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13~086~
1
ACIDE NUCLEIQIfJE CO1)ANT POUR L' ENZYME DE CONVERSION
DE L'ANGIOTENSINE (ECA) HUMAINE, ET SES
APPLICATIONS, NOTAMMENT POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO
DE L' HYPERTEN.~.~ION A:RTERIELLE .
L'invention concerne un acide nucleique codant
pour 1'enzyme de conversion de 1'angiotensine (ECA)
humaine ainsi que des vecteurs contenant cet acide
nucleique et 1'utilisation de ces derniers pour la
production d'ECA humaine. L'invention concerne
egalement les applications de cet acide nucleique,
notamment dans le domaine de la conception de nouveaux
inhibiteurs de 1'ECA humaine.
L'ECA, ou peptidyl dipeptidase A (EC 3.4.15.1), ou
encore kininase II, joue un role important dans la
regulation de la pression arterielle, en hydrolysant
1'angiotensine I (peptide inactif libere apres clivage
de 1'angiotensinogenE~ par la renine) en angiotensine II
vasopressive jouant un role dans les mecanismes de
1'hypertension arterielle (SKEGGS, L.T., et al (1986)
J. Exp. Med., 7.03, 295-299).
L'inhibit:ion dea 1'activite de 1'ECA par 1'EDTA et
les chelateurs de m~taux, indique qu'il s'agit dune
metallopeptida~;e, plus particulierement dune peptidase
a zinc, capable d'hydrolyser, non seulement,
1'angiotensine I, maps aussi la bradykinine (un peptide
vasodilateur et: natriuretique qu'elle transforme en un
heptapeptide inactif), et de nombreux autres peptides a
activite biologique (YANG, H.Y.T. et al (1970)
Biochim. Biophys. Acaa, 214, 374-376 ; ERDOS, E.G., et
al (1987) Lab. Invest:., 56, 345-348).
L'ECA est une peptidase largement distribuee daps
1'organisme, que 1'on retrouve par exemple sous forme
d' enzyme memb~ranair~e a la surface des cellules
13~~~6~
2
endotheliales vasculaires, et des cellules epitheliales
renales, ainsi que sous forme d'enzyme circulant dans
le plasma (ERDOS, et al (1987) sus-mentionne ;
CARDWELL, P.R.B. et al, (1976) Science, 191, 1050-1051
RYAN, U.S. et al (1976) Tissue Cell, 8, 125-145).
Des methodes dea purification de 1'ECA humaine ou
animale ont de:ja ete decrites (notamment dans BULL H.G.
et al, (1985)J. Biol. Chem., 260, 2963-2972 ; HOOPER,
N.M. et al, (1!387) Biochem. J., 247, 85-93).
Toutefois, la structure de 1'ECA humaine nest
pas connue <~ 1'heure actuelle. Seules quelques
sequences peptidique~s de 1'ECA d'origine animale ont
ete publiees (BERrfSTEIN, K.E. et al (1988), Kidney
Int., 33, 652-655: HARRIS, R.B. et al (1985) J. Biol.
Chem., 260, 228-2211; IWATA, K. et al (1982) Biochem.
Biophys. Res. Commun, 107, 1097-1103 ; IWATA, K. et al
(1983) Arch. Biocheam. Biophys., 227, 188-201 ; ST
CLAIR, D.K. et al (1'986) Biochem. Biophys. Res. Commun,
141, 968-972 ; SOFFE1R, RL. et al (1987) Clin. Exp. Hyp.
A9, 229-234).
Quelques essais de clonage de 1'ADN codant pour
1'ECA animale ont ete effectues a partir de deux
organes riches en EC:A, les reins et les poumons, mais
aucun acide nuc:leique complet codant pour 1'ECA animale
n'a cependant ete decrit ; seuls quelques fragments
d'un tel aside nuc7Leique ont ete decrits (DELUCA-
FLAHERTY, C. et: al (:L987) Int. J. Peptide Protein Res.,
29, 678-684 ; BERN~~TEIN K.E. et al, (1988 J. Biol.
