Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
, t
~.%~S26
La présente invention concerne une nouvelle substance
biologiquement active, désignée par le numéro 41 200 RP, obtenue
à partir de cellules isolées de la culture d'un nouveau microorga-
nisme, déslgné par l'appellation Micrococcus sedogenes M 78, son
procédé de préparation et les médicaments qui la contiennent.
La substance 41 200 RP selon la présente invention, qui
estobtenue après traitement par le lysozyme.des cellules isolées
de Micrococcus sedogenes souche M 78, précipitation des impuretés
par le chlorure de calcium, élimination des protéines par traite-
ment au phénol suivie d'un fractionnement sur tamis moléculaire,
est constituée essentiellement par 11 à 18 % d'acides aminés
(dont 5,5 à 7,5 % d'alanine), 10 à 17 % de glucose, 10 à 17 % de
sucres aminés et moins de 5 % d'acides nucléiques.
Généralement isolée avec une teneur en eau comprise entre
2 et 6 %, la substance 41 200 RP est une poudre blanche hydrosoluble
amorphe contenant du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de
l'azote, du phosphore, du soufre, du chlore, du sodium et du cal-
cium. Sa composition élémentaire (calculée sur sec) est voisine
de:
C % = 45 - 47 H ~ = 7,1 - 7,6 0 % = 35 - 38 (par différence)
N % = 4,0 - 5,7 P % = 0,9 - 1,2 Cl % = 0,1 - 0,4
S % inférieur à 0,5 Na % = 2,0 - 3,0 Ca % = 0,9 - 1,9
Le procédé de préparation de la substance 41 200 RP
consiste essentiellement à traiter par le lysozyme, dans des con-
ditions de température, de pH et de durée déterminées et précisées
ci-après, une suspension aqueuse de cellules (de préférence préala-
blement séchées et éventuellement traitées à pH voisin de 3 et à
une température voisine de 120C pendant 30 à 60 minutes) isolées
de cultures de Micrococcus sedogenes souche M 78, à isoler sous
forme salifiée le produit brut à partir de la phase liquide de la
suspension obtenue, à le purifier par précipitation progressive
-1-
'~ :
l~Z2526
d'impuretés au moyen de chlorure de calcium puis par traitement
au phénol pour éliminer essentiellement la plus grande partie des
protéines et enfin par fractionnement sur un tamis moléculaire
en recueillant la fraction de haut poids moléculaire c'est-à-dire
compris entre 5.105 et 5.106.
Généralement, le lysozyme est utilisé à raison de 2 à
20 mg par gramme de cellules séchées mises en jeu. Le traitement
s'effectue à un pH constant compris entre 6,5 et 8, de préférence
voisin de 7, pendant 1 à 3 heures, de préférence pendant 2 heures,
et à une température voisine de 37C tout en agitant énergiquement.
La phase liquide de la suspension obtenue est générale-
ment séparée par centrifugation et les produits de falbles poids
moléculaires en solution sont éliminés soit par dialyse à travers
une membrane de porosité convenable, soit par ultra-filtration.
La substance brute ainsi obtenue peut être isolée sous forme
salifiée par lyophilisation de sa solution. A ce stade de la pré-
paration, la substance obtenue est constituée essentiellement par
des protéines, des acides nucléiques, des sucres aminés et moins
de 5 % de polysaccharides et sa composition élémentaire est voisine
de:
C % = 41,5 - 44,9 H % = 5,6 - 5,9 O ~ = 29,4 - 32,2 N % = 11,2 -
12,6 P % = 3,2 - 4,4 S % = 0,1 - 0,5 Cl % = 0,2 - 0,4
Cendres sulfuriques % = 11,4 - 15,4.
La substance brute est purifiée, en solution dans lieau
à une concentration comprise entre 10 et 40 grammes par~litre,
de préférence 20 grammes par litre, par addition d'une solution
concentrée de chlorure de calcium jusqu'à l'obtention d'une con-
centration finale en chlorure de calcium comprise entre 5 et 50
grammes par litre, de préférence 10 grammes par litre. Le précipité
formé est éliminé par centrifugation et la solution résultante est
dialysée (ou ultrafiltrée) puis traitée par une résine échangeuse
1~2252 E;
d'ions portant une fonction acide sulfonique sous forme alcaline.
La sùbstance obtenue, désignée par le numéro 32919 RP, peut être
séparée de sa solution aqueuse par lyophilisation.
La substance 32919 RP est constituée essentiellement par
24 à 33 % d'acides aminés, 26 à 33 % d'acides nucléiques, 11 à
17,5 % de sucres aminés (détermination selon la méthode Elson-
Morgan et expression des résultats en glucosamine) et 2,8 à 4,3
de polysaccharides, et sa composition est voisine de:
C % = 44 - 48 H % = 5,2 - 6,7 O % = 29 - 33 N % = 10,0 - 11,6
P % = 2,3 - 3,7 S % inférieur à 0,5 Na % = 3,0 - 3,8 Ca % = 0,15 -
0,50.
