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~ Procédé de préparation de gamma-globulines
; ~ ~ adminiskrées par voie intraveineuse et gamma-globulines
obtenues
2~0
La présente invention a trait à un procédé de
~ préparation de gamma-globulines administrables par voie
t~ intraveineuse ainsi qu'aux gamma-globulines obtenues par ce
procédé
Il exiske actuellement sur le marché un cer-
tain nombre de préparations de gamma-glohulines obtenues par
; des procédés différen-ts et qui présentent à la fois des
qualités et des inconvénients liés à ces procédés.
~ Parmi les inconvénients que ces procédés
s'efforcent d'atténuer le plus possible, se trouve en bonne
place le pouvoir d'activation du complément qui peut
entrainer des réactions allant jusqu'au choc anaphylactique.
D'une façon générale, ce pouvoir anti-complémentaire est
attribué à l'ex.istence d'agrégats globuliniques qui seraient
inhérents aux diférents procédés de préparat.ion et
~:
.
.,
~269~
notamment aux étapes de fractionnement alcoolique.
C'est pourquoi, il a été déjà développé
différents procédés de préparation cllerchant à supprimer, ou
du moins à limiter cet inconvénient.
5Un premier procédé cherche à éliminer les
agrégats et consiste à effectuer une digestion à la pepsine
de la préparation de gamma-globulines, de fa~on à provoquer
une rupture de chaines lourdes à proximité de la jonction
des fractions Fab et Fc. Voir, par exemple, le brevet F~-A-
102.433.342.
Un autre procéde, qui avait été mis au point
par la déposante, consiste à traiter une préparation de
gamma-globulines à la plasm.ine, de façon à provoquer une
digestion ménagée conservant un pourcentage important (de 30
à 50 ~0) de gamma-globuline intacte et donnant des fragments
Fab et Fc. Cette préparation est active et très bien
tolérée.
Ces différents procédés qui cherchent à
réduire le pouvoir anti-complémentaire présentent cependant
l'inconvénient d'une dlgestion plus ou moins ~oussée des
gamma-gl~bulines et consistent finalement à rechercher un
compromis entre l'innocuité et l'activité de la préparation.
; On peut également citer divers procédés de
préparation formant des gamma-globulines modifiées chimique-
;25 ment : alkylation, réduction, sulfonation.
Le bxevet FR-A-2.301.266 préconise de ne pas
I effectuer de traitement enzymatique, notamment à la pepsine,
~ des gamma-globulines et d'effectuer, à la place, un frac-
I tionnement au polyéthylène-ylycol.
30Ainsi, il a été mis au point un procédé de
préparation de gamma-globulines par fractionnement au
I
¦ polyéthylène-glycol (P.E.G.) qui présente l'avantage
d'empêcher la formation des agrrégats ou de les éliminer,
tout en conservant des globulines intactes.
En outre, bien q~l'à des degrés divers, les
différentes préparations déerites ci-dessus peu~ent
.
1,
~lZ69Z9
--3--
présenter des facteurs de choc par actlvation du système
kallicr~ine-bradyklnine, ces facteurs paralssent liés ~ une teneur
r~siduelle en activateur de pr~kallicréine.
Une autre technique, qui permet d'obtenir des gamma-
globullnes de bonne qualit~, consiste ~ effectuer un traitement ~
pH acide, en présence de falbles quantités de pepsine. Voir, par
exemple, J.J. Nalsh : Purificatlon of normal immunoglobulin for
intravenous use. DEVELOP. BIOL. STAND. 1974, 27, 31-6.
Cependant, il reste encore des agr~gats at des dim~res à un taux
relativement lmportant.
On a également proposé, dans la demande de brevet ~P-A-O
120 385, publiée le 3 octobre 1984, d'éviter d'utiliser des
traitements ~ la pepsine ou ~ la plasmine, que ces enzymes soient
insolubilisés ou non, pour proposer une digestion aux enzymes
pancréatiques accompagn~e d'un traite~ent au polyéthylène glycol
concentration relativement élevée. Cependant, cette gamma-
globuline n'est pas ~quilibr~e en sous-classes.
La présente invention se propose de fournir des
pr~parations de gamma-globulines administrables par voie
intraveineuse, ~ la fois dépourvue~ d'agrégats et de dim~res,
dépourvues de pouvoir anti-compl~mentaire et d~pourvues de
kallicr~ine et d'activateur de prékallicréine et avec un profil
des sous-classes comparable ~ celui du Sérum Humain normal.
Un autre ob~ectif de l'invention es~ de fournir un tel
proc~dé qui, appliqué aux pr~parations de gamma-globulines
pr~parées par un fractionnement avec de ~aibles teneurs en PEG ou
substances analogues, améliore ces préparations en diminuant
notamment le pouvoir anti-complémentaire, la teneur en kallicreine
6~ 9
`l~
et en activateur de la pr~kallicr~ine, ainsi que le PEG r~slduel.