Chem., 263, 11021-11024)). Les quantites d'ARN messager
(ARNm) codant pour 1'ECA sont probablement trop faibles
daps ces organes pour permettre le clonage d'un ADN
compl2mentaire (ADNc;) de set ARNm. Aucun essai de
~.34U868
3
clonage de 1'ADN codant pour 1'ECA humaine n'a ete
decrit jusqu'a maintenant.
Bien que le ro:le physiologique de 1'ECA dans les
tissus extra-vascula~ires ne soit pas encore connu, il
est desormais bien etabli que cette enzyme que 1'on
retrouve dans 1'endothelium vasculaire et dans le
plasma, joue un role essentiel dans 1'homeostasie
circulatoire par son action de clivage du dipeptide
carboxy-termin~~l dea 1'angiotensine I, activant ainsi
cette derniere en la transformant en angiotensine II
qui est un ~~eptide vasoconstricteur, stimulant la
production d'a:Ldosterone, et facilitant la transmission
adrenergique.
Etant donne le role essentiel de 1'angiotensine II
dans le controle de la pression arterielle, une
recherche active s'est developpee sur la synthese
d'inhibiteurs de 1'E;CA. Le captopril a ete le premier
inhibiteur oral de 1'ECA, suivi par de nombreux autres
composes. Actuellement, les inhibiteurs de 1'ECA
occupent une ~~lace importante dans le traitement de
1'hypertension arterielle. La structure complete de
1'ECA n'etant pas connue,les inhibiteurs sus-mentionnes
ont ete congus sur la base de la structure de proteases
a zinc posseda.nt de;s proprietes enzymatiques voisines
de celles de 1'ECA, notamment sur la base de la
structure du site actif de la carboxypeptidase A
(ONDETTI, M.A. et al (1977) Science, 196, 441-444).
Ainsi, en 1'ab:aence d'indication precise sur la
structure de 1'ECA, et plus particulierement sur le ou
les sites) a~~tif(s) de cette derniere, on conroit
facilement que les inhibiteurs de 1'ECA sus-mentionnes
synthetises sur la base d'analogies avec la structure
d'autres enz~rmes, peuvent etre des molecules
~~~!~$6~
4
insuffisamment actives, ou non totalement specifiques
de 1'ECA et suscs:ptibles de posseder une action
therapeutique insuffisante, ou de creer des effets
secondaires indes~irables. Parmi ces effets
indesirables, on distinguera notamment des phenomenes
de toux, de t:roubleas digestifs, d'eruptions cutanees
qui peuvent etre liEa a 1'inhibition d'autres systemes
enzymatiques par les inhibiteurs de 1'ECA sus-men-
tionnes.
Un des buts de la presente invention est de
permettre la conception de nouveaux inhibiteurs de
1'ECA plus pui.ssant:~ et specifiques de cette derniere
que ne le sont les actuels inhibiteurs sus-mentionnes,
permettant eve:ntuel7_ement une meilleure efficacite a
dose moindre, et limitant les risques d'effets
indesirables de ces :nouveaux inhibiteurs.
La presence invention a pour obj et Le clonage et
le sequen~age de 1'acide nucleique codant pour 1'ECA
humaine ; ce travail a ete realise a partir de deux
banques d'ADN comp~lementaires d'ARNm provenant de
cellules endotheliales de veines ombilicales humaines
et de sondes nucleotidiques deduites a partir de
sequences peptidiques obtenues par sequengage de
fragments purifies de 1'ECA humaine. Les techniques
utilisees pour le clonage et le sequen~age de 1'acide
nucleique sel.on 1.'invention seront plus parti-
culierement de~crites dans la description detaillee de
1'invention.
Il sera fait reference dans ce qui suit, au
tableau I et aux figures dans lesquels .
