Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
La présente invention concerne un procédé de fabrication de tubes
de collagène et notamment de tubes de faibles diamètres et l'application
des tubes obtenus dans le domaine des prothèses vasculaires et des su-tures
nerveuses.
5Le collagène, qui représente environ 40 % des protéines de l'être
vivant, est la substance de soutien des tissus conjonctifs qui lui doivent
l'essentiel de leurs fonctions.
On sait que le collagène présente des propriétés mécaniques remar-
quables, un bon pouvoir hémostatique et qu'il exerce une action dans la
10 croissance cellu~aire.
A ces propriétés, il convient d'ajouter deux autres caractéristiques
fort intéressantes qui sont sa biocompatibilité et sa biodégradabilité.
La macromolécule de collagène d'une longueur de 3 000 A e-t d'une
largeur do 15 A est constituée de trois chaînes peptidiques. Chaque chaîne,
15d'une masse de 100 000 daltons, est en forme hélicoldale. Les axes des
hélices s'enroulent en hélice autour d'un axe commun à l'intérieur d'une
même macromolécule. Entre certaines chaînes peptidiques existent des
liaisons réticulaires. L'arrangement ordonné des macromolécules entre elles
conduit à la formation de fibres.
20Les excellentes propriétés mécaniques du collagène proviennent,
en grande partie, de la structure hélicoldale et des liaisons réticulaires.
Le caractère antigénique du collagène est très faible. De ce fait,
le collagène d'origine animale, ne provoque pas de réaction de rejet chez
l'etre humain, ainsi qu'il ressort d'une étude de TAKEDA,U. et coll. dans
25le Jal of Toxicology Sciences, Vol 7, suppl. Il, 19~2 pp 63-91.
Le collagène présente deux avantages importants le rendant adap-
té à la constitution d'une prothèse vasculaire: d'une part, sa biocompatibilité
et d'autre part son aptitude à exercer une action dans la croissance cellu-
laire. Par contre, dans cette utilisation, le collagène a deux inconvénients:
30 sa biodégradabilité et son pouvoir hémostatique. Cette dernière propriété
est particulièrement gênante, car elle risque de provoquer des thromboses,
et il ne peut être question de la faire disparaître en détruisant la structure
hélicoldale de la protéine, car alors, la prothèse présenterait de très mauvai-
ses propriétés mécaniques. Enfin, la biodégradabilité du collagène doit être
'7~319
suffisamment faible afin qu'il puisse être réhabite par des cellules avant
qu'il soit di~éré par les enzymes.
On connaît par ailleurs des prothèses vasculaires synthétiques qui
donnent à peu près satisfac-tion pour des diamètres supérieurs à 4 mm;
5 en dessous de cette dimension pourtant, les vaisseaux de remplacement
présentent de sérieux inconvénients, en particulier au niveau de la com-
pliance. C'est pourquoi il est apparu important à de nombreux chercheurs
de combler cette lacune à l'aide d'un biomatériau à base de collagène dont
les qualités biologiques semblaient être d'un Krand secours dans ce domaine
des prothèses vasculaires.
Dans un premier temps, I'utilisation d'hétérogreffes veineuses s'est
revélée la plus aisée et a conduit à des résultats intéressants.
Malheureusement, cette technique est d'un coût élevé et le nombre
de prélèvements de veine est limité. C'est pourquoi s'est fait sentir la néces-
15 sité de pouvoir préparer des tubes de petits diamètres à base de collagène.
Le brevet roumain 76 922 décrit un procédé et un dispositif d'obten-
tion d'éléments tubulaires à partir d'un gel de collagène; dans ce procédé,
le collagène mis en solution est soumis à une dialyse contre de l'eau distillée
additionnée de EDTA puis est transformé-en élérnent tubulaire par une techni-
20 que d'électrodéposition. Outre le fait qu'il s'agit d'une technique assez lourdeà mettre en oeuvre, on peut remarquer que les inventeurs ne donnent aucune
indication sur le diamètre minimum qu'il est possible d'obtenir avec ce
procédé.
