`' ~l L'~
La présente invention a trait à un procéde dl:inclu-
sion de micro-organismes du groupe des mycorhizes e-t des acti-
norhizes dans une matrice consti~uee par un gel de polymere,
notamment ~ des fins ag~onomiques.
On a dejà propose depuis longtemps de fixer des
micro-organismes sur un support comme par exemple dans l'US
1 909 622 depose en 1923 selon lequel on apporte des bacteries
fixant l'azote, du genre Rhizobium.
Mais en general la culture de micro-organismes est
adsorbee sur un support comme dans le brevet belge 521 850 qui
preconise l'utilisation de terre de diakomees et de silice
colloidale pour des Rhizobium. On a aussi fait appel à de la r
bentonite comme dans le GB l 777 077, à des granules de plâtre
(dans le FR 1 490 0~6), voire à de la lignite.
Mais ce mode par adsorbtion presente des inconve-
nients notamment en ce qui concerne la survie du micro-organisme
et sa protection lors du transport, du stockage et de la mani-
pulation.
On comprend que cette voie n'a abouti qu'à des resul-
tats très limites, et que l'on ait cherche à ameliorer les
techniques de fixation. C'est ainsi que dans le brevet fran~ais
1 180 000 dans le cas de la fabricaiton des preparations riches
en b~cteries du groupe des Azotobacter on a fait appel a un
moût auquel on ajoute des substances a action adsorbante comme
la cellulose, la farine d'os, le kaolin, du gel de silice.
Mais là encore la solution n'est pas satisfaisante. On a donc
cherche à ameliorer à la fois la survie des micro-organismes,
par exemple par inclusion, et la manière de les amener dans le
milieu aux plantes.
C'est ainsi que dans le FR 77 102S4 du 5 Avril 1977 F
(correspondant à l'US 4 155 737) on a propose un procede qui
fait appel à un inocuIum constitue par un gel de polymère dans
" 1 ~
, ~ .- : :- -
: .
lequel est inclus le micro-organisme, cet inoculum étant
apporte dans la rhizosphère des plantes.
Selon ce brevet, le gel de polymere peut être consti-
tue par un gel de polyacrylamide ou un gel de silice.
Mais l'on sait que le support doit retenir suffi-
sa~nent le micro-organisme pour le conserver, le protéger, le
présenter sous une forme manipuIable, tout en permettant son
essaimage dans le milieu, et eventuellement en autorisant une
aptitude au greffage d'additifs.
Par ailleurs ce support doit assurer la viabilite du
micro-organisme mëme après des periodes de temps égales à plu
sieurs semaines et ce dans des conditions d'hygrometrie varia-
ble. Ceci veut dire que ce support doit etre a meme soit de
contenir une reserve d'eau suffisante et la libérer à bon
escient, soit de se procurer l'eau necessaire a partir du mi-
lieu. Enfin le support ne doit pas etre gênant pour le milieu,
c'est-à-dire qu'il doit etre soit biodegradable, soit non~ ~;
polluant. -
Cette rapide enumeration qui ne pretend pas être
exhaustive permet de comprendre pourquoi cette voie n'a pas ~
connu le developpement que l'on etait en droit d'esperer. -`
Or, dans le brevet français N 2.453.215 publie le 30 octobre
19~0, la Demanderesse a revendique une solution particuliare-
ment attrayante qui consiste a inclure le micro-organisme dans
un polymere du groupe des polysaccharides et a provoquer une
reticulation au moins partielle du polymère par exemple par voie
thermique, ou par un sel metallique ou par synergie grâce à un
autre polymère.
Cette solution donne des resultats etonnants, et pre~
sente en outre l'avantage de montrer une synergie remarquable
lorsque l'on fait appel en plus a un compose absorbant et
adsorbant tel qu'une silice. -~
,~
- , ,, , . ; . .:
', . ., ' ' . .: ~ ' , . :
~'7~
La Demanderesse a e~Eectué ses premiers travaux en
- particulier sur Rhizo~ium japonicum, bactérie non sporulée
fixatrice d'azote, tres sensible notamment ~ la dessiccation,
la temperature et aux facteurs physico-chimiques.
Mais certains micro-organismes presentent des diffi-
cultes supplementaires en raison de leur nature filamenteuse
comme par exemple les champignons ectomycorhiziens (exemple:
_solithus, Hebeloma, Tuber, Boletus ...) qui entre autres ne
presentent aucune ~orme de résistance lorsqu'ils sont cultivée
en culture pure.
Les associations mycorhiziennes sont le résultat de
l'association d'un champignon et d'une racine qui realise une
symbiose vraie. Selon la nature de l'association, on distin-
gue:
- les mycorhizes ectotrophes, se rencontrant surtout
chez les arbres forestiers (Pinacees, Fagacees), et
dont la plupart sont des champignons superieurs
(Ascomycètes et sasidiomycètes);
- les mycorhizes endotrophes, qui sont le plus souvent
I des champignons inférieurs (Phycomycètes), beaucoup
plus répandues que les precedentes aussi bien chez
les arbres et les arbustes que les plantes herbacees,
dans le cas des mycorhizes à arbuscules e-t à vesi-
cules, et limitees aux Ericacées, dans le cas de
mycorhizes à pe1otons.