La substance 32919 RP est à nouveau purifiée en opérant
de la manière suivante:
Une solution aqueuse de la substance 32919 RP, dont la
concentration en substance 32919 RP est comprise entre 10 et 50
grammes par litre, de préférence 25 grammes par litre, est lavée
par un volume égal d'un mélange phénol-eau (contenant de préférence
10 % d'eau) pendant 15 à 60 minutes, de préférence 30 minutes, à
une température voisine de 65C. Après refroidissement, la phase
aqueuse séparée est lavée par un solvant chloré, de préférence
le chloroforme, jusqu'à élimjination du phénol dissous puis est
dialysée contre de l'eau distillée. La phase aqueuse contenant
la substance active est lyophilisée.
Le produit ainsi obtenu est mis en solution dans l'eau
tamponnée à pH 7 au moyen d'un acétate alcalin tel que l'acétate
de sodium. La solution ainsi obtenue est soumise à un fraction-
nement sur tamis moléculaire à haute porosité tel que "Ultragel
Ac A 22" de l'Industrie Biologique Française, "Sépharose 4 B" ou
"Sépharose CL 4B" de la Sociëté Pharmacia, en recueillant la frac-
tion de haut poids moléculaire. La substance 41200 RP est alors
isolée de sa solution par lyophilisation après dialyse prolongée
l~Z2SZ6
contre de l'eau déminéralisée.
Le microorganisme Micrococcus sedogenes, souche M 78,
dont la culture dans des conditions appropriées fournit les cellu-
les qui sont utilisées pour la préparation du 41200 RP, doit être
considéré comme une espèce nouvelle qui appartient au genre
Micrococcus.
I1 a été isolé à partir d'un échantillon de terre pré-
levé au Brésil selon les méthodes habituelles d'isolement des micro-
organismes. Un échantillon de cette souche a été déposé au Northern
Regional Research Laboratory de l'U.S. Department of Agriculture
à Peoria, III. (Etats-Unis) où il a été enregistré le 14 août 1968
sous le numéro NRRL B-3505.
Ce laboratoire est autorisé à distribuer la souche à
toute personne ayant licitement connaissance du présent document.
Les caractères de ce microorganisme ont été déterminés
conformément aux différentes méthodes d'identification résumées
dans "Manual of Microbiological Methods", Society of American Bac-
teriologists, Mc Graw-Hill Book Company, New-York (1957) ainsi
que dans les ouvrages suivants: J. Dumas, "Bactériologie Médicale",
Editions Médicales Flammarion, Paris (1951); S. Lambin et A. German,
"Précis de Microbiologie", Collection des Précis de Pharmacie,
Masson, Paris, (1961); H. Cassagne, "Milieux de culture", Editions
de la Tourelle, Paris (1961); Skerman, "Guide to the Identifica-
tion of the Genera of Bacteria", The Williams and Wilkins Company,
Baltimore (1967).
La détermination du Genre a été faite selon la clé
d'identification du "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology",
7ème édition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1957).
~ L'étude des caractères morpholoqiques de la souche M 78
a été effectuée sur des cultures statiques de 24 heures à 26C.
Ces cultures sont constituées par des cellules cocciformes Gram-
--4--
llZZSZ6
positives, non acido-résistantes, immobiles, de l ~ à 1,3 ~ de
diamètre, isolées ou groupées par deùx ou quatre cellules, ou
en cha;nettes de 4 à 16 cellules, ou bien encore en amas irrégu-
liers de 20 à 50 cellules. La présence de spores n'a pas été ob-
servée.
Les cultures sur gélose nutritive inclinée ont l'aspect
d'un enduit gras abondant, lisse ou très peu rugueux, inodore,
no~ chromogène, ayant une consistance molle. Les cultures sur
gélose nutritive en bo;tes de Petri se présentent sous la forme de
colonies circulaires, à bords réguliers, à surface lisse; ces
colonies sont aplaties ou légèrement convexes, plus ou moins opa-
ques.
Les cultures en bouillon nutritif glucosé sont modéré-
ment troubles, sans pigment, inodores, avec un sédiment floconneux.
Cultivée sur pomme de terre, la souche M 78 forme un
enduit gras, lisse, blanc jaunâtre très pâle, sans noircissement
de la pomme de terre ni pigment soluble.