Dans la Communication présentée par CHIGNIER E. HUC A. et
25 ELOY R. au XVlllème Congrès de la Société Européenne de Recherche Chirur-
gicale à Stresa en mai 1 982, la biocompatibilité du collagène soulignant
tout l'intérêt qu'il pourrait y avoir à réaliser des prothèses vasculaires à
partir de ces matériaux a été mise en évidence par le test suivant: une
pastille constituée d'un collagène très proche de celui des tubes ci-après
30 décrits a été cousue sur une aorte de rat préalablement perforée. Les résul-
tats obtenus ont montré une bonne biocompatibilité du matériau, I'absence
de coagulation sanguine au contact du collagène et, enfin, une resistance
mécanique suffisante pour résister à la pressis~n sanguine.
Il était donc nécessaire de mettre au point un procédé permet-
* EDTA n'est pas une marque de commerce mais une abrévia-
tion qui signifi.e "Ethylènediamine tétracetique acide"
une abréviation classique.
..... .
-
.,
~'7i~
tant d'obtenir, à partir de collagène, des tubes de
diamètres inférieurs à 4 mm susceptibles d'être appliqués
dans le domaine des prothèses vasculaires, et possèdant donc
une biodégradabilité suffisamment faible ainsi qu'une
thermostabilité satisfaisante.
Une solution à ce problème est apportée par le
procédé selon l'invention qui comporte les étapes suivantes:
extrusion, dans une filière cylindrique équipée d'un tube
central concentrique destiné à recevoir une partie du bain
de coagulation, d'un gel acide aqueux contenant 1,5% environ
de collagène natif, suivie d'une coagulation des parois
interne et externe du tube sortant de la filière dans un
bain coagulant constitué d'environ 70% d'acétone pour 30%
d'ammoniaque, d'un séchage.
15Eventuellement, le tube de collagène est soumis
après séchage à une réticulation.
Le tube sortant de la filière est avantageusement
maintenu pendant une durée d'environ deux heures dans le
bain coagulant.
20Selon un mode de réalisation préférentiel de
l'invention, le séchage du tube est effectué à l'air libre.
Selon un autre mode de réalisation préférentiel,
le séchage du tube est effectué par lyophilisation.
La réticulation du collagène est avantageusement
25effectuée par déshydratation poussée en étuve à environ 80 C
sous un vide d'environ 0,1 mm de mercure pendant environ 24
heures.
Selon un mode de réalisation préféré de
l'invention, le tube de collagène, une fois réticulé, est
30soumis à un traitement permettant d'introduire des groupes
azides dans la molécule sans toutefois occasionner de
couplage avec quelque molécule étrangère que ce soit.
On a en effet constaté, par calorimétrie différen-
tielle programmée, que la température de début de
~'
713~
dénaturation du collagène était de l'ordre de 34C ce qui
signifie que ledit collagène commencera à se dénaturer à une
température inférieure à celle de l'organisme, ce qui
contribuera à faire perdre au matériau implanté une partie
S de ses propriétés mécaniques (HUC A. Labo Pharma, 275,307-
312 -1978).
L'introduction ci-dessus m0ntionnée de groupements
a~ides dans la molécule de collagène permet d'augmenter la
température de début de dénaturation sans pour autant fixer
de composes etrangers, souven~ bL~
- 3a -
~2~'7~
au comportement biologique du matériau en général et au développement
cellulaire en particulier. On augmente ainsi d'une dizaine de degrés Celsius
la température de début de déna-turation qui devient alors nettement supé-
rieure à celle de l'organisme.
11 faut toutefois noter que cette stabilisation chimique de la protéine
n'est nécessaire que. Iorsque le tube implanté doit être soumis à des con-
traintes mécaniques importantes ou qu'une faible biodégradabilité est cle-
manclée au biomatériau.
Sur un plan plus général, le procédé d'introduction de groupemen-ts
10 azides dans la molécule de collagène peut également s'appliquer à des hétéro-greffes, dans lesquelles il joue le même rôle que pour les tubes de collagène
ce qui peut permettre d'éviter l'emploi de glutaraldéhyde qui est souvent
à l'origine de calcification, en particulier dans le cas des valves cardiaques.