L'action bénéfique de ces champignons mycorhiziens
sur la croissance des plantes peut être attribuée à une protec- `
tion phytosanitaire contre les pathogènes du sol, à la produc- ~ ~
tion de substances de croissance ou de vitamines, à l'améliora- `
tion de la nutrition minérale de la plante, en particulier du
phosphore par augmentation de la possibilite d'exploration du
sol, amélioration de l'absorption en eau en condition de
~1'7~
deficit hydrique.
Par ailleurs, dans le cas des non légumineuses fixa-
trices d'azote, des associations s~mbiotiques de m~me type que
celles existant entre Rhizobium et :Légumineuses se caractérisant
par la formation de nodosites sur le système racinaire, se
rencontrent aussi bien chez des arbres que chez des arbustes ou
des plantes herbacees. Le role de ces nodules n'est connu que
pour certaines plantes ligneuses, colonisant en general les
sols pauvres ou degrades ~sables, moraines), où il a été mis en
évidence une ~ixation réelle d'azote atmosphérique. 137 espèces
- d'Angiospermes appartenant a 12 genres différents, classés dans
7 familles (BétuIacéesr Casuarinacées, Coriariacees, Eleagna-
cees, Myricacees, Rhamnacees, Rosacees) ont ete reconnues (Bond
1974). L'endophyte responsable de la formation de ces nodosites
fixatrices d'azote est un Actinomycete (Frankia) qui n'a ete
isole en culture pure que depuis 1978 par LALONDE et al. (Uni-
: versite de LAVAL, QUEBEC).
L'interet de l'utilisation de ces essences forestiares :
fixatrices d'azote en sylviculture, en particulier dans les sols
marginaux, pauvres en azote, sans structure ou a structure
modiEiee ne fait aucun doute; on peut citer pour mémoire, les
exemples suivants:
- reforestation de tourbi~re en FRA (Aulne, Myrcia), -
de moraines glacieres dans les Alpes (Aulne), de
rejets de mines ou de carrieres de schistes bitumi-
neux aux U.S.A.; ~ : -
- fixation de dunes maritimes et continentales au
Sénegal (Casuarina);
- amenagement de la Baie-James au Canada;
- associations Alnus r~bra - D~uglas dans les systemes
forestiers N.O. Americains;
- utilisation d'~lnus glutinosa, A. c~rdata, _ incana,
,.
-- 4 --
~'7~8
A crispa comme plantes d'appoint (nurse-tree)
pour favoriser le developpement d'especes non
fixatrices;
- utilisation de _anothus, Myrica, Hipophaea, Elea- ~_
gnus en association avec des espèces non fixatri-
ces ou comme productrices d'engrais vert ou de
biomasse.
L'inoculation est pratiquee traditionnellement au
stade pép1niare par apport de nodules broyés avec l'inconvé- ~;
nient majeur de possibilite d'introduction de germes patho-
gènes, et de l'impossibilité de les conserver même à basse
temperature par suite d'une oxydation rapide des tanins et des
substances phenoli~ues tcomposes toxiques pour le micro-orga-
nisme). Il n'a pas ete possible jusqu'alors de demontrer de
fa~on ~ormelle la possibilite d'augmenter la prod~ctivite de
ces espèces par inoculation de l'endophyte developpe en cultu-
re pure. De même dans le cas des ectomycorhizes l'inoculation
; se pratique traditionnellement par un sol provenant d'une autre
;~ pepinière et plus couramment actuellement par des cultures
~ pures de champignons mycorhiziens sur vermiculite; l'inocula-
tion pratiquée de cette façon présente trois inconvenients:
. difficulte de developper le champignon (Pisolithus
ou Hebeloma):
au moins 6 semaines (GRAHAN-LINDERMAN 1980
Can. J. Microb. 26, II) avec obtention d'une
culture hétérogène et peu dense en milieu~
::
~liquide;
- au moins 8 ~ lO semaines sur vermiculite. ~ -~
Dans le cas d'une culture liquide, il est necessaire i~
de recuperer le mycelium et de le~broyer avant utilisation,~
avec les risques que comporte un cisaillement trop poussé
~aucune repousse en particulier pour Tub r) puisque le micro- -
: ' , ':'~
- 5 -
~'7~
organisme ne présente q~e des hyphes et aucune ~orme de
resistance.
. quantlte irnportante cl'inoculum à mettre en oeuvre,
l/m dans le cas de micro-organisme developpe
sur vermiculite, cl'o~ dificulte de stockage;
. necessite d'inoculer avec des inoculums fralchement
prepares ou stockes a 4C.
