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122~653
.
La présente lnvention, réalis~e en collaboration
avec le CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTI~IQUE,
le CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION SANGUINE repxésent~
par le CENTRE HOSPITALIER REGIONAL DE TOURS, et le
STUDIENGESELLSCHAFT XOHLE mbH, concerne un procédé
d'encapsulation dans les ~rythrocytes humains ou
animaux d'au moins une substance présentant une
activité bioIogique, un dispositif utile pour la
mise en oeuvre de ce procedé et les érythrocytes
obtenus.
Préalablement à l'exposé de la presente ~-
invention, il peut etre interessant de rappeler
certaines notions en la matiere.
Le sang est un melange complexe constitué
d'un liquide, le plasma, dans lequel sont en
suspension des globules rouges (erythrocytes)
transportant l'oxygene, des globules blancs
(leucocytes) et les plaquettes. Le plasma contient
en solution des sels, des proteines et des metabolites
solubles qui s'echangent dans les differents tissus.
Dans le cadre de la presente invention,
seuls les érythrocytes nous int~ressent.
De façon simplifiée, on peut considerer que
les ~rythrocytes sont constitues d'une membrane qui
entoure un cytoplasme rempli essentiellement ~ -
d'h~moglobine. ~ ~
:
2 1z2~653
Le rBle de l'h~moglobine est de se combiner
l'oxyg~ne mol~culaire pendant le passage des ~rythrocytes
travers les poum~ns et de transporter cet oxya~ne
tous les tissus du corps pour qu'il y solt utills~.
Comme pour toutes les cellulcs, les ~rythrocytes
peuvent être lysés dans certaines conditions, en particulier
de pression osmotique, mais c'est en ~952 que Teorrel a
introduit la notion de rescellement de la membrane
~rythrocytaire, c'est-~-dire de la reconstitution
~0 de la membrane ~rythrocytaire apr~s une lyse des
~rythrocytes.
Dans la mesure où il devenait ainsi possible
d'ouvrir et de refermer les érvthrocytes, il devait donc
être possible d'y introduire certains composants exog~nes.
Outre la technique de base qui consiste ~ mettre les
érythrocytes dans une solution contenue dans un récipient
dont on fait successivement chanqer la pression osmotique
afin d'effectuer la lyse puis le rescellement, il faut
citer certains procédés mettant en oeuvre une lyse en
milieu iso-osmotique en appliquant aux érythrocytes un
choc ~lectrique ou thermique. Dans certains cas il a
également été utilisé des virus ou des prot~ines virales
afin de réaliser cette encapsulation.
Il a également ~té r~alisé des encapsulations
par dialyse dans un sac de cellophane. Tous les proc~d~s
utilisés précédemment ont en commun de présenter des
rendements d'encapsulation faibles, d'etre excessivement
aléatoires quant à leur reproductibilité, et de ne
permettre de traiter que des quantités faibles de
suspensionsérythr~cytaires.
... .
"
:
: : .
' ' ' 3 lZ21653
Ainsi, bien que l~on ait rappor.te l'encapsu-
lation de certaines enzymes, du facteur IX, de la
desferrioxamine, des acides organiques, du glucose,
du saccharose, du fragment A de l'anti-toxine
diphtérique et du'methothrexate, ces procedes sont
restes au stade du'laboratoire et n'ont pas permis
jusqu'~ present leur utilisation chez l'homme.
SeuIe une publication récente de Green R. et al.
(The Lancet (1980?, 16~aout, 327-330) decrit l'encap-
sulation de Desferal ~ (commercialise par CIBA-GEIGY) et
l'utilisation des erythrocytes obtenus chez l'homme.
Cette encapsuIation ayant ete realisee parsimple
dilution en milieu'hypo-osmotique montre toutefois
des rendements très faibles d'incorporation du
Desferal dans les erythrocytes.
C'est pourquoi la presente invention a pour
but la mise au point d'un procede et d'un dispositif
perm.ettant de realiser l'encapsulation dans les - :
erythrocytes de substances presentant une activite
20. biologique avec un rendement d'encapsulation très
~ eleve et permettant de traiter des grandes quantites
de suspensions d'erythrocytes tout en assurant le
maintien de bonnes conditions de sterili*e qui
permettent d'utiliser les.erythrocytes ainsi obtenus
chez l'homme ou l'animal. '
Bien que la presente invention ait ete
developpee pour l'encapsuIation d'un grand nombre de
composes'.a activite biologique, 'l'une des classes de
composes à activite biologique paralt plus particuli~re- .
ment interessante, il s'agit des effecteurs allosteriques
de .l'hemoglobine.
' ~7'
'': : ' ' .
4 ~Z21653
.
!
L'h~mogloh~ne forme avec l'oxyg~ne au niveau
des poumons un produit d'addition r~éverslhle :
l'oxyh~moglobine.
Ce prodult d'addition se d~compose au niveau
du sy~t~me ca~illaire pour lib~rer l'oxyg~ne car la
pression partielle de l'oxyg~ne dans le système
capillaire est plus faible (de l'ordre de 70 mm de Hg)
gue dans les poumons (de l'ordre de l~o mm de Hg).
Dans les conditions normales, seule une partie,
environ 25 ~, de l'hémoglobine se dissocie, le reste
retourne aux poumons par le système veineux.
In vitro, il a été possible de montrer le rôle
de certaines substances comme l'inositol hexaphosphate (IHP),
l'inositol pentaphosphate (IPP), le pyridoxal phosphate,
par exemple, qui sont susceptibles de se combiner avec
l'hémoglobine au niveau du site de fixation du
2,3-diphosphoglycérate.
Ces produits dénommés "effecteurs allostérigues
de l'hem~lobine" (EAH) modifient la conformation
allostérique ae l'hémoglobine, ce qui a pour effet de
diminuer l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxyg~ne.
La diminution ~e l'affinit~ de l'hémoglobine
pour l'oxygène rend plus facile la libération de
l'oxygène à partir de l'oxyhémoglobine, même pour des
pressions partielles d'oxygène relativement élevées.
Dans ces conditions, sans que le contenu global
en oxygène du sang soit notablement modifié, il est
possible d'envisager d'accroître le pouvoir oxvphorique
du sang vis ~ vis des tissus en utilisant des globules
rouges comportant une hémoglobine modifiée.
Ce type de traitement de l'hémoglobine permet
une meilleure oxyaénation du tissu par amélioration de
la lib~ration de l'oxya~ne.
~ ,
~- :
1221653
.
On con~oit que les applications de ces effecteur6
allost~rlques de l'h~moglob~ne puissent ~tre nombreuses,
par exemple dans le traitemcnt de certaines affectionS
telles que les insuffisances respiratoires, les troubles
circulatoires, ou bien ~our améliorer ou accélérer
certains processus th~rapeutiques, par exemple dans la
pr~vention ae l'infarctus ~u myocarde lié ~ certaines
isch~mies, ou pour modifier la physiologie respiratoire
~ de ~randes altitudes ou profondeurs.
Le problème essentiel est, bien entendu, d'amener
les effecteurs in situ afin gu'ils puissent se fixer
sur l'hémoalobine intracellulaire.
Les tentatives de transformation de l'h~moglobine
en solution par les effecteurs allost~riques de
l'h~moglobine ont pu être réalis~es in vitro, mais les
applications pratiques ne sont pas encore susceptibles
d'une utilisation th~rapeutique du fait de la durée
de vie insuffisante de l'h~moglobine en solution et des
propriétés réduites qu'elle a alors aans le transport
de l'oxygène.
Le brevet des Etats-~nis d'Amérique n~ 4 192 869
et le brevet européen n~ O 001 104 décrivent des
proc~dés destinés à transformer les globules rouaes par
interaction desdits globules avec des liposomes
chargés en effecteurs allost~riques de l'hémoglobine, . :~:
en particulier chargés en ~HP.
Le proc~dé et le dispositif selon la pr~sente
invention permettent, en utilisant comme compos~ à
activité biologique un effecteur allostérique de
l'h~moglobine, la transformation de l'hémoglobine dans
des conditions qui autorisent son utilisation au niveau
th~rapeutique. .
. ~
, :, , ~ . ~ . ,
6 ~ Z1653
Pour ce falre, la présente inventlo~ propose
un proc~d~ d'encapsulation dans les érythrocytes
humAins ou animaux d'au moins une su~stance pr~sentant
une actlvit~ biologlque, caract~ris~ en ce qu'on
alimente en continu le compartiment primaire d'au
moins un ~l~ment de dialyse avec une suspension aqueuse
~ d'~rythrocytes~ dont le compartiment secondaire
contient une solution aqueuse hypotonique par rapport
~ la suspension d'erythrocytes afin de lyser les
erythrocytes, et en ce que le lysat d'érythrocytes
est alors en contact avec ladite substance pr~ésentant
une activité biologique, et en ce que,afin de
resceller la membrane des érythrocytes, on augmente
la pression osmotique et/ou oncotique du lysat érythro-
cytaire apres sa mise en contact avec laditesubstance à activité biologique, et en ce que l'on
recueille la suspension d'erythrocytes rescell~s.
Dans le cadre ae la pr~sente description,
~ on entendra par "element de dialyse" de façon generale
un ~l~ment comportant deux compartiments sépar~s par
une paroi de dialyse a travers laquelle peut se faire
un ~change ionique qui permet de modifier de façon
contrôl~e la pression osmotique d'une solution aqueuse
situ~e dans l'un des compartiments en introduisant
dans l'autre compartiment une solution aqueuse a ~ un sel.
Ce type d'~lément de dialyse est largement utilis~ tant
dans le domaine medical pour la mise en oeuvre
d'h~modialyse en flux continu, par exemple de dialyse
p~ritonéale ou d'~change plasmatique avec separation
des cellules et du plasma, que dans le domaine
industriel dans des operations de purification, par
exemple dans l'industrie pharmaceutique et alimentaire.
~. . - . . ::: - . : . :
:. . : .
~ : ~ . -: .. :. . . .
- 7
'lZ;2~.653
;
I1 dolt ~tre blen entendu gue 1' lnventlon ne
portc pas sur la structure d'ur~ tel ~1~ment de d1a1y~e
qu~ peut être que1conque et ~tre constltue, par exemple,
par des membranes ou des fibre~ creuses avec aes
S cheminements gue1ccn9ues a travers plusieurs chambres
de dialyse, 1 'aspect essentiel du proc~dé ~tant que
1 'on puisse mrJdifier la tonicit~ de la solution aqueuse
intrc>duite dans le compartiment primaire grace à
1 ' ad jonction dans le compart~ment secondaire d ' une
solution aqueuse hypotonique par rapport ~ la
suspenslon d ' érythrocytes, ceci bien entendu afin de
lyser les ~rythrocytes.
