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14~5
,
La présente invention concerne un procédé perfectionné
pour la séparation et la purification de protéines de masses molé-
culaires très diverses, pouvant se trouver à l'état d'unites mor-
phologiquement organisees; elle utilise la méthode chromatogra-
phique d'exclusion, en phase liquide. Elle s'applique en parti-
culier à la séparation ou/et purification de virus à partir du
milieu de culture de ces der~iers, ou à partir du milieu déjà con-
centré et partiellement purifie; ansi convient-elle avantageuse-
ment à la separation et purification des virus de la grippe.
Malgre le succès rencontre par les méthodes chromato-
graphiques, en analyse et dans l'extraction de différentes sub-
stances, ces méthodes n'ont pas pu jusqu'à présent s'appliquer uti-
lement au traitement industriel de proteines de bases et tres hau-
tes masses moleculaires; c'est notamment le cas des virus. L'uti-
lisation de la chromatographie d'exclusion, dans la purification
et la separation des macromolecules solubles ou organisees en uni-
tés morphologiques plus ou moins complexes, telles que micelles li-
pidiques,fractions organisées de corps bactériens ou virus, estdécrite dans diverses publicationsn C'est ainsi qu'une am~lioration
de la pureté des protéines, en particulier de virus a été obtenue
par l'application de la chromatographie d'exclusion sur gels sou-
ples, notamment sur des billes d'agar (Bengtsson et Philipson
Biochim. Biophys. Acta 79 (399) 1964): cependant, ces supports,
manquant de resistance;mécanique, se prêtent mal fi une exploitation
économique et industrielle o~ deforts débits, c~rrespondant à des
pressions relativement elevees, doivent être appliqués a la colonne
chromatographique. D'autre part, ces gels ne supportent pas la ste-
rilisation par la chaleur, ce qui limite leur emploi pour la sé-
paration de produits qui doivent être conservés stériles. Il est
également connu que l'on peut utiliser, en chromatographie d'exclu-
-1- ~
B
-- .
1111415
sion ou d'affinité, des supports rigides, tels que billes de
verre~ ces supports présentent l'avantage d'une bonne résis-
tance mécanique et peuvent supporter des pressions élevées;
ils ont également d'avantage de pouvoir être stérilisés
avant l'utilisation. Ces supports présentent toutefois l'in-
convénient d'une adsorption importante de protéines; cet in-
convénient a pu être atténué par un prétraitement du support
avec des réactifs bloquant les sites actifs adsorbants du
support; ainsi est-il connu de traiter les supports par du
polyéthyl2ne-glycol; cependant ce traitement ne conduit pas
a des résultats stables et les sites actifs réapparaissent
peu à peu au cours du traitement.
Il est à noter egalement que, dans l'art anterieur
~Analytical Biochemistry 58, 30-38, 1974), des protéines n'ont
pu être séparées par la chromatographie d'exclusion en phase
liquide, sur du gel de silice poreux, que sous des fortes
pressions de l'ordre de dizaines de bars. D'autre part, cette
technique s'appliquait seulement à des protéines de masses
moléculaires de 250 000 ~ 800 000 et à des fins analytiques
seulement. Le probl2me restait entier, lorsqu'il s'agissait
de séparer avec des débits industriels, sous des pressions
voisines de l'atmospherique, des proteines de très hautes
; masses moleculaires, notamment au-dessus du million, comme
c'est particuli2rement le cas des virus de la grippe, dont
la moyenne des masses moléculaires est supérieure à quelques
-- millions.
Ce probl8me est résolu par la présente invention
qui permet de séparer efficacement des protéines de très
hautes masses molaires de l'ordre de plusieurs millions,
aussi bien que celles dont les masses vont d'environ 10 000
à 1 000 000.
On connait d'autre part divers procédés de sépara-
~,. .
~ 1111415
tion et de purification ae virus. Parmi ces procédés, cer-
tains comportent une séparatîon par densité sur appareil
d'ultracentrifugation en continu, les ~irus étant piégés dans
un gradient continu de saccharose; d'autres consistent en
une adsorption spécifique, notamment sur erythrocytes, ou
sur complexe insoluble de polymare et de sels bivalents,
suivie d'une désorption, ou bien en une adsorption sur des
tels insolubles, tels que phosphate de calcium ou sulfate
de baryum, ou en une simple précipitation, par exemple au
sulfate d'ammonium, au polyéthylèneglycol et solvants orga-
niques. Ces procédés, combinés entre eux, qui sont a l'heure
actuelle des procédés industriels, conduisent encore à des
produits insuffisamment purifiés; cela peut nécessiter ul-
térieurement des traite~ents par solvants qui dénaturent les
protéines et dissolvent les lipides. En outre, leurs rende-
menta ne sont pas optimum.
La presente invention apporte un perfectionnement
a la séparation et a la purification de protéines, par l'appli-
cation de la chromatographie d'exclusion pratiquée d'une
façon nouvelle. elle remedie aux inconvenients de l'art an-
térieur et peut être avantageusement combin~e avec d'autres
moyens déjà connus. Le procédé suivant l'invention permet
des opérations à l'échelle industrielle, conduisant à des
` rendements voisins de 100%.
Le terme proteine comprend - dans la présente des-
cription - également des unités morphologiquement organisées,
notamment virus, qui peuvent être extraits des mllieux qui
les contiennent, ~ l'état de tres grande pureté. Le nouveau
proc~dé et ses variantes donnent en particulier d'excellents
résultats dans la séparation et la purification des virus
de la grippe multipliés sp~écialement sur oeufs embryonnés
ou sur substrats cellulaires culti~és in ~itro.