L'étude des caractères biochimiques a été effectuée sur
des cultures incubées à 26C. L'ensemble des résultats observés
se résume de la manière suivante:
- Type respiratoire: aérobie strict
- Réduction des nitrates en nitrites: positif
- Chromogénèse: négatif
- Production d'indole: négatif
- Production de H2S: négatif
- Liquéfaction de la gélatine: négatif en 21 iours
- Hydrolyse de la caséine: positif
- Test au rouge de méthyle: négatif
- Recherche de l'acétyl-méthyl-carbinol (réaction de Voges-
Proskauer): négatif
- Culture sur lait écrémé: pas de ccagulation, pas de peptonisa-
~ZZ5Z6
tion, alcalinisation du milieu de pH 6,1 à pH 7,5 entre le ler
et le 21e jour
- Température optimale de développement: 4C - pas de développement
22C - bon développement
26C - très bon développe-
ment
30C - bon développement
37C - développement
médiocre
45 C - pas de développement
- Catalase: positif
- Oxydase: négatif
- Formation d'acides à partir des glucides et polyalcools suivants
(en aérobiose et anaérobiose) décelée par virage du rouge de
phénol:
- glucose: négatif
- galactose: négatif
- arabinose: négatif
- saccharose: négatif
- lactose: négatif
- mannitol: négatif
- glycérol: négatif
- Hydrolyse de l'amidon: positif
- Milieu à l'esculine: pas de noircissement
- Culture sur milieu additionné de fortes concentrations de NaCl:
4 % NaCl: développement moyen
10 % NaCl: pas de développement
- Utilisation de l'urée comme seule source d'azote: négatif
- Uréase: négatif
- Hydrolyse de la chitine: négatif
- Culture sur milieu pour autotrophe ~avec (NH4)2SO4 comme seule
.
~2ZSZ6
source d'azote~: pas de développement; pas de formation de
nitrites à partir de NH4
- En suivant le principe de la méthode de Pridham CJournal of
Bacteriology, 56, 107-114, (1948~ , la souche M 78 utilise moyen-
nement ou bien, comme sources de carbone, les substances suivantes:
amidon, éthanol, acétate de sodium, propionate de sodium, acide
succinique, acide malique, citrate de sodium, pyruvate de so-
dium. Ne sont pas utilisés ou ne permettent qu'un développement
pauvre: ribose, arabinose, glucose, lactose, maltose, saccha-
rose, tréhalose, glycérol, mannitol, inositol, acide glutarique,
tartrate de sodium, acide galacturonique.
- La recherche des sources d'azote utilisables par la souche M 78
pour son développement a été faite selon cette même méthode de
Pridham, en utilisant le citrate de sodium comme source de
carbone et en remplaçant NH4H2PO4 du milieu de base par divers
composés azotés. Dans ces conditions, les composés suivants sont
bien ou moyennement utilisés: NaNO3, NaNO2, NH4H2P04, DL aspara-
gine, succinimide, glycine, DL alanine, acide DL aspartique,
acide DL (+) glutamique, L (-) tyrosine, DL proline. Ne sont
pas utilisés: adénine, uracile, créatinine, D (+) glucosamine,
sarcosine, L (+) arginine, DL méthionine, bétaine.
En se rapportant à la clé d'identification du "Bergey's
~lanual of Determinative Bacteriology", 7e édition, The Williams
and Wilkins Company, Baltimore, 1957, le fait que les cellules
bactériennes étudiées ne contiennent pas de pigments photosynthé-
; tiques, qu'elles soient incapables de se développer sur un milieu
pour autotrophes, qu'elles se reproduisent par scissiparité, qu'elles
soient sphériques, isolées, en courtes chaînettes ou en amas irré-
guliers, et qu'elles ne possèdent pas de trichomes, permet de
classer la souche M 78 dans l'ordre des Eubacteriales (Buchanan,
1917).
`~
~122S2~;
D'autre part, la bactérie M 78 est sphérique, Gram-
positive, aérobie stricte, réduit les nitrates en nitrites, est
incapable de fermenter les glucides en anaérobiose et ne forme
pas de spores: ces caractères permettent de la ranger dans la
famille des Micrococcaceae (Pribram, 1929).
Cette famille est divisée en six genres répartis en deux
groupes selon le type respiratoire: cette distinction permet de
classer la bactérie M 78 dans le premier groupe qui comprend les
genres Micrococcus, Staphylococcus, Gaffkya et Sarcina. Ce groupe
est scindé en deux sous-groupes caractérisés par la façon dont
les cellules sont groupées. Les cellules bactériennes étudiées
ne se présentent pas systématiquement en tétrades ou en paquets
de huit cellules: cette propriété conduit à classer la souche M 78
soit dans le genre Micrococcus soit dans le genre Staphylococcus.
Un grand nombre de caractères, et en particulier le fait
que la souche M 78 soit incapable de fermenter le glucose en anaé-
robiose et qu'elle soit aérobie stricte, permet de la rattacher
au genre Micrococcus.
; .