Le lysat d'érythrocytes doit etre en contact
avec la substance presentant une activite bic~1~9ique
ql~e 1 ' on souhaite encapsuler, mais il est possible
d'introduire cette substance soit avant, soit penaant
la lyse, soit même eventuellement apres la lyse,
toutefois, dans ce dernier cas les renaements d ' encap-
sulation sont moins bons.
En iait, dans la m;se en oeuvre du procédé pour
I 'encapsulation érythrocytaire de substances à activité biolo-
gique, deux situations peuvent se présenter:
a) ILa taille de la substance à encapsuler est supé-
rieure à la taille des pores de la membrane qui sépare compar-
timents primaire et secondaire du dialyseur. Ce sera le cas
d'une substance macromoléculaire. Dans ces condit;ons, iI n'y
aura aucune perle de cette substance au cours de la dialyse
conduisant à la phase d' introduction de la substance dans les
hématies, le rendement final correspondra à la phase d'équi-
I i bre ob tenu après l a I y se des héma t i es .
b) La substance à encapsuler a une taille réduite
(inférieure à 10 OOO daltons), elle dialysera donc dans le com-
part;ment secondaire du dispositif au cours de la phase de Iyse.
Ce qui conduira à une diminution du rendement d'encapsulation
de la substance dans les hématies. Pour réduire cette perte
de substanre qui peut être très préjudiciable dans le cas de
lZZ~653
~ .
-
composés coûteux ou rares, il est possible de modifier le pro-
cédé de la facon qui suit:
~n effet, les hématies sont initialement lavées dans
un milieu contenant des solutés don~ la pression osmotique est
d'environ ~20 à 300 mos. La Iyse de ces hématies ne se produit
normalement qu'en dessous de 200 mos. C'est au cours de la
phase d'abaissement de la pression osmotique jusqu'à 200 mos
que se produit la perte principale de la substance à encapsuler,
si elle a été introduite préalablement au début de I 'opération de
dialyse. Pour obtenir une réduction de cette perte par diffusion,
il suffit donc de réaliser l'introduction de la substance dans
le milieu au moment où commence la Iyse des hématies, c'est-à-
dire lorsque la tonicité de la suspension a été amenée entre
180 et Z20 mos.
Dans cette variante, avant d'introduire la suspension
d'érythrocytes dans le premier élément de dialyse, on abaisse
la pression osmotique de la suspension jusqu'à 180-220 mos et
c'est seulement -lorsque la pression osmotique atteint cette valeur
que I 'on injecte dans la suspension la substance à encapsuler.
La suspension ainsi obtenue est alors soumise aux différentes
étapes décrites précédemment.
L'abaissement de la tonicité à 180-220 mos est réalisé
de préférence en utilisant un élément de dialyse supplémentaire
placé en amont des éléments déjà décrits. Dans cet élément de
dialyse, on fait - circuler la suspension érythrocytaire dans I 'un
des compartiments et une solution hypotonique dans I 'autre, ceci
a pour effet d'abaisser la tonicité de la suspension
d 'érythrccytes.
Dans ce mode de réalisation, la substance à encapsuler
est introduite dans I 'effluent de I 'élément de dialyse supplémen-
taire et ensuite la suspension ainsi traitée est introduite dans
I 'élément de dialyse dont les caractéristiques sont choisies de
telle sorte que la Iyse soit optimale à la sortie de cet élément.
Il existe plusieurs possibilités afin d'augmenter la
pression osmotique du Iysat d'érythrocytes lorsque I 'on désire
rescel I er I a membrane des éry t hrocy tes .
_~ .
~. 1 ", " ~ ~' "~ ," '" ~ "'~
lZ2~653
Dans un premier mode de réalisation, on augmente la
pression osmo~ique du Iysat d'érythrocytes en le faisant
passer dans le circuit primaire d~un élément de dialyse dont
le circuit secondaire contient une solution hypertonique par
rapport au Iysat, la solution après rescellement étant recueillie
en continu.
Dans un second mode de réalisation, on augmente la
pression osmotique du Iysat en le mélangeant avec une solution
hypertonique et/ou hyper-oncotique par rapport audit Iysat.
Dans ce qui précède, il convient de remarquer que
le produit traité est une suspenion aqueuse d'érythrocytes,
c'est-à-dire que dans la plupart des cas on préférera tra-
vailler sur une suspension "synthétique" d'érytnrocytes et non
sur le sang total, c'est-à-dire une sus?ension ne comportant
principalement comme composant d'origine sanguine que les
éry throcy tes .
C'est pourquoi, outre les phases de dialyse-
rescellement, le procédé peut faire intervenir d'une maniere
prépondérante des phases de: ~
- lavages et préparation des hématies, avant Iyse et rescel le- ~ ~'
men t,
- lavages et éventuel lement remise en suspension plasmatique
ou de composition artificielle des hématies transformées.
De nombreux procédés et variantes actuel lement connus
peuvent être ajoutés aux dispositifs permettant I 'encapsulation
de substance dans les globuies rouges selon le procédé. I l
s'agit essentiellement des méthodes de:
centrifugation pour la séparation cel lules-plasma et ?our les
I avages,
- séparation à l'aide de séparateurs de cellules en flux
con t i n u ou sem i -con t i n u,
- utilisation de dispositifs en flux continu et semi-continu pour
la séparation des cellules sur membranes semi-perméables selon
1221653
les méthodes actuel les de plasmaphor~se sur membrane ou sur
f i bres creuses,
- lavages selon les mêmes procédés.
En o~tre, il est bien connu en transfusion sanguine,
S qu'il est parfois souhaitable d~éliminer les globules blancs ou
les plaquettes avant transfusion pour des raisons soit immuno-
logiques soit liées à la formation de microaggrégats.
Les mêmes situations peuvent se rencontrer pour
l'utilisation de globules rouges Iysés et fescellés ayant encap-
sulé une substance d' intérêt biologique. i I peut donc être
envisagé l'introduction dans le procédé d'un dispositi~ de
déleucocytation tel qu'un filtre à absorption conventionnel. Les
autres procédés class;ques de déleucocytation peuvent évidem-
ment être adaptés au dispositif.
L'utilisation d'une suspension ~synth~tique"
d'~rythrocytes permet de controler avec pr~cision la
pression osmotique de ladite suspension aqueuse et
donc assure une bonne reproductibilite des resultats
obtenus.
Lorsque.l'on prepare cette s~spension agueuse
d'~rythrocytes, il est possible d'eifectuer divers
types de "conditionnement" de la suspension.
On peut tout d'abord placer les ~rythrocytes
~ dans un milieu iso-osmotique par rapport au sang,
c'est-~-dire dans les conditions naturelles de pression
osmotlque, dans ces conditions la lyse sera ef~ectu~e
en pr~sence d'une solution aqueuse hypoton;que par
rapport ~ la suspenslon d'erythrocytes. -
Mais il est ~galement possible de conditionner
les ~rythrocytes dans une solution aqueuse contenant des
substances diffusibles ~ travers la membrane, dans ces conditions
ces ~rythrocytes vont avoir tendance a gonfler et
~'' ' ~ ~' ''' ' ' , ~ ' ,
~ ~ , '
- " 12Z~6S3
ll sera poss~ble d'e~fectuer la lyse en utilisant un
milleu is~-osmotlque ou m~me, dans certains cas,
hyper-osmotlque lces pressions étant évalu~es par
rapp~rt ~ la pressi~n osmotique normale dans le sang).
Il peut être ~galement int~ressant lorsque
l'on prepare la suspension synthetique d'érythrocytes
destinee ~ etre traitee d'ajouter à cette suspension
des composés macromoleculaires, en particulier des
collo~des, de façon 3 creer dans cette solution une
pression oncotique, cette pression oncotique aura
pour effet lors de la lyse de limiter la perte des
macromolécules intracytoplasmiques et en particulier
la perte de l'hémoglobine.
Il est ~ien entendu possible d'envisager,
au stade de la lyse ou du rescellement, d'utiliser
non seulement des modifications de la pressio~
osmoti~ue de la solutio~, mais egalement des modifi-
cations de la pression oncotique afin d'améliorer
la lyse ou le rescellement.
L'un des avantages considerable du procéde
selon la présente invention, outre les possibilités
de controler la sterilite et la presence de pyrogènes
ce qui permet l'utilisation des produits obtenus chez
l'homme, est que ce procédé se pr~te particulièrement
bien ~ un asservissement par contrOle des parametres
tels que tcmps, volume, temperature, déblt, surface
d'échange, conductivit~, force ~onique, notamment.
Les diff~rents paramètres de mlse en oeuvre
du procéaé peuvent varier suivant la nature des
~l~ments traltés mais la lyse sera e~fectuee, de
préférence, ~ une temp~rature comprise entre 0 et 10~C
et le rescellement ~ une temp~rature comprise entre
20 et 40~C.
1 2 ~2Z1653
-
L'analyse du phénomène de resceilement des héma-
ties permet de considérer comme possible I ' intervention de con-
ditions dif~érenles de celles qui ont été décritesci-dessus:
- introduction de la substance à encapsuler à 2-4~C dans la
suspension d'hématies Iysées et non avant l'entrée dans le cir-
cuit de dialyse;
- étapes à des temperatures différentes, par palliers succes-
sifs, conduisant généralement à un passage de la température
de 2 à 6~C au départ à ~5 - 42~C entre la Iyse et le rescel le-
men t
- introduction de solut;ons ou substances de rescel lement à
différents points des palliers précedents;
- compositions variables des solutions ou tampons de rescelle-
men t .
Enfin, I 'encapsulation de substances très actives à
des concentrations faibles qui possèdent un caractère protéique
ou facilement adsorbables sur les surfaces plastiques utilisées
dans le procédé conduit à envisager dans certains cas un pré-
traitement du circuit de dialyse. Ces phénomènes d'absorption
sont bien connus et peuvent conduire, compte tenu des grandes
surfaces utilisées, à la perte dans le procédé d'une quantité
très importante de la substance à encapsuler. Ceci pourralt
être par exemple le cas de substances comme les cytokines ou
les enzymes. Diverses méthodes peuvent être util;sées paur modi-
fier les surfaces des circuits de transformation, comme par
exemple l'utilisation préalable d'un recouvrement par une
protéine comme I 'albumine.
Ces précautions méthodologiques ne sont pas directe-
ment liées au procéde mais peuvent jouer un rôle majeur dans
son utilisation.
.,., ,.~ ,,.,. . j.
. .. ;. - : . . ::: , .:: , ,
:~: : :: : . : . :. . : : :
~221653
13
. :
.