- le tableau I represente les fragments
peptidiques obt:enus ~3 partir de 1'ECA humaine purifiee.
.~340~68
- la figure 1 represente la comparaison des
sequences en acide:~ amines aminoterminales de 1'ECA
humaine, et dens ECA provenant de lapins, de boeuf, de
porc et de souris ;
- la figure 2 represente les positions respectives
des acides nucleiques des trois clones utilises pour la
determination de 1'acide nucleique codant pour 1'ECA
humaine;
- la figure 3 represente 1'acide nucleique ainsi
que le polypep~tide, deduit de ce dernier, correspondant
a 1'ECA humaine ;
- la figure 4 represente les homologies entre
certaines sequences. peptidiques de 1'ECA humaine
(ECAh), de la thermolysine (THERM), de 1'endopeptidase
neutre de rat ou de lapin (rNEP), et de la collagenase
de fibroblastea de p~eau humaine (COLLh) ;
Une etude: approfondie de 1'acide nucleique de
1'invention, ainsi clue du polypeptide deduit a partir
de ce dernier cat cor:respondant a 1'ECA humaine, conduit
aux observations suivantes .
- la phasEa de lecture ouverte de 1'acide nucleique
de la figure 3 east constituee dune sequence d'ADN
delimitee par les nucleotides correspondant aux
positions 23 et 109 de la figure 1 codant pour un
peptide signal de 29 acides amines, et dune sequence
d'ADN delimitee par les nucleotides situes aux
positions 110 a 3940 de la figure 3, et codant pour
une proteine m~iture de 1277 acides amines ;
- 1'acide nucle:ique de 1'invention est caracterise
par une forte homologie interne (superieure a 60 %)
entre la sequence d"ADN delimitee par les nucleotides
situes aux position~~ 700 et 1770, et celle delimitee
par les nucleoi~ides situes aux positions 2495 et 3565.
I34p8~g
6
Les polypeptides d.e 257 acides amines codes res-
pectivement par 7Les deux sequences d'ADN sus-
mentionnees presentent egalement une forte homologie
entre eux (de 1'o:rdre de 67,7 %). la plus forte
homologie se situe au niveau des acides amines des
parties centrales des deux polypeptides sus-mentionnes
par exemple le polypeptide delimits par les acides
amines situes aux positions 361 et 404, et celui
delimits par l~es acides amines situes aux positions 951
et 1002, pre:~entenit un pourcentage d'homologies de
1'ordre de 85~ %. Les deux polypeptides homologues
comprennent clhacun une sequence His-Glu-Met-Gly-His
correspondant aux acides amines situes aux positions
361 a 365 et 959 .a 963 de la figure 3. Une etude
comparative (representee sur la figure 4) de cette
derniere sequence pe:ptidique de 5 acides amines amines,
avec les sites act:ifs de plusieurs enzymes dont la
thermolysine, :~ugger~e le fait que T une au moins de ces
deux sequences de 5 acides amines, que 1'on retrouve
dans les deux parties homologues de 1'ECA, pourrait
constituer une parti~e du site actif de cette derniere ;
- le produit dEa la phase ouverte de lecture sus-
mentionnee comprend 17 sites potentiels de
glycosylation, dont la plupart sont groupes dans la
region N-terminals de la molecule, et dans la region
localises a la jomction entre les deux domaines
d'acides amines homologues sus-mentionnes.
La presen.te invention concerns donc tout acids
nucleique comprenant. la sequence nucleotidique de la
figure 3 codant: pour 1'ECA humaine.
L'invention concerns plus particulierement tout
acids nucleique~ comprenant la sequence d'ADN delimitee
par les nucleoi~ides situes aux positions 23 et 3940 de
13408~g
7
la figure 3, ea cod<~nt pour la pre-ECA humaine de 1306
acides amines : les 29 premiers acides amines du cote
N-terminal rep~resent:ent le peptide signal, et les 1277
acides amine; restant representent 1'ECA humaine
nature.