Afin de donner plus de précision à la détermination du
genre, on a effectué, pour de nombreux tests, des comparaisons
avec Staphylococcus aureus 209 P, Neisseria catarrhalis A 152 (IP),
Streptococcus faecalis ATCC 8043, Streptococcus faecalis ATCC
9790, ce qui a permis d'éliminer ces différents genres à cellules
cocciformes, et dont certains appartiennent à d'autres familles que
les Micrococcaceae.
Parmi les 16 espèces décrites appartenant au genre
Micrococcus, celles dont pourrait se rapprocher le plus la souche
M 78 sont les suivantes: Micrococcus varians, Micrococcus caseoly-
ticus et Micrococcus colpogenes.
La souche M 78 diffère notamment de Micrococcus varians
par le non-formation d'acides à partir du glucose, du lactose,
--8--
~lZZSZ6
du saccharose, du glycérol, du mannitol et par la non-acidification
du lait.
Elle diffère de Micrococcus caseolyticus par l'absence
de liquéfaction de la gélatine, de peptonisation du lait, et de
production d'acides à partir du glucose, du lactose, du mannitol,
du glycérol.
La souche M 78 est également différente de Micrococcus
colpogenes par le fait essentiel qu'elle ne peut hydrolyser la
chitine, et qu'elle est de plus uréase-négative.
La souche étudiée présente en définitive avec les espèces
décrites du genre Micrococcus des différences qui permettent de
la considérer comme une espèce nouvelle.
Le procédé de préparation des cellules utilisées pour
la préparation du 41200 RP consiste à cultiver Micrococcus sedo-
genes, souche M 78, sur un milieu et dans des conditions appropriés,
puis à séparer les cellules qui se sont multipliées au cours de
la culture.
La culture de Micrococcus sedogenes, souche M 78 peut
être effectuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou
en profondeur, mais cette dernière est à préférer pour des raisons
de commodité. On utilise à cette fin les techniques d'ensemencement
et de fermentation et les différents types d'appareils qui sont
d'un usage courant dans l'industrie des fermentations.
Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement
des sources de carbone, d'azote, de phosphore et de soufre assi-
milables, des éléments minéraux et éven.uellement des facteurs de
croissance, tous ces éléments pouvant être apportés sous forme de
produits bien définis ou par des mélanges complexes tels qu'on en
rencontre dans les produits biologiques d'origines diverses.
Comme sources de carbone assimilable on peut utiliser
des hydrates de carbone tels que les dextrines, l'amidon ou d'autres
1~2ZS26
substances carbonées comme des alcools (éthanol) ou comme cer-
tains acides organiques: acides lactique, citrique. Certaines
huiles animales ou végétales comme l'huile de lard ou l'huile de
soja peuvent remplacer avantageusement ces différentes sources
carbonées ou leur être adjointes.
Les sources convenables d'azote assimilable sont extrê-
mement variées. Elles peuvent être des substances chimiques très
simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium, certains
acides aminés. Elles peuvent être aussi apportées par des sub- `
stances complexes contenant principalement l'azote sous forme pro-
tidique: caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats,
farines de soja, d'arachide, de poisson, extraits de viande,
de levure, résidus solubles de distillation de grain ~distillers'
solubles), liqueur de trempage de ma~s (corn-steep).
Le soufre et le phosphore sont généralement apportés en
quantité suffisante par les substances complexes mentionnées ci-
avant. Ils peuvent être également apportés sous forme de sulfates
et phosphates.
Parmi les éléments minéraux ajoutés certains peuvent
avoir un effet tampon ou neutralisant, comme les phosphates al-
calins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium ou de
magnésium. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au
développement de Micrococcus sedogenes, souche M 78, comme les
chlorures et sulfates des métaux alcalins et alcalino-terreux ou
les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganese.
Le pH du milieu de fermentation au départ de la culture
- doit être compris entre 6,0 et 7,~ et de préférence entre 6,5 et
7,5. La température optimale pour la fermentation est comprise
entre 25 et 30C, mais une production satisfaisante est obtenue
pour des températures comprises entre 20 et 35C.
L'aération de la fermentation peut varier entre des
--10--
': .
1~%2526
valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de
0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute convien-
nent particulièrement bien. Le rendement maximal est obtenu après
8 à 20 heures de culture, de préférence après 15 heures, ce temps
dépendant essentiellement du milieu utilisé.
Le pH du milieu de fermentation à la fin de la culture
est généralement compris entre 7,3 et 8,8 et il est préférable
qu'il soit compris entre 8,0 et 8,4.