Comme cela a éte ind~qué pr~c~demment, il a
~t~ constat~ que bien que le proc~de selon la presente
invention soit un procedé en continu, on obtenait
des rendements tr~s supérieurs aux rendements observés
par la technique dite en "sac de dialyse". En outre,
les volumes de sang traites peuvent etre tr~s
imp~rtants, le traitement s'effectuant avec une
grande rapidité.
Les différences observées entre ces résultats
peuvent s'expliquer en partie car les deux proc~dés sur
le plan fondamental sont tr~s diff~rents. En effet,
l'un des procédés est une méthode cin~tique alors que
l'autre est une méthode d'équilibre. Dans ces conditions, ;~
le raccourcissement considérable de la dur~e durant
laquelle les hématies sont maintenues lysées limite les
~changes p~ysicochimiques membrane-milieu s'accompagnant
d'une perte de constituants de la membrane érythrocytaire,
ce qui réduit fortement la proportion d'hématies
pour lesquelles la lyse est devenue irréversible.
Bien entendu, outre les avantages liés à la
rapidit~ de traitement qui peut ~tre obtenue par la mise
en oeuvre du procédé, il faut mentionner le fait qu'il
est p~ssible, pour la phase de dialyse, de traiter des
volumes importants, par exemple ~1 est possible de
tralter 20~ ml de culot globulalre lav~ en 10 mlnutes
au lieu de 10 ~ 20 ml en 2 heures et demie par la
méthode en sac ae dialyse.
Le procédé selon la pr~sente invention peut
être mis en oeuvre pour encapsuler un grand nombre de
substance prksentant une activité biologique. Il s'agit
en particulier :
,, . ~
,:- . : ~ . : . : ~. : . ::
14 122~6S3
- des prot~l~es,
- des enzymes,
- des hormone~,
- des substances ~ activit~ pharmacologique de facon
g~nérale,
- des substances modifiant le m~tabolisme des érythrocytes,
telles que, par exemple, les effecteurs allostériques
de l'hémorglobine, et
- des substances protectrices, notamment cryoprotectxiceS,
ae l'h~moglobine et des ~rythrocytes.
- les acides nucléiques.
Comme cela a été d~veloppé pr~écédemment, parmi
les substances pr~sentant une activité biologique qui
peuvent être mises en ~euvre dans le procéd~ de l'invention,
il faut citer les effecteurs allostériques de l'h~moglobine.
Parmi les effecteurs allostériq~es de
l'hémoglobine, il faut mentionner l'inositol hexaphosphate ~s
(IHP), mais d'autres effecteurs sont utilisables, par
exemple les sucres phosphates tels que l'inositol
pentaphosphate, l'inositol tétraphosphate, l'inositol
triphosphate, l'inositol diphosphate et le diphosphatidynil-
inositol diphosphate.
Il est possible d'utiliser également des
polyphosphates tels que des nucl~otides triphosphates,
nucl~otides diphosphates, nucléotides monophosphates,
des esters phosphate-alcools et le phosphate de pyridoxal.
Toute une série de substances naturelles ou synthé-
tiques présentant un intérêt croissant en thérapeutique cellu-
laire ou moléculaire peuvent être encapsulées :- les prostaglandines
- les leukotriènes
- les cytokines ou immunomodulateurs de synthèse (immuno-
act;vateurs ou ;mmunosuppresseurs) ; dans cette dernière
catégor;e, ;I peut être ut;le d'env;sager d'util;ser le procédé
pour moduler le système de défense immun;taire de l'organisme
à l'aide de substances naturelles ou synthétiques que le pro~
cédé permet de cibler :
..
: ::::, . ; :: . , .
: , . ; . . . . . .
:
:
1 5 ~22~653
- sur le système réticuloendo~hélial, lieu privilégié de dispari-
tion des érythrocytes au cours du vie;llissement;
- sur certaines cellules comme les monocytes, destinés à se
transformer en macrophages tissulaires, en particuiier à I 'aide
d'une réaction de cytolyse anticorps dépendante (ADCC);
- sur le système Iymphatique qui représente le lieu privilégié
d'élimination d'érythrocytes transfusés, par exemple par voie
intrapérilonéale.
Les composés les plus intéressants sont actuellement:
~o - les interférons ~, ~ ou ~5 ou de recombinaison
génét i que;
- I ' interleukine I I
- les immunomodulateurs de synthèse, en particulier
les dérivés du muramyldipept;de (MDP)
Pour les mêmes raisons qui permettent d'envisager
le ciblage sélectif et efficace des immunomodulateurs naturels
ou synthétiques, outre un effet retard et la limitation de la
toxicité, il peut être très utile et efficace d'utiliser le procédé
pour I 'encapsulation, le ciblage et la mise en action de
substances douées de propriétés anticancéreuses.
Parmi les nombreuses autres substances naturel les,
en particulier les enzymes, que le procédé permet d'encapsuler,
il est possible de donner de nombreux exemples.
I l faut en mentionner trois plus particulièrement
intéressantes:
a) Encapsulation d'enzymes du métabolisme du glucose
Le glucose est un substrat qui diffuse rapidement
et librement à travers la membrane du globule rouge.
L'encapsulation d'enzymes du métabolisme du
glucose, particulièrement des hexokinases, pourrait permettre
d'agir sur le métabolisme extraérythrocytaire du glucose, et
donc de moduler la concentration sanguine du glucose, en
dehors de l'action d'hormones comme l'insuline.
~, : . .
16 ~2;~653
La stabilité in~raéry~hrocytaire pourralt éventuelle-
ment nécessiter l'addition d~inhibileurs de protéases comrne
dans le cas de I 'insuline ou d~autres inhibiteurs enzymatiqUeS.
b) Encapsulation d'anhydrase carbonique
S Le métabol isme du C02 pose de graves problèmes
dans la réanimation de certains malades présentant une forle
surcharge, mal maîtrisée jusqu'à présent, du C02 sanguin.
L'encapsulation d'anhydrase carbonique, en plus
des concentrations naturellement importantes dans le globule
rouge, pourrait permettre de déplacer I 'équilibre:
C~2 ~ C03H
ce dernier composé pouvant être éliminé par dialyse du sang
du malade.
c) cncapsulation d'enzymes du métabolisme de I 'histamine
11 a été vérîfié que I 'histamine diffuse à travers
la membrane érylhrocytaire d'une manière analogue à celle du
glucose, mais avec une cinétique plus lente.
Ce point fondamental permet d'utiliser le procédé
pour I 'encapsulation d'enzyrnes du métabolisme de I 'histamine,
en particulier: la diamino-oxidase (histaminase) et la méthyl-
. histamine transférase, qui sont les deux enzymes privilégiées
du catabolisme de I 'histamine.
Ce point permet d'étudier une éventuelle adaptation
du procédé pour le traitement de surcharges en histamine, en
particulier chroniques, chez les sujets allergiques.
Ces exemples illustrent, sans être limitatifs,
I'encapsulation d'enzymes permettant de modifier le métabolisme
de certains sujets présentant des anomalies acquises ou congé-
nitales, ou pour I 'encapsulation d'enzymes de détoxification.
Conformément à ce qui a été indiqué plus haut sur la ~ -
possibilité, grâce au produit de l'invention, de cibler vers le
macrophage une substance active, il est particulièrement avanta-
geux d'utiliser comme substance active à inclure dans les héma-
ties un dérivé ou analogue du MDP puisque I 'on sait que ces
substances exercent leur activité notamment par I ' intermédiaire
:: ' , ~.: : : - :'~: ,':: :,, ' .: - '
' ~ ~ ' ' :':: . , :
17 122~6~;3
!
des macrophages tC. Leclerc et L. Chedid "Macrophage activation
by synthetic muramyl peptides In Lymphokines, E.Pick ~d.
Academ;c Press Inc. 7,1-21,1982). Parm; ces dérivés et analogues
du MDP c;tons no~amment ceux qui ont fait l'objet des demandes
de brevet ~rancais suivantes :
- 74 22909 du 1.07.74 N~ publication 2 292 486
publi~ le 25.06.76
- 75 28705 du 18.09.75 N~ publication 2 324 884
publi~ le 15.04.77
- 75 29624 du 26.09.75 n~ publication 2 288 527
publié le 21.05.76
- 76 06820 du 10.03.76 N~ publication 2 343 483
publié le 07.10.77
- 77 02646 du 31.01.77 N~ publication 2 369 292
publié le 26.05.78
- 76 19236 du 16.07.76 N~ publication 2 355 505
publié le 20.01.78
- 78 16793 du 5.06.78. N~ publication 2 428 051
publié le 04.01.80.
2n Parmi ces produits citons particulièrement les MDP dont
la chaîne peptidique a été mono- ou di-estérifiée sur les groupe-
ments carboxyliques de l'acide D-glutamique par des chaînes
alkyls de 1 à 10 carbones, de préférence de 1 à 6 carbones, en
particulier l'ester butylique de la D-glutamine. Parmi les déri-
vés du MDP particulièrement avantageux citons également les
mono- et di-esters comportant en position alpha une chaîne alkyl
de 4 à 10 carbones, de préférence 4 carbones et en position
gamma une chaîne alkyl inférieure de 1 à 3 carbones.
Bien entendu, il est possible, si cela est nécessaire
et/ou utile, d'encapsuler plusieurs composés à activité bio-
logique.
L'encapsulation de ces produits permet pour certains
d'entre eux un ciblage sélectif sur certains organes ou bien
I'induction d'un effet retard prolongé qui peut atteindre 15 à ,
25 jours ou plus selon les données actuelles recueillies chez
I'animal.
~2Z1653
17a
I l est également important de noter que I 'encapsulation
peut induire un effet protecteur pour certa;ns médicaments qui
son~ toxiques à I 'égard de la plupart des tissus et des organes
non visés par le médicament. Une activité de même type est
observée dans 1 ' induction d'un effet protecteur à I 'égard du
médicament ou de I 'hormone transportée qui, dans certains cas,
sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire~ ou bien
:: : ~ - ,: : .
~2;i~i6S3
1 8
Iorsqu'elles son~ injec~ées à des individus qui possèdent un
anticorps dirigé contre ces substances dans la circulation san-
guine, par exemple un anticorps anti-insuline. Cet effet protec-
teur peut aussi s'exercer à I ~égard d~une dégradation métabo-
S I ique du médicament ou d ' hormone.
La stabilité intraérythrocytaire pourrait éventuelle-
ment nécessi~er I 'addition d'inhibiteurs de protéases comme
dans le cas de l'insuline ou d'autres inhibiteurs enzymatiques.
Enfin, le procédé permet d'introduire des composés
protecteurs de l'hémoglobine et de la membrane pertnettant,
notamment, de protéger l'intégrité des érythrocytes.
