbiologique ':-
destiné à ma~triser la pr-oductivite des plantes cultivees,
caracterise en ce que l'on inocuie dans la rhizosphère desdites
plantes des fragments de gel polymère dans lequel se trouve ~ ;
inclus au moins un microorganisme tellurique à effet rhizosphe-
rique favorable supportant l'inclusion dans ledit ~el. ;~
~e terme " rhizosphère" tel'qu'utilisé dans le
present texte clesigne à la fois l'ensemble des regions du sol
en contact avec les racines de la plante qui constituent la
~ .
3g~
rhizosphère au sens strict et la surface même des racines
qui est souvent appelee rhizoplan.
Par les termes " microorganisme tellurique" on
entend designer des microorganismes susceptibles de vivre dans -;~-
le sol, qu'ils soient aerobies, anaerobies ou microaerophiles.
Il peut s'agir aussi bien de microorganismes sauvages que de
microorganismes acclimates et aussi bien de bacteries que de
levures, de champignons et microorganismes apparentes.
Par les termes " microorganisme tellurique à action
rhizospherique favorable" on entend designer des microorganismes
susceptibles de vivre dans le sol, soit en symbiose obligatoire
avec un système racinaire, soit en association sans s~mbiose
obligatoire mais dans la rhizosphère d'au moins une plante
cultivee et qui presentent une action rhizospherique favorable.
Par " effets rhizospheriques favorables" on entend
designer en premier lieu une action modifiant la rhizosphère
au point de vue energetique, physique, chimique et/ou biologique ~
dans un sens favorable à la plante cultivee. Cet effet rhizo~ '
spherique favorable sera essentiellement une amelioration de
l'assimilation des substances nutritives de l'atmosphère ou
du sol, notamment l'azote, le phosphore et le potassium. Mais,
on envisage egalement d'autres types dleffets rhizospheriques
favorables, en particulier:
- l'acceleration ou au contraire l'inhibition de la
, ~ .
croissance des plantes pa~ la production de substances chimiques
~elles que les substances auxiniques,
- la protection contre les microorganismes pathogènes '
par la production de substances antibiotiques ou la predation
de ces microorganismes,
- la symbiose de type mycorhizienne.
Par les termes " microorganisme supportant l'inclusion
dans ledit gel" on entend designer des microorganismes qui
--3--
.
peuvent supporter les conditions d'inclusion dans ce gel,
c'est-à-dire en general les conditions de polymerisation et
les reactifs de polymerisation et capables de se multiplier
à partir du gel pourvu qu'ils trouvent un environnement favo-
rable bien entendu.
- Ce procedé permet ~ la fois d'ameliorer le contact
entre le système racinaire et les microorganismes a action
rhizospherique favorable et, en outre, permet de proteger
lesdits microor~anismes des actions antagonistes.
Le procede selon la presente invention est plus
particulièrement mis en oeuvre avec des bacteries, en parti- -~
culier des bacteries diazotrophes, ou des microorganismes
solubilisant les phosphates insolubles et/ou solubilisant le
potassium des silicates potasses.
Parmi les bacteries diazotrophes, il faut citer
plus particulièrement les bacteries ~ symbiose obligatoire
avec la plante hôte, telles que les Rhizobium, et les bacteries ; ;
à symbiose non obligatoire avec la plante hôte, telles ~ue ;
les bacteries de la SARFA (symbiose associative rhizosphérique
fixatrice d'azote), telles que les Spirillum ou Enterobacter.
Les microorganismes solubilisant les phosphates
insolubles sont choisis notamment parmi les bactéries tel-
luriques des genres Bacillus, Pseudo onas, Enterobacter et
micromycete.
Le procedé selon la présente invention est plus
particulièrement destiné à améliorer les rendements en azote
des legumineuses et est plus particulièrement applicable ~ la
culture du soja en utilisant des Rhizob _m mais permet egale-
ment d'ameliorer les rendeme~ts en azote des cereales telles
que le riz en utilisant les microorganismes SARFA tels ~ue
Spirillum tout en reduisant la consommation des engrais
chimiques conventionnels.
-4-
?~ ' ' ~-
~3~
L'inoculation est effectuée, de preference, à une
profondeur de l'ordre de 5 à 15 cm dans le sol en fonction
de la souche et de la nature du sol.
Ainsi, la souche incluse devra être inoculee d'autant
plus près de la surface du sol que cette souche requiert
d'oxygène et l'inoculation devra être assez proche de la sur-
face dans les sols à structure défectueuse (structure bat~ante)
où la diffusion de l'oxygène est insuffisante.
La quantité d'inoculum nécessaire peut varier dans
un très large domaine en fonction de la souche et de la plante
traitée, notamment, par exemple, pour le soja, le Rhi~obium
peut être apporté ~ des concentrations comprises entre 107 et
- 109 bacterie/plante.
L'inoculation peut être realisée par des procédés
connus, soit lors des semis, soit après, soit même, dans
certains cas, avant. En particulier on peut mélanger les -
fragments de gel aux semences pour effectuer l'inoculation.