- 3 -
~ ~11415
Le procédé suivant l'invention est caractérisé en
ce que la charge ou support d'une colonne chromatographique
d'exclusion est soumise, avant l'emploi, a une double passi-
vation: une au moyen d'une solution aqueuse d'un polymere
non protéinique, selon un mode connu en soi, et une seconde
a l'aide d~une solution aqueuse de protéine de masse molécu-
laire inférieure ~ celle de la protéine a séparer, et sus-
ceptible d'être adsorbée par la charge. On entend par passi-
vation la mise des grai~s de la charge au contact d'un réactif
susceptible de bloquer les sites adsorbants de cette charge.
Comme on a vu plus haut, la passivation d'apras
l'art connu, notamment avec du polyéthyleneglycol ne donne
pas des résultats stables; par contre, les sites actifs de
la charge ne réapparaissent plus au cours du travail, lors~
qu'une passivation supplémentaire a été effectuée avec une
protéine.
Dans le procédé suivant l'invention, la charge
chromatographique peut être constituée par de la silice ou
par un silicate, notamment gel de silice ou billes de verre,
c'est-~-dire un silicate de métal alcalin. Le diamatre
poreux est de préférence 5 a 200 nm, la surface spécifique
pour des grains de 40 a 200 microns étant respectivement de
500 a 20 m2/g.
Apres passage du milieu renfermant la protéine à
séparer, a travers ce support, le produit est élué par de
l'eau a pH tamponné entre 5,5 et 7,5 a une température de
0 a 30C et de préférence entre 4 et 20C, a une pression
correspondant à la perte de chargede la colonne. Le pH préféré de
l'éluant a une valeur proche de 7, pratiquement 6,5 a 7,5.
La pression est en général de 1 à 2 bars.
La nature du tampon doit, bien entendu, être com-
patible avec celle des protéines a traiter, afin d'é~iter
- 4 -
~` . .
11114~5
des précipitations ou alt~rations de celles-ci. Les tampons
a base de phosphates alcalins, connus en soi, conviennent
bien a cet effet. D'autre part, il est avantageux que l'eau
d'élution renferme également un électrolyte fort, qui peut
~tre du chlorure de sodium, a la concentration de 0,1 a
0,2 M.
Des gels de silice, convenant a la réalisation du
procédé suivant l'invention, se trouvent dans le commerce,
.. . . . _ _ _ ................. . _ ..
sous ~
. .
" ` 11~14~5
.
la denomination de Sphérosil* On peut utiliser tout autre gel de
même qualité, ou des billes de verre.
Lorsque les conditions opératoires sus-indiquées sont
respectées, il devient possi~le d'utiliser des colonnes de dia-
mètres intérieures allant de 8 à 200 mm, susceptibles de debits de
l'ordre de 3 à 30 l/h correspondant à des productions biologiques
industrielles. La hauteur de la colonne depend de la nature des
produits à separer et à purifier, des caractéristiques du support
et de la courbe chromatographique du système donn~; elle peut,
par exemple, être de 0,5 à 2 mètres.
L'invention peut être avantageusement realisee à 7'aide
de plusieurs colonnes disposees en series et chargees eventuelle-
ment de supports sus-indiques aux caracteristiques differe~tes;
cela permet de separer les unes des autres, differentes proteines,
et parachever la purification d'un produit donne.
Comme dans les proaedes connus, le polymère pour la
; première passivation du support chromatographique peut être un
compose aliphatique hydrosoluble, en particulier porteur d'hydro-
xyles. Ainsi, peut-on employer des polyethylène-glycol, poly-
propylène-glycol, polybutylène-glycol, alcool polyvinylique, poly-
vinylpyrrolidone, copolym~re (polyethyl~ne~polypropylène) glycol,
etc. Il est preférable que la masse moleculaire d'un tel blo-
queur soit de l'ordre de 5 000 à 30 000.
Le blocage des sites adsorbants du support est obtenu
par passage d'une solution aqueuse du reactif choisi, par exemple
du polyéthylène-glycol, de poids moleculaire 20 000, assez dilue,
par exemple à 0,5 à 5 g par litre, à travers la charge de la co-
lonne; le volumc de cette solution doit etre egal à plusieurs
fois celui de la charge; un ordre de grandeur de 10 fois ce vo-
lume est approprié. Cependant, cette passivation est insuffisante,et une partie des proteines ou produits à separer restent fixes
sur le support, si l'on n'applique pas, en outre, la seconde
* marque de commerce
~,
.Y,,~
111141S
passivation suivant la presente invention. Cette seconde passi-
vation est effectuee par traitement du support chromatographique
avec une solution aqueuse d'une ou de plusieurs proteines de
! masses moleculaires plus petites que celle de la protéines à se-
parer. Ainsi, selon la nature de cette dernière, diverses protei-
nes, accessibles industriellement, telles par exemple qu'albumine,
notamment sérum -albumine, ovalbumine ou lactalbumine, gelatine,
peptones etc. peuvent être utilisees. Il est pratique d'employer
celles des proteines, plus legères, qui accompagnent la proteine
plus lourde que l'on veut separer. Des produits de degradation
de differents polypeptides peuvent être employ~s. En general, la
masse moleculaire de la ou des proteines de passivation est de
preference inferieure à lO0 000 et, mieux encore, ne depase pas
50 000. La solution peut renfermer 0,2 à 20% en poids de proteine
de passivation, et plus particulièrement 1 à 15%.