L'invention c:oncerne egalement tout acide
nucleique comprenani~ la sequence d'ADN delimitee par
les nucleotides situes aux positions 110 et 3940 de la
figure 3, et codant pour 1'ECA humaine mature.
L'inventi~on a egalement pour objet tout acide
nucleique issu de la sequence d' ADN de la figure 3 et
codant pour un polypeptide susceptible de posseder des
proprietes en~:ymatiques du type de celles de 1'ECA
humaine, notamment un polypeptide capable d'hydrolyser
1'angiotensine I et/ou les kinines, notamment la
bradykinine, ou tout. acide nucleique ne se distinguant
du precedent au niveau de sa sequence nucleotidique que
par des substitutions de nucleotides n'entrainant la
modification de la sequence en aminoacides du susdit
polypeptide da.ns des conditions propres a lui faire
perdre les susdites :proprietes.
A ce titre, 1'invention concerne plus
particulierement tout acide nucleique comprenant T une
ou 1'autre des regions homologues de 1'ECA sus-
mentionnees.
Parmi lns acides nucleiques conformer a
1'invention, on citera notamment tout fragment d'ADN
contenant .
- une sequence d'ADN s'etendant entre, dune part,
un nucleotide situe entre les positions 1 a 1177 et,
d'autre part, un nuc:leotide situe entre les positions
3070 a 3940 ;
l3~pg~g
8
- une sequence d'ADN s'stendant entre, dune part,
un nucleotide situs entre les positions 110 a 1177, et
d'autre part un nuc:leotide situe entre les positions
1276 ~ 1966 ;
- une sequence d'ADN s'etendant entre, dune part,
le nucleotide situe entre les positions 1967 a
2971, et, d'autre part, le nucleotide situs entre les
positions 3070 a 3940.
L'invention concerns aussi les acides nucleiques
dont les ssquEances nuclsotidiques sont modifises dans
les limites aotorisees par la degsnerescence du code
genstique, des lors que les polypeptides codes par ces
acides nucleiques conservent soit une structure
primaire identique, soit leurs proprietss enzymatiques
ou immunologiq~ues.
De telles modifications non limitatives conduisent
par exemple a des acides nuclsiques variants qui se
distinguent de;s acides nuclsiques ci-dessus .
- par addition et/ou
- supprescsion d'un ou de plusieurs nucleotides
et/ou
- modific<~tion ~d'un ou de plusieurs nucleotides.
L'invention a plus particulierement pour objet
tout acids nuc:leique~ presentant la caractsristique de
s'hybrider spscifiquement avec 1'acide nuclsique
represents su:r la figure 3, dans les conditions
dsfinies ci-apses .
- traitemEant de prshybridation du support (filtre
de nitrocellulose ou membrane de nylon), sur lequel est
fixe 1'acide n.ucleique susceptible de s'hybrider avec
celui de la figure 3, a 65°C pendant 6 heures avec une
solution ayant la composition suivante . 4 x SSC,
x Denhardt,
~3~086~3
9
- remplac:ement de la solution de pre-hybridation
au contact du support par une solution tampon ayant la
composition suivantea . 4 x SSC, 1 x Denhardt, 25 mM
NaP04 pH 7, 2 mM EDTA, 0,5 % SDS, 100 ,ug/ml d'ADN de
sperme de saumon sonique, comprenant 1' acide nucleique
de la figure 3 en tint que sonde, notamment de maniere
radioactive, ea pre.alablement denaturee par un trai-
tement a 100°C pendant 3 minutes,
- incubation pendant 12 heures a 65°C,
- lavages successifs avec les solutions suivantes .
. 2 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5 % SDS, pendant 45
minutes a 65°C a quatre reprises,
. 0,2 x S~SC, 0,1 x SSC pendant 45 minutes a 65°C a
deux reprises,
. 0,1 x S;SC, 0,1 % SDS pendant 45 minutes a 65°C.