Dans un mode de mlse en oeuvre préféré l'inoculation
est effectuée comme suit:
a) on broie finement le gel de polymère qui est ;~
conserve à l'etat frais (humide) dans une solution tampon ou
d'eau physiologique, - -~
b) on dilue ce broyat avec une certaine quantite
; de sol à inoculer, environ 10 fois le volume du broyat, pour
constituer un inoculum;
c) on applique l'inoculum au voisinage des graines,
dans la raie de semis ou autour des paquets de graines, de pré-
férence en le melangeant au sol sur une profondeur de 5 à 15 cm.
La dose de gel de polymère à appliquer varie de 0,5
à 2 ml par plante et dépend de la concentration du gel en
microorganismes de la plante à traiter et surtout du sol ainsi
dans le cas de sol présentant des phénomènes de compétition
--5--
il est necessaire de prevoir une dose maximum.
Bien entendu, il est possible cl'associer plusieurs
types de microorganismes lors de la mise en oeuvre du procede
selon la presente invention. Ce type d'association peut être
realise soit en prevoyant plusieurs souches de microorganismes
- dans un même gel pourvu que ces souches soient compatibles,
c'est-a-dire n'agissent pas de façon defavorable l'une sur
l'autre, ou bien, depreference, en inoculant des fragments
de plusieurs gels contenant differentes souches de microor-
ganismes.
En particulier, dans ce mode de mise en oeuvre du
procede selon la presente invention, on peut utiliser des
souches de microorganismes ayant des effets rhizospheriques ~ ;
favorables differents, en particulier des souches agissant
chacune sur l'assimilation d'un element particulier, azote,
phosphore et potassium.
Mais, on envisage egalement d'utiliser des souches
different par leur sensibilite à l'oxygène, c'est-à-dire que
les souches utilisees peuvent être aerobies, anaerobies ou
microaerophiles; dans ce cas on prevoira de les inoculer à
des profondeurs dif~erentes dans le sol, les souches aerobies ~-
etant inoculees au voisinage de la surface, les souches ana-
erobies assez loin de la surface et les souches microaerophiles
a un niveau intermediaire. -
Les gels utilisables dans le procede selon l'in-
vention sont, de preference, des polymères synthe-tiques,
poreux, tridimensionnels, faiblement reticules, comme on
l'explicitera plus en de-tail ci-apr~s, ou des gels mineraux
tels que le silicagel.
La presente invention concerne egalement un procede
de preparation des gels utilisables dans la mise en oeuvre
du procede selon l'invention, ainsi que les gels obtenus par
--6--
.~ ~ . .
t '
~ 3:~
ce procede.
Ce procede de preparation des gels est caracterise
en ce que:
- on selectionne parmi les souches possedant l'effet
rhizospherique favorable désire une souche supportant l'inclu-
sion dans le gel utilise;
- on effectue la polymërisation du gel dans un milieu
tampon comportant en suspension :Ladite souche;
- on lave le bloc obtenu avec un milieu tampon ou
un milieu de culture de ladite souche;
- on fragmente le bloc de polymere obtenu;
- on stocke les fragments obtenus dans un milieu
tampon à basse temperature;
- on reactive les fragments de gel avant la mise en
oeuvre par incubation dans un milieu de culture de ladite ~
souche, ou bien .
- on selectionne parmi les souches possedant l'effet
rhizospherique favorable desire une souche supportant l'inclu~
sion dans le gel utilise;.
2~ - on effectue la polymerisation du gel dans une cul~
ture du microorganisme; ~ ;
- on lave le bloc obtenu dans l'eau; ~ ;~
- on le stocke dans un milieu tampon ou de l'eau
- physiologique ~ une temperature comprise entre 4 et 10~C; :
- on broie le bloc avant l'utilisation.
L'etape de selection est conduite en effectuant la :
polymerisation en presence de ladite souche et en contr81ant, -
qu'après incubation du gel obtenu dans un milieu de culture,
la souche incluse garde la faculte de se multiplier. Ainsi, :~
pour les bact~ries diazotrophes, en utilisant un gel de
polyacrylamide, on a pu determiner trois categories de bac~
teries:
-7- - :
... , ,. ~ . ,,, ::
1) sacteries ne supportant pas l'inclusion dans le
gel de polyacrylamide; par exemple certaines souches d'Azoto-
bacter. Une fois incluses, ces bacteries perdent la faculte
.,
de se multiplier.
2) Bacteries supportant l'inclusion dans le gel de
polyacrylamide mais ne retrouvant la faculte de se multiplier
qu'après un temps de réactivation très lon~ (plusieurs jours
à une semaine), exemple: certaines souches de Spirillum
lipoferum.