I I peut s'agir de cryoprotecteurs ou de
Iyoprotecteurs; ces derniers intervenant en particulier pour
la cryodessication que le procédé permet d'envisager.
I I faut enfin noter que les hématies peuvent être
congelées Iysées et être rescellées à la decongélation, ou en
cas de Iyophilisation, au cours des phases de réhydratation.
~ Cette dernière situation permet de résoudre théoriql~ement le
passage transmembranaire de I 'eau lors de la réhydratation après
Iyophi lisation.
La présente invent1on concerne egalement un
dispositif destin~ à l ' encapsulation dans les
érythrocytes humains ou animaux d ' au moins une
substance présentant une activité biologique,
caractéris~ en ce qu'il comporte en combinaison au
moins:
-- un ~lément de dialyse comportant au moins
un compartiment primaire et lln compartiment secondaire
s~pares par une paroi de dialyse,
-- un dispositif d'alimentation en continu de la
suspension d'~rythrocytes dans le compartiment primaire
dudit el~ment de dialyse,
-- un moyen permettant d ~ amener une solution
aqueuse dans le compartiment secondaire de 1 ' elément
de dialyse,
- ::- : . : , :
:: ., :
.: ~ : ,: . :: ~,
lZ2~653
19
!
~ - un moyen assurant l'introduction de la
sub~tance ~ activite biologique dans le compartiment
primaire de l'el~ment de dialyse,
- un m~yen assurant le transfert de la solution
effluente du compartiment primaire dans un ensemble de
rescellement comportant au moins un moyen pour au~menter
la pression osmotique et/ou o~cotique de la solution .
effluente.
En ce qui concerne l'~lement de dialyse, sa
structure ne constitue pas en soi une caract~ristigue
au dispositif selon la présente invention et il est
possible d'utiliser tout type d'~lement de dialyse
comme cela a ~t~ indiqu~ précéaemment aans le cadre du
proc~de.
Comme dlspositlf d'allmentation en continu,
on peut envlsagex un dispositif quelcongue,notamment
un syst~me de pompe, en particuller les pompes
péris~t~ues couramment utilisées~dans le domaine
des dialyses.
Le dispositif selon la pr~sente invention peut
comporter diff~rents modes ae réalisation, en particu- .
lier au niveau de 1'ensemble de rescellement.
Le premier mode de réalisation de l'ensemble
de rescellement peut ~tre constitu~ par un element de
dialyse comportant au moins un compartiment primaire
et un compartiment secondaire s~pares par une paroi
de dialyse, la solution effluente ~tant amenée dans le . -,
compartiment primaire par le moyen de transfert et le :
moyen pour au~menter la pression osmotique ~tant
constitué par une solution hypertonigue par rapport
la solution effluente, ladite solution hypertonique
~tant contenue dans le compartiment secondaire de
ment de dialyse.
Mais il est ~galement possible de prevoir
d'autres modes de realisation de cet ensemble de
rescellement qui peut ~être constitu~ par une enceinte
comportant un moyen d'amenee d'une solution hypertonique
- par rapport à la solution effluente.
-.
,,,:
,: , . . .
12;~16~3
(
Comme la lyse est effectuée de préférence ~
temp~rature assez basse, comprise entre 0 et 10~C, et
de preférence aux environs de 4~C, et comme le rescelle-
ment est effectue de préference à une temperature plus
elevée, par exemple entre 20 et 40~C, le dispositif
selon l'inyention comportera, de pr~f~rence, un moyen
de chauffage de la suspension à traiter, le moyen de
c~auf~age pouvant ~tre ~ltu~ entre l'el~ment de dialyse
et l'ensem~le de rescellemen~ ou bien d~rectement
l'int~rieur de l'ensemble de xescellement. -
Dans un autre moae de réalisation, 11 est
posslble de prévolr apres le premier ~lément de dialyse
un réclpient permettant de recueillir l'ensemble du
volume de suspension ~ traiter, puis après avoir chang~
la tonicit~ de la solution agueuse circulant aans le
compartiment secondalre de l'elément de dialyse, ae
recycler le lysat d'érythrocytes ainsi obtenu dansle même
él~ment de dialyse, dans ce cas cet element de dialyse
est utilisé dans un premier temps pour la lyse de la
suspension d'érythrocytes, aans un deuxi~me temps
comme ensemble de rescellement.
Le dispositif selon la présente invention peut
egalement comporter des circuits d'asservissement qui,
en r~ponse à des modifications de caracteristiques de
la suspension trait~e, agiront sur 1'ensemble des
paramètres de la réaction afin de ramener les caract~- ;
ristiques de la suspension au niveau d'un seuil ~e
consigne détermine.
D'autres caractéristiques et avantages du
procede et dispositif selon la presente invention pourront
~tre dégages dans la description aes figures ci-apres
sur lesquelles :
- la figure 1 represente un premier mode de
réalisation du dispositif selon la presente invention,
., , . : .
:- - ' ' . '' ~ . .
: : ' ~ ,:
: : .
122~653
- 21
.
- la figure 2 repr~sente un second mode de
r~alisation du dispositif selon la pr~sente invention~ '.
- la figure 3 représente un troisième mode de
réalisation du dispositif selon la présen~e invention,
- la figure 4 représente un quatrième mode de
réalisation du dispositif selon la présente invention,
- la figure 5 représente la pression partielle
d'oxygène en fonc~ion du pr,urcen~age de saturation des
érythrocytes après encapsulation d' IHP,
- la figure 6 est une photographie au microscope
électronique d'une suspension érythrocytaire rescellée,
- la figure ? représente le pourcentage d'hémolyse
en fonction de la pression osmot;que pour divers prélavages,
- la figure 8 représente les rendements bruts et nets
en fonction d'un débit de sang pour divers prélavages selon la fig~7,
- la figure 9 représente la quantité de Desferal
encapsulée en fonction de la concentration initiale du produit,
- la figure 10 représente l'influence de la tempéra- ~;
ture de rescellement sur la fragilité osmotique des hématies rescellées7
- la figure 11 représente la variation de la p50
pour diverses concentrations en IHP,
- la figure 12 représente les variations des
diverses pressions d'oxygène sanguin,
- la figure 13 représente l'évolution du débit cardiaque
25 du mini-porc 'en fonction de la variation de la p50,du sang transfusé,
- la figure 14 est une microphotographie de culots
témoin et rescel lé,
- la figure 15 représente une analyse comparative
des histogrammes des volumes érythrocytaires.
,''' ~
.. . .... . .. .
~ 22 12Z1653
~ . .
Le dlsposltif de la figure 1 est constltu~
d'un ~lement de dlalyse 1 comportant un compartiment
primaire 2 et un compartlment secondaire 3 s~par~ ;
par une paroi de dialyse 4.
Le compartiment primaire 2 est alimente par
une suspension d'érythrocytes contenue dans le r~servolr 5
plac~ dans l'incubateur 6.
Le sang avant d'etre introdult dans le dialyseur 1
est amené a la temp~rature de lyse, en g~néral 4 DC~ :
par l'interm~diaire d'un échangeur de température 7. :~ ;
La suspension d'érythrocytesest mise en
circulation par l'intermédiaire de pompes pêristaltiques
telles que 8.
Dans le mode de realisation décrit, le compose
~ activité biologique est introduit dans le circuit par
1'intermédiaire de la pompe peristaltique 9 avant que
la suspension d'érythrocytes ne pénetre dans l'échangeur ~ :
de temperature 7.
Le compartiment secondaire 3 de l'élément de
dialyse est alimente en une solution hypotonique :
contenue dans le recipient 10 plac~e dans l'incubateur 11. ~:
Cette solution hypotonique est amenee dans le comparti- '
ment secondaire de l'element de dialyse par l'inter-
mediaire d'une pompe peristaltique 12 et à travers un
échangeur de température 13. Après son passage dans le
compartiment secondaire de l'~lement de dialyse, la
solution hypotonique retourne au récipient 10 ; elle peut : :
aussi être ~liminée~ :;
Afin de s'assurer que la l~se des ~rythrocytes
. est complète, il est possible, comme cela est represente
~ la figure 1, de placer à la sortie de l'element de
dialyse 1 une ligne retard 14, c'est-a-dire le plus
souvent une simple tuyauterie de grande longueur par
exemple.
.. . . . . . . ..
~ ~ : - . .
. .
23 1221653
Dans le cas le plus frequent o~ l~operation
de rescellement doit etre effectuee à une temperature
superieure à la temperature de lyse, on introduit
apres la ligne retard un echangeur de temperature tel
que 15 qui permettra d'amener la suspension d'erythro-
cytes lysee a -la tempexature, par exemple, de 37~C.
Le lysat est place en continu dans un
recipient 16 contenu dans un incubateur 17, c'est
dans ce recipient 16 que l'on ajoute en continu, ou
bien en une seuIe fois, la solution de rescellement
placee dans le recipient 18 contenu dans l'incubateur 19
par l'intermediaire de la pompe peristaltique 20.
Lorsque le rescellement est complet, la
suspension d'erythrocytes dans laquelle se trouve
encapsuIe le compose a activite biologique est prelevee
directement a partir du recipient 16.
L'un des avantages du dispositif selon la
presente invention est qu'il est possible de controler
en permanence tous les paramètres de la reaction. -'~
Bien entendu, il est possible de contrôler la
temperature des differents fluides circulant à l'aide -~,
de dispositifs qui n'ont pas ete figures car ils sont
bien connus de l'etat de la technique.
Mais il est, en outre, tr~s interessant de
pouvoir contrôler la pression des fluides et egalement
leur pression osmotique afin de s'assurer que les
echanges S2 feront dans les conditions optimum.
Il n'est bien entendu pas necessaire de rentrer
dans le detail de ces dispositifs de controle qui sont
de type connu. On prevoiera, de preference, au moins un
manometre tel que 21 pour controler la pression des
~.~
'.~
. ~ : :: : ,
24 1Z2~653
fluides dans le circuit primaire et un élément de
mesure de la pression osmotique, par exemple par mesure
de la conductivite à l'aide d'un dispositi~ tel que 22,
ces eléments permettant d~agir pour modifier les autres
paramètres de la rêaction tels que le debit d'alimenta-
tion, afin de ramener les valeurs de la pression et
de la pression osmotique à des valeurs de consigne.
Il en ira de meme sur le circuit secondaire :
où un dispositif schematise 23 permettra de mesurer
la pression du fluide ainsi que la pression osmotique
afin de maintenir les caracteristiques des fluides
a certaines valeurs de consigne.
~ st represente.egalement d'autres dispositifs
de contrôle tels que 24 et 25 assurant des fonctions
identiques a celles definies precedemment.