Ces problemes ont amene la demanderesse a poursuivre
ses recherches. Un objet de l'invention est de proposer un
inoculum pouvant etre stocké à temperature ambiante et facile
a utiliser.
Un autre objet est d'ameliorer la culture des mycorhi~
zes et des actinorhizes en particulier au niveau de l'homogenei- ~-
té et de la réduction de la durée de culture (ectomycorhizes).
La présente invention a trait a un procede de prépara-
tion d'un produit sec contenant des microorganismes inclus dans
une matrice d'un gel de polym8re comprenant l~s étapes suivan- -
tes: - la formation d'un gel de polymere en combinant au moins ~,
un polymere du groupe des polysaccharides avec une composition
contenant un microorganisme du groupe des mycorhizes et des
actinorhizes et - la réticulation au moins partielle dudit
polymère, ladite réticulation renfermant lesdits microorganis- ~`
mes dans la matrice dudit gel de polymère; - et le sechage -
. ~ ,.
dudit gel de polymère. ~
~.
Selon la presente invention on entend par traitement ~ ;
de reticulation au moins partiel un traitement susceptible de
modifier la structure du polysaccharide tel que traitement
thermique, traitement par un sel metallique ou de synergie -~
au moyen d'un autre pol~mère et de preference avec un autre
polysaccharide.
Avantageusement le polymere est a base d'un hetero-
polysaccharide à haut poids moleculaire obtenu par
'.,i '
-- 6 --
~, ` ~,; ' ~ ' '
~ i
~796:~8
fermentation d'un hydrate de carbone par un micro-organisme
du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou des champignons
appartenant au genre Sclerotium.
~ ~ ~ . - , , - . .... . .. ... ...... . .
On peut égalemen-t faire appel à des polymeres issus
de go~nmes naturelles ou biosynthetiques, de provenances diver-
ses: algues (alginates~ carraghenanes, agar), exsudats de
plantes (gommes karaya, adragante, arabique), de graines
(guar, caroube).
La farine de graines de caroube (locust bean gum)
est un extrait du fruit du caroubier (Cera-tonia siliqua L.)
arbre de la famille des Caesalpiniaceae (aire géographique:
bassin méditerranéen). La farine de graines de caroube est
contenue dans l'endosperme de la c~raine. L'endosperme est sé-
paré de l'embryon par abrasion mécanique ou par procede chimi-
que.
La farine de graines de caroube est un polysaccharide
(galactomannane) constitué d'unités ~.D. mannopyranosyl (liai-
sons 1-4), une sur ~ ou 5 étant substituée en C6 par ~ D.
galactopyranosyl.
. La combinaison de la gomme Xanthane et de la farine
de graines de caroube par effet synergique accrolt la viscosité
du gel. On pense que la gomme Xanthane est formee de chalnes
~ helicoidales et que l'lnteraction avec le galactomannane en-
traine la formation de liaisons entre les chaînes et permet
d'obtenir un gel à reseau tridimensionnelO
Les alginates sont des extraits raffines d'algues
brunes de la classe des Phaeophycées.
L'acide alginique est un polymere lineaire de haut
poids moleculaire formé d'une succession de molécules d'acide
~.D. mannopyranosyluronique et d'acide ~.L. gulopyranosyluro-
nique. L'addition d'ions calcium permet la liaison de deux
groupements carboxyl formant un pont entre les chalnes paral-
leles, surtout dans les regions constituees d'acide guluroni-
que. On obtient ainsi instantanement a 25 C un gel d'une plus
grande viscosite. A l'oppose, l'addition d'ions phosphate
. ~
':
:: : .~ ' ,,
1~ 8
permet un retard de la prise en masse, qui peut ~tre intéres-
sant pour une manipulation de la preparation avant la gelifi-
cation complete.
Comme indique dans le brevet ~rançais N 2.~53.215
publie le 30 octobre 1980, la concentration en micro-organismes dans la
pre~aration peut etre augmentee par filtration ou centrifuyation
prealable du milieu de culture, remise en suspension du il-
trat ou du culot sous faible volume et introduction dans la
solution de polysacchari.de.
Le (ou les) micro-organisme(s) peut être apporté se-
lon des modes operatoires difEerents qui se caracterisent par
le fait que l'on prepare tout d'abord un milieu de culture ¦~
que l'on ensemence avec le mi.cro-organisme et que l'on apporte :.
ensuite ce milieu de culture ou la suspension du micro-organis-
me obtenue par filtration centrifugation dans la solution de
polysaccharide et que l'on forme le gel par refroidissement. j~
Pratiquement, selon un premier mode de mise en oeu-
vre, on forme tout d'abord une solution de polysaccharide a
chaud que l'on ramène a une temp~rature de l'ordre de 40 a :~ ~
45C, et a laquelle on ajoute le milieu de culture renfermant :
le micro-organisme, ou la suspension du micro-organisme, on
refroidit ensuite de manière a former le gel.