3) Bacteries supportant l'inclusion dans le gel de
polyacrylamide et retrouvant la faculte de se multiplier après ~ '
un temps de reactivation relativement court (de l'ordre de ;
1 à 3 jours); exemple: Rhizobium sp., Enterobacter cloacae,
Beijerinckia sp
~ -:
Ce sont les bacteries appartenant à la categorie
3 qui sont susceptibles de donner les resultats les plus in-
teressants pour la mise en oeuvre du procede selon la présente
invention.
La polymerisation est effectuee de façon connue en
utilisant, de preference, un monomère hydrophile tel que
l'acrylamide en presence d'un agent de reticulation tel que
; le N,N'-methylene-bis-acrylamide en présence d'un catalyseur
de polymerisation~ La polymerisation est conduite dans un
milieu tampon comportant la souche de microorganisme en
suspension. On determine les conditions de polymerisation,
en particulier la quantite d'agent de reticulation, de fa~on
obtenir une structure tridimensionnelle poreuse~
D'autres polymères de ce type utilisables dans la
mise en oeuvre de la presente invention sont decrits dans
les brevets français n~ 75 24509 et n~ 2 171 108.
On choisit, en outre, les conditions de polymerisation
de fa~on à limiter le plus possible la durée de la réaction
':
': ~
3~7~
et on lave le polymère o~tenu pour que les microorganismes
soient en contact le moins longtemps possible avec le cata-
lyseur et les sous-produits de la reaction.
Dans le cas où le gel polym~re est de type colloide,
par exemple mineral, on opère de la même fason que precedem-
ment, soit en preparant le collo;de dans le milieu tampon
contenant la souche de microorganisme, soit en preparant le
colloide sous forme dispersee à part et en le faisant " prendre"
; dans le milieu tampon.
Le bloc de gel obtenu après polymerisation peut être
fragmenté par tous moyens connus, en particulier par découpe.
Bien que la dimension et la forme des fragments obtenus ne
semblent pas avoir d'influence notable lors de la mise en
oeuvre du procede selon la presente invention de petits cubes
d'environ l/8eme de cm3 ont donné de bons resultats.
Comme dans le domaine agricole il est necessaire de
disposer au moment dec semis d'une quantite suffisante
d'inoculum qui doit donc être prepare et stocke, on stocke
les fragments de gel obtenus à basse temperature, de l'ordre
de 2 à 10~C, de preference de 5 à 6~C, dans un milieu tampon.
On a constate de facon surprenante que l'inoculum ~;
se conservait tres bien dans ces conditions, sous reserve de
prendre la precaution avant l'utilisation, bien que cela ne
. ~
soit pas toujours necessaire, de reactiver ledit gel. Les
gels réactivés comportent, outre des microorganismes inclus,
les m~mes microorganismes adsorbes sur leur surface. Cette
réactivation est conduite en inoculant, à une temperature
comprise de preference entre 27 et 30~C, les fragments de gel
dans un milieu de culture avec une legère agitation pendant
3Q une periode d'environ 3 3 7 jours suivant les souches incluses.
La presente invention concerne egalement à titre
de moyen pour la mise en oeuvre du procede selon la presente
~1~3~'6
invention les fragments de gel obtenus par le procéde precedent.
- Les cubes de gel obtenus peuvent être utilises tels
quels ou enrobés de differents produits utiles en phytochimie
tels que phosphate tricalcique, compost, résidus industriels
ou agricoles.
Les exemples ci-aprës permettent d'illustret cer-
taines caracteristiques de l'invention sa~s pour autant la
. limiter.
Exemple 1 ~:
Procedé de preparation du gel
On introduit dans un flacon sérum une suspension
bacterienne de 5 à 10 ml de culot de bacteries en suspension
dans 150 ml de tampon phosphate ayant la composition suivante:
PO4KH2 : 2 g
PO~Na2H : 2 g
Eau : 1 000 ml !
On dissout dans 50 ml de tampon phosphate 23/75 g
d'acrylamide (solution A) et dans 50 ml de tampon phosphate
1,25 g de N,N'-méthylène-bis-acrylamide (solution B). On
ajoute l'une après l'autre ces solutions A et B ci-dessus à
la suspension bacterienne tout en agitant. On dissout 0,250 g
de sulfate d'ammonium dans environ 3 ml de tampon phosphate,
on ajoute cette solution à la preparation ci-dessus en con-
tinuant l'agltation.
On introduit le.melange obtenu dans le moule de .
fabrication tout en agitant avec une baguette de verre stérile
puis on ajoute 150 ~1 de N,N,N',N'-tétraméthyléthylène-diamine,
on prolonge l'agitation jusqu'au moment de la prise du gel.
La prise du gel est accéleree si l'on a pris soin de conserver
l'acrylamide et la bis-acrylamide à l'abri de l'humidite en
dessiccateur. On demoule alors le gel lorsqu'il s'est su~-
fisamment refroidi, ce qui demande au maximum 10 mn. On lave
--10--
'
3~
immediatement ce gel, soit dans une solution tampon phosphate,
soit dans un milieu de culture dilue au l/2. On fragmente
ensuite le gel en blocs de dimensions variables, des cubes de
l/2 cm d'arête ont donne d'excellents resultats.