La figure 2 represente un dispositif qui est ~:
identique à celui de la figure 1 jusqu'au niveau du
second.echangeur thermigue reference 15 sur la figure 1, ~ .
c'est pourquoi cette partie du dispositif ne sera pas ~ ::
redecrite puisqu'elle est absolument identique a celle
de la figure 1.
Par contre, pour ce qui concerne l'étape de
rescellement, celle-ci est effectuee par l'intermediaire
d'un second element de dialyse 30 comportant un
compartiment primaire 31 et un compartiment secondaire 32
,separes par une membrane de dialyse 34.
Une solution de rescellement hypertonique
circule dans le compartiment secondaire 32 par l'inter-
media.ire d'une pompe peristaltique 35 qui prelave
30. cette.solution hypertonique dans le recipient 36 et
la conduit par l'intermediaire de l.'echangeur de
temperature 37 dans le compartiment secondaire de
.l'element de dialyse. Cette solution hypertonique peut
::
. ~
: ' ' ' '
lZ21653
.
~ : .
~tre recycl~e dan~ le r~cipient 36.
La suspension de ly~e provenant du premier
~l~ment de dlalyse,et après son passage dans la l~gne
retard et dans l'~changeur de température, est amen~e
5 dans le compartiment primalre de l'elément de dialyse 30
dans lequel les érythrocytes sont rescell~s, la
suspension après rescellement ~tant recueillie dans
un récipient 38 contenu dans un lncubateur.
Là encore, tout comme cela a et~ mentionné
précédemment, on prévolt différents dispositifs de
controle tels gue 40, 41 et 42 permettant de contr~ler
en continu les paramètres de mise en oeuvre du procédé.
De façon gén~rale, le d~bit du circuit primaire
contenant les érythrocytes est compris entre 20 et
80 ml/min. alors que les debits des solutions
hypertoniques ou hypotoniques du circuit secondaire -
sont de l'ordre de 100 à 1 000 ml/min.
Dans les essais qui seront rapport~s ci-après, ~ ;
les surfaces de dialyseurs mis en oeuvre sont en général
de l'ordre de 0,41 m .
~ es pressions aans les circuits sont voisines
de 100 mm de mercure selon les débits utilisés.
Les forces ioniques des solutions de lyse sont
d'environ 40 mosmoles et les forces ioniques des
solutions de rescellement sont d'environ 300 mosmoles.
Le schéma de la figure 2 qui est
sym~trique pour les deux operations de lyse et de
rescellement montre qu'il est possible a'envisager
l'utilisation d'un dispositif ne co~portant qu'un seul
él~ment de dialyse et de le faire fonctionner dans un
premier temps pour lyser la suspension d'érythrocy~es
puis, apr~s avoir recueilli l'ensemble de la solution
.. . . . . . . . . , , _ ..
.. . . . . . . . .
: ,: . , : :
, : , ~ . - : : . ~
~, .
26 ~Z21653
lys~e, de falre ~onctlonner cette bobine de dialy~e
pour le rescellement en changeant uniquement la tonic~tk
de la solution alimentant le compartiment seconda~re.
Le schéma de I a f i gure 3 permet d ' amener I a pres-
sion osmotique de la suspension d'érythrocytes à 200 mos afin
de limiter la perte de la substance à encapsuler comme cela a
été indiqué précédemment.
La taille de l'élément de dialyse 1 est choisie pour
que, compte tenu des débits et des volumes, I 'abaissement de
la force ionique dans la suspension érythrocytaire amène celle-
ci à environ 200 mos. - La substance à encapsuler contenue dans
le récipient 50 est introduite à I 'aide la pompe 51 dans le cir-
cuit de sorlie du dialyseur 1. Ceci peut être simplement réalisé
à l 'aide d'un pousse-seringue à débit continu classique.
La suspension érythrocytaire issue du dialyseur 1 ,
reçoit alors en continu la substance à encapsuler et pénètre
dans le circuit primaire 27 d'un élément de dialyse 28 dont la
membrane 26 possède une surface choisie, de tel le sorte que
soit alors effective la Iyse des hématies passant dans le circuit
primaire selon le procédé initial.
Les circuits secondaires 3 et 29 peuvent être ali- '~
mentés en série par la même soluticn hypotonique telle qu'elle
est indiquée sur la figure 1.
Le rapport des surfaces des membranes 1 et 26 est
choisi pour optimiser les échanges moléculaires dans les deux
phases de dialyse.
Les éléments de dialyse 1 et 28 peuvent être soit
séparés pour utiliser des éléments commerciaux existants, soit
intégrés dans un d;alyseur à deux compartiments spécialement
adapté au procédé, ce qui est facitement réalisable selon la
méthodologie actuel le.
La sortie du dialyseur 28 reprend les éléments du
schéma de principe de la figure 1.
., : I ~:
.
27 ~Z;z~.653
Le schéma de la figure 4 représente un mode de réa-
lisation particulier du proc~dé selon l'lnvention.
Les conditions décrites jusqu'à présent sont particu-
lièrement adaptées à I 'encapsulation d~une substance dans un
volume globulaire d'environ 200 à 400 ml ou à I 'utilisation
d'une transformation en flux continu. En modifiant surfaces
des dialyseurs et débits, des volumes variables peuvent être
traités.
Il est cependant utile de détailler un circuit de
reçyclage cont;nu pour les conditions extrêmes:
a) La transformation d'un volume d'une suspension
érythrocytaire de plusieurs iitres, si le rescellement n'est pas
effectué en continu, introduit une différence importante dans la
cinétique du phénomène pour les hématies qu; sont passées les
premières dans les phases de dialyse par rapport à cel les qui
passeront les dernières.
b) De la même fason, la manipulation à I 'aide d'un
minidialyseur de faibles quantités de sang (quelques ml ) pour
I 'encapsulation de substances très actives qui ne nécessitent
pas des volu mes importants de sang pour les doses à adminis-
trer, introduit un paramètre supplémentaire En effet, I'effica-
cité d'un dialyseur dépend de sa surface, donc permet un équi-
libre de dialyse déterminé, mais cet équilibre n'est atteint que
selon une cinétique d'autant plus lente que la surface est
réduite~ Une simple adaptation débit/surface est donc
insuffisante pour réaliser une encapsulation dans des conditions
convenab I es.
Dans ce mode de réalisation, la surface du dialy-
seur 1 est réduite et le débit du sang dans le circu;t primaire
augmenté de sorte qu'à la sortie du dialyseur 1 la pression
osmotique n'est réduite que pour une fraction de ce qui serait
nécessaire pour provoquer la Iyse des globules rouges. Ia sus-
pension érythrocytaire est recyclée en continu dans le réservoir
_,, _, , , ., _ . _, . . . . . . . ... .. . . . _ _
,- :. : : ~ . ,,, - , , :: .
:. :: . ........... -:~ . ~
: .
28 ~Z~ 53
- ini~ial 5. L'échangeur de température 15 peut être programrné uniquement en fin de transformation, de même pour la pompe
20 .
Ce disposilif permet d'effect~ler la mise en oeuvre
du procédé par modifications successives et progressives des
forces ioniques des milieux, ce qui permet de négliger la ciné-
tique propre du dialyseur 1, en faisant intervenir une
cinétique complémentaire liée au volume de sang à traiter et
au débit dans le circuit.
Cette modification perme~ d'adapter facilement le
procédé à une gamme très large de volumes de sang traités,
compte tenu des caractéristiques techniques des dialyseurs
actuellement utilisables et donc, en principe, de rechercher les
conditions optimales d'encapsulation pour des conditions très
variées. On peut, ainsi, transformer aussi bien de grands
volumes que quelques ml de sang destinés à une expérimenta-
tion anirnale ou pour I 'encapsulation d'une substanc~ rare et -
onéreuse.
Les dispositlfs ~;chématis~s aux figures 1 et 2
ont ~té utilisés afin de mettre en oeuvre le proc~d~
revendiqué . - - -
EXEMPLE 1
Incorporation de desferrioxamine (Desféral)
Dans cet exemple, on utilise le dispositif
sch~matisé à la figure 1.
Le dialyseur 1 présente une surface de 0, 41 m2 et
est alimente par une suspension d ' érythrocytes avec un
d~bit de 60 ml/min dans le compartiment primaire alors
que dans le compartiment secondaire on fait passer, avec
un débit de 500 mlJmin., une solution de lyse comportant
NaH2P04--Na2HP04, pH 7, 4, 10 mM, CaC12 O, 5 mM et 2mM de
glucose .
La suspension d ' érythrocytes a ét~ obtenue de la
facon suivante : A 200 ml de culot globulaire lavés, à
70 ~ d 'h~matocrite, on a joute 5 ml de solution contenant
.~ . :
~ ~Z2~653
29
25~ mg de ~esféral. La lyse est effectu~e ~ 4~C en
maintenant la suspension de lyse dans un r~cipient 16
cette temp~rature pendant 10 min. On intrcauit ensu~te
20 ml de NaCl 1,5 M, contenant 10 ~ de PEG 4000. La
suspension est maintenue en contact avec cette s~lution
de rescellement pendant 30 min ~ 37~C. Ensuite, on
pr~lève l'ensemble et on effectue 3 lavages par NaCl à 9 g/l.
Il est utile d'effectuer un lavage interm~diaire
par une solution a 200 mos. ou 250 mos. environ pour
IO ~liminer certaines populations érythrocytaires fragilis~es.
De même, la resuspension dans le plasma initial ou dans
des solutions de régénération peut se r~véler n~cessaire
p~ur une bonne conservation des hématies.
Après dosage, on constate que l'on ~ ~ncorp~r~
dans le culot globula~re 148 mg de Desferal (solt un
rendement brut de 59 ~), mai~ il conv~ent de remarquer
que l2 mg de Desféral ont et~ elimlnes dans la solut~on
de dialy~e, ce qui condu~t en fait ~ un rendement net
d'incorporation du Desféral dans les erythrocytes de
63,5 ~
Si l'on m~difie le deb~t d'alimentation en
suspension d'erythrocytes pour l'amener ~ 80 ml/min.,
le rendement brut d'incorp~ration e~st de 47,3 ~ et
le rendement net est de 57,9 %.
Pour un débit de 40 mljmin~ le rendement brut
est de 49,4 ~ et le rendement net de 59,l %.
Pour un debit de 20 ml/min. le rendement brut
est de 46,l ~ et le rendement net de 64,2 ~.
Le rendement brut est-c~lculé par rapport au produit
total mis en réaction et le rendement net est caIculé par rap-
porl au produit restant après la phase de Iyse.
Ces résultats démontrent qu'il existe un optimum de
débit de suspension érythrocytaire pour une surface de dialy-
seur donnée, lorsque la substance qui doit être incorporée est
une substance susceptible de diffuser à travers la membrane
de dialyseur.
- . . ~ ~ .