La présente invention sera mieux comprise d'ailleurs et ses avanta-
15 ges ressortiront bien de la description qui suit, en référence au dessin schéma-
tique annexé dans lequel:
- Figure 1 est une vue en coupe schématique d'une filière destinée
à l'extrusion selon l'invention de tubes de diamètres supérieurs à 2 mm;
- Figure 2 est une vue en coupe schématique à un autre mode
20 de réalisation de cette filière plus spécialement adaptée à l'extrusion de
tubes de diamètre intérieur inférieur à 2 mm;
- Figure 3 est une vue en coupe très schématique du dispositif
servant à la coagulation des tubes;
- Figure 4 est une vue en coupe selon 4-4 de la figure 3.
Sur les figures (2) représente le corps de la filière munie d'un con-
duit intérieur concentrique (3), Ie gel de collagène est représenté par (4),
le bain de coagulation par (5), (6) représente le bac de coagulation, (7) un
support cylindrique femelle et (8) le tube obtenu.
Le procédé de fabrication du tube de collagène selon l'invention
30 comporte essentiellement trois étapes qui vont maintenant être décrites
en détail:
- préparation du gel de collagène,
- extrusion et coagulation du tube,
- traitements du tube en vue d'améliorer son comportement "in
'7~L9
vivo .
PREPARATION DU GEL DE COLLAGENE
-
La peau provenant de veau fraîchement abbattu est lavée à l'eau.
Les poils et les tissus sous-cutanés sont éliminés mécaniquement à l'aide
5 d'une refendeuse et seul le derme est conservé. Celui-ci est alors haché
et broyé. Le broyat obtenu est ensuite lavé par du tampon phosphate à
pH 7,8, puis rincé à l'eau permutée. Il est alors placé dans une solution
d'acide acétique à pH 3,5. La dilution doit être telle que la concentration
en collagène soit de 1,5 %. L'ensemble est homogénéisé par ultra-sons,
10 puis dégazé par agi-tation sous vide.
FORMATION DU TUBE
Le gel de collagène (4) obtenu dans l'étape précédente est extrudé
dans la filière cylindrique (2). L'originalité de cette filière est qu'elle com-porte un conduit intérieur (3) concentrique à celui qui amène le gel de col-
15 lagène (4). Ce conduit (3) sert à introduire le liquide coagulant (5) à l'inté-
rieur du gel de protéine et à donner ainsi au collagène une forme de tube
dont le diamètre intérieur sera égal à celui du conduit. Un système d'avan-
cement par vis sans fin (non représenté) permet de déplacer la filière à
vitesse constante réglable au-dessus du bain coagulant. Le tube coagulé
20 (8) est déposé sur un support cylindre femelle (7) de même diamètre que
le tube placé dans le bac de coagulation (6). Ce système empêche l'écra-
sement du tube dans le bain coagulant.
Comme on le voit sur la figure 2, le diamètre de la tete de la
filière (2) est diminué quand on désire extruder des tubes de 2, voire de
25 1 mm.
Le tube ainsi formé est laissé au repos pendant environ deux heures
dans le bain coagulant. Au bout de ce laps de temps, le tube encore gorgé
d'eau est placé sur une tige de polytétrafluoréthylène (P.T.F.E.) (non repré-
sentée) de même diamètre et séché à l'air. Après séchage, le tube peut
30 être facilement enlevé de son support.
Le tube coagulé peut être également séché par Iyophilisation.
Dans ce cas, le tube sec obtenu a une structure spongieuse et a des
parois beaucoup plus épaisses que celui séché à l'air.
Le matériau obtenu est analysé sur trois plans: sur le plan
:~Z~-~'7~
chimique, sur le plan des rnasses moléculaires et sur le plan de la structu-
re. Le premier groupe d'analyses mettra en évidence le degré de pureté
du collagène, le deuxième, I'intégrité des chaînes peptidiques et le troisième,
la non destruction de la structure hélidocoldale de la protéine. Toutes ces
5 analyses sont nécessaires pour etre sûr que la protéine possèdera toutes
les propriétés du collagène (HUC A. et BARTHOLIN F. revue de l'lnstitut
Pasteur de LYON, ll-N 2- 179-190 - 1978).