Dans le cas de la separation et purification des virus
de la grippe, d'excellents resultats sont obtenus par un ou plu-
sieurs passages de liquide allantoique préleve sur des oeufs em-
bryonnes! non infectes par le virus grippal. Dans ces conditions,
la colonne de gel de silice a perdu tout son pouvoir de fixation
des virus; elle est stable et peut fonctionner pendant des mois avec
l'eluant tamponne, pour extraire lès unites morphologiquement or-
ganisees, voulues, sans que celles-ci subissent une adsorption
par la silice ou le silicate.
Le procede et appareil suivant l'invention permettant
, d'obtenir des produits proteiniques très purs a partir de milieux
aqueux, et, en particulier, des virus à partir de milieu de cul-
ture de ces microorganismes. Toutefois, etant donne le mecanisme
de la chromatographie d'exclusion, qui comporte l'elution avec
des volumes plus ou moins grands de liquide, la concentration de
la proteine cherchee, dans la solution purifiee, obtenue, n'est
generalement pas très forte. ~uand l'utilisation envisagee n'exige
` 1111415
pas une solution très concentree, le produit obtenu, comme dé-
crit ci-dessus, convient parfaitement; mais, si des concentra-
tions plus elevees sont necessaires, elles peuvent être atteintes
par une variante de la presente invention.
. .
~- Des variantes de la présente invention consistent en
des combinaisons de la chromatographie d'exclusion en phase li-
quide avec des moyens de purification diffcrents, par excmple pré-
cipitation, adsorption, ou/et ultracentrifugation. Ces variantes
peuvent être pratiquces de deux manières: la protéine recherchée
est d'abord concentrée et/ou purifiée par une des methodes ci-
dessus, connues, de fa~on à former une solution concentrée et/ou
semi-purifiée du produit recherché; ce produit est ensuite extrait
; à l'état purifié par la chromatographie; ou bien, le milieu ini-
tial est soumis à la chromatographie d'exclusion en vue de la se-
paration des produits recherches à l'etat de bonne purete, la so-
lution, ainsi obtenue, étant ensuite concentrée, et le produit
i
recherche, extrait, est purifie par une des methodes sus-indiquees.
Ainsi, dans le cas de la separation du virus de la-
grippe a partir de solutions allantoiques, la premiare operation
peut être la concentration du virus par adsorption-desorption
sur hematies; adsorption sur lc phosphate de calcium, puis re-
larguage par complexation du calcium; précipitation par des sels
tels que BaSO~ ou (NH4)2S04 ou bien par du polyéthylène-glycol,
ou autre poly (oxy-alcène); ultracentrifugation zonale en gra-
~ dient de densitc; adsorption sur verre poreux ou gel de silice,
i~` suivie d'une désorption par elevation du plI; ultrafiltration sur
membranes ou fibres creuses; ou bien, la séparation du virus est
d'abord rcalisée par la chromatographie d'exclusion suivant l'in-
vention, après quoi la solution de ce virus est soumise à la con-
, . .
centration par une de ces méthodes, ou par lyophilisation.
Un procédé remarquable pour la combinaison avec la chro-
matographie colsiste en 1'adsorpt on semi-spéciiique par addition
, .
415
dans le liquide contenant le virus purifié ou non, d'un polylaky-
lène-glycol ou poly (oxy-alcène) en particulier du polyéthylène-
glycol et d'un sel bivalent spécialement le chlorure de calcium.
Le complexe insoluble polymère-Ca++ qui dans son insolubilisation
a entrainé les virus, est redissous dans une solution aqueuse de
l'acide éthylene diaminotétra-acétique ou d'un sel alcalin de
celui-ci (particulierement sel de sodium) ou de tout autre agent
décomplexant le calcium.
La solution concentrée, ainsi obtenue, est alors
soumise à la chromatographie d'exclusion décrite plus haut. Cette
dernière fournit ainsi une solution à la fois concentrée et tres
pure.
Bien que le principe de cette méthode soit connu en
soi (Ph. Adamowicz, B. Legran~, J. Guerche et P. Prunet; Bull.
off. int. Epiz 1974, 81, (11-12), 1125, 1150) sa combinaison
avec la purification chromatographie suivant l'invention com-
porte une adaptation, sans laquelle les résultats ne seraient
pas satisfaisants. En effet, selon la méthode connue, le poly-
éthylène-glycol, utilisé à la complexation conjointement avec
un sel de métal bivalent, doit avoir une masse molcculaire d'au
moins 100 000, pouvant aller à 300 000; or, suivant la présente
invention, des polymères de masses moléculaires nettement plus
faibles doivent être appliqués car avec 100 000 ou plus le fonc-
tionnement de la chromatographie peut être perturbé par la vis-
cosité élevée et conduire à des préparations moins pures, le
polymère étant moins bien séparé des virus. Conformcment à l'in-
vention, le polymère d'oxyde d'alkylène utilisé doit avoir un
degré de polymérisation limité à environ 80 à 1 400, ce qui -
dans le cas du polyéthylène-glycol - correspond à des masses
moléculaires d'environ 5000 à 85 000; des masses préférées sont
de 6 000 à 30 000 et plus particulièremetn 10 000 à 25 000. Des
résultats équivalents ont également ete obtenus en utilisant les
.: . . . . .