1~1653
EXE~LE 2
Inc~rp~ration de desfernDxamine (Desferal)
Dans cet exemple, on met en oeuvre le disp~sitif
d~crit ~ la figure 2, c'est-3-dire que l'on effectue
5 le rescellement à l'aide d'une deuxième dialyse 3 22~C .
3 l'aide d'un él~ment de dialyse tel que 30.
Dans ce cas, on utilise le tampon de rescellement
suivant NaH2P04-Na2HPo4 10 m~ p~ 7~4~ CaC120,5 mM,
glucose 2 mM, NaCl 144 mM.
Les autres paramètres restant identiques, le
d~bit de suspension erythrocytaire est de 50-ml/min.
Dans ce cas, on observe un rendement net
d'incorp~rati~n de 46,7 ~ alors que le rendement brut
~ est de 32,5 ~
Ces r~sultats 6'expliguent ais~ment p~isque ~:
le Desféral est une substance aiffusible et que l'on
tend ~ perdre encore une nouvelle quantité de Desf~ral
lors de la sec~nde dialyse.
EXEMPLE 3
Incor~Dration d'insuline
. .
. Dans cet exemple on encapsule de l'insuline
dans les ~ry~hrocytes en mettant en oeuvre le aispositif
schématis~ 3 la figure 1. Dans ce qui suit il ne sera
mentionne que les parametres qui diffèrent de ceux
indiqués à l'e~emple 1.
Afin de permettre le dosage de l'insuline, le
produit utilisé est maryu~ avec I125 par la methoae
de la chloramine T.
On ajoute 10 ml d'insuline.(4 U/ml-432~80~ cpm/ml) : .
a 20~ ml de culot globulaire laves trois fois avec NaCl
9 g/l. -
Le debit de suspension.~érythrocytaire utilis~
est de 60 ml/min. ~près la lyse, 1'incubation se p~ursuit
10 min. à 4~C.
Le rescellement est effectu~ ~ 37~C a l'aide
de 20 ml de NaCl 1,5 M contenant 10 ~ de PEG 4 00~. :
. . .
~. . ..
. .
31 lZZ1~3
L'incubation est poursui~ie 30 min. ~ 37~C et
les globules ro~ges sont ensuite laves trois fois par
NaCl ~ ~ g/l.
Dans ces conditions, le rendement d'incorp~ration
de la radioactivite est de 48 ~ (~ 4 ~). Bien ente~du,
cette incorp~ration ne saurait prejuger de l'activit~
biologique de l'insuline encapsul~e dans les globules ~ -
rouges. Il est bien connu que cette hormone est modifiée
en pr~sence d'h~molysat de glo~ule rouge.
Toutefols, ce resultat confirme les posslbl-
lit~s d'incorporer dans les ~rythrocytes une protéine
de 7 OOO daltons.
Afin de conserver l'int~gr~té fonctionnelle
de l'insuline, il peut etre n~cessaire de prevolr
d'incorporer des substances protectrices de l'insuline
au milieu erythrocytaire , ceci peut bien entendu
etre réalise très aisément 3 l'aide du dispositif
selon la pr~sente invention.
EXEMPLE 4
zo Incorporation d'albumine
On opere comme cela est decrit dans 1'exemple 3
en utilisant de l'albumine marquee ~ Il25 Dans ces
conditions, on observe un rendement qui est de l'ordre
de 3~ ~, ce resultat m~ntre l'influence de la masse
mol~culaire sur le rendement d'incorporation a'une
proteine.
.
Les exemples suivants sont destinés à illustrer
l'encapsulation d'effecteurs allost~riques de l'h~mo-
globine, notamment l'inositol ~exaphosphate (IHP~ grâce
au procéd~ de la présente invention.
EXEMPLE 5
. . _
Encapsulation d' IHP
122~653
~ Pour r~aliser une transformation plus ou moins
importante des globules rouges à l'aide de l'inositol
hexaphosphate, on utilise par exemple deux types de
solution permettant de faire varier le rapport IHP/Na.
Solution A
15 g d'lHP 12 Na (12 ~ H20) dans 55 ml d'eau
distillée so~t passés sur une colonne de DOWE ~50 W-
400 mesh ~quilibrée en ions H . On obtient 63 ml d'IHP
acide (14,2 . 10 3 mole1.
Cet IHP acide est utilisé pour neutraliser une
autre solution d'IHP 12 Na jusgu'~ pH 7,4. 33,1 . 10 mole
d'IHP 12 Na dans 153 ml sont neutralisés par 97 ml
d'IHP aclde contenant 17 . 10 3 mole d'IHP.
Au total on obtient une solution contenant
55 . 10 mole IHP et 457 . 10 mole sodium aans
250 ml. Cette solution est diluée pour obtenir un
mllieu à 250 mosmoles/l.
Solution B
11 9 d'IHP 12 Na (12 % H20) sont neutralisés
par 40 ml d'HCl N dans 750 ml d'H20 à pH 7,4. On
obtient un milieu à 230 mosmoles/l.
Dans cet exemple, on utilise le dispositif
schématisé à la figure 1.
Le dialyseur 1 présente~une surface de 0,41 m
et est alimenté par une suspensi~n d'érythrocytes avec
un débit qui varie selon les expériences de 20 à 60 ml/min.
Le circuit secondaire est aliment~ à 500 ml/min
par un tampon de lyse ayant la composition suivante :
- C03HNa 10 mM
-- P04H2K/P04HK2 10 mM,
- glucose 2 mM,
pH 7,4.
La suspension d'érythrocytes utilis~e a été
obtenue de la facon suivante :
_;
,. : -
. ~ , , ~ .: , ~
lZ21653
33
A 200 ml d'un culot ylobulaire d'~rythrocytes
lav~s 3 fois par une solution de NaCl ~ 9 g/l
(70 ~ d'h~matocrite), on ajoute un volume ~quivalent
de l'une des solutions A ou B.
Apr~s centrifugation, le surnageant l~yèrement
h~molysé est ~liminé.
La lyse est effectu~e ~ ~C. La suspension
de lyse est maintenue dans un récipient 16 pendant
10 minutes à 37~C en pr~sence d'I~P.
La suspension de lyse est rescellée par aadition
de 1~ ~ en volume d'une solution contenant NaCl 1,5 M,
PEG 4000 ~ 10 ~
Après incubation de 30 minutes à 37~C, les
culots globulaires sont lav~s 3 fois par une solution
de NaCl à 9 y~l et remis en suspension dans le plasma
d'origine.
Il est utile d'effectuer un lavage intermédiaire
par une solution ~ 220 mos environ afin d'éliminer
certaines populations érythrocytaires fragilisées.
De même, la resuspension dans le plasma initial ou dans
des solutions de rég~n~ration peut se révéler nécessaire
pour une bonne conservation des h~maties.
Les r~sultats de ces expériences sont rassemblés
dans le tableau ci-apr~s :
.: . ~ ; -, ,:,
:. . :- :, .......... .
~' lZ~ 653
r J ~ :
~~ 1~
~ ~ ~~
~'
)~ ~o~ E ~ C~
t-' C~-- ~ --~ ,_,_
,.,......... ~ ::
lZ%1653
Le~ courbe~ de liai60n de i'oxygène repr~ent~e~
~ la f~yure 5 ~ont mesur~e6 ~ 25~C par la m~thode de
dlffusion raplae à l'alde de l'apparell de Duvelleroy
5J. Appl. Physsiol. 2~, 227-233 (~970) et ~esseirre
S et al. (Bull. Physiopath. Resp. 11, 837-851 (1975).
La courbe de la figure 5 représente pour
divers débits de suspension ~rythrocytaires et suivant
la nature de la solution utilisée, A ou B, la pression
partielle d'oxygène en mm de mercure en fonction au
p~urcentage de saturation des ~rythrocytes.
La pression de demi-saturation notée dans le
tableau P50 est une indication de l'affinité de l'oxygène
pour l'hémoglobine. La pente de la courbe au voisinage
de la demi-saturation, c'est-3-dire entre 40 et 60 ~,
représente le degré de coopération des quatre sites
de fixation de l'oxyyène dans l'hémoglobine, cette
pente permet de calculer le coefficient de HILL.
On d~tecte une amélioration de la lib~ration
de l'oxygène, c'est-à-dire une diminution de l'affinit~
de l'hémoglobine pour l'oxygène, soit par une diminution-
du coefficient de HILL, c'est-à-dire une diminution
ae la pente ae la courbe de la figure Sau voisina~e
ae 5~ ~ de la saturation, ou bien par un déplacement
global de la courbe vers la droite qui correspond ~
une augmentation de la pression partielle d'oxyg~ne
au voisinage de 50 ~ de la saturation.
Pour les ~rythrocytes t~moins de la courbe T
dont la P50 est ae 19,3 mm ae mercure, on observe que
les memes ~rythrocytes traités par le procédé de
l'exemple en présence initiale de sérum physiologique
ont une p50 de 18,5 mm de Hg alors qu'après incorpo-
ration d'IHP par le proc~dé selon la pr~sente invention
.. . . ., ., .. . ... .. .. . , .,, .. , . . , . . .. . . ~ . . . .. . ... .
- ~ I, . . : .
~~ : : :, ,. :: . : , : :.
lZ21653
36
les P50 observ~es var~ent entre 36;8 et 77 mm de ~g
suivant les d~bits utilis~s ainsi que la nature de la
~olution d'IHP utllls~e.
EXE~PLE 6
En utillsant la solution A diluée pour obtenir
- 210 mosmoles/l on effectue une lyse à 4~C avec un
d~bit de 20 ml/min puis un rescellement de 30 min en
faisant varier la temp~rature. Le tableau ci-apr~s
montre l'influence de la temp~rature de rescellement
~0 sur la valeur de la P50 obtenue mais aussi sur le
rendement en globules rouges reconstitués exprimé en
faisant le rapport des hématocrites des suspensions
de globules rouges reconstitués à l'hématocrite de
la suspension initiale pour un volume total équivalent.
. _ _ . ' :''
15Temp~rature de p Rendement
rescellement -S0 ( Hg) (hématocrite)
25~C 42 27 %
30~C 48 36
35~C S0,5 45 %
40~C 54,5
Après rescellement et maintien en milieu
plasmatique, la plus grande partie de globules rouges
retrouve une forme discocytaire bien que faiblement
microcytaire. Les formes plus ou moins vésiculaires
ne sont pas significativement plus nombreuses ~ue
dans la population native. Ceci est confirm~ par la
figure 6 correspondant ~ une photographie au microscope
~lectronique à balayaue d'une suspension érythrocytaire
rescellée dont la P50 est de 68 mm de ~g.