L'invention a pour objet un procédé de pr~paration de
qamma-qlobulines administrables pare voie intraveineuse,
caractérisé en ce qu'il comporte une étape de fractionnement au
poly~thy1éne-qlycol (PEG) ou substances similaires et une étapa de
traitement enzymatlque ménagé, dans lequel le pH est d~pendant de
la nature de l'enzyme utilisée~ celle-ci ~tant a~outée de
préférence 60US forme de traces, le traltement étant conduit pour
éviter une protéolyse sensible.
; L'enzyme utllisée est ehoisie dans le groupe form~ par les
pepsines, $ibrinolysines (plasmine), et papaines.
Selon un aæpect, la pr~sente invention fournit un procédé de
préparation de gamma-globuline administrable par voie
intraveineuse, caract~risé en ce qu'il comporte une étape de
fractionnement au poléthyléne-glycol IP~G) et une 6tape de
traitemen~ enzymatique m~nagé évitant une protéolyse sensible à
l'aide d'une enzyme choisie dans le groupe form~ par les pepslnes,
les flbrinolysines et les papaines, ladi~e ~tape de traitement
enzymatique étant conduit ~ un pH adapté ~ l'enzyme utilisée.
Le matériau de d~part est une frac~ion d'ori~ine sérique
riche en gamma-globulines telle que la fraction II Teehnigue 6.9
de Cohn, connue pour donner; des produits exempts d'h~pati~e, ou
une $raction d'origine placentaire telle que la fraction technique
6.9 de Cohn modifiée par Taylor. Cette fraction a une pureté en
IgG sup~rieure ou égale à 90%. Elle peut contenir des guantités
variables en albumine qui peuvent aller jusgu'à 10%.
.~
~ ,"~
~Z6~
-4a-
ler exemPle.
1 - ~
La matiére de d~part consiste en une mise en
solution du précipit~ et en une clarification de cette solution,
solution qui contient en g~néral de 1 ~ 4% de protéines. On
procède à une ~tape de pr~aipitation par adjonction de
poly~thyl~ne-glycol (PEG), de poids mol~culaire 4 000, de fac5on à
obtenir une concentration en PEG de 5%. Le pH est ajust~ 5,8 par
de l'aclde ac~tique N ou HC1 0,1 N et la temp~rature maintenue
entre 0 et 4C. La force ionique est trés basse, de l'ordre de
0,02.
On obtient ainsi un précipit~ qui contient les agr~gats
que l'on s~pare alors de la solution par simple d~cantation, par
filtration, ou par cent;ifuga~ion. Le pr~cipit~ est ~limin~.
Sur le surnageant qui en r~sulte, on effectue ensuite
une nouvelle precipitation, sans nouvelle addition de PEG, à la
même temp~rature, mais en augmentant la force ionigue ~ 0,05 par
addition de ~aC1 de 0,05~ ~ 0,2% et de pr~ference 0,1% et en
portant le pH de 7 à 8,5 et de
;: :
1~ .J
v ,,s
~69~2~
préférence 8,0.
Les gamma-globulines préclpitent alors et
l'on sépare de la phase liqulde par décantat.ion ou centrifu-
gation le précipité ainsi formé.
Ce précipité contient les gamma-globulines
dépurvues d'agrégats de haut poids moléculaire, mais pouvant
encore contenir un taux voisin de 10 ~ de protéines
dimérisées. La pureté électrophorétique de ce produit est
supérieure ou égale à 90 ~0. Il peut contenir de l'albumine.
L'activité anti-complémentaire est -très faible. Le taux de
kallicréine et de l'activateur de prékallicréine est réduit,
; mais celles-ci peuvent encore exister à des -taux variables,
suivant la teneur de la matière de départ utilisée.
2 - Traitement enzymati~ue ménagé :
Le précipité de gamma-globuline est repris
dans de l'eau apyrogène de faSon à obtenir une concentration
de 20 g/l en gamma-globulines. On ajoute 50 g/l de sac-
charose et 0,002 g/l de pepsine, la température étant amenée
et maintenue à 37~C, le pH étant réglé à 4,1 et on lncube
,~ ~ 20 pendant 24 heures.
On préfère utiliser la pepsine en solution,
sous forme insolubilisée sur des supports classiques.
'incubation s'effectue pendant 10 à 96 heures, à cette
température, suivant la quantité d'enzymes utilisée. Après
~ 25 traitement, le pH est neutralisé.
i ~ 3 - Traltement ultérieur :
:On effectue une ultrafiltration, de façon à
porter la concentration de la solution de gamma-globulines à
70 g/l.
~ Cette étape d'ultrafiltration est suivie
d'une diaEiltration destinée à l'élimination du PEG. Cette
diafiltration s'effectue par une solution de NaCl 4,5 g/l.