Le microorganisme Micrococcus sedogenes, souche M 78,
est ensuite séparé du milieu de fermentation par filtration ou cen-
trifugation, avantageusement après avoir acidifié ce dernier jus-
qu'à un pH voisin de 3 par addition d'un acide minéraI tel que
l'acide chlorhydrique. Pour les traitements ultérieurs, on peut
soit utiliser les cellules brutes ainsi obtenues soit effectuer
une déshydratation par lyophilisation ou par lavage à l'alcool ou
à l'acétone, puis un séchage sous pression réduite pour obtenir
des cellules sèches purifiées.- Il peut être particulièrement
avantageux de soumettre les cellules obtenues à un chauffage à
une température comprise entre 120 et 130C pendant 30 à 60 minutes
avant leur utilisation ultérieure.
La nouvelle substance 41200 RP selon la présente inven-
tion présente des propriété biologiques remarquables et utiles.
Administrée par voie intra-veineuse, sous-cutanée, intra-
péritonéale ou intra-nasale à des souris, la substance selon l'in-
vention augmente de manière significative la résistance des souris
à l'infection par des doses normalement mortelles de souches viru-
lentes de bactéries telles que Listeria monocytogenes, Staphylococ-
cus aureus, Escherichia coli et de virus tels que le virus de
l'encéphalomyocardite, de l'hépatite murine, de-la grippe (virus
`30 - humains adaptés à la souris, type Ao et A2), de l'herpès et de
l'arbovirus Semliki-Forest. L'état de résistance accrue persiste
--11--
.: :
l~Z252~;
au moins 96 heures après le traitement.
Administré par voie parentérale à des souris, ce
produit stimule fortement le pouvoir phagocytaire du système
réticulo-endothélial et augmente, au niveau de la rate, le nombre
de lymphocytes producteurs d'anticorps. Il exerce un effet sti-
mulant sur les réactions d'hypersensibilité de type retardé et de
production d'anticorps vis-à-vis d'antigènes particulaires.
Chez la souris greffée avec des cellules tumorales (telles
que des cellules du sarcome 180), ce produit favorise le rejet
des tumeurs en provoquant une réaction nécrotique à leur~ niveau.
Dans certaines conditions, le produit selon l'invention
augmente le nombre et/ou l'activité cytolytique des lymphocytes
T de la rate vis-à-vis de cellules tumorales allogéniques.
Chez l'animal (souris), selon les systèmes expérimentaux
utilisés et les voies d'administration, les doses actives sont
généralement comprises entre 0,03 et 3 mg/kg et de préférence entre
0,3 et 1 mg/kg. Généralement un seul traitement suffit pour obtenir
l'effet recherché pendant une période d'au moins 48 heures.
Chez la souris, par voie intra-veineuse, la dose létale
50 % (DL50) du 41200 RP est voisine de`23 mg/kg.
Dans ce qui suit:
- les protéines sont exprimées d'après l'analyse des acides aminés
- le glucose est déterminé par la méthode à l'anthrone
- le phosphore est dosé par la méthode au molybdate après minérali-
sation
- la teneur en acides nucléiques est déterminée par l'absorbance
à 258 nm
- les sucres aminés sont dosés par la méthode de Elson-Morgan et
exprimés en glucosamine, soit par dosage à la ninhydrine ~près
hydrolyse et séparation à l'aide d'un autoanalyseur Biotronik
LC 6000 E.
-12-
1~2ZS26
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif,
montrent comment l'invention peut être mise en pratique.
Exemple 1 - (A) - Préparation des cellules
On charge dans un fermenteur de 170 litres:
- peptone ... 1200 g
- extrait de viande ......................... .600 g
- huile de soja ............................. 1200 cm3
- eau de ville, complément pour 110 litres
Le pH est ajusté à 6,90 par addition de soude 10 N, puis
on stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122C pendant 40
minutes. Après refroidissement, du fait de la condensation de la
vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de
120 litres; le pH du milieu est de 6,70. On ensemence avec 200 cm3
d'une culture en erlenmeyer agité de Micrococcus sedogenes, souche
M 78.
La culture est développée à 27C pendant 14 heures en
agitant et en aérant avec de l'air stérile; elle est alors con-
venable pour l'ensemencement de la culture productrice.
La culture productrice est effectuée dans un fermenteur
de 800 litres chargé avec les substances suivantes:
- acide L-lactique .... 4 kg
- huile de soja .... 2 litres
- sulfate d'ammonium .... 2,4 kg
- chlorure de sodium .... 2 kg
- phosphate monopotassique .... 0,4 kg
; - sulfate de magnésium, 7H2O .... 0,8 kg
- sulfate de cuivre, 5H2O .... 0,02 kg
: - sulfate de zinc, 7H2O .... 0,012 kg
- chlorure de cobalt, 6H2O .... 0,008 kg
30 . - eau de ville complément pour .... 370 litres
Le pH du milieu est ajusté à 7,10 par addition de 2950 cm3
-13-
~ : ., : : : . -
~Z2~26
de soude 10 N, puis on stérilise le bouillon par barbotage de vapeur
à 122C pendant 40 minutes. Après refroidissement, du fait de la
condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume
du bouillon est de 400 litres; son pH, égal à 4,20, est ajusté à
6,60 par addition de 2100 cm3 d'une solution aqueuse de soude 5 N.