-
4~
polym~res cités précédemment.
Le nouveau procédé et ses variantes donnene d'excel- -
lents résultats dans la préparation de solutions concentrées en
virus pur de la grippe. Generalement les virus de la grippe,
destinés à la préparation des vaccins, sont multipliés dans la
cavité allantoique des oeufs de poule em~ryonncs. Lors de la
récolte, les liquides allantoiques, déjà charges de diverses
protéines et de sels, peuvent être contaminés avec les phospho-
lipides prélevés accidentellement par altération de la membrane
vitelline. C'est de ce milieu de culture que sont extraits les
virus de la grippe, purs. Ces virus ont la propriété d'agglu-
- tiner les hématies de poule, ce qui permet une détermination
quantitative, rapide, exprimable en unités internationales
d !hémagglutination.
Etant donné la sensibilité des protéines, en général,
aux attaques par des microorganismes, et surtout celles des mi-
lieux biologiques dont on extrait des enzymes, virus, etc., le
traitement du milieu soumis à la séparation doit être effectuc
dans des conditions stériles. La st~rilisation classique des
appareils utilisés, par la chaleur, comporte l'obligation de dé-
montage de l'appareil, lorsque celui-ci a les dimensions et cons-
truction industrielles; cette opération ne peut d'ailleurs pas
empêcher les contaminations au cours du travail. La méthode
usuelle consiste à ajouter, au liquide traité, un ou plusieurs
antiseptiques, dont les plus employés sont le formaldéhyde et
le merthiolate de sodium (éthyl-mercuri-thiosalicylate de sodium);
on obtient ainsi une sterilisation convenable, mais - dans le cas
de virus en particulier - l'antigène obtenu est inactive; la
méthode courante ne permet donc pas la préparation d'un vaccin
vivant dans des conditions stérilcs.
Une variante de la presente invention remédie à ces
insuffisances de la technique antérieure: elle permet d'empecher
1111415
- en permanence la prolifération de bacteries, tout au long du
travail de séparation de protéines, sans toutefois inactiver le
vérus donné, que l'on cherche à séparer. Le procéd de l'inven-
tion s'applique donc fort utilement aussi bien dans le cas
général des protéines non vivantes qu'à celui de la séparation
de virus; ce dernier cas est - comme Oll le sait - très important
pour la sérologie. L'invention permet ainsi la preparation aisée
de vaccins vivants.
Cette variante réside dans le choix spécial d'un agent
antiseptique, susceptible d'agir sélectivement comme bactericide
ou, du moins, bactériostatique, inoffensif vis-à-vis des unités
protéiniques, morphologiquement organisées, qu'il s'agit de sé-
parer. Conformément à l'invention, de tels agents sont choisis
parmi les hydrocarbures aliphatiques, inférieurs, halogénes;
; conviennent surtout des hydrocarbures di- et tri-halogénés, et
principalement ces derniers. Selon la nature des unités, notam-
ment virus, à respecter, et suivant la sensibilité de ceux-ci
aux hydrocarbures halogénés, on peut utiliser, comme antisepti-
ques, un ou plusieurs des composés tels que mono-, di-, tri-, et
tétrachlorométhane, -éthane ou -propane, ou bien les dérivés
bromés ou iodés correspondants, à condition que leur solubilite
dans l'eau soit d'au moins 0,1 g/l et, de préférence, egale ou
supérieure à 1 g/l. La proportion d'agent antiseptique utilisée
est comprise dans les limites de la solubilite de l'agent dans
l'eau. D'autre part, l'agent utilisé doit présenté une forte
tension de ~apeur, pour pouvoir être éliminé facilement du produit
fini.
Bien que des composés tels que chlorure, bromure ou
iodure, de méthyle, à solubilité dans l'eau relativement élevee,
soient utilisables, il vaut mieux employer des hydrocarbures
halogénésssolubles à raison d'environ 1 à lO g/l. Appartiennent
a cette classe, par exemple, les composés suivants:
--10--
415
dichloromethane, dibromo-methane, diiodo-methane, dichloro-
ethanes-1,2 (cis et trans), dibromo-éthane-1,2, trichloro-
méthane (chloroforme), tribromo-méthane (bromoforme), tri-
chloro-1,1,2-eethane, trichloroethyl8ne, etc....................... ~ :
` L'iodoforme (CHI3), qui fut autrefois employé beau-
coup en chirurgie, peut également convenir dans certains cas,
mais, tant a cause de sa faible solubilite d'environ 0,1 g/l ~ -
que de sa toxicité relativement élevée (DL50 630 mg/kg souris~, :
il est préférable d'avoir recours au chloroforme (CHC13), qui
donne des résultats remarquables, sa solubilité dans l'eau
étant d'environ 5 a 7 g!l, aux températures moderées.
Puisque les hydrocarbures halogenés sont des solvants
puissantsdes lipides, on pouvait s'attendre a ce qu'ils af-
fectent les microorganismes dont l'enveloppe est de nature
lipidique' or, de façon tout à fait inattendue, on constate
qu'une telle action n'a pas lieu avec les agents antisepti-
ques suivant l'invention, lorsque les doses sont situées
dans les limites de solubilité de ces agents. C'est ainsi
que, par exemple, des concentxations de l'ordre de 5 g de
chloroforme, par litre du milieu contenant un virus de la
grippe, n'affectent nullement ce dernier, alors qu'ils sté-
rilisent fortement la solution vis-a-vis de bactéries; a
ces concentrations, ni le titre infectieux, ni le pouvoir
hémoagglutinant du virus ne sont modifies, même apr~s 5 jours
- d'incubation. Il en résulte, par conséquent, que malgré la
connaissancedeja ancienne de l'effet antiseptique de cer-
tains hydrocarbureshalogenés sus-mentionnés, l'application,
sui~ant l'invention, est tout a fait nouvelle et imprévue.