Selon une autre forme de mise en oeuvre, on apporte
separement le milieu de culture ou la suspension microbienne a
chaque solution de polysaccharide dans les mêmes conditlons de
temperature, on melange et on refroidit pour former le gel.
On peut aussi, comme dit precedemment, faire appel à
un sel metallique, tel que de fer ou d'aluminium, complexe ou .
non par un polyol. :~
De plus on peut aussi dissoudre le polysaccharide
dans le milieu de culture, notamment ~ temperature ambiante et
former la reticulation in situ. - `
- 8 - ~
:
7~
Comme dit precédemment le micro-organisme selon
l'invention peut etre constiute par une actinorhize telle que
l'actinomycète endophyte de non légumineuse ou une mycorhize,
ectomycorhize ou endom~corhize.
Les inoculums peuvent se presenter sous diverses
formes: gel, poudre, billes, ou même fibres.
Dans le cas de l'actimomycète celui-ci peut être ap-
porte sous forme de culture liquide ou sous ~orme de nodules
broyés.
De manière avantageuse on procède a un sechaye du
gel. Comme dit précedemment, il y a lieu de ne pas detruire
le micro~organisme, et l'on sait que celui-ci est generalement
très thermosensible.
Un séchage tel quel est long et conduit à un film
sec facilement friable, et qui peut etre broye sans difficulte~
De manière preferentielle on additionne le gel d'une
substance absorbante a grande capacite d'absorption d'eau, de
manière à obtenir une teneur en eau residuelle dans la melange
gel ~ absorbant comprise entre 70 et 250 g/100 g d'absorbant
et avantageusement entre 100 et 150 g pour 100 g.
L'adsorbant est constitue par une matière poreuse ~ ~
telle que silice naturelle ou synthetique, silico-aluminates, ~ -
:
cellulose. Le pH est voisin d~ 7 et les temperatures de se-
~cha~e suffisamment basses pour ne pas detruire le micro-orga-
nisme, de l'ordre de 20 a 30C.
La mise en forme peut être realisee de diverses façon.
Selon le premier mode de mise en oeuvre le gel est
seché, puis broye finement, additionné d'une substance telle
que la silice pUiS homogeneise. La poudre ainsi obtenue peut
alors être mise sous forme de pastilles.
Selon une autre forme de mise en oeuvre, on introduit
le gel humide et la substance telle que la silice dans un
g _
. .
t~
melanyeur ou malaxeur, puis après malaxage, soit on e-tale e-t
sèche directement le melange, jusqu'à ce que la perte en eau
50it comprise entre 0 et 50% de son poids, mais de préférence
entre 30 et 40~, on obtien-t une poudre dont la teneur en eau
residuelle est comprise entre 100 et 150 CJ pour 100g d'absor-
bant, soit on introduit le melanye dans une extrudeuse et on
sèche les granules obtenus à temperature ambiante jusqu'à ega-
lement une perte en eau comprise entre 30 et 40%.
Dans le cas où le micro-organisme est constitué par
une mycorhize, avantageusement celle-ci est apportee sous
forme d'une culture mycelienne homogène. L'inoculum peut se
presenter sous forme de billes, fils ou fibres humides.
On peut selon une première forme de realisation
transformer le volume de culture liqui.de en un volume sensible- ;
ment identique du volume liquide, de manière à obtenir avanta-
- geusement des billes humides. Selon une deuxième forme de
realisation le gel obtenu après inclusion de la culture ou de
la suspension du micro-organisme est additionné d'une substance
absorbante, de façon a obtenir une poudre facilement manipula-
ble. Avantageusement l'absorbant est constitue par une silice
dont le pourcentàge en poids par rapport au gel est de 10 à
120~ et de preference 30 à 50%.
Dans les deux cas de mise en oeuvre, ce procede pre-
sente l'avantage considerahle de ne faire subir au mycelium
aucun traitement mecanique tel que cisaillement ou broyage.
De plus ce procede permet le stockage, en conditions non ste-
riles sans contamination, des inoculums à temperature ambiante.
~ais la presente invention sera plus aisement compri-
se à l'aide des exemples suivants donnes a titre indicatif,
mais nullement limitatifs.
.
EXEMPLE 1: Actinomycète endophyte de non legumineuse
:
-- 10 --
, ,,. ,'1,
9't~
1. Souche - Isolement - Culture conservation
_ . .
. Symbiose etudiee: Alnus ylutinosa - Frankia
. Souches: Frankla ARbNN4b e-t AgNlay (Collection
LALONDE Faculte de Foresterie et de Geodésie,
Université de LAVAL-QUEBEC)
. Isolement de E'rankia à partir du nodule ~technique
LALONDE et al. Proc. Woxkshop 2.5/4-1979- ;
Corvallis-Oregon).