On ensemence alors avec 40 litres de la culture inoculum
en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est
développée à 27C durant 16 heures en agitant avec une turbine
tournant à 205 tours/minute et en aérant avec un volume d'air sté-
rile de 15 m3/heure.
En fin d'opération le pH de la culture est de 8,20 et le
volume du bouillon de 440 litres.
Le moût ainsi obtenu est refroidi à + 4C et son pH est
ajusté à 3 par addition de 4 litres d'acide chlorhydrique 5N. Les
cellules sont isolées par centrifugation à 4000 tours/minute
(2900 g).
Les cellules sont reprises avec 80 litres d'éthanol à
-10C en agitant pendant 15 minutes, puis isolées par centrifugation
et séchées à 35C sous pression réduite (5 mm de mercure) pendant
15 heures.
On obtient ainsi 1500 g de cellules sèches~
(B) - Préparation du 32919 RP-
1 kg de cellules préparées comme décrit en (A) sont misesen suspension dans 40 litres d'eau distillée stérile, dans un
réacteur en acier inoxydable muni d'une double enveloppe thermostatée
par circulation d'eau et d'une agitation centrale énergique. Le
pH est ajusté à 7,0 par addition de soude 10 N.
On ajoute alors 2 g de lysozyme et on agite pendant 2
heures à 37C en réajustant périodiquement le pH à 7,0 par addition
de soude 5N.
Le mélange est alors centrifugé sur machine Sharples M16
-14-
112~52~;
(2 passages successifs à 17000 tours/minute avec un débit de 30
litres par heure). Le surnageant (37 litres) est ultrafiltré
(appareil UFP 20 équipé d'une membrane acrylique IRIS 3042) en
recyclant le rétentat et en ajoutant 3 fois 40 litres d'eau déminé-
ralisée, refroidie à +-4C.
On recueille ainsi 7 litres de rétentat concentré et
débarrassé de ses petites molécules (PM inférieur à 25000 daltons
environ). Son pH est réajusté à 7 par une solution de soude 5N,
puis la solution obtenue est lyophilisée.
On obtient ainsi 147 g de produit brut.
31 g de ce produit sont dissous dans 1550 cm3 d'eau démi-
néralisée à une température voisine de 20C en agitant pendant
30 minutes; on ajoute alors, en 5 minutes et en agitant constam-
ment, 31 cm3 d'une solution aqueuse à 668 g/l de chlorure de
calcium dihydraté; on maintient l'agitation pendant 30 minutes. -
Le précipité formé est éliminé par centrifugation sur machine
Sharples de laboratoire à 40000 tours/minute avec un débit de 5
litres par heure. Le surnageant est dialysé sur membrane cellulo-
sique pendant 3 jours à + 4C contre 3 fois 40 litres d'eau démi-
néralisée.
Le rétentat est alors traité dans un ballon par 310 cm3 ~ -
de résine polystyrène sulfonique DOWEX 50 X2 en cycle sodium, en
agitant pendant 1 heure; la résine est filtrée et lavée sur filtre
par 310 cm3 d'eau.
Les eaux de lavage sont jointes au filtrat et l~ensemble -
est lyophilisé.
On obtient ainsi 17 g de 32919 RP sous forme salifiée
dont les caractéristiques sont les suivantes:
- aspect: poudre blanche
- comPosition: eau (Fischer) % = 15,7
sur sec: - protéines % (somme des acides aminés) = 24,6
-15-
. .
- 112Z526
- polysaccharides % = 3,9
- acides nucléiques % = 28,9 d'après le spectre
UV
- analyse élémentaire: C % = 46,30 H ~ = 5,84 0 % (par diffé-
rence) = 30,71
N % = 10,04 P % = 3,11 S % inférieur à 0,5
Na% = 3,70 Ca % = 0,30
(C) - Purification du 32919 RP -
25 g de substance 32919 RP obtenue dans les conditions
de l'exemple (B) sont dissous dans 1 litre d'eau déminéralisée
contenue dans un réacteur de 2 litres muni d'une agitation et d'un
dispositif de régulation de température; on ajoute 1 litre de
mélange phénol-eau (109 cm3 d'eau pour 1 kg de phénol). Le mélange
est chauffé à 65C, sous agitation énergique. L'agitation est
poursuivie pendant 30 minutes à cette même température. Après re-
froidissement rapide du réacteur au moyen d'un bain de glace, à
une température voisine de 25C, on sépare les phases par centrifu-
gation à 3300 g pendant 30 minutes sur machine de laboratoire
réfrigérée (JOUAN type K 63 F de capacité 4 litres).