. ~ . ... ~
37 ~6~ :
Les cond1tlons exp~rimentales décrites
d~m~ntrent les grandes posslb1lit~s d'utilisati~n
de la dialyse en flux continu p~ur r~aliser dans des
c~nditions variables l'incorpora~ion d'lHP ou d'autres
ef~ecteurs allost~riques de l'h~mogloblne afin de
r~aliser une modification des propriétés oxyphorique~
du sang.
Le contrôle des paramètres de la r~action de
lyse-rescellement, volumes, d~bits, températures,
comp~sitions des milieux, est aisément réalisable
à l'aide du aispcsitif expérimental utilisé.
Ce dispositif permet la transformation rapide
de quantités importantes de globules rouges. Il pourrait
éventuellement être incorporé dans un circuit de
circulation extracorporelle_ Les conaitions d'utilisat~on
permettent une application thérapeutique chez 1'homme.
La méthode d'incorporation d'effecteurs
allostériques ae l'hémoglobine dans les globules rouges
décrite dans ce brevet présente une série d'avantages
évidents par rapport à la méthode liposomale décrite ~-
dans le brevet aes Etats-Unis d'Amérique n~ 4 192 869 :
1) Elle n'utiIise pas de phospholipides et
du cholestérol exogènes et en cela simplifie consiaé-
rablement les problèmes de toxicité ainsi que d'activités
immunologiques acquises par les globules rouges.
2) Elle permet une quantification très précise
de la concentration d'effecteurs allostériques de
l'hémoglobine inc~rporée et par conséquent permet
l'obtention de la p~0 souhaitée.
3) Le processus d'incorporation est plus
rapide et largement automatisable.
4) La reproductibilité de cette méth~de est
sup~rieure ~ celle de la méthode liposomale
- . . -- ............. ............. . . . ..... . .. ..
, : :. , ,, ~ . ,........ : , .
. .. . .. ... ~ . . . :.
~;2;i~1653
3B
4 ~ ~
Les exemples suivants réalisés avec le Desféral selon
le processus de I 'exemple 1 met~ent en év;dence I ' influence de
divers paramètres du procédé.
EXEMPLc 7
Influence d'un prélavage sur la courbe Iyse
_
Comme cela a é~é décrit précédemment, on peut
envisager de faire gonfler les hématies, avant d'effectuer la
Iyse, en effectuant un prélavage à I 'aide d'une solution conte-
nant une substance diffusible à travers la membrane du globule
rouge comme par exemple le glucose. -~
La figure 7 représente les courbes de Iyse obtenues ~
après lavages dans des solutions contenant des proportions ~ ~-
variables de glucose et de cl~lorure de sodium.
Solution de prélavage (mos)
1 - 130 glucose 130 NaCI
2 - 150 glucose 100 NaCI
3 - 210 glucose 50 NaCI
T - 300 NaC I
Les courbes de la figure 7 démontrent clairement
I'intérêt de faire gonfler les hématies afin d'améliorer la Iyse,
mais il faut tenir compte du fait que parallèlement le volume
des hématies augmènte. Pour un hématocrite de départ de 70 ~0,
le volume extracellulaire après rescellement sera d'autant plus
important que le volume globulaire moyen aura été artificielle-
ment augmenté. Ces deux effets sont donc antagonistes sur le
plan du rendement d'encapsulation final.
I l existe donc un optimum entre les conditions de
prélavage et les conditions de Iyse comme cela est illustré sur
la figure 8.
La figure 8 représente, en effet, les rendements
nets et les rende~nents bru:s d'encapsulation pour divers débits
de sang et pour les diverses solutions de prélavage et I 'on
constate que pour un débit de sang donné il existe,
en général, au moins un prélavage qui permet d'augmenter les
rendements.
.. . ~ . . .. .
. : : ,. .: . .
-
~Z21653
39
-
Les résultats initiaux donnés pour l'encapsulation du
Desféral dans les exemples 1 et 2 ont éte obtenus à l'aide d'une
méthode de dosage chimique colorimétrique. Ces résultats sont
majorés par rapport à ceux obtenus à l'aide de la méthode de
S dosage radioactif utilisant le complexe 59Fe-Desferrioxamine
utilisée pour l'obtention des résultats de la figure 8. Cette
méthode est utilisée dans les exemples suivants :
Cet exemple montre qu'il est possible en aJustant
les conditions expérimentales d'obtenir des résultats compris
entre 40 et 50 % pour les rendements bruts.
EXEMPLE 8
Influence de la quantité de Desféral ajoutée
Dans cet exemple, on mesure la quantité de
Desféral encapsulée pour diverses concentrations de Desféral
dans le culot globulaire.
Les conditions expérimentales sont déterminées pour
donner un rendement brut d'environ 40 ~.
La figure g rassemble les résultats obtenus et
montre l'existence d'une relation linéaire pour une large zone
de concentration de Desféral.
De cette figure il ressort que la dose maximale de
Desféral encapsulable n'est pas atteinte. En utilisant les condi-
tions optimales de la figure, 8 ou celtes correspondant à l'utili-
sation de deux dialyseurs mentionnées ci-après (rendement
d'environ 50 ~), on voit qu'il est possible d'encapsuler
800 mg à 1 q, au moins, de Desféral pour 100 ml de culot
rescellé.
EXEMPLE 9
Influence de l'hématocrite
Le tableau suivant monlre l'influence de l'hémato-
crite du culot globulaire lavé sur le rendement d'encapsulation~
'
iS3
. ~.. .
Hématocrite % Rendement
35 ,3 :
35,7 :
40,4 .
. 80 . 42
:
EXEMPLE 1 0
Influence de la température de rescellement
Le tableau de l'exemple 6 indique l'influence de la
température sur le rendement de rescellement et d'encapsulation
pour l'IHP.
Des essais complémentaires effectués avec le Desféral
ont montré qu'enlre 37 et 42~C l'influence de la température
su r I e ren demen t f i n a I es t re I a t i v emen t modé rée ma i s q u e, p a r
contre, les courbes de Iyse des hématies rescel lées sont considé-
ra b I emen t mod i f i ées .
La figure 1C représente I ' influence de la température
de rescel lement sur la Iyse bactérienne en fonction de la
tonicité du milieu.
Les formes les plus stables sont obtenues vers 40
à 42~C (déplacement des courbes vers la gauche). A partir de
45~C, une fragilisation des globules rouges apparaît (déplace-
ment des courbes vers la droite).
:: . ~ ~ . : ,: - ... . .
41 ~ ~i6~
-
EXEMPLE ll
L a compos i t i on de I a so l u t i on de resce I I emen t
utilisée selon l'exemple 1 joue un rôle imporlant, comme
indiqué dans le tableau ci-dessous pour deux hématies
5diférentes:
s
Composition de la solution Rendement brut % Rendement net %
NaCI 1 M 42,7-40 70,7-63,1
. ;~!aCI .1,2 M 38,3-39,4 69,1-62,9 -:
NaCI 1,5 M 38,8-37,3 66,6-57,3
10NaCI 1 M + PEG 4000 10 ~o 42,1-41,6 66,9-63,4
NaC I 1, 2 M+PEG 4000 10 % 39,7-37,8 69,9-62,6
NaC I 1, 5 M+PEG 4000 10 % 38,3-37,3 68,3-61,2
Les dosages sont e~fectués selon la rr;étho~e' isot'o;7ique
Comme cela a été décrit précédemment, afin de
respecter la durée de vie maximale des hémat;es in vivo, il est
lS bien connu que certains constituants sont essentiels. Ce sera le
cas de l'ATP, de l'équilibre Na/K, des ions Ca et Mg , du
glucose ou d'autres composés comme 1 ' Inosine ou le 2--~ DPG par
exemp I e .
Il peut, en conséquence, être nécessaire de modifier
la composition de la solution de rescel lement ou des solutions de
lavages pour respecter au maximum 1 ' intégrité biologique des
hématies rescel lées.
EXEMPLc 12 ' ~ : .
Cet exemple a été mis en oeuvre en utilisant un dispo-
sitif conforme à celui de la figure 3, c'est-à-dire dans lequel la
substance active est introduite entre deux phases de la Iyse des
91 obu I es rou ges .
::': , '. : '' '' . ' ' ':-.~', '-~"- , ..... . .
~22~6S3
1.2
Les tableaux cl-dessous résumen~ les résultats moyens
correspondant à I 'u~llisation de ce dispositif pour I 'encapsulation
de Des~éra 1.
Les paramètres sont:
- S1 = surface du dialyseur 1
- 52 = surface du dialyseur 28
- Débit du sang = 20, 40, 60 ou 80 ml/min ~ :
pour différentes solutions de prélavage des hématies:
at solution de NaCI 0,15 M (300 mos)
b) solution de NaCI 130 mos + glucose 130 mos.
a) --Prélavage Par NzCl 300 MOg S
-- ~ ~1 00 28 m ~ S2 ~ ~~ 28 M
débit ml/Min rat net ~ ~lt brut %
51,9 ' 3~4
38,8 31 ,6 ~:
. 27,7 24~7
~ 80 19,3 17,7
--S1 --0~28 ~In ~ S2 ' 0~41 n~
d~bit m~,/mi~ rdt ne'c % rdt brut ;t
51, 6 32 , 3
40 . 39,6 28~7
36,6 28,3
38,~ 27,5
~- S1 - 0~41 m2 ~ S2 ~ 0~28 m
debit m~min rtlt net ~ r~lt b~ut %
50,75 46,2
50~57 39~5
42,4 39,2
. 80 34,4 32~6
.~
:.: . .: . - ~: .~ : . . :
: : :: .. ,: : : :, : ., . ., . ,.. ,", , ~ , . . ..
~,.: - :: - . : .
12Z1653
43
~ b) - Prelavages NaCl 130 mos + glucose 13Q.mos :
- Sl = 0,28 m2 S2 = 0,28 m2
débit ml/min rdt net ~rdt brut %
51,8 46,8
52 45,75
48,5 42,1
51,5 45,7
- Sl = 0,28 m2 S2 = 0,41 m2
débit ml/min rdt net %rdt brut
43,1 34,2
50,4 46,2
45,4 45,1
46,6 3g,7
- Sl = 0,41 m2 S2 = 0,28 m2
débit mllmin rdt net %rdt brut %
3?~45 27,4
38,7 37,7
38 37,8
38 37,15
Les résuItats ainsi obtenus et compares à ceux de
la figure 8 indiquent que.selon certaines conditions .
expérimentales optimales il est possible d'ameliorer le
rendement d'encapsulation d'une substance dialysable et que
ces valeurs:sont proches de 45 a 50 % en rendement final,
selon le globule rouge utilise. De:meme, les valeurs des
rendements net et brut se rapprochent, ce qui traduit la
diminution de la perte de substance dialysable. Des
conditions optimales peuvent etre recherchees pour des :
valeurs dif.ferentes de Sl et S2.