- On sterilise superficiellement une ex-tremite de
nodule coralloIde (~l22 30~ durant 5 mn; puls NaC10 5% durant
30 mn);
- On rince à l'eau sterile
- On place le nodule dans une salière contenant une
solution à 1~, stérilisee par filtration de polyvinylpyrrili-
done PVP + tampon phosphate (PBS tg/l) = NaC1 0,8 Na2HPO4,
7H2O 1,14 - KH2PO4 0,2));
- On sectionne la partie inferieure du nodule et
transfère l'extremlte dans une autre salière contenant du PBS
~20 ~ (quelques gouttes);
- On écrase le nodulel prelève l'interieur et ense-
mence un tube a essai contenant du milieu Q mod* ~QUISPE~ 1960
.
modifie LALONDE 1979);
*Q mod (g/l): K2HPO4 0,3 - NaH2PO4 0,2 - MgSO4 7H20 0,2 - KCl
0,2 Yeast Extract ¦BBL) 0,5 - Bacto-peptone
(DIFCO) 5 - glucose 10 - citrate ~errique ~ac.
Citrique ~ citra*e ferrique solution 1%) 1 ml
oligo-elements 1 ml - H2O qsp 1000 ml pH 6,8 -
7,0 - CaCO3 0,1 - lecithine 5 mg - sterilisation
20 mn a 120C.
- On incube deux semaines à 27C.
, .
~1~7~
. Culture
Après incubation, on fragmente le mycelium avec une
seringue et on rein~cule 6 tubes; on procède de la meme façon
toutes les 2 semaines afin de multiplier act.ivement l'Actino~
mycete (avant chaque repiquage, on lave la culture au PBS), on
prelève la colonie dans le fond du tube avec une pipette et on
transfère dans un milieu Q Mod.
. Conservation - Germination des spores
On favorise la germination des spores d'une culture
stockee plusieurs mois en plongeant la colonie dans une solu-
tion: alanine 45 mg ~ leucine 60 mg + PBS 50 ml durant 30 mn
et en la replasant dans le milieu Q mod après l'avoir fragmen~
tee.
2. CULTURE DES PLANTES (ALNUS GLUTINOSA~
. Pre~ermination des graines
Cette operation comporte quatre phases:
~`
: - selection des graines
; ~ Les`gralnes sont placees dans un becher contenant de
l'hexane (d = 0,66). On recupère et on seche sur papier ~
tre celles qui tombent au fond, les graines surnageant sont
eliminees;
~ ' `.
- levee de dormance
Les graines sont mises dans de l'eau et placées du-
rant 4 jours à +4C;
3~ .
- Stérilisation ;
Dans NaCl~ à 5% durant 5 mn, suivie d'un lavage a
.~:
- 12 -
l'eau distillée sterilisee;
~ .
- Pregermination r
Les graines sont placées sur un milieu gélosé, sur
bolte de Pétri, renfermant 1% de gélose, et 1,5~ de saccharose;
les boites de Pétri sont disposées ~ l'envers dans une enceinte
saturee en eau et sont maintenues à une température de 28C à
l'obscurité durant 6 jours.
. Repi~uaye des plantules
Les plantules non contaminées sont repiquées dans
des POUC~ES>~ ou en tubes à essai de ~ 22.
. Repiquage en ~<POUCHES
On dispose dans un sac en polyéthylène (10 x 20 cm)
du papier filtre présentant une gouttière à sa partie supé-
- rieure; on introduit 8 ml de solution de CRONE (modifié
LALONDE - 1972 - J. Can. Botanic 5, 25-97), sans azote, diluée
au l/2 dans le sachet, de fa~on à humecter le filtre en tota-
2:0 lite; on perce des trous dans la gouttière et on dispose les
plantules, radicelles en ace de l'ori~ice et de façon à ce
que les cotyledons dépassent de la gouttière; les sachets sont
mis en pièce régulée (éclairement 15000 lux, photo-période 14 j
heures, température comprise entre 19 et 23C). I
:
- RepIqua~e sur vermiculite ~ -
Des tubes de 0 22 mm sont remplis de 40 ml de vermi-
culite lavée ~ l'eau; on additionne 20 ml de solution de CRONE
diluée au 1/2 puis on stérilise l'ensemble 20 mn à 120C; les
plantules sont repiquées et incubees comme precedemment;
'
3. PREPARATION DES. INOCULUMS
13
3.1 Inoclllurns avec culture de Frankia incluse
Les colonies de Frankia provenant de 10 cultures en
tubes a essai.s développees durant 15 jours sont prelevees,
remises en suspension dans 55 ml de PBS et fraymentées; les
inoculums sont prepares avec cette suspension concentree, ren-
fermant hyphes, spores et sporanges, de la façon suivante:
. Inoculum à base d'al~i ate AlG)
Les concentrations sont donnees pour la preparation
de 45 g de gel.
- on dissout 0,45 g d'alginate dans 36 ml de suspen-
sion;
- on ajou-te 9 ml de solution de CaSO4, 2H2O à 6 g/l
sous agitation. Le gel obtenu est alors soit seché a l'air
~usqu'a deshydratation soit additionne de 40% de son poids en
silice et melange. jusqu'a obtention d'une poudre humide homo-
gène;
cette poudre est ensuite sechee à temperature ambiante jusqu'à
ce que l'inoculum ne contienne plus que 125 g d'eau par 100 g
de silice.