On obtient ainsi 450 cm3 de phase aqueuse.
La phase phénolique et l'interphase sont à nouveau ex-
traites par 1 litre d'eau déminéralisée pendant 30 minutes à 65C;
après refroidissement et centrifugation comme indiqué ci-dessus,
on obtient à nouveau 1470 cm3 de phase aqueuse.
Les phases aqueuses sont réunies. Le phénol es~ éliminé
par deux lavages successifs au moyen de 2 litres de chloroforme à
chaque fois. Les phases aqueuses sont ensuite clarifiées par cen-
trifugation pendant 30 minutes à 3300 g. On obtient ainsi 1800 cm3
de phase aqueuse.
Cette phase aqueuse clarifiée est alors dialysée pendant
trois jours à + 4C contre 3 fois 40 litres d'eau déminéralisée.
-16-
. - ~
~lZZSZ6
Le rétentat est lyophilisé, on obtient ainsi 14,5 g d'une poudre
amorphe blanche.
On dissout 8 g de cette poudre dans 400 cm3 d'un tampon
acétate de sodium 0,1 M à pH 7 stérile (on dissout 136,09 g d'acé-
tate de sodium pour analyse dans 0,9 litre d'eau déminéralisée,
puis ajuste le pH à 7,0 par additiond'acide acétique (d = 1,049) et
complète à 1 litre; la stérilisation est effectuée par chauffage
pendant 45 minutes à 122C; cette solution est diluée au 1/10 avec
de l'eau déminéralisée stérile juste au moment de l'emploi).
La solution obtenue est versée sur une colonne de
SEPHAROSE CL 4B(R) ~diamètre: 13,5 cm, hauteur: 65 cm) installée
en chambre froide (+ 4C) et montée en tampon acétate de sodium
0,1 M à pH 7,0 stérile. L'élution est effectuée avec le même tampon
au débit de 1,33 litre/heure en enregistrant en continu l'absor-
bance à 230 nm sous 0,1 cm de l'éluat.
On recueille d'abord une fraction de 3,13 litres qui est
éliminée. La fraction suivante (1,22 litre), qui correspond à un
pic d'absorbance à 230 nm, est introduite dans un tube de cellulose
régénérée NOJAX(R) et est dialysée à + 4C pendant trois jours
contre 3 fois 40 litres d'eau déminéralisée puis le rétentat
(1300 cm3) est lyophilisé. Le solide obtenu est repris dans 93 cm3
d'eau déminéralisée et la solution est dialysée, avec la même
membrane que ci-dessus, pendant 48 heures à + 4C contre 2 fois 20
litres d'eau déminéralisée. Le rétentat est lyophilisé.
On obtient ainsi 1,3 g de substance 41200 RP doht les
caractéristiques sont les suivantes:
- aspect: poudre amorphe blanche
- spectre U.V.: Ce spectre est représenté par la figure 1
- spectre infra-rouge: (déterminé à partir de comprimés en mélange
avec KBr).
Ce spectre est représenté par la figure 2 sur laquelle on a porté,
-17-
~ . . ..
1~225Z6 -"
en abscisses, d'une part les longueurs d'ondes exprimées en microns
(échelle supérieure) et d'autre part les nombres d'ondes en cm 1
(échelle inférieure) et en ordonnées le pourcentage de transmission.
Dans le tableau suivant sont indiquées les principales
bandes d'absorption infra-rouge de la substance 41200 RP exprimées
en nombre d'ondes (cm 1):
3420 cm 1 tF (dont H2O) 1440 cm 1 ép.900 cm 1 f
3280 cm 1 ép. 1405 cm 1 ép.875 cm 1 f
3090 cm 1 ép. 1375 cm 1 F800 cm 1 m
2970 cm 1 ép. 1335 cm~l ép.775 cm 1 f
~ 2950 cm 1 ép. 1310 cm 1 m -1
2920 cm 1 F 1230 cm 1 m630 cm 1 ép.
2845 cm 1 m 1210 cm 1 ép.560 cm 1 F (dont
H20)
2680 cm 1 ép. 1160 cm 1 F520 cm 1 ép.
2100 cm 1 tf 1115 cm 1 F480 cm 1 ép.
1730 cm 1 ép. 1060 cm 1 tF450 cm 1 ép.
1645 cm 1 tF 1025 cm 1 ép.400 cm 1 ép.
1545 cm 1 F 945 cm 1 m365 cm 1 ép.