~7 .
~, ~ . ~ . . ! . . . '
~22~653
~ 44
EXEMPLE 1 3
Influence de I 'âge du globule rouge
Les essais effec~ués ont montré qu'il n'y a pas de
variation signif;cative du rendement d~encapsulation lorsque les
hématies utilisées ont été prélevées depuis moins de 5 jours. Une
diminution progressive et lente du rescel lement se produit après
cet te da te .
Les exemples suivants donnent les principaux résultats
expérimentaux obtenus avec les globules rouges contenant de
1 ' IHP encapsulé par le procédé de I 'exemple 5.
EXEMPLE 1 4
La figure 11 indique la relation obtenue entre la P50
de la courbe de saturation et la concentration en IHP incorporé
dans les globules rouges humains. Le coefficient de corrélation
est de 0,916.
Les courbes de la figure 12 indiquent les modifications
de la saturation de I 'hémoglobine en fonction de la pression
d 'oxygène.
L'étude des courbes de la figure 12 indique que mal-
gré une baisse de la saturation de I 'hémoglobine pour une pres-
sion artérielle de 100 mm de Hg, la différence artério-veineuse
obtenue à 30 et 40 mm est très significativement augmentée. Ces
différences sont déjà très importantes pour un déplacement de 10
à 20 min des P50 des courbes de saturation.
EXEMPLE 15
Des globules de porc transformés dans des conditions
équivalentes aux globules humains de I 'exemple 14 ont été trans-
fusés à des animaux (mini-porc) par exanguino-transfus;on. Des
volumes de 300 à 500 ml reconstitués à I 'hématocrile de I 'hémato-
crile de I 'animal ont été utilisés dans chaque essai~
s'
: :
::: : : :
~2Z16S3
L'équilibre acldo-basique et les paramè~res de l'oxygé-
nation son~ donnés avan~ e~ après transfusion dans le ~ableau
ci -dessous:
Av~e trzsnsPusi on ADr~S tr~ns~usion
. . ~
5~50mm~g 30.7 ~ 1.041.2 ~ 4,0~ '
p~a 7.36! 0.057.34~ 0.04
pE~v 7.33~ 0.057.28~ 0.05
O2 mnI3g 39.0 + 3.235.8 ~ 5.4
~vC02 ~Hg 48.1 ~ 6~ 545.3 l10.5
10co2~a mn/l 2i.3 -- 3.519.0--4.8
C02~v ~l 25.9 ~ 3.621,3 + 5.8
D g/l~D ml 11.1 ~ 2,,011.2 + 1.5
~,~0.0~ ' ~
~
Le transport de I 'oxygène et la cession tissulaire de
15 1 'oxygène sont donnés avant et après transfusion dans le tableau
ci -dessous:
46 ~Z21653
Avant transfusion Apres transfusion
__ . ... ~ _ _
PaO2 mmHg 82.5 - 10.3 97.5 - 10.6
Pv02 mmHg 36.7 - 5.3 35.1 - 3.7
CaO2 ml/100 ml13.9 + 2.5 14.1 + 1.5
Cv ~2 ml/100 ml 9.2 + 2.9 5.6 + 1.7 +++
DAV ml/100 ml 4.8 - 1.1 7.6 - 0.3 +++
Q Q/mn/Kg 0.210- 0.029 0.144- 0.054+++
V~2 ml/mn/Kg 10.3 - 1.6 10.6 - 3.6
Part mnHg 91.5 - 10.2 87.2 - 22.8
+ P<0.05
+++ P<O.001
Ces resultats indiquent que, pour une diminution de
- l'affinité de l'hemoglobine pour l'oxygene, l'animal entier
repond par une diminution du debit cardiaque et un elargisse-
ment de sa différence artério-veineuse. La cession d'oxygène
tissulaire est ainsi favorisée par rapport au transport de
l'oxygene. La figure 13 indique l'evolution du débit
cardiaque en fonction de la P50 chez six porcs exanguino-
- transfuses avec des globules de porc ayant incorpore des
quantites variables d'IHP.
EXEMPLE 16
Caracterisation des hematies rescellees
1~) Microscopie electronique
Comme pour la figure 6 avec l'IHP, la figure 14 montre,
en microscopie electronique à balayage, la morphologie
comparee des globuIes rouges temoins, leg~rement echynocytaires,
par rapport aux globuIes lyses et rescelles ayant encapsule
du Desferal. Ces derniers sont de taille comparable. La
tendance echynocytaire est reduite. Il s'agit essentiellement
de stomatocytes de type 1 ou 11 - 5 a lo % de la population
est constituee de formes sphero-echynocytaires ou de vesicules.
,~ .
.
.
~: :
:lZ21653
47
2~ ) Caractéristiques hématologiques
La figure 15 compare la distrlbution érythrocytaire
obtenue au Coulter S d'un culot globulalre lavé (courbe a3 à
cel le qui est obtenue après rescel lement (courbe b) . Un léger gl is- '
S sement de la dislribution vers les formes microcytaires est
ob servé .
Le tableau ci-dessous regroupe les principales caracté-
ristiques de ces globules rouges.
_ .
a~~e (4) Posc (2)
t~no~n . tr~sfor~t ~mointr~~sfo
Volume globulaire
mo~ (10~ 3? 9~,~4 84 ~3,1 5j 52,2
_
Conc. h~snoglobinc . .
globl21aire mr~ne 32,3~;1,9 30 ~,5 31 32,2
(G/100 ml) . .
. _ . .
~ndice ~e ~istri~ 15,4~2,823,1+7~2 21,3 29,2
ff~n globulaire . . :
. . ~
. . .
I l apparalt d'après ces résultats que les hématies
Iysées et rescel lées selon le procédé sont faiblement microcytaires
et normochromes, avec un élargissement de la distr;bution volu-
mique vers les valeurs faibles.
3~) Caractéristiques ;mmunologiques
Les hémat;es Iysées et rescel lées ont été examinées
pour des modifications qualitatives et quantitatives des antigènes
de groupes sanguins. Les méthodes conventionnelles de l'immuno-
hématologie ont été uti I isées y compris les tests de Coombs et le
traitement aux enzymes protéolytiques.
--'~
12Z~6~;3
4B
Les aggrégats obtenus ont une taille un peu réduite
mais sont complets et parfaitement v;siblcs. De tel les hématies
peuvent donc, après leur transformation, ê~re compatibilisées par
rapport à un receveur potentiel.
Aucune modification significative1 quantitative ou qua-
litative, n'a été observée, pour des hématies ayant encapsulé du
Desféral, dans les systèmes antigéniques suivants:
ABO - Rh - CcDEe - Kk kpa kpb - M~Ss - Pl - lea - leb - Fya -
Fyb _ JKa _ ~Kb l ua
Ainsi que pour les an~igènes:
Ku - Gerbich - Fy3 - JK3,
Ies antigènes du système P - les antigènes Cartwright
et Vel.
Aucune anomal;e des antigènes de polyagglutinabilité
l S n ' est observée en sérum AB .
Ces résultats indiquent ciairement la non modification
des antigènes publics, privés ou de polyagglutinabilité pour les
hématies transformées. Ce résultat est essentiel pour l'utilisation
in vivo de ces hématies comme transporteurs de substances d'inté-
rêt biologique en particulier immunomodulateurs susceptibles
d'agir sur la réponse immunitaire du receveur.
EXEMPLE 1 7
~ncapsulation de MDP et de ses dérivés
Parmi les nombreux immunomodulateurs de synthèse ou
d'hémi-synthèse la famille au muramyldipeptide semble très
prometteuse .
On a vérifié qu'il est possible d'encapsuler certaines
de ces substances à I 'aide du procédé.
On a étudié la stabilité dans le temps, à l'intérieur
des érythrocytes stockés à 4~C. ~
100 mg de Murabutide Ibutyl MDP~ (Choay) dans 10 ml
de sérum physiologique sont mélangés à 200 ml de culot globu-
laire lavé, à 70 % d'hématocrite. Après Iyse et rescellement selon
le procédé de I 'exemple 1, 23 mg (23 %) sont retrouvés dans 96 ml
de culot globulaire rescellé et lavé~ ayant un hématocrite de 64%.
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49 ~lG~
Durant une durée de 8 jours, à l'aide d'un dosage
ef~ectué par HPLC, aucune modification significative de la concen-
tration de cette substance dans les erythrocytes cons~rvés à 4~C
n'est observée, ce qui signifie que ce type de composé peptidique
n'est pas dégradé à l'intérieur des érythrocytes duranl la conser-
vation, à la différence de ce qui est observé avec l'insuline, en
l'absence d'inhibiteurs de protéase.
Durant le même laps de temps, aucune concentration
significative de ce dérivé du MDP n'est observé à l'extérieur des
globules rouges, ce qui indique qu'il n'existe pas une fuite signi-
ficative transmembranaire de ce composé. Le rendement d'encapsu-
lation (23 %) est relativement faible~ mais peut être attribué au
caractère hydrophobe du composé et à son interaction avec la
membrane érythrocytaire.
Une dose thérapeutique normale de S mg telle qu'elle
est estimée actue11ement ne nécessiterait qu'environ 20 ml de sang
transformé, ce qui indique l'extrême efficacité de ce mode de
transport ; une telle opération permet de disposer très aisément,
pour le même malade, de 5 doses utiles échelonnées dans le
temps. En outre, cet exemple n'est pas limitatif de la dose
encapsulable (environ t 9/100 ml pour le Desféral).
EXEMPLE 18
Encapsulation d'interféron cy
D'une manière identique à celle de l'exemple 17, une
solution d'interféron ~ purifié contenant 2,1.10 unités dans 1 ml
est mélangée à 220 ml de culot globulaire. Au préalable, compte
tenu de la très faible concentration protéique, le circuit de
dialyse est incubé durant 30 min par une solution à 1
d'albumine humaine pour limiter les pertes par absorption non
speci~ique dans le circuit de dialyse. Après Iyse et rescellement,
840 000 unités d'interféron (Rdt = 38 ~) sont retrouvées dans les
125 ml de culot globulaire rescellés et lavés. Il est à remarquer
que ce rendement est proche de celui qui a été obtenu pour
l'album;ne (exemple 4). ~ '~
7'
~Z21653
Dans les limites du tltrage biologique effectué, il n'y
a pas de diminution nette du titre de I ' interféron , durant une
période de ~3 jours à 4~C, après son encapsulation dans les
globules rouges, ce qui indique une excel lente conservation in
vitro de ce composé après son encapsulation.
Des rendements d'encapsulation équivalents sont
obtenus pour 1 ' interféron 2S et I ' interleukine 11.
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