TRAITEMENT DU TUBE
a) Réticulation du collagène
Pour augmenter la résistance de la protéine, le matériau est soumis
à une déshydratation poussée en étuve à 80C sous un vide de 0,1 mm demercure pendant 24 heures. Un tel traitement crée de nouvelles liaisons
réticulaires entre les chaînes peptidiques du collagène et augrnente ainsi
son insolubilité et diminue sa biodégradabilité.
b) Amélioration de la stabilité du colla~ène par introduction de
~roupes azides dans la molécule
Les demandeurs ont, en effet, déterminé qu'il était posible d'amié-
liorer cette stabilité en soumettant le collagène à un traitement permettant
l'introduction de groupes azides dans la molécule sans pour autant coupler
20 cette molécule à des substances étrangères~ comme c'est le cas dans le
procédé décrit et revendiqué dans le brevet français 2 235 133.
On place le matériau pendant huit jours dans une solution méthano-
lique acide (méthanol pur, concentration en HCI de 0,3 N). Il se produit
une méthylation des groupements acides libres du collagène selon le schéma
25 suivant: l~ICI
Collagène-COOH + CH30H ~Coll-~C~-O-CH3 + H20
0,3N O
Les groupements acides sont ceux des acides aspartique et glutami-
que.
Le matériau est ensuite lavé abondamment à l'eau puis placé dans
une solution aqueuse à 1 ~ d'hydrazine; les groupements méthylés se trans-
forment en groupements hydrazides selon la réaction:
~l 3 NH2-NH Coll- ICl-NH-NH2
12~713~L9
Une durée de quatre à cinq heures es-t nécessaire pour obtenir
le nombre maximum de groupements transformés. Le matériau est alors
rincé abondamment à l'eau, puis sournis à l'action d'une solution de nitrite
de sodium dans de l'acide chlorhydrique 0,3 N. On obtient alors les groupe
ments azides selon la réaction:
Coll-C-N~I-NH2 +NaNO 2 -~ HCI~ Col 1- IC~-N3
O O
La durée totale de cet-te réaction es-t d'environ cinq minutes. Le
matériau est ensuite placé pendant deux heures dans du tampon borate
pH 9 (acide borique, tétraborate de sodium 0,2 M) puis rincé abondamrnent
à l'eau.
Toutes les étapes du procédé sont réalisées à température arnbiante
(20C environ).
Les dosages effectués sur le matériau final montrent qu'il ne con-
tient ni hydrazine, ni ni-trite de sodium, ni aucune autre substance étrangère.
La calorimétrie différentielle programmée révèle que la tempé-
rature de dénaturation du collagène est de 10C plus élevée pour du collagène
ainsi traité que pour du collagène brut ou simplement réticulé~ Le collagène
activé est donc plus stable que le collagène reconstitué. La température
de dénaturation dépasse alors 37C, température de l'organisme. Le collagène
conservera donc toute sa structure native et, par là, I'essentiel de ses pro-
priétés, en particulier mécaniques; il résistera beaucoup mieux à l'attaque
des enzymes protéolytiques.
Un film de collagène ainsi traité a été implanté chez le rat, en
situation intrapéritonéale et en situation sous-cutanée. Son comportement
a été comparé à celui d'un film dç collagène placé dans les mêmes situations.
Les résultats des examens histologiques font ressortir:
-. qu'au bout de 21 jours, le film brut a disparu alors que, au bout
de 90 jours, le film activé est toujours identifiable;
- que des cellules mésothéliales existent sur les deux implants,
mais que leur apparition est retardée sur le matériau activé et qu'elles
s'y développent moins bien.