Les agents antiseptiques, suivant l'invention,
peuvent être ajoutés au liquide à traiter, a la solution
tampon utilisée pour l'élution, ou bien dans ces deux milieux
'
l , ` ~11~41S
.
à la fois. Lorsque la solution de la proteine séparee est
soumise a la lyophilisation, cette operation élimine la très
....
- - falble quantité d'hydro~
- . - . . . _ . .
~ 14~5
carbure halogéné qui aurait pu rester dans la proteine.
La preserlte description est illustrée par les figures
1 à 4 suivantes.
Fig. 1 est la courbe chromatographio~ue d'une sépara-
tion de virus de la grippe.
Fig. 2 est la courbe chromatographique de Ia solution
de virus purifié de la figure 1.
Fig. 3 représente le chromatogramme d'une solution de
catalase purifiée par le procédé de l'invention.
Fig. 4 est un schcma de l'appareil chromatographique
qui a servi aux opérations d~crites dans lcs exemples.
Les dispositifs servant a la chromatographie d'exclu-
sion pour la préparation de diverses substances sont connus,mais
à des fins analytiques seulement, les colonnes ayant un diamètre
int~rieur de 8 mm environ. Aucun matériel automatique de chroma-
` tographie d'exclusion de grande capacité n'existait jusqu'à
:! présent.
Le dispositif pour la réalisation industrielle suivantl'invention est représenté par la figure 4: une pompe 2 pousse
en permanence dans la colonne 5 le solvant d'élution contenu dans
le réservoir 1. La solution à fractionner, contenue dans le
réservoir 4, est injectée dans la colonne 5 à intervalles de temps
réguliers par un système automatique 3 constitue d'électrovannes
et d'une boucle d'échantillonnage de 500 ml (par exemple). La
colonne 5, de grande capacité, par exemple 10 cm de diametre et
120 cm de hauteur, est en acier inoxydable; elle est entourée
d'une double enveloppe 10 en acier inoxydablc également, pouvant
supporter des pressions de stérilisation par la vapeur, et rac-
cordée également à une circulation réfrigerante (+4C par exemple).
Le gel de silice est dispose dans la colonne 5. Des produits,
issus de la chromatographie, peuvent être recoltés par fractions
sélectionnées et le contrôle de l'effluent de la col~nne est ef-
-12-
.
``; -` 1111415
fectué à l'aide d'un détecteur ultra-violet 6, dont la réponse
est transmise à un enregistreur 8. Les différents produits élués
sont recueillis dans un collecteur de fractions 7 constitué par
une vanne automatique à n voies (20 voies par exemple), notamment
par un ensemble d'électrovannes. Les differentes opérations,
injections et collectes, sont effectuées automatiquement à l'aide
d'un programmateur du commerce. Cet appareil peut fonctionner en
continu 24 heures sur 24.
Il est possible de traiter avec l'appareillage décrit,
450 ~ 500 ml de liquide par heure, soit une quantit~ de 10,8 à 12
litres par jour, pour obtenir un produit parfaitement purifié.
Dans le cas de la purification du virus de la grippe on peut
traiter 12 litres de liquide allanto~que/jour. On voit ainsi
l'intérêt que présente la variante décrite, qui consiste à traiter
; dans la colonne un liquide prealablement concentré et partielle-
ment purifié. Etant donné qu'il es~ possible de concentrer le
liquide allantoique 40 fois, la quantité de liquide allantoique
provenant des~oeufs, qui peut être traitee, est de 400 - 480 1,
ce qui correspond à la production fournie par 60 000 oeufs environ.
Les exemples qui suivent illustrent non limitative-
ment la présente invention.
EXEMPLE 1
Préparation de la colonne.
La colonne, décrite plus haut, a un diamètre intérieur
de 10 cm et une hauteur de 120 cm. Elle est chargée avec de la
poudre de gel de silice en particules de 100 à 200 microns, dont
le diamètre poreux moyen est de 60 nm et la surface spécifique
50 m2/g, le volume poreux de la charge est de 1 ml/g. Le gel de
silice utilisé est le "SPHEROSIL XOB 030"*(Rhône Poulenc). Après
stérilisation par la vapeur, le gel, placé dans la colonne, est
préalablement passivé, c'est-à-dire trait~ par une solution aqueuse
de 1% de poly~thylène glycol de masse molaire 20 000, pendant 24 h,
* marque de commerce. -13-
.
de façon a bloquer ses sites adsorbants. La colonne re~oit
ensuite une charge de 500 ml de liquide allantoique non char-
gé de ~i~us grippal, qui produit la seconde passivation.
Cette double passivation est suivie d'un lavage
avec une solution aqueuse, tampon, de phosphate monopotassi-
que et disodique stérile, de p~ 7,5 renfermant du NaCl a la
concentration 0,15 M. Une telle colonne est prête pour le
traitement de solutions de produits à purifier.
EXEMPLE 2
., .
Séparation du virus de la grippe, souche A/X53,
de son milieu de culture allanto~que.