I1 est ~~ rappeler que la composition de la
solution de Denhardt. est la suivante . 1 % ficoll, 1 %
polyvinylpyrro:lidone, 1 % BSA (albumine de serum de
boeuf), et que 1 x SSC est constituee de 0,15 M de NaCl
et 0,015 M de citrate de sodium, pH 7.
L'invention concerne egalement tout acide nu-
cleique presentant la caracteristique de s'hybrider
specifiquement avec 1'acide nucleique de la figure 3
dans des conditions non stringentes reprenant les
caracteristiques essentielles des conditions strin-
gentes definie:~ ci-d~essus, sauf pour ce qui concerne la
temperature qui est de 40°C dans les conditions non
stringentes, et les lavages successifs qui, dans les
conditions non stringentes, sont realises a 1 'aide de
2 x SSC a 45°C pendant 15 minutes a 2 reprises.
L'invention vise egalement les sondes nucleo-
tidiques susce:ptibles de s'hybrider avec les acides
nucleiques dec:rits precedemment, ou leurs sequences
13~08~~
complementaires, ai:nsi qu'avec Y ARN messager codant
pour 1'ECA et aver le gene humain responsable de
1'expression de 1"ECA, daps les conditions d'hy-
bridation definies c:i-dessus.
I1 va den soi que les conditions d'hybridation
stringentes ou non. stringentes, definies ci-dessus
constituent des conditions preferees pour
1'hybridation, mais ne sont nullement limitatives et
peuvent etre modifiees sans affecter pour autant les
proprietes de reconnaissance et d'hybridation des
sondes et des acides nucleiques sus-mentionnes.
Les conditions salines et de temperature, au cours
de 1'hybridation et du lavage des membranes, peuvent
etre modifiees dans le sens dune plus grande ou d'une
plus faible string~ence sans que la detection de
1'hybridation en soit affectee. Par exemple, il est
possible d'ajouter de la formamide pour abaisser la
temperature au cours de 1'hybridation.
L':invention concerne egalement le
polypeptide dont 1<~ sequence en acides amines est
representee sur la figure 3, ainsi que tous les
polypeptides :ausceptibles de posseder une activite
enzymatique du type ~de celle de 1'ECA et qui sont codes
par les fragments d'.ADN sus-mentionnes issus de 1'acide
nucleique de la figure 3.
Parmi l~es polypeptides sus-mentionnes, on
distinguera noi~ammen~t
- le po:Lypeptide s'etendant entre les acides
amines correspondant: aux positions 1 et 619 de la
figure 3 ;
- le po7Lypept:ide s' etendant entre les acides
amines correspondant aux positions 620 et 1229 ;
~~~(~~6g
11
- le polypept.ide s'etendant entre les acides amines
correspondant aux positions 350 et 395 ;
- le polypept:ide s'etendant entre les acides
amines correspondant: aux positions 948 et 993.
Les polyp~eptide~s precedents peuvent etre modifies
des lors qu' il.s con;servent les proprietes biochimiques
ou immunolog~iques ou pharmacologiques definies
precedemment.
Par exem~ple, .et de fagon non limitative, des
polypeptides clans le cadre de 1'invention peuvent se
distinguer des polypeptides definis ci-dessus ;
- par addition et/ou
- suppre;asion d'un ou plusieurs acides amines
et/ ou
- modification d'un ou de plusieurs acides
amines, sous reserve que les proprietes biochimiques ou
immunologiques ou p~harmacologiques comme indique ci-
dessus soient ~~onservees.
