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Ceci est une division de la demande de brevet
canadien n 456.495 déposée le 13 juin 1984.
La présente invention a pour objet à titre de
produits industriels nouveaux, les produits de formules
générales (III) et (IV), sous forme de mélange d'isomères
syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'iso-
mère anti:
33C-1 ~ R 33C-N ~ ~ 'C- C-CH
C~H2 (III) ~H2 _ (IV)
HO- O O
dans lesquelles la ligne ondulée sur l'azote oximinique
signifie que la fonction oxime peut etre en position syn ou
anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un
groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un
groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12
atomes de carbone et R2 représente un groupement activateur
de la fonction carbonyle.
Parmi les valeurs de R, on peut citer:
: a) les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle,
butyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, iso-pentyle,
: 30 sec-pentyle, tert-pentyle, néo-pentyle, hexyle, iso-
hexyle, sec-hexyle, tert--hexyle;
b) les radicaux formyle, acétyle, propionyle, butyryle,
:~ isobutyryle, valéryle, hexanoyle, benzoyle, caprylyle,
~ méthoxy-carbonyle, éthoxy carbonyle.
.~
Parmi ces produits, on citera les produits
suivants:
- le 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-dimé-
thylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)estra-4,9-dièn-3-one sous
forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme
d'isomère syn et sous forme d'isomère anti,
- l'anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~-
hydroxy~ -(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)estra-
4,9-dièn-3-one avec le formiate d'isobutyle sous forme de
10 mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et
sous forme d'isomère anti:
H3C-N~ OH
15cl ~ ,c--c-cH3
CH( CH 3 ) 2
20ll H2 ~H2
O=C C=O
\o/
L'invention a également pour objet un procédé de
préparation des produits répondant à la formule générale
(III) ou (IV) ci-dessus.
Ce procédé est caractérisé en ce que l'on fait
réagir un produit de formule générale (II):
::: H3C-N~,
C ~ ~ C~CH (II)
-- 2
dans laquelle R a les significations précitées avec un
halogénure de carboxyméthoxyl.amine en présence d'une base et
ob-tient un produit de formule (III):
H~C-N
C~3 ~ R
~ C- C CH
O (III)
~H2
H-O- 0
dans laquelle R a les significations précitées et la ligne
ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de
mélange d'isomères syn et anti, puis isole le produit
obtenu, ou bien l'on fixe sur la fonction acide de ce
; produit, un groupement activateur de la fonction carbonyle
et obtient le produit de formule générale (IV):
25 : H C-N_~
3 , ~ R
: , ~ C _ C-CH3
N~ J (IV)
:30~: 1
CH2
~: O
~;:: O'
R
.
~ - 3 -
~: ', : ,,
:
~ .
~ D~ ~
dans laquelle R a les significations précitées, R2 repré-
sente un groupement activateur de la fonction carbonyle e-t
la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous
forme de mélange d'isomères syn et anti, puis isole le
produit obtenu, le sépare, si désire,en ses isomères, puis
le cas échéant, éthérifie ou estérifie la fonction hydroxyle
en 17.
Dans une mise en oeuvre préférentielle du procédé
de l'invention:
- l'halogénure de carboxyméthoxylamine est l'hémihydro-
chlorure de carboxyméthoxylamine et on opère sous atmosphère
inerte et en présence de soude;
- on fixe sur la fonction acide un groupement activa-
teur de la fonction carbonyle en faisant agir un halogéno-
formiate d'alcoyle en présence d'une base tertiaire, en
milieu anhydre et sous atmosphère inerte.
Dans une mise en oeuvre très préférentielle du
procédé de l'invention, l'halogénoformiate d'alcoyle est le
chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-
butylamine.
Llactivation de la fonction carbonyle du produit
de formule générale ~III) peut aussi etre réalisée en
faisant agir sur celui-ci le N-hydroxy succinimide ou le
dicyclohexylcarbodiimide, générateur de groupements activa-
teurs de ladite fonction carbonyle.
L'éthérification ou l'estérification de la fonc-
tion hydroxyle en 17 du produit de formule générale ~III) ou
(IV), dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, peut
être effectuée selon des méthodes habituelles.
L'éthérification peut être effectuée par exemple
au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure
d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle.
L'estérification peut être effectuée par exemple
au moyen d'un agent d'estérification tel qu'un dérivé
-- 4
fonctionnel d'acide, comme un chlorure d'acide ou un
anhydride.
Pour obtenir les isomères syn et anti des produits
de formule générale (III) séparés, objet de l'invention, on
peut procéder par exemple de la manière décrite ci-après:
on soumet un produit de formule générale (III),
sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, où R
a les significations précitées, à l'action d'un agent
d'estérification pour estérifier la fonction carboxyle,
sépare l'isomère syn de l'isomère anti de l'ester résultant
puis saponifie séparément ladite fonction ester de chacun
des isomères syn et anti., puis obtient l'isomère syn et
l'isomère anti des produits de formule générale (III), dans
laquelle R garde les significations précitées.