:~i La solution de virus traitée provient de la culture
classique dans la cavité allantoique de l'oeuf de poule em-
~; bryonné, aprés 10 à 12 jours d'incubation; elle titre 1 200
'! .
~ unités HA (méthode d'hémato-agglutination) par 0,25 ml.
., :
~ 450 ml de cette solution sont injectés dans la colonne, avec
:! ' .
un débit de 150 ml/mn, soit en 3 minutes, et cela toutes les
heures. Pendant ce temps, on fait passer en permanence, à -
! travers la colonne, un débit de la solution tampon susindi-
.~ . :
quée. Ce débit est de 9 l/h, tant que seul le virus appa-
ralt a la sortie de la colonne. A ce débit le ~irus commen-
ce a apparaltre au bout de 30 minutes; le débit est triplé,
c'est-à-dire augmenté à 27 l/h, lorsque l'éluat commence à
renfermer les impuretés du virus. Cela permet d'achever
l'opération plus rapidement, notamment en 1 heure.
La colonne étant équipée de dispositifs d'automa-
tion connus en soi, il est possible de la faire fonctionner
sans interruption pendant tout le temps voulu.
La détection des composants de l'éluat, a la sortie
de la colonne, est effectuée au moyen d'un dispositif de dé- -
termination de la densité optique dans l'ultra-violet de
longueur d'onde de 252 nmt cet appareil étant bien connu dans
- 14 -
1111415
l'art, il n'y a pas lieu de le décrire ici.
La perte de charge dans la colonne étant assez faible,
la circulation de la solution a travers la colonne n'exige
qu'environ 1 bar de surpression a l'entree de celle-ci.
A partir des 450 ml de solution virale, traitée, on
obtient, apres chromatographie 1 050 ml d'éluat renfermant du
virus tres pur, tandis que les impuretés se trouvent dans le
reste de la solution ~ampon passée par la colonne.
Sur la figure 1, qui montre la courbe chromatogra-
phique de cette opération (densités optiques en ordonnées,
volumes d'éluat en abscisses), on peut voir le pic V corres-
pondant au virus et le pic I aux impuretés; la discontinuité
du pic I est due au changement du débit de 9 a 27 l/h. Lors-
qu'on examine, dans une colonne chromatographique analytique
de 0,8 cm de diametre sur 120 cm de haut, garnie de la même
silice que plus haut, un échantillon de 3 ml, préleve dans
les 1 050 ml de solution purifiée, on trouve un pic du virus
seul, figure 2, les impuretés étant completement absentes.
On voit que la purification du virus a été remarquable.
Voici le bilan de l'opération déterminé par la me-
sure de l'activité suivant la méthode d'hemato-agglutination
(HA). Les 450 ml de solution allantoique de depart titraient
1 200 unités H~/0,25 ml, tandis que l'activité des 1 050 ml
obtenus etait de 4~0 unités HA/0,25 ml. On avait ainsi, au
départ, un total de 2 160 000 unités HA, et on en retrouve
2 016 000 dans la solution purifiée. Le rendement est
donc de
( 2 016 000: 2 160 000) x 100 = 93,3 %
ce qui peut être considéré comme tr2s élevé, car les méthodes
classiques donnent des résultats de beaucoup inférieures.
' . ,' :
. ' . . ~
~141$
EXEMPLE 3
Séparation du virus grippal par un double procédé
d'adsorption - élution sur érythrocytes suivie d'une purifi-
cation par chromatographie sur gel de silice.
50 litres de liquides allantoiques virulents, pro-
venant d'oeufs de poule e~bryonnés de 10 a 12 jours, sont
préalablement clarifiés selon l'art connu par centrifugation,
pour éliminer les substances insolubles. Le liquide centri-
. .
- fugé présente 1200 unités HA dans 0,25 ml.
On ajoute 4% (V/V) d'un culot d'hématies de poule
à cette suspension. Après un temps de contact de 8 à 16
" .
heures à la température de +4C ou +37C, les érythrocytes
sont séparées par centrifugation à 3 000 tours/minute, et
le virus est élué par un tampon phosphate sous un volume de
5 litres. L'éluat a un titre hémagglutinant de 12 000 uni-
'7 tés HA dans 0,25 ml.
450 ml de cette suspension virale sont automatique-
, ment injectés dans la colonne, en 3 minutes à un débit de
150 ml/mn. Pendant ce te~ps, on fait passer en permanence,
à travers la colonne, un débit de la solution tampon décrite
dans l'exemple 1. Ce débit est de 9 litres/heure tant que
seul le virus appara~t a la sortie de la colonne. Il est
triplé (27 litres/heure), lorsque l'éluat ne renferme plus
de virus mais des protéines contaminantes. Chaque opération
dure 1 heure. Grâce à son dispositif d'automatisme la co-
!J lonne fonctionne en continu jusqu'à épuisement des 5 litres
de concentrat d'éluats. Les pics, correspondant aux virus
purifiés, sont rassembles et donnent un volume de l5 litres.
Leur titre en unite hemagglutinante est de 32 000 unites HA
pour 0,25 ml, ce qui represente un rendement de l'ordre de
100%.
- 16 -
~111415
EXEMPLE 4
En partant de 10 litres d'une solution de liquide
allantoique infecté par le virus grippal, similaire ~ celle
de l'exemple 2, on procade en premiare étape ~ une concentra-
tion-purification sur co~plexe polymare calcium. Pour cela,
on ajoute ~ cette solution aqueuse 2 ~ en poids de polyéthy-
lane-glycol de
. _ _ . .. .