. Inoculum à base de gomme xanthane + farlne de
graines de caroube (XG)
I :
Les concentrations sont donnees pour la preparation
de 45 g de gel.
- on dissout 225 mg de gomme xanthane dans 15 ml
d'eau distillee a environ 70C;
- on procède de la meme façon en remplacant la gomme
xanthane par 225 mg de farine de graines de caroube;
- lorsque les deux solutions sont a environ ~5C, on
ajoute a chacune, sous agitaiton, 7~5 ml de suspension;
- on verse alors le melange suspension ~ graines de
; ~ :
-- 14 --
~1'7~
caroube dans le mélanye suspension + yomme xanthane;
- on refroidit et on obtient un yel.
Ce gel est soit séche à l'air jusqu'à déshydratation
soit additionné comme pour le gel AlG de 40% de son poids en
silice; le melange est seche à température ambiante jusqu'à ce
que la teneur en eau residuelle soit de 125 g par 100 g de
silice.
3.2 Inoculums avec ~ s inclus
100 ml de nodules d'Alnus glutinosa fraichement pre-
leves sont lavés puis broyés à l'aide d'un mixer de ~acon ~
obtenir environ 300 ml d'une suspension homogène qui servira à
préparer les gels à base d'alginate ou de gomme xan-thane avec
nodules broyés inclus.
,
Les gels sont seches à l'air puis reduits sous forme
de poudre.
- Inoculums à base d'alginate (AlG)
Pour la preparation de 200 g de gel:
. on dissout 2 g d'alginate dans 160 ml de suspension
. on ajoute 40 ml de CaSO4, 2H2O à 6 g/l, on obtient
un gel.
Une partie de ce g21 est sechee jusqu'~ deshydrata-
tlon totaIe, à temperature ambiante t une autre partie est
additionnée de 40~ de son poids de la même silice puis sechée
jusqu'à ce que la teneur en eau résiduelle soit de 125 g par
100 g de silice.
'
- Inoculum à base de gomme xanthane + farine de
~raines de caroube
Pour la preparation de 360 g de gel:
- 15 -
.:
~L'7~
. on dissout l,8 g de gomrne xanthane dans 120 ml
d'eau à 70C, durant 20 minu-tes, sous agitation, puis on rame
ne la température à environ 45C;
. on procède de la même fa~on en rempla~ant la yomme
xanthane par 1,8 g de farine de graines de caroube2
. lorsque les deux solutions sont à environ 45C, on
ajoute à chacune 60 ml de suspens:Lon de nodules broyés;
. on reroidit et on ob1:ien-t un gel dont une partie
est désh~dratee et l'autre partie additlonnec de sil;ice comm~
pour le gel d'alginate.
4. RESULTATS
..... _ , I
4a. _Essai_en_~POUCHES
La survie du microorganisme après inclusion, séchage
et stockage à température ambiante (20 - 25C), a été contro-
lée sur des plantules dlAl~us glutinosa selon la technique des
POUCHES decrite précedemment; les plantules disposées dans
les sachets sont développées durant l0 jours en conditions
contrôlées puis elles sont inoculées par depose, sous llextré-
; 20 mité de la racine principale, de l'inoculum à étudier; si
l'inoculation est eficace et si le microorganisme est vivant,
on voit apparaltre l0 a 20 jours apr~s l'inoculation des ren-
flements puis de petits nodules sur la racine à l'emplacement
de la dépose. Les résultats obtenus avec des inoculums à base
de gel AlG ou XG + silice stockes l0 à 20 jours à température
ambiante figurent dans le tableau ci-après.
`~
.:
..
, .-
: ;
- 16 -
Influence_du type d'inoculum sur la nodulation
d'Alnus glutinosa
. . _ . _ ~ . . . _
: Inoculum :Conservation: Quantité :nb. plantes
: :(~ours) (4) :inoculum/plante:nodulées/nb. :
: : : :total plantes:
:Non inoculé : - : 0 : 0/18
t~
:Suspension : :
:nodules broyes : 0 : 0,25 ml : 5/6
: (1) : : : : r
:nodules broyés :
:inclus dans XG :
:sec (2) . :20 : environ 5 my : 4/4
:ARbNN4b
:culture liquide: 0 : 0,25 ml : 1/5
:(3)
:inclus dans XG :
:~ silice (5) : 70 : 5 mg : 6/9
:
:inclus dans AlG: : : :
:~ silice : 70 :5 mg : 6/9
,, _ . _~
:AgNlag : : : : ;
:culture liquide: 0 : 0,25 ml : 6/6
:(3) : : : :
:inclus dans XG :
:+ silice (5) : 20 : 5 mg : 5/6
:
(l) 150 mg nodules frais/5 mlH2O
- (2) sechage à l'air H = 12%
20 (3) culture ayant servi a l'inclusion.