On congoi.t que 1'homme de metier dispose de la
possibilite d'identifier, voire de selectionner ceux
des polypeptides de sequences plus courtes qui entrent
dans le champ de _L'invention. A titre de 1'un des
moyens generaux lui. permettant de proceder a cette
identification, on mentionnera, par exemple, le
traitement du polypeptide de la figure 3 avec une
protease clivant le polypeptide sus-mentionne dans un
site peptidiq~ue choisi, snit dans une region N-
terminale, sort dans> une region C-terminals, suivi de
la separation du fragment N-terminal ou du fragment C-
terminal du restant dudit polypeptide, ce "restant"
~tant alors tests pour son activite enzymatique vis-a-
vis de 1'angiovtensine et/ou de la bradykinine. En cas
de reponse po;~itive, 1'on aura alors etabli que le
134~8~~
12
fragment N-terminal ou C-terminal, ne jouait pas un
role signif:icatif, sinon essentiel pour la
manifestation des proprietes enzymatiques dudit
polypeptide. L'ope:ration peut eventuellement etre
repetee pour autant: que 1'on dispose dune protease
susceptible do reconnaitre un autre site specifique
proche dune extremiite N-terminale ou C-terminale du
polypeptide reatant. La perte par le polypeptide plus
petit reconnu des p~_~oprietes enzymatiques du fragment
plus long dont i.l etait issu pent conduire a
1'hypothese qL~e le dernier fragment separe jouait un
role significatif dins la manifestation des proprietes
enzymatiques du polypeptide de la figure 3.
Une autre variante, plus simple que la precedente,
de detection ~des rE:gions de 1'ECA essentielles a la
manifestation des activites enzymatiques de cette
derniere, pent et:re basee sur des traitements
enzymatiques dl'un acide nucleique codant pour 1'ECA,
avant 1'incorporati.on de 1'acide nucleique ainsi
obtenu, et presume c;oder pour un polypeptide possedant
des activites enzymatiques du type de celle de 1'ECA,
dans le vecteur d'expression utilise pour la mise en
oeuvre d'un procede de production dudit polypeptide
dans 1'hote ce:llulaire approprie (procede qui sera plus
particulierement ~detaille dans ce qui suit). Ce
traitement enz:ymatique peut alors consister soft en un
emondage des eaxtremites de 1'acide nucleique initial
(codant par exemple pour le polypeptide de la figure 3
en entier), par exemple par une enzyme
exonucleolytiqixe, te~lle que Ba131, soft par une ou
plusieurs enzymes de restriction choisie pour leurs
sites de reconnais:~ance respectifs (le cas echeant
amenages par :mutagenese ponctuelle dirigee) dans la
13408ti~
13
sequence de 1'acide nucleique initial, soit par
1'addition d'un fragment d'ADN synthetique de jonction
entre le site de coupure de 1'enzyme de restriction et
le debut de :La region a exprimer. L'acide nucleique
tronque obtenu peut alors etre teste, apres
incorporation dans :Le vecteur choisi et transformation
de 1' hote cs~llula:ire avec le vecteur recombinant
obtenu, pour sa capacite a exprimer un polypeptide
tronque correspondant, possedant encore les susdites
proprietes enzymatiques -- ou au contraire ne les
possedant plu:a, d'ou la possibilite, comme dans la
variante precedent:e, d'identifier au sein du
polypeptide ds~ la figure 3, les sequences jouant un
role important:, sinon essentiel dans la manifestation
des proprietes enzymatiques de 1'ECA.
L'invention a egalement pour objet tout acide
nucleique recombinant contenant tout fragment d'ADN du
type sus-indic~ue codant pour la pre-ECA humaine, ou
1'ECA humaine mature, ou encore pour tout polypeptide
susceptible ds: possceder une activite enzymatique du
type de celle de 1'ECA, associe avec un promoteur et/ou
un terminateur de transcription reconnu par les
polymerases de' la cellule hote dans laquelle ledit
acide nucleiq~ze recombinant est susceptible d'etre
introduit.
L'introduction dudit acide nucleique recombinant
dans la ce11u7Le hote, est avantageusement realisee a
1'aide de vecteurs, notamment du type plasmide, qui
sont aptes a se repliquer dans ladite cellule hote et a
y permettre 1'expression de la sequence codant pour
1'enzyme.