Les gels ainsi obtenus sont stockes dans des
solutions tampon maintenues à une temperature comprise entre
4 et 6~C.
Exemple 2
Association symbiotique SARFA
Les microorganismes utilises dans cet exemple sont
des Spirillum lipoferum. On prepare des gels contenant ces
microorganismes en utilisant le procede de l'exemple precédent.
Après fragmentation, les petits blocs obtenus sont
réactives par incubation à 27-30~C dans un milieu de culture
pendant environ 7 jours sous légère agitation.
Milieu de culture pour Spirillum lipoferum
,
KH2PO4 : 0~4
K2HPO4 0,l00 g '~
MgSO4 7H2O: 0,200 g
NaCl : 0,lG0 g
CaCl2: 0,020 g
FeCl3: 0,0l0 g
NaMoO4 2H2~: 0,002 g
4 : 0,013 g
Extrait de levure : 0,l00 g
Acide malique : 3,2 g (neutraliser à pH 7
avec KOHj
De petits blocs de gel de polyacrylamide (l/8ème
de cm3) renfermant les Spirillum lipoferum sont inocules
dans le sol à une profondeur comprise entre l0 et 15 cm au
voisinage du système racinaire de riz car il s'agit la de
souches microaerophiles en anaerobie facultative.
-11
.~ .
~ t7~
Après que le systeme racinaire ait largement pénetre
les petits cubes de gel, on preleve l'ensemble du système
que l'on observe en ultracryomicxoscopie. On observe les
resultats suivants:
1) les cubes de gel excercent un effet attractif
sur les racines,
2) les racines pénètrent tras aisément dans les
cubes de gel sans les faire éclater,
3) il n'y a pratiquement pas de solution de conti-
nuité entre le cortex racinaire et le gel,
4) les racines principales peuvent émettre les
racines secondaires à l'intérieur même des cubes de gel qui
jouent le rôle de reservoirs d'inoculum.
Le procede d'inoculation ainsi realise permet d'as~
surer un contact parfait entre la source permanente d'inoculum
que constitue le gel de polyacrylamide et la racine.
Exemple 3
Inoculation du soja
Dans cet exemple, on compare l'effet de l'inoculation
par le procéde classique et l'effet de l'inoculation suivant
trois modalités du procéde selon la presente invention, afin
d'étudier l'influence du procédéselon la présente invention
sur la fixation d'azote et le rendemen-t du soja cultivé en
vase de végetation.
Pour cette étude, on utilise un soja de variété
Jupiter dans un sol Dior.
; Les microorganismes à effet rhizospherique favorable
utilisés sont des Rhizobium 1~ sous forme de deux
mutants, le mutant G3S résistant à la streptomycine (1 000 ~g
par ml de milieu de culture?, le mutant G2Sp résistant à la
spectinomycine (500 ~g par ml de milieu de culture). Ces
deux souches mutantes de Rhizobium sont disponibles dans la
-12-
Collection de l'I.N.R.A. de Di~on, 7 rue Sully, 21000 Dijon.
Les vases de végétation d'une capacité de 5 1 con-
tiennent 6,7 kg de sol Dior, le fond des vases est recouvert
d'une couche de 200 g de gravier quartzeux, on n'apporte pas
d'azote combine, le phosphore et le potassium sont apportés
sous forme suivante:
- le phosphore est apporté sous forme de phosphate
(40 % de P2O5) en solution en deux apports à la dose de 0,478 g
par vase;
- le potassium est apporté sous forme de KCl (60 %
de K2O) ~ la dose de 0,319 g par vase.
(Ces doses correspondent à des apports de 50 kg de
P2O5 à l'hectare et de 50 kg de K2O à l'hectare~
Dans chaque vase de végétation on sème trois graines
de soja, une semaine après le semis on procède au demariage
de façon à ne laisser qu'un plant par vase.
On réalise les essais suivants:
1) un temoin: pas d'inoculation,
2) une inoculation classique par une culture liquide '
de Rhizobium,
3) une inoculation selon la présente invention, les
cubes de gel de polyacry~amide etant places à 5 cm de profon-
deur,
4) le même traitement qu'en 3 mais avec un enrobage
des cubes de gel par du phosphate tricalcique,
5) mëme traitement qu'en 3 mais on place les cubes
de gel de polyacrylamide à 15 cm de profondeur.
- Les :inoculums ont eté préparés de la façon suivante:
Les gels de polyacrylamide sont préparés suivant la
technique décr:ite à l'exemple 1, ils ont ensuite eté conservés
à 5 - 10~C pendant un mois dans une solution de tampon phos-
phate composé comme suit:
.~
-13- ~
~ ~b~ 3~ ~ 6
KH2P04 ~ : 2 g
Na2HPO4 : 2 g
Streptomycine ~.