(4) Conservation de l'inoculum a temperature ambiante (20 a
25C).
(5) Silice precitée - surface BET = 200 m2/g - CTAB = 80 m2/g.
On constate que la nodulation est d'environ 100%
dans le cas des inoculums préparés à partir de microorganismes
inclus + silice bien que la quantité de culture apportee dans
5 mg soit 50 ~ 100 fois inferieure a celle apportée dans 0,25
ml d'inoculum liquide.
4.b. Essais sur vermiculite
L'injectivité et l'efficience du microorganisme r
(souche ARbNN4b) après inclusion et stockage à température am-
biante (20 ~ 25 C) ont été contrôlées sur Alnus glutinosa
- 17 ~
. . .~ .. ~ ,
developpë en tubes A essais renfermant ve:rmiculite -~ milieu
nutritif sans azote (solution de CRONE); les resul-tats obtenus
figurent dans le tableau suivant: r
Influence du ty~e d'inoculum sur la nodulation et la
.... ~
croissance d'Alnus ~lutinosa (âge des plantules 50 jours)
- . _ ; ,:
:
:Inoculum :Conservation:Nb.nodules:Poids en :Hauteur:Aspect
: (1) : (jours) (2):/6 plantes:mg partie:moyenne: des :
: : : :aerienne : des :plantes :
: : : :ver-te/6 :plantes:
: : : :plantes
: non : : 0 : 182 : 3i~~ chlorose:
: inocule : - : 0 : 195 : 42 :chlorose:
.
~ liquUide ' g ~ 331 50 vert
: Inclus : : : ~- -
:dans XG -~
: silice : 15 . 30 . 468 . 56 vert
: Inclus : : : ~ : :
silice 30 36 , 515 . 59 . vert
: _ : : _ ~ I
: Inclus
.+ silice 30 . 32 , 444 . 62 ' vert
,: : : : : : :
__
(1) Culture ayant servi à l'inclusion.
(2) Conservation de l'inoculum a temperature ambiante (20
25C).
Ces resultats presentent une originalite certaine
dans ce domaine, puisque, pour la premlere fois, on a reussi A ~.
preparer des inoculums avec inclusion de l'endophyte (cul-ture
pure de Frankia ou suspension de nodules broyes) ayant les I -
avantages suivants: -
- inoculums sous forme de poudre facile à manipuler
- mise en oeuvre possible sous de très faibles
volumes
- conservation de l'infectivite des microorganismes
inclus au cours du s-tockage a temperature ambiante
,
- 18 ~
- aucun probleme de contamination par agents exté-
rieurs.
Le procédé d'inclusion de nodules broyés de Casuari-
na, dans un gel d'alginate séché ~ l'air, a notamment été
utilise pour l'inoculation de 600 000 pieds de Casuarina au
Sénégal dans le cadre d'un projet de fixation de dunes mariti-
mes et continentales.
EXEMPLE 2: Mycorhizes
.
1.1: Souche utilisée
- Pisolithus tinctor us (Marx)
,
1.2: Culture du microorganisme en milieu li~uide
.
L'entretien et la culture du champignon sont prati-
qués en regle générale sur milieu MARX modifié MELIN-NORKRANS
(~N)(l) ~
la duree de fermentation dans ces conditions est de 6 à 8 : -
semaines.
(1) MMN (g/l): CaC12 0,05 - NaCl 0,025 - K2HPO4 0,5 - (NH4)2
HPO4 0,25 - MgSO~,7H2O 0,15 - Citrate Ferrique
1 ml (1% citrate Fe) - thiamine 100 ~m - I
extrait de malt 3,0 saccharose 10,0 - H2O qsp .:
1000 ml pH = 5,5 -:
Une des sequences de culture qu'on a adoptee pour
Pisolithus est donnee ci-après:
-- 19 --
~'7~3ti1~
SOUCHE D ' ORIGINE
~1,
Repiquage sur milieu gélosé MARX
Culture inoculum I Stockage à + 4C
en erlen 300
(milieu PEG )
!
.~
. Culture inoculum II
en erlen 300
(milieu PEG)
~ /
Culture productrice en
fermenteur de 2 litres
(m.ilieu PEG)
- Entretien de la souche: Sur milieu gélosé MARX
. (boite de Pétri ou tubes
inclinés).
' ~
- Culture inoculum I
: . . " ':
. recipient: erlen de 300 ml bouché au coton polyu-
réthane rempli avec 70 ml de milieu de culture;
. milieu de culture PEG (g/l): peptone 10 - yeast ~.
extract 5 - glucose 10 - gélose 1, pH = environ 7, sterilisa- :
tion 25 mn a 120C, pH après stérilisation d'environ 6,6;
. ensemencement a partir d'une culture sur gelose
(fragments de gelose ~ mycélium);
. conditions: incubation 10 ~ 15 jours sur table
d'agitation tournant a 100-140 t/mnj excentration du plateau
: 25 mm, temperature 28C.