Les produits de formule générale (III) sont des
produits de depart utiles pour la préparation d'antigènes,
nécessaires également aux dosages radioimmunologiques de la
17~-hydroxy 11~ -(4-diméthylaminophényl) 17O~-(prop-l-ynyl)
estra 4,9-diène 3-one et de ses métabolites dans les fluides
biologiques, chez l'homme ou l'ami.nal.
Leur application en tant que telle fait également
l'objet de la présente invention et es-t caractérisé en ce
que l'on conjugue un de ces produits avec l'albumine sérique
bovine (~SA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA) et
obtient llantigène cherché.
` Dans des conditions préferentielles de mise en
oeuvre, l'application des produits de formule générale
(III), est caractérisée par les points suivants:
- on fait réagir un produit de formule générale (III)
sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous Eorme
d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
- 5 -
:: .
CH3~)R
C_C - CH3 (III)
O
CH2
H-O - CO
dans laquelle la ligne ondulée et R on-t les significations
précitées, en vue de l'activation de la fonction carbonyle,
avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base
tertiaire, e~ milieu anhydre et sous atmosphère inerte,
obtient l'anhydride mixte!!correspondant, de formule ~IV):
~: H3 C-N _~,
CU~--C-CH3
(IV)
O
CH
2 5 ` O
R
: 2
::~ :
dans laquelle R garde la signification précitée et R2
; 30 : représente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un
: : radical alcoyle ayant au:plus 6 atomes de carbone, que l'on
conjugue avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine
(HSAj et obtient l'antigène cherché:.
6 -
~:~
~ '
'
~:
Dans un mode d'exécution préférée, l'application
des produits de formule générale (III) est encore
caractérisée par les points suivants:
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate
d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine et
sous atmosphère inerte,
- on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale
(IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA)
en ayant préalablement dissout cette dernière dans un
mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
Tout particulièrement, la 3-carboxyméthyloxime de
~ OR 11 B- (4-diméthylaminophényl) 17d-(prop-1-ynyl) estra-
4,9-dièn-3-one, sous forme de mélange d'isomère syn et
d'isomère anti, sous Eorme d'isomère syn ou sous forme
d'isomère anti, permet la préparation d'antigènes de formule
générale (V) et (VI):
. . .
CH3~)R
fy~ C_ C-CH3
(v)
o
ICcH2
2 5
n
BSA
dans laquelle R a les significations précitées, n = 20 à 30
et la partie oxime de stéroide est sous forme de mélange
d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous
forme d'isomère anti, et
-- 7
H 3 C - N ~ I
CH3 ~)R
~ C----C-CH~
0
CH (VI)
YO
n
HSA
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroide est sous forme de mélange
d'isomère syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous
forme d'isomère anti.
Pour étudier et doser par des méthodes radioimmu-
nologiques conventionnelles la 17~-hydroxy-llB-(4-diméthyl-
aminophenyl-17~ -(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one non
radioactive, on prépare comme déjà dit à partir de ce
dernier, des antigènes avec l'albumine sérique bovine (BSA)
ou avec l'albumine sérique humaine (HSA).
Les antigènes~résultant de formules (V) et (VI)
peuvent servir au développement d'anticorps lorsqu'ils sont
injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant. Ils
perme~;ttent alnsi d'obtenir des sérums contenant des
anticorps.
; Ces produits de formules (III) ou (IV) permettent
en outre la préparation de dérivés estradiéniques marqués à
iode, faisant l'objet de la demande principale, sous forme
de ~mélange d'isomères syn et anti ou sous forme d'isomères
syn ou sous forme d'isomères anti, de formule générale (I):
- 8 -
:: :
. ~ . -.
;~ ~ ', .
~ ~ .
~ ~?d~8
H3C-N_~
CH3 ~ R
~ C - C-CH~ (I)
cH2
l =O
NH-R
dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique
signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou
: 15anti, formule dans laquelle R représente un atome
d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de
carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant
de 1 à 12 atomes de carbone et Rl représente le reste d'un
:~ ~acide aminé RlNH2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce
20reste étant accepteur d'iode et étant marqué à l'iode 1.25 ou
; i31. Cette préparation s'effectue notamment par réaction du
produit de formule (IV) avec un acide aminé de formule RlNH2
:possédant un groupe accepteur marqué à lliode 12S ou 131 ou
avec un dérivé d'un tel acide.
: 25: Les exemples suivants illustrent l'invention sans
toutefois la limiter.
EXE~PLE 1:: 3-carboxyméthylo~ime de 1 ~-hydroxy-1 ~-(4-dimé-
thy:laminophényl)17~ -(prop-1-ynyl)-estr_-4,9-dièn-3-one
~
A une solution de lg de 17Jg-hydroxy-1 ~-(4-dimé-
thylaminophenyl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one dans
:35 ml d'éthanol, on ajoute 665 mg d'hemihydrochlorure de
g
:~`:: .
~ : .
.:~ .
' '- ' `: .' .