(pour la souche G3S)
ou :200 mg
Spectinomycine
(pour la souche G2Sp)
Eau : 1 000 ml
Avant l'inoculation du sol, les gels de polyacryl- ';' !
amide contenant des bactéries incluses ont ete decoupes en
cubes de 1/8ème de cm3 et reactivés par incubation sur table
d'agitation dans le milieu de culture classique pour Rhizobium. '
Milieu de culture
,
2 ~4 : 0,5 g ~ ,.
MgS04 7H20 0,2 g
NaCl : 0,2 g
CaC03 : 0,1 g -~
- Mannitol , : 10 g : ,.
Eau de levure : 100 ml '~
Eau distillee ou permutee : 900 ml
Ajuster à pH 7. Steriliser 20 mn à 120~C. -~
Qn apporte 24 ml de cubes de gel de 1/8ème de cm3 (soit environ 200 ~ es~
par vase de vegetation, soit à 5 cm, soit à 15 cm de profondeur. Le nombre
des bacteries apportees par v,ase de vegetation est de l'ordre de 7.108
pour la souche GZSp et 0,7.108 pour la souche G3S. ~ ~
Au cours de la réactivation, les Rhizobium ont ,,:
proliférés dans le milieu de culture, ce sont ces bactéries'~
libres qui ont été utilisees comme inoculum liqu}de. L'ino-
culation classique a été effectuée par apport au sommet du
scmis do 1 cm3 dc la solution conccntrec par ccntrifu~ation
de ~açon à apporter le même nombre de bacteries par ce procede
classique que par l'inoculation selon le procede de la presente
invention.
-14- ''
' ~
~1~3~L'7~
Tableau I
Nombre de bacteries vivantes apportees par_vase de
vegetation.
. _
Inoculum par bacteries
. . Inoculum liquide includes en gel de
.~ polyacrylamide
. ,'
Souche G2Sp 7.108 7 .10
Souche G3S 1.10 0,7.10
Chacune des experiences a ete repetee 5 fois.
Lorsque les plantes ont atteint le stade de formation
des gousses (60ème jour)j on procède aux analyses suivantes:
On compte et on pèse les nodules et on contrôle
la nature de la souche responsable de la nodulation sur un :
milieu selectif a la streptomycine ou la spectinomycine suivant
suivant la souche utilisee. .;
On evalue l'activite fixatric~ d'azote par la
methode de reduction de l'acetylène, le vase de vegetation
avec la plante etant place dans l'enceinte où l'on a injecte .
l'acetylène.
Evaluation du rendement de la plante en matière :
sèche des partiesaerienneset des racines (par sechage à -
l'etuve à 60~C). ~ :
Evaluation du rendement de la plante en azote (dosage
de Kjeldahl).
On procède, en outre, a l'analyse statistique des '
resultats fondee sur le test de la plus petite difference :~
significative. '~
Les resultats obtenus sont regroupes dans le tableau .
.... . . . . . .. ............. . . ... . ......
i~3~
.
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-16- .
3~
Le controle de la nature de la souche responsable
de la nodulation a révéle que pratiquement tous les nodules
avaient ete induits par l'infect:ion par la souche G2Sp
(resistance à la spectinomycine3. Dans ces conditions, on
peut admettre que les résultats obtenus auraient été vraisem-
blablement les memes si on avait apporte l'inoculum uni~uement
sous forme de Rhizobium G2Sp inc:Lus à la dose de 200 cubes
de 118ème de cm3 par plante.
Exemple 4
Procede de preparation du gel de polymere
.,
On introduit dans un becher de 300 ml, 150 ml d'une
culture bacterienne à la fin de la phase exponentielle (4-5
jours dans le cas de Rhi~obium japonicum). On ajoute suc-
- cessivement 50 ml d'une solution d'acrylamide (solution A):
- acrylamide 155 g
- tampon phosphate (pH 7), qsp 650 ml,
et 50 ml d'une solution de N,N'-methylène-bis-acrylamide
(solution B):
- N,N'-methylene-bis-acrylamide 6,27 g -
- - tampon phosphate (pH 7~, qsp 500 ml
(les solutions A et B sont filtrees sur papier filtre de bonne
qualite de façon a obtenir une solution limpide, c'est-a-dire
exempte de cristaux non solubilises), puis 126 mg de persulfate ~
d'ammonium (conserve sur deshydratant) dissous dans 3 ml d'eau -
distillee et enfin 76 microlitres de N,N,N',N'-tetramethyl-
ethylene-diamine.
On agite avec une baguette de verre pendant quelques
minutes. La prise en masse du gel a lieu au bout de 10 minu-
tes. On laisse refroidir le gel pendant encore 10 minutes
et on demoule. On decoupe le gel en tranches ayant un volume
approximatif de 10 à 20 cm3 et on lave immediatement dans
un courant d'eau du robinet pendant 24 h au minimum.
-17-
~. .
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~ 3~ 76
Les gels ainsi obtenus peuvent être conserves très
longtemps (jusqu'à un an) dans la solution tampon phosphate :
ou d'eau physiologi~ue (NaCl: 8,5 g par litre) ~ une tempé-
rature comprise entre 5 et 10~C.