~ ..
- 20 -
~ ! .
,' ~ ''' " ' ' " ' ` .
~.~t~
, - Culture inoculum II
.
Les conditions de cu~ture sont les mêmes,que prece- ~
demment mais,l'ensemencemen-t se fait à partir d'une cul-ture I
à raison de 5 à 10% la durée d'incubation est réduite a une
semaine. .
- Culture productrice en fermenteur de 21 (Bi.ola-
itte)
. rempIissage: 1000 ml.
. milleu: PEG décrit ci-dessus
. ensemencement: 1 à 10%
. conditions: agitation par une turbine tournant a
250-300 t/mn aération 20 l/heure, température 25
à 30C. I
' ' ., .
RESULTATS
' ~:
Après 8 à 13 jours de culture en fermenteur de 2
litres, on obtient une culture homogène et dense, ce qui évite
~: un broyage ulterieur du mycélium avant preparation de l'ino- ,
, culum; la quantite de,biomasse Ipoids sec a 105C) obtenue par
litre de milieu est voisine de 2,5 g/l.
1.3 Préparation d'inoculums avec microorganismes
inclus ;,
' ; '
Les champignons ectomycorhiziens ne présentant au-
cune forme de resistance lorsqu'ils sont cultives en culture
pure, il est necessaire de conserver lors de la preparation de
l'inoculum une certaine teneur en eau residuelle de façon à
,~
21 -
.
assurer la survie du mycelium; ce type d'inoculum a ete reali-
se soit par adjonction de silices au gel, apres inclusion du
champignon dans un gel à base de polysaccharides, soit en
melangeant la suspension mycelienne avec de l'alginate et en
laissant tomber goutte à goutte ce melange dans une solution
concentree de CaCl2 selon le principe decrit par HACKEL 1977
applique à l'immobilisation de Rhizobiu_ (brevet FR 79.28956 -
1979). r
- Inoculums sous for_e de poudre
La culture developpée en fermenteur de 2 litres est r
filtree ou centrifugee, lavee puis mise en suspension dans
l'eau physi.ologi~ue; cette suspension est utilisee pour prepa-
rer des gels a base d'alginate ou de gomme xanthane selon les
procedes decrits anterieurement pour Frankia. ~
Ces gels sont ensuite additionnes de silice synthe- , ;
tique ou naturelle mala~es puis seches jus~u'a ce que la teneur
en eau residuelle soit comprise entre 70 et 250%, de façon à 5~.
obtenir des poudres humides ou partiell'ement deshydratees qui
sont conservees en flacons bouches. , :
- Inoculums sous forme de billes d'alginate
On dissout dans la suspension mycelienne l à 2 g/l
d'alginate puis on laisse tomber goutte a goutte le melange
dans une solution concentree de CaCl2 a 170 g/l; on recupere , ,~
rapidement les billes formees qui sont ensuite lavees a l'eau
du robinet et conservees en flacons bouches.
~ '
La survie du champignon ~Pisolithus tinctorius), en
.
`' - 22 -
.
particulier dans le cas des billes d'alginate, est supérieure
à 6 mois, a température ambiante; le test utilisé pour appre
cier la survie repose sur le principe de la datermination r
colorimetrique de l'activite respirometrique par reduction du
Nitro Blue Tetrazolium en formazan, compose colore en bleu.
Le contrôle de l'inEectivite et de l'efficience de ces inocu-
lums est effectue sur Pinus caribaea ou Pinus pinaster après
remise en solution des billes à l'aide d'un decomplexant tel r
~ue phosphates, citrate, 1actate.
Ces essais illustren-t les progrès spectaculaires
realisés dans la préparation d'inoculums avec ectomycorhizes:
- par amélioration des conditions de culture en mi-
lieu liquide d'un champiynon mycorhizien utilise
couramment: production de biomasse homogene e-t re-
duction de 4 à 6 semaines de la duree de fermenta-
tion;
- par la preparation d'inoculums faciles à mettre en
oeuvre et permettant la survie du microorganisme
durant plusieurs mois.
~es exemples precedents ne sont pas limitatifs de la
presente invention, en particulier, on na sortirait pas du
cadre de ladite invention en appliquant le procede de prepara-
tion d'inoculums avec E'rankia et ectomycorhizes à l'inclusion
d'endomycorhizes à pelotons developpées en culture pure et à
l'inclusion de broyats de racines mycorhizees par des andomy- -
corhizes à vesicules et à arbuscules, des inoculums prepares
par inclusion de racines infectees puis broyees (m~celium -~
spores) dans des gels XG ou AlG additionnes de silice conser-
30 vent leur infectivite: presence du champignon endomycorhizien
à vésicules et arbuscules sur les racines de la plante test
inoculae par ce procede.
.;
- 23 -
. : : , . .