: ` ~ ''', ,
'
carboxyméthoxylamine, soumet le mélange reactionnel à
l'agitation pendant une heure environ à température
ambiante, additionne de 1,6 ml de soude N, puis concentre
sous vide, reprend le résidu par le chloroforme, essore,
évapore le filtrat à sec, le chromatographie sur silice
(éluants chloroforme/méthanol 7:3), isole le produit cherché
que l'on empâte par l'éther isopropylique, essore et sèche
sous vide pour obtenir 1,13 g du dit produit cherché sous
forme de mélange d'isomères syn et anti. La chromatographie
sur couche mince de silice, en éluant au mélange
chloroforme/méthanol (8:2) donne Rf=0,45.
Préparation dianhydride mixte de 3-carboxyméthyl-
oxime de 17~-hydroxy 11~ (4-diméthylaminophényl) 170~-(prop-
1-ynyl) estra-4,9-dien-3-one sous forme de mélange d'isomè-
res syn et anti, avec le formiate dlisobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère
inerte 3,5 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy 11~-(4-
diméthylaminophényl) 17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one
préparé au stade précédent dans 50 ~ul de dioxane, ajoute 10
~1 de mélange tri-n-butylamine/tétrahydrofuranne (1-5) puis
10 ul de mélange chloroformiate d'isobutyle/tétrahydrofuranne
(1:10), maintient ce mélange réactionnel sous agitation pen-
dant une demi-heure à 4C environ, puis additionne de 3,4 ml
de tétrahydrofuranne et obtient une solution du produit cherché.
EXEMPLE 2: antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de
__ _ _
17~-hydroxy~ (4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-
estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et
anti et d'albumine séri~ue bovine (BSA).
-
STADE A: Anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~-
hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-
4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti
avec le formiate d'isobutyle.
- 10 -
On dissout sous agitation et sous atmosphère
inerte 63 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-
diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one,
préparé à de l'exemple 1 dans 1,2 ml de dioxane, ajoute 57,5
~l de tri-n-butylamine, puis abaisse la température vers
13C, ajoute 16 ~l de chloroformiate d'isobutyle, maintient
ce mélange réactionnel SOU9 agi-tation à la température de
13C environ pendant une demi~heure. On obtient une solu-
tion du produit cherché, que l'on utilise telle quelle pour
le stade suivant de la synthèse.
STAD~ B: Dissolution de l'albumine sérique bovine.
On introduit à 4C sous agitation et sous
atmosphère inerte 175 mg d'albumine sérigue bovine dans 0,5
ml d'eau, maintient sous agitation pendant 20 mn environ,
ra~oute successivement après la dissolution 3 ml de dioxane
et 170 ~l de NaOH N.
STADE C: Conjugaison.
On verse lentement dans la solution d'albumine
sérique bovine obtenue au stade B, la solution d'anhydride
mixte obtenue au stade A, amène le pH à 8,9 à l'aide d'acide
chlorhydrique N et agite le mélange réactionnel pendant 5
heures à 10C environ. On sépare ensuite la phase organique
du précipité formé, la dilue par 30 ml d'eau distillée,
amène le pH à 4,1 par l'addition d'acide chlorhydrique N,
sépare le précipité formé, le reprend par 25 ml d'une
~ solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 1%. La solution
résultante est laissée au repos, puis soumise à l'ultrafil-
tration. On épuise ensuite la solution des molécules de
poids moleculaire 10-15000 par 510 ml d'eau distillée puis
~;~ ajuste le volume final à 17 ml. On lyophilise cette solu-
- 1 1 -
~ ~ .
.
~: .
~2~ 3
tion pendant 30 heures environ et obtient 169 mg d'antigène
cherché.
Analyse
Spectre_UV
- dans eau : max 265 nm E'1=53
max 290 nm E'l=62
- dans HCl N/10 : max 290 nm E'1=61
Dichrofsme circulaire
- dans eau : max 222 nm ~ E'1=-0,305
max 260 nm ~ E'1=-,070
max 289 nm aE ' l=- ~ 050
- dans HC1 N/10 : max 222 nm a E'1=-0,250
max 290 nm ~ E'1:-tO,027
Ce produit contient 20 à 22 groupes de stéroïde
liés par mole de protéine.
EXEMPLE 3: _ntigene à partir de 3-carboxyméthyloxime de
17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl~-
estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et
anti et d'albumine sérique humai_e (HSA).
:
En procédant comme décrit dans le stade C de
: l'exemple 2, mais en partant de la solution d'anhydride
mixte du stade A et d'une solution d'albumine sérique
humaine préparée selon la méthode décrite au stade B, on
~ obtient 180 mg d'antigène cherché.
: 30 Ce produit con-tient 34 à 36 groupes de stéroïde
liés par mole de protbine.
~ 12 -
:
.
Analyse
Spectre UV
_
- dans eau : max 265 nm E'1=79
5max 291 nm E'l=g4
- dans HCl N~10 : max 290 nm E'1=93
Dichroîsme circulaire
- dans eau : infl. 218 nm ~ E'1=-0,308
max 259 nm ~ E'1=-0,115
max 288 nm ~ E'1=+0,085
- dans HCl N/10 : max 223 nm ~ E'1=-0,300
max 283 nm ~ E'1=+0,037.
- 13 -