Ledit acide nuc:leique recombinant peut egalement
etre introduit: dans~ la cellule hote a 1'aide d'un
14
vecteur viral (virus recombinant) capable d'infecter
ladite cellules note: et d'y permettre 1'expression du
polypeptide .code par un acide nucleique selon
1'invention, ~~e dernier etant loos le controle d'un
promoteur viral acti.f daps la cellule Note.
L'invention concerne donc un procede de production
de 1'ECA humaine, ou des polypeptides sus-mentionnes
issus de 1' EC:A, c~ai comprend la transformation des
cellules hotel; au moyen des vecteurs sus-indigoes, la
mise en culture des cellules notes transformees dans un
milieu approprie et la recuperation desdits
polypeptides snit directement a partir du milieu de
culture, lor:aque ces derniers y sont secretes
(notamment dans le c:as ou les polypeptides consideres
sont precedes dune sequence signal lors de leur
synthese dans la cel.lule note), soit apres lyse de la
paroi de la cellule note dans le cal ou les
polypeptides ne seraient pas secretes hors de cette
derniere.
Le procede sus--mentionne comprend avantageusement
one etape finale de purification, par exemple selon les
techniques de chroma~tographie hybrophobe et d'affinite
en faisant appel a un inhibiteur de toute ou partie de
1'ECA fixe sur la c:olonne (cf. description detaillee
qui suit).
A ce tit:re, 1'invention a plus particulierement
pour objet one: composition contenant de 1'ECA humaine
pure, exempte de contaminants notamment de nature
proteique.
Les cellules notes utilisees pour la mile en
oeuvre du procede sus-mentionne peuvent etre des
cellules procaryotea, notamment des cellules de E.
coli, ou, d'un~e maniere plus avantageuse, des cellules
13~0~6$
eucaryotes, ~qui pe~rmettent, notamment, d'obtenir des
proteines sours le~ur forme glycosylee et mature
(levures, cellules CHO, ou cellules d'insectes
infectees par le bac:ulovirus) .
Ce proc~ede ~decrit ci-dessus est egalement
realisable par trans;fection des cellules hotes avec des
vecteurs d'ex~~ression ayant integre un gene modifie de
1'ECA. Soit c~u'il s'agisse de parties tronquees de
1'ADN compleme~ntairE, de YARN messager endothelial de
1'ECA, comprenant pa.r exemple un seul des deux domaines
homologues, ou bien ampute de 1'extremite 3' codant
pour le segment hydrophobe d'insertion membranaire. La
transfection des cellules hotes est egalement
realisable avec des vecteurs comprenant une forme mutee
de 1'ECA, ou de ses fragments, les mutations portant en
particulier sur les bases codant pour les acides amines
impliques dans 1'activite enzymatique decrits ci-
dessus.
I1 est p<irticulierement avantageux en vue de la
cristallisatio:n de 1'enzyme recombinante de muter un ou
plusieurs su=es potentiels de N glycosylation,
c'est-a-dire les codons correspondants aux asparagine
des sequences ~~sparagine-X-Threonine et asparagine-
X-serine.
L'invention vise egalement un procede de
preparation dees nouveaux polypeptides sus-mentionnes
par synthese yui comprend soft 1'addition etape par
etape des residus pe~ptidiques choisis, avec 1' addition
ou 1'elimination de ~groupes protecteurs quelconques des
fonctions amino et carboxyle, ou addition de residus
peptidiques choisis afin de produire des fragments,
suivie dune condensation desdits fragments en une
130868
16
sequence en ac:ides amines appropriee, avec addition ou
elimination des groupes protecteurs choisis.
L' invention se rapporte egalement a des anticorps
specifiques di.riges contre les polypeptides ci-dessus.
En particuli~er, 1'invention vise des anticorps
monoclonaux d:iriges contre les sequences peptidiques
paraissant impliquesas dans au moins une des activites
enzymatiques de 1'EC'.A.