La solution A n'est pas autoclavable; la solution
B est autoclavable. Il en résulte que si l'on desire obtenir
un produit aseptique (ce qui n'est pas necessaire pour l'uti~
lisation au champ), il faut steriliser la solution A par .
filtration.
Tampon phosphate:
PO4 KH2 1 g
PO4 Na2H 2 g -~
Eau distillée1 000 ml
Le pH est de 7,0.
Exemple 5 '
Cet exemple a pour objet de determiner l'effet du
broyage et de la dessication du gel de polymere sur l'in-
fectivité de l'inoculum vis-à-vis du soja et determiner la :
: dose necessaire pour obtenir un resultat equivalent à celui
obtenu par un inocolum liquide, pris comme reference.
On a cultive le soja cv. Jupiter en pot sous abri ~:
pendant 5 semaines sur sol Dior avec une fertilisation phos-
phopotassique (32 mg P2O5 ~ 28 mg K2O par kg de sol). ~ -
Le gel de polymère prepare par le procede de l'ex- ;~
emple 4 ainsi que l'inoculum liquide renfermaient le même
nombre de Rhizobium G2Ap, soit 5 x 10 par ml.
Les resultats qui figurent au tableau III sont la
moyenne de 5 repetitions. Dans les colonnes (1) et (2) les
chiffres reperés par une même lettre ne différent pas signi-
ficativement pour P - 0,05. La fixation de Nz (colonne 3)
a ete determinée par la méthode de la difference (difference
entre la teneur en azote total des plantes inoculees et la
-18-
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teneur en azote total des témoins non inoculés, donc sans
Rhizobium). Les dosages d'azote ayant éte effectues sur un
échantillon de plante résultant du melange des parties aé-
riennes des plantes soumlses à un même traitement, il n'a
pas été possible d'effectuer l'analyse statistique des ré-
sultats correspondants (colonne 3).
On observe que:
1. Le broyage de l'inoculum améliore considéra-
blement son infectivité (pour une même quantité appliquée).
2. La dose d'application de l'inoculum broyé est
de l'ordre de 2 ml par plante, pour obtenir un résultat
- comparable à celui donné par l'inoculum liquide (préparé ~ -
extemporanément). ~-
3. La dessiccation diminue significativement
l'infectivité de l'inoculum mais il est intéressant de consta-
ter que, meme desséché, l'inoculum conserve encore une in-
fectivité relativement importante, s'il est appliqué à la
dose de 2 ml par plante.
-19-
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Exemple 6
La souche de Rhizobium japonicum utilisée est le
mutant G2Sp resistant à la spectinomycine (500 ~g par ml de
milieu). Cette souche est disponible dans la collection de
l'INRA de Dijon, 7 rue Sully 21000 Dijon. Nous avons verifie,
par ailleurs, que l'efficience de ce mutant etait elevee ;~
puisqu'au champ, en l'absence de facteur limitant, la fixation
de N2 est de l'ordre de 300 à 400 kg/ha quand cette souche est
inoculee au soja cv. Jupiter.
La souche de Rhizobium G2Sp a ete cultivee sur le
milieu de Wacek et Brill (1976, Crop Science~ 16: 519-522)
Mannitol ............................. 10 g
K2H PO4 .............................. 0,5 g
Mg SO4, 7H2O ......................... 0,2 g
NaCl ................................. 0,2 g
FeC13 ......................... ~....... 4,88 mg
Extrait de levure ~ifco .............. 1 g
Eau distillee ........................ 900 ml
On ajuste à pH 7 avec HC1 N. On stérilise à l'autoclave 20
2~0 minutes à 120~C. La culture est effectuée sur table d'agita-
tion penclant 5 jours a 30~C. Le sol utilisé est un sol sableu~
(Dior).
Le soja cv. Jupiter a ete seme en petits pots de
plastique de 50 g de sol. On a choisi les plants de taille
uniforme pour les replanter lorsqu'ils avaient leurs premières
feuilles (5 jours apres le semis) dans les vases de vegetation
en plastique contenant chacun 3 kg de sol.
L'inoculum prealablement dilué dans du sol a ete
mélangé au sol dans les 10cm supérieurs du sol dans la région
centrale du pot. On a comparé deux types d'inoculum:
.
(1) Inoculum en gel de polymère prepare conformément
au protocole decrit dans l'exemple 4 et applique à 2 doses
-21-
~ ' ~
.. , , ,, ~ . , , , . ......... . . . , ., . . ~ . . .
3~6
(0,5 et 2,0 ml) '~
(2) Inoculum classique sur tourbe
- inoculum commercial de bonne qualité ~
- inoculum sur tourbe stérile préparé au labo- ;
ratoire par ensemencement avec la même
; culture que celle utilisée pour l'inclusion
en gel de polymère.