Enfin, une biodégradabilité plus ou moins importante pourra être
obtenue en m.odifiant le temps de contact du collagène avec l'alcool méthy-
lique dans la première étape de la méthode de traitement aux azides. Un
12~
temps de contact plus faible entraînera une diminution du nombre de grou-
pements acides bloqués et, par là même, une protection moindre du colla-
gène. La biodégradabilité du matériau sera donc plus importante que dans
le cas du traitement complet.
c) Stérilisation
Le tube est soumis à une dose de rayonnement de 2,5 Mrad. Une
telle dose élimine tous les microorganismes, réticule le collagène et diminue
son pouvoir hémostatique.
Le procédé selon la présente invention permet donc d'obtenir des
10 tubes simples, tout à fait adaptés à la réalisation de prothèses vasculaires, de diamètre intérieur compris entre I et 10 mm.
Les résultats des analyses physico-chimiques et mécaniques des
tubes ainsi obtenus sont les suivants:
ANALYSE CHIMIQUE
- Résidu sec à 105C 86,3
- Matières minérales 0,61
- Acidité (en acide acétique) 0,33
- Azote 14,6
- Protéines totales 79,7
- Hydroxyproline 9,88
- Collagène 73,7
Les quantités sont données en g pour 100 g de produit brut.
ANALYSE PHYSIQUE
- Diffraction des rayons X: Mise en évidence
de la structure
hélicoldale
-Calorimétrie différentielle programmée:
. température début dénaturation en C: 34,3
- température fin dénaturation en C: 49,7
~H en joule par mg de collagène: 4,2 X 10-2
d'où pourcentage de structure hélicoldale: 87
ESSAIS MECANIQUES
- Contrainte à la rupture en l<g ~/cm2: 608 (coefficient variation: 20%)
- Allongement à la rupture en pour cent: 13 (coefficient variation 55%)
k'~
- Module d'élasticité en l<g f/cm2: 11.422 (coefficient variation: 12%).
On peut noter la valeur élevée de la contrainte à la rùpture en
l~g/cm2.
Quand le tube a été traité par le nouveau procédé de stabilisa-
5 tion décrit ci-avant, les résultats de calorimétrie différentielle program-
mée sont les suivants:
- Température début dénaturation en C 47
- Température fin dénaturation en C 67
soit par rapport au tube non traité une augmen-tation de 1 3C pour la pre-
10 mière température et de 8C pour la deuxième.
Il se peut qu'une simple paroi n'ait pas des propriétés mécaniquessuffisantes lorsque la prothèse est soumise à des contraintes mécaniques
importantes. Dans ce cas, la prothèse pourra être constituée soit de deux
tubes de collagène concentriques collés l'un à l'autre par une colle biologique
15 type Tissucol, soit de deux tubes de collagène' entre lesquels se trouve une
trame synthétique, par exemple en polyester.
Dans le tableau suivant sont données les compliances respectives
d'une veine saphène humaine, d'une prothèse synthétique (Gore-Tex3, d'un
tube de collagène et de deux tubes de collagène renforcés par une trame
20 en polyester.
Les résultats ont été obtenus dans le laboratoire de Biorhéologie
et d'Hydrodynamique Physiologique de l'Université de Paris Vll (H. FLAUD).
Gamme de pression Compliance en mm /mb/m
(en mm de mercure)
PROTHESE 50 1 0 0 - 2 0 0
~ . _
- Veine saphène humaine 14,2 4,5
30 - Gore - Tex (diamètre 4 mm) 2,7 2,7
- Collagène (diamètre 4 mm) 21,5 11,6
- Collagène renforcé 5,6 5,6
(diamètre 4 mm) _
* Tissucol et Gore-Tex sont des mar~ues de commerce.
i.,r~, 7
.. ',
.1~4';'~
Ces résultats rnontrent que le tube de collagène simple a une com-
pliance plus élevée que la veine saphène et que celle de la prothèse de
colla~ène renforcée par la trame synthétique est plus élevée que celle de
la prothèse en Gore Tex.
Les tubes de petits diamètres en particulier peuvent être utilisés
pour la réalisation de sutures nerveuses. Les premières e~périences faites
dans ce domaine ont montré que ce biomatériau permettait de réaliser
des jonctions nerveuses dans de bonnes conditions.