De tels anti.corps monoclonaux peuvent etre
produits par la technique des hybridomes dont le
principe general est rappels ci-apres.
Dans un premier temps, on inocule un des
polypeptides c:i-des:aus a un animal choisi, dont les
lymphocytes B sont alors capables de produire des
anticorps con~.tre ce polypeptide. Ces lymphocytes
producteurs d',anticorps sont ensuite fusionnes avec des
cellules myelomateuses "immortelles" pour donner lieu
a des hybridomes. .A partir du melange heterogene des
cellules ainsi obtenu, on realise alors une selection
des cellules capables de produire un anticorps
particulier et. de :~e multiplier indefiniment. Chaque
hybridome est multiplie sous la forms de clone, chacun
conduisant a la production d'un anticorps monoclonal
dont les proprietes de reconnaissance vis-a-vis des
polypeptides de 1'i:nvention pourront etre testes par
exemple sur co:Lonne d' affinite.
Parmi l~~s p~olypeptides utilises pour la
fabrication des anticorps monoclonaux sus-mentionnes,
on mentionnera notamment ceux delimites par les acides
amines situes aux positions 350 et 395, ou 948 et 993
de la figure 3.,
L'invention concerns egalement une methods de
depistage, ou de doaage, in vitro dune ECA, et plus
l3~pg~g
particuliereme:nt de: 1'ECA humaine, ou d'un produit
derive de 1'ECA tel que les polypeptides sus-mentionnes
ayant in viwo le:~ proprietes de 1'ECA, daps un
prelevement biologic~ue susceptible de les contenir. Une
telle methode de depistage selon 1'invention, peut etre
realisee soft a 1'aide des anticorps monoclonaux sus-
mentionnes, soit a 1'aide des sondes nucleotidiques de-
crites ci-dessus.
Le prep=vement biologigue sus-mentionne est
effectue soit dans des tissus fluides, tels que le
sang, soit dans d.es organes, ce dernier type de
prelevement permett:ant notamment d'obtenir des coupes
fines de tis:aus sur lesquelles les anticorps sus-
mentionnes sont ulterieurement fixes.
La methode de dosage selon 1'invention, procedant
par 1'intermE~diaire des anticorps sus-mentionnes
comprend notaaument les etapes suivantes .
- la mise en contact d'un anticorps reconnaissant
specifiquement 1'ECA, ou un polypeptide derive de 1'ECA
selon 1'inveni~ion, avec le susdit prelevement bio-
logique dans des conditions permettant la production
eventuelle d'un co:mplexe immunologique forme entre
1'ECA ou produit qui en est derive et 1'anticorps sus-
mentionne ;
- la detection ,a 1'aide de tout moyen approprie du
susdit complex~~ immu:nologique.
Avantageu:~ement, les anticorps utilises pour la
mise en oeuvre d'un tel procede sont marques notamment
de maniere enz;~matiq~ue ou radio-active.
Une telle methode selon 1'invention peut notamment
etre realisee suivant la methode ELISA (enzyme linked
sorbent assay) qui comprend les etapes suivantes .
13~p868
18
- fixation dune quantite predeterminee
d'anticorps sur un support solide, notamment a la
surface d'un puits cl'une microplaque ;
- addition du prelevement biologique (sous forme
liquide) sur ledit support ;
- incubation pendant une temps suffisant pour
permettre la reaci:ion immunologique entre lesdits
anticorps et :1'ECA ou produit qui en est derive sus-
mentionne ;
- elimi:nation des parties non fixees du
prelevement biologiclue et lavage du support solide (en
particulier des puits de la microplaque) ;
- addition dune immunoglobuline marquee par une
enzyme susceptible d'activer un substrat specifique de
cette enzyme,
- addition du substrat specifique de 1'activite
enzymatique liberee lors de la reaction immunologique
precedente ;
- detection, a 1'aide de tout moyen approprie, de
la degradation du substrat par 1'enzyme