..
1111415
masse moléculaire 20 000, ainsi que 12 g de CaC12 en poudre.
Après melange homogène pendant 30 minutes, le précipite est sépar~
par décantation suivie de centrifugation; il est ensuite repris
pour elution du virus, dans environ 500 ml d'une solution aqueuse
~ 0,2 M, du sel disodique de l'acide éthylène-diamino-tctraacétique,
reajuste à pH 7,5 par de la soude 6 N.
La solution ainsi obtenue est centrifugée pour éliminer
l'insoluble, et le liquide clair surnageant, soit environ 500 ml,
est conservé.
Le rendement de cette opération de concentration puri-
fication a été trouvé voisin de 65 %.
Les 500 ml de cette solution concentrée sont chromato-
graphiés par exclusion dans une colonne de 10 cm de diamètre inté-
rieur sur 120 cm de haut, garnie de la même silice qu'à l'exemple
1, et l'on utilise également la même solution tampon. Les 500 ml
sont injectés comme dans l'exemple 2. Le pic virus est recueilli
par élution dans 1500 ml de solution qui titre 10 800 U~A/0,25 ml,
; ce qui correspond à un rendement de purification voisin de 98 %.
La solution obtenue de virus est à la fois concentrée et très
pure.
EXEMPLE 5
Du liquide allantoique infecte, comme décrit ci-dessus,
est concentré par diafiltration sur des membranes ou fi~res
creuses ayant un point de coupure de 1.106.
50 litres sont ainsi ramenés à un volume de 5 litres
ou moins. Après clarification, ce concentrat est directement in-
jecté dans une colonne conforme au modèle decrit dans les exemples
précédents, et selon le même procédé.
Le pic viral contient la totalité des unités hémagglu-
tinantes qui ont été déposées. Cette solution, très purifiée dupoint de vue protéique, peut encore être contaminee par des phos-
pholipides du sac vitellin organisés en micelles; ce contaminant
-17-
-- 1111415
peut être séparé d'après la densite par une opération d'ultra
centrifugation sur gradient de saccharose. 'routes les impuretés
ayant eté éliminées par la chromatographie d'exclusion, les rende-
ments de l'opération s'en trouvent très améliorés.
EXEMPLE 6
. , .
500 litres de liquide allanto1'que infectieux, comme
décrit ci-dessus, sont purifiés par une première opération d'ultra-
centrifugation sur gradient de saccharose.
Le pic viral récolté représente le volume de 1 litre.
Le rendement de cette opération est compris entre 30 et 80 %.
Le pic viral est introduit automatiquement dans une colonne de gel
de silice, comme celle que décrit l'exemple 2, et l'on procède à
la chromatographie d'exclusion par le procédé de cet exemple 2.
Le volume récolté est ~e 3 litres.
Le rendement de l'opération de chromatographie est
voisin de 100 % comme précédemment, alors que le liquide traité,
issu de l'ultracentrifugation contenait encore une proportion sen-
sible de contaminants protéiques.
EXEMPLE 7
Les opérations, réalisées selon cet exemple, sont
identiques à celles des exemples 2, 3, ~, 5 et 6. Cependant, la
suspension virale, soumise à l'opération de chromatographie d'e~-
clusion, est preaLablement inactivee par le formol, par la ~-
propiolactone ou par les ultra-violets, et/ou traités par un sol-
vant organique.
EXEMPLE 8
La colonne chromatographiquc,préparce selon l'exemple
1, est utilisée à la purification d'une solution aqueuse impure de --
catalase, extraite, par des opérations préliminaires, du foie de
boeuf. Cette solution présente une activité de 220 Unités Inter-
nationales. L'éluant est tamponné à pH 7. On obtient une solu-
tion à activité 180 U.I. soit un rendement de 86 % dans la fraction
-18-
`f' 1~L11415
Sl du chromatogramme représenté par la figure 3.
EXE~PLE 9
.
Les opérations de l'exemple 2 sont répétées avec la
colonne décrite dans l'exemple 1, mais la charge de la colonne
est constituée par des billes de verre de ~imensions comprises
entre environ 80 et 280 microns, au diamatre poreux moyen de
50 nm.
Le rendement en virus purifié est de 87 ~.
EXE~lPLE 10
Une purification du virus de la souche B/HK est effec--
tuée conformément aux exemples 1 et 2, sauf que pour la seconde
passivation de la charge de la colonne, on emploi 500 ml dlune
solution aqueuse à 6% de lactalbumine de masse moléculaire d'envi-
ron 18 000.
Les opérations conduisent à un rendement ~e 92 %.
EX~MPLE 11
: .
Dans l'exemple 10 la lactalbumine est remplacée par
` une solution à 8 % de peptone de viande, c'est-à-dire des pro-
! duits de protéolyse des polypeptides de la viande. Le rendement
'
ressort à 93 %.
EXEMPLE 12
Après la séparation du virus suivant l'exemple 2, le
produit obtenu est examiné au point de vue de sa flore micro-
bienne: le nombre de germes par ml est indique ci-dessous, en
A.
Une séparation similaire est effectuée, avec cette dif-
férence que la solution tampon est additionnee de 5 g de chloro-
forme, CHC13,par litre, afin de stériliser le milieu sélectivement:
la solution obtenue, B, ne contient plus que très peu de germes.