La même souche (G2Sp) a été utilisee dans tous les
traitements, sauf le traitement " inoculum commercial" (souche
- 10 inconnue).
La-quantité de bactéries utilisées a ete de 5 x 108
par ml dans le gel de polymère et 5 x 108 bactéries dans la
tourbe préparée au laboratoire. On a réalisé 5 répétitions ~;
par traitement. Le témoin était constitué par un gel de
polymère avec Rhizobium inclus stérilisé a l'autoclave. L'Ac-
tivité Réductrice d'Acetylène (ARA) spécifique a été déterminée
; suivant la méthode classique, et exprimée en micromoles - -
d'éthylène formé par g de nodule sec. ~
- : !
L'azote fixé, dans les parties aériennes a été
détermine par la methode de la difference, c'est-~-dire en
soustrayant la teneur en azote total des plants temoins (non
nodules) de la teneur en azote total des plantes nodulees,
pour chacun des differents inoculums. Les analyses ont ete
effectuees lorsque les plantes etaient âgees de 35 ~ours. Il
' resulte du tableau IV:
1) l'inoculum en gel de polymère permet d'obtenir
: ~:
une fixation de N2 double de celle qui resulte de llapplication '-~
de l'inoculum commercial bien qae l'ARA specifique et le poids
de nodules soient sensiblement les mêmes.
2) l'acrolssement de la dose d'inoculum en gel de
polymere se traduit par un accroissement sensible mais non
significatif de la quantite d'azote fixe, ce qui peut
-22-
3~
.. ,
s'expliquer par une augmentation du poids de nodules. D'autre
part l'application de la dose élevée présente l'avantage
d'améliorer nettement la reproductibilité des résultats.
3) l'inoculum en gel de polymère donne des résultats
identiques a l'inoculum sur base tourbe préparé au laboratoire,
(tourbe stérile ensemencée extemporanément avec la culture de
Rhizobium).
Une expérience accessoire a montré que l'accrois-
sement de la teneur en azote de la plante ne pouvait être
attribué à une utilisation de l'azote rentrant dans la consti-
tution du polymère proprement dit.
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Exemple 7 ~ ~ 3
SYMBIOSE ASSOCIATIVE RHIZOSP_IERIQUE FI ATRICE D'AZOTE
(SARFA)
Le microorganisme utilisé dans cet exemple est
Enterobacter cloacae souche RO3 isolée de la rhizosphère d'un
riz. Le gel est préparé conformement à l'exemple 4.
Le milieu de culture d'E. cloacae est le suivant:
K~2 PO4 500 mg
K2H PO4 500 mg
MgSO4 200 mg
NaCl 100 mg
CaC12 100 mg
eSO4, 7H2O 10 mg
Solution d'Oligo-éléments 1 ml
Glucose 10 g -
Potato extract Difco 1 g
Yeast extract Difco 100 mg
On ajuste le pH à 7,0
La solution d'oligo-éléments est préparée suivant Augier
(1956. Ann. Inst. Pasteur: 91, 759). ~
L'inoculum en gel de polymère es-t préparé confor- -
mément au protocole décrit antérieurement à partir d'une
culture de 24 h d'E. cloacae. Les résultats de l'expérience
correspondante figùrent dans le tableau V.
Cette expérience a pour but de: ~;
Comparer l'inoculum liquide, l'inoculum en gel de
silice et l'inoculum en gel de polymère, ou ce qui concerne ~ ~
.. .
la stimulation de la fixation d'azote rhizosphérique (fixation
libre d'azote) par Enterobacter cloacae dansle cas du sorgho.
Dispositif expérimental.
Des graines de sorgho cv. 51-69 ont été repiquees
à raison d'une par pot, dans des pots renfermant environ 800 g
-22c- ;
~ ~.
~3~
de sol sableux. On a comparé 3 types d'inoculum (4 x 10
bactéries par plante)
- inoculum liquide (préparé extemporanément)
- inoculum en gel de silice broyé
- inoculum en gel de polymère broyé ~-
- - temoin (inoculum liquide autoclavé).
L'inoculum a été appliqué dans les 4-5 cm supérieurs
du sol. On a effectué 3 répétitions par traitement. Lorsque
les plantes ont été agées de 33 jours la mesure de la fixation
de N2 a été effectuée par la méthode classique de réduction
de l'acétylène, l'incubation ayant porté sur l'ensemble du
système plante + sol dépoté avec le minimum de perturbation. ;-
Résultats.
La stimulation de la fixation rhizosphérique de
N2 par Enterobacter cloacae apparait seulemen-t dans le cas ~
où l'inoculum a été apporte sous forme de gel de polymère, ~ -
- l'effet de ce type d'inoculum étant hautement significati~.
Exemple 8
Stimulation de la rhizogénèse
Le microorganisme utilisé est E. cloacae souche
RO3 comme dans l'exemple 7, les conditions de culture et de
preparation des inoculums sont identiques à celles utilisées
dans cet exemple.