1460 cm 1 ép.
tF = très forte f = faible
F = forte tf = très faible
m = moyenne ép.= épaulement
- composition: eau (Fischer) %: 3,8
sur sec: acides aminés %: 12,3 (dont 7 % d'alanine)
glucose % : 11,95
acides nucléiques % : inférieur à 1,3 (d'après le
spectre UV)
~ sucres aminés % : 16,3
- analyse élémentaire
C % = 45,58 H % = 7,47 ~ % = 4,85 O ~ = 37
-18-
A
ll~Z526
P % = 1,17 Cl % = 0,25 Na % = 2,36 Ca % = 1,33
S % inférieur à 0,5
- electrophorèse
Dans un gel à 1 % d'agarose avec tampon barbital à pH
8,6 et sous une tension de 6 V/cm, le 41200 RP migre vers l'anode
à la vitesse de 11 mm par heure environ. (Le produit est mis en
évidence par le réactif de Schiff après oxydation périodique ou
par le noir Soudan B).
Exemple 2 -
On opère comme dans l'exemple l(A). Après 16 heures de
culture, le moût est refroidi à 4C et son pH est ajustè à 3 par ad-
dition d'acide chlorhydrique. Les cellules sont isolées par cen-
trifugation à 4000 tours/minute. Le gâteau cellulaire acide est
alors chauffé en autoclave pendant 45 minutes à 122C. Après
refroidissement, les cellules sont lavées par l'éthanol puis
séchées.
En opérant ensuite comme dans l'exemple 1 (B) et l(C~, et
; en utilisant les mêmes quantités, on obteint 0,55 g de substance
41200 RP soùs forme d'une poudre amorphe blanche dont les caracté-
ristiques sont les suivantçs:
- comPosition: eau (Fischer) %: 6
sur sec: acides aminés %: 17,7 (dont alanine ~ 7,2)
glucose %: 10,5
acides nucléiques %: inférieur à 3
sucres aminés %: 15,2
- analyse élémentaire:
C % = 46,90 H % = 7,32 N % = 5,38 O % = 35
P % = 1,08 Cl % = 0,18 Na ~ = 2,26 Ca% = 1,83
S % inférieur à 0,5.
Le spectre infra-rouge de ce produit est identique à
celui de la substance 41200 RP obtenue à l'exemple 1.
--19--
11~2526
L~ présente invention concerne également les médicaments
- constitués par le produit selon la présente invention et les com-
positions pharmaceutiques qui le contiennent en association avec
un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceuti-
quement acceptables et éventuellement avec ou moins un autre
produit thérapeutiquement actif tel qu'un antibiotique.
De préférence, ces compositions sont utilisées par voie
parentérale ou intra-nasale.
Les compositions selon l'invention pour administration
parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des
suspensions ou des émulsions. Comme véhicule dans ces derniers cas,
on peut employer le propylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des
huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et des esters
organiques injectables par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compo-
sitions peuvent contenir également des adjuvants, en particulier des
agents mouillants, émulsifiants et dispersants. La stérilisation
peut se faire de plusieurs façons, par exemple en incorporant à
la composition des agents stérilisants. Elles peuvent également
être préparées sous forme de compositions solides rendues stériles
par irradiation (rayons ~), qui peuvent être dissoutes dans de
l'eau stérile ou dispersées dans tout autre milieu stérile injec-
table, éventuellement au moment de l'emploi.
Les compositions pour administration intra-nasale
peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou
des émulsions qui peuvent éventuellement être associées-à un agent
propulseur compatible.
Les compositions selon l'invention sont particulièrement
utiles en thérapeutique humaine ou vétérinaire pour le traitement
immunologique (immunothérapie) des cancers éventuellement en asso-
ciation avec une chimiothérapie anticancéreuse appropriée ou aucours de rémissions induites par cette dernière.
-20-
1~225Z6
Les compositions peuvent être également utilisées pour
augmenter la résistance aux infections virales, bactériennes,
fongiques ou parasitaires, stimuler les défenses naturelles de
l'organisme agissant spécifiquement sur ces infections, renforcer,
par administration intra-nasale, les barrières naturelles contre
les infections respiratoires ou exercer un pouvoir adjuvant sur
l'immunisation spécifique lors de l'administration concomitante
d'un vaccin bactérien, viral ou parasitaire.
Ces compositions permettent aussi de restaurer les réponses
immunologiques adéquates chez des sujets présentant des états
d'immunodéficiences congénitaux ou consécutifs à la sénescence
ou à des traitements immuno-suppresseurs.
En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet
recherché et de la durée du traitement: elles sont généralement
comprises entre 0,1 et 10 mg par jour pour un adulte par voie
parentérale.
L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre
une composition selon l'invention.
EXEMPLE -
On prépare une solution contenant 5 g de la substance
41200 RP sous forme salifiée, préalablement stérilisée par irra-
diation au moyen des rayons ~, dans 100 cm3 de soluté injectable
stérile. Cette solution est répartie aseptiquement en ampoules de
5 cm3 à raison de 2 cm3 par ampoule. Ces ampoules sont scellées.
Elles contiennent chacune 100 mg de principe actif.
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., : .