Dans une opcration C, le même antiseptique est ajoute, à raison
de 5 g/litre tant à la solution tampon qu'au liquide à traiter.
Le résultat est semblable à B.
--19--
` ' 1111415
D. D'autre part, une quantité du même milieu viral,
initial, est soumise a l'ultracentrifugation zonale, après
l'adjonction usuelle de 0,01% de merthiolate et 0,02 ~ de
formaldéhyde.
Les résultats suivants ont été trouvés.
Germes/ml
A Chromatographie; sans antiseptique ........... ....105
B Chromatographiei chloroforme dans le tampon .. ...~10
C Chromatographie; chloroforme dans le tampon et ~10
dans le liquide traité
D Ultracentrifugation zonale 3 000
Merthiolate ~ formaldéhyde
Il y a lieu de noter en outre que les virus obtenus
dans les opérations A, B et C étaient vivants, tandis que
celuide l'opération D était inactivé.
De plus, les produits résultant des opérations B
et C, avec du chloroforme, ont conservé le même titre infec-
tieux et le même pouvoir hemoagglutinant que ceux du produit
A, dont la séparation a été effectuée sans aucun antisepti-
que.
EXEMPLE 13
Une solution virale, similalre à celle qui a servi
aux essais A à D, dans l'exemple 1, mais correspondant à
d'autres souches de virus, est soumise ~ la séparation par
le procédé décrit dans l'exemple 2.
On étudie ainsi des liquides obtenus à partir de
3 souches de virus de la grippe: A/URSS, A/Texas, B/HK.
Dans chaque cas, on effectue la chromatographie
avec 5 g de chloroforme par litre de liquide et de tampon,
et sans chloroforme.
En outre, des séparations comparatives sont effec- -
tuées par ultracentrifugation zonale.
Le tableau suivant donne les rendements par rapport
- 20 -
-- 1111415
. au liquide de départ, dans chaque cas, ainsi que le titre en :~
virus, en unites internationales par mg de protéine.
~IRUS: A/URSS A~TEXAS B/HK
Rendement %
Chromatographie avec Chloro- ........ 88 77,5 88
Chromatographie sans chloro- ........ 81 71,5 81
Ultracentrifugation zonale .......... 72 50 63
(merthiolate-formaldehyde)
UI/mg
protéine:
Chromatographie avec chloro- ........ 19 800 23 400 26 200
forme
Chrfomatographie sans chloro_ ....... 12 100 19 200
Ultracentrifugation zonale .......... 12 900 13 600 15 3
(merthiolate-formaldéhyde)
Ces résultats montrent que l'adjonction de chloro-
:` forme améliore tant le rendement que la concentration du virus
dans le produit obtenu, et cela non seulement par rapport au
procédé classique d'ultracentrifugation zonale, mais même
vis-à-vis du procédé perfectionne de chromatographie d'exclu-
sion, decrit dans les exemples 1 a 11.
Dans le present exemple 13, on a constate, comme
precédemment, que le virus, séparé en présence du chloroforme,
est vivant et présente le même titre infectieux et le même
pouvoir hemoagglutinant que le virus résultant de la chroma-
tographie sans chloroforme. Par contre, le virus separe par
ultracentrifugation zonale avec sterilisation classique,
est inactive.
EXEMPLE 14
Dans des operations similaires aux cas B et C de
l'exemple 12 on a utilise di bromoforme à la concentration
d'environ 1 g/l, qui correspond au maximum de la solubilite
- 21 -
~- ~111415
du CHBr3 dans i'eau, on retrouve une centaine environ de
germes, par ml, dans le liquide final.
EXEMPLE 15
Le remplacement du chloroforme, dans l'exemple 12,
... . _ _ . . _ .. . . . _ . .. .. _ .. _ .. ...
` ~ ` 11114~S
par du trichloro-1,1,2-éthane, à raison de 4 g/l (solubilite
4,4 g/l à 20C), conduit à une flore bactérienne également très
réduite, de moins de 30 germes/ml.
EXEMPLE 16
Les opérations de l'exemple 2 sont realisées dans la
colonne décrite dans l'exemple 1, mais sans la seconde passiva-
tion, c'est-à-dire sans traitement de la charge avec du liquide
allantoi'que. Le rendement en virus est alors de 70 %.
EXEMPLE 17
En opérant sans la seconde passivation, comme dans
l'exemple 16, la charge étant constituee par les même billes de
verre que pour l'exemple 9, on a un rendement de 64 % contre 87 %
dans ce dernier.
Les conditions du débit d'éluant, de la quantitué de
liquide à traiter injectée dans la colonne, la frequence de cette
injection, décrites dans les exemples ne sont pas limitatives;
elles peuvent varier dans d'assez larges limites.
EXEMPLE 18
Des solutions de liquide allantoique infecte de virus
sont préparées à la maniere connue, à l'aide de diffésentes souches
de virus. On introduit dans ces solutions 6 g/l de chloroforme.
Le tableau suivant montre que l'adjonction de chloro-
forme ne modifie pas le titre infectueux et le pouvoir hémoag-
glutinant de ces solutions.
A/Victoria 75 A/X47 HK 73
Titre HA -avant chloroforme 210 160 290
~ après 24 heures 210 160 2~0
. .
après 2 jours 130
après 3 jours 230 160
après 5 jours 90
Titre infectieux
sans chloroforme 107. lo7.25 105.5
avec chloroforme 107.3 1o7.25 1o5.25
-22-