Cette experi~nce a pour but de comparer l'efficacité
de trois formes d'inoculum (inoculum liquide, inoculum en gel de
silice, inoculum en gel de polymère) en ce qui concerne l'ef~et
rhizogène de la souche d'Enterobacter cloacae ~03 sur le sorgho
cv. 51-69. Les résultats sont reunis dans le tableau VI.
Dispositif expérimental
Des graines de sorgho cv. 51-69 ont été repiquées
à raison d'une par tube dans des tubes de PCV 25 x 3 cm
renfermant 220 g de sol sableux etplacés dans un phytotron
.
-22d- ~ ~
s ~i
à 28~C avec un eclairement de 15000 lux environ et une photo-
periode de 14 h. On a effectué 3 repetitions par traitement.
On a compare les même types d'inoculum que ceux
qui ont eté utilises dans l'exemple 7, seule diffère legère-
ment le nombre de bacteries apportee par plante: 2 x 109.
20 jours après la mise en route cle l'experience on a deter-
mine le poids des parties aériennes et des racines du sorgho.
Resultat.
L'effet rhizogenique d'E. cloacae se manifeste
uniquement dans le cas de l'inoculum en gel de polymère,
la stimulation de la rhizogenèse etan-t hautement significative.
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Exemple 9
INFLUENCE DE L'INCLUSION EN GEL DE POLYMERE
SUR LA SURVIE DE RH:CZOBIUM JAPONICUM ..
On a stocke pendant 75 jours a deux températures différentes
14~C et 30~C) une même culture de Rhizobium japonicum G2Sp, r
sous trois formes différentes:
- culture liquide telle quelle
. - culture liquide sur suppor-t tourbe stérile
- culture incluse en gel de polymère en cubes
d'environ l ml maintenus dans une solution tampon
phosphate pH7.
, Les taux de survie exprimés par le pourcentage du nombre des
bactéries encore vivantes après le stockage par rapport au
nombre de bactéries vivantes avant le stockage sont indiqués
au tableau VII.
Les comptages ont eté faits suivant la technique classique de
: dilution et étalement sur le milieu Wacek & Brill (voir
exemple 6) en boltes de Petri incubées a 30~C.
Les resultats montrent que l'inclusion en gel de polymère
assure une très bonne survie, même si la te~.mpérature de
: stockage est élevee (30~~).
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2 5
~3~76
Il ressort des experiences precedentes que le
procéde selon la presente invention permet d'augmenter de
façon très importante le nombre et surtout le poids des
nodules formes par rapport aux procedes classiques d'ino-
culation.
Cette propriéte permet: d'envisager l'introduction
de souches nouvelles dans un sol possedant deja des souches
de Rhizobuim specifiques. En d'autres termes, l'emploi
du procede selon l'invention doit permettre d'eliminer le
handicap de la compétition qui constitue actuellement
l'obstacle majeur à l'introduction in situ des souches
nouvelles obtenues par Ies généticiens. ~;
D'apres lesobservations effectuees, l'infection
de la racine n'a pas lieu au niveau du segment de racine qui
traverse chaque cube de gel de polyacrylamide~ mais dans
une zone situee immediatement au-dessous de l'inclusion. ;
L'inclusion jouerait le role d'un reservoir d'inoculum a
-
partir duquel des bacteries seraient liberees en permanence ~
.
et se multiplieraient le long de la racine pour infecter
2~ ensuite celle-ci des qu'elles rencontreraient des sites
d'infection favorables.
Le rendement en azote est ameliore de façon tres
.
spectaculaire par la mise en oeuvre du procede selon la
presente invention puisque celui-ci a pratiquement quadru~
ple lorsque l'inoculum de bacteries incluses est placé à
5 cm de profondeur. Cet accroissement est plus faible dans
.
le cas où le placement des cubes de gel de polyacrylamide
est effectué à 15 cm. Cet effet défavorable du placemen~
en profondeur s'explique bien par le fait que dans les
conditions exp~erimentales adoptees la diffusion de l'oxygene
en profondeur est faible.
Si l'on considere l'activite fixatrice d'azote
- 26 -
, 3~
specifique, on constate qu'elle est environ dix fois plus
faible dans le cas de l'inoculum par bacteries incluses.
' Ceci s'explique par le fait que le procede selon l'invention
aboutit a surequiper les plantes en nodules et qu'un fac-
teur limitant intervient qui ne permet pas l'expression
complete de l'activite fixatrice d'azote par le systeme
obtenu, ce facteur limitant pouvant être propre au vegetal
(notamment photosynthese) ou être un facteur de l'environ-
nement climatique, par exemple intensite lumineuse insuf-
: 10 fisante au moment de la mesure ou edaphique (par exemple
dystrophie phosphatee). . .
Le pr~cede selon la presente invention permet
d'eliminer avec une très grande securite l'intervention du ~ ;
facteur limitant que constitue souvent l'insuffisance de . :
l'equipement d'une legumineuse en nodules efficients. .. .
-.~7 - :~