Le volume de solution de diafiltration à utiliser est fonc-
l ; tion du taux de PEG à éliminer. Généralement, un volume
1 35 correspondant à 8 Eois celui de la solution d'IgG permet
d'éliminer plus de 90 ~0 du PEG contenu init:ialement dans la
'--'
:
solution et de passer ainsi d'un taux de 1,5 g/l à 0,10 g/l.
On effectue alors l'ajustement de la solution
obtenue à 50 g/l de protéine, 50 g/l de saccharose, 4,5 g/l
de chlorure de sodium, à pH 7,0.
On répartit ensuite la substance en flacons
de 0,5 - 2,5 ou 5 g de gamma-globulines, puis on effectue
une lyophilisation.
2ème exemple :
La matière première de départ consiste en une
mise en solution du préclpité et en une clarlfication de
cette solution qui contient de 1 à 12 ~ de p~otéines et, de
plus, préférentiellement 6 % à 10 ~0 de protéines.
Traitement enzxmatique ménagé :
On procède à un faible traitement par de la
fibrinolysine humaine. La concentration en fibrinolysine
humaine est de 0,5 à 4 unités caséinolytiques par gramme de
! protéines.
La température d'incubation est de O' à 37-C,
de préférence 4C. Le p~ est de 6,0 à 8,0, de préférence
20 7,4
; Le temps d'incubation est dépendant de la
l température et de la quantité d'enzyme mise : de 2 jours à
~ ~ ; 10 jours.
i 2 - Précipitation au PEG :
On procède à une étape de précipitation de la
¦~ solution protéinique qui contient en général de 1 à 4 ~ de
protéines par adjonction de polyéthylène glycol (PEG), de
1~ ; poids moléculaire 4 000, de faSon à ob-tenir une concentra-
¦j j tion en PEG de 5 %. Le pH est ajusté à 5,8 par de l'acide
acétique N ou HCl 0,1 N et la température maintenue entre O
l~ et 4-C. La force ionique est tres basse, de l'ordre de 0,02.
Il On obtient ainsi un précipite qui contient
j des agrégats que l'on sépare alors de la solution par simple
décantation, par filtration, ou par centrifugatlon. Le
précipité est éliminé.
Sur le surnageant qui en résulte, on eEfectue
:
:
i.
3~2~9~2~
ensuite une nouvelle précipitation, sans nouvelle addition
de PEG, à la même température, mai.s en augmentant la force
ionique à 0,05 par addition de NaCl de 0,05 % à 0,2 ~0 et en
portant le pH de 7 à 8,5 de préférence à 8,0.
Les gamma-globulines précipitent alurs et
l'on sépare de la phase liquide le précipité ainsi formé,
par décantation ou centrifugation.
3 - Traitement ultérieur :
,
On effectue une ultraf.iltration de façon à
porter la concentration de la solution de gamma-ylobulines à
70 g/l.
Cette étape d'ultrafiltration est suivie
d'une diafiltration destinée à l'élimination du PEG. Cette
diafiltration s'effectue par une solution de NaCl 4,5 g/l.
Le volume de solution de diafiltration à utiliser est fonc-
tion du taux de PEG à éliminer. Généralement, un volume
correspondant à 8 fois celui de la solution d'IgG permet
d'éliminer plus de 90 ~0 du PEG contenu initialement dans la
¦ solution et de passer ainsi d'un taux de 1,5 g/l à 0,10 g/l.
On efEectue alors l'ajustement de la solution
obtenue à 50 g/l de protéines, 50 g/l de saccharose, 4,5 g/l
~ de chlorure de sodium, à pH 7,0.
I On répartit alors ensuite la substance en
flacons de 0,5 - 2,5 ou 5 g de gamma-globulines, puis on
effectue une lyophilisation.
L'analyse des gamma-globulines obtenues selon
l'invention montre les avantages suivants :
. Diminution du pouvoir anti-complémentaire
dans les différentes techniques de détermination utilisées.
. Les sous-classes sont équilibrées.
. Absence de facteurs hypotenseurs démontrée
par test tensionnel sur chien et sur rat.
. Diminution du taux de protéines dimérisées
de plus de 50 ~O par rapport à la teneur initiale et obten-
tion d'un taux de monomères très élevé (supérieur à 90 ~0).
. Taux de fragments inférieurs à 7 S nul ou
,...
~2~ 2~Ys
très faible.
. Taux de kallicréine et d'activateur de la
prékallicréine nuls (inférieurs à la limite de sensibilité
du test).
. Tau~ de PEG résiduel diminué de plus de 10
fois par rapport à la teneur d'origine.
Bien que l'invention ait été décrite à propos
de formes de réalisation particulières, il est bien entendu
qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter
diverses modifications sans pour cela sortir ni de son cadre
ni de son esprit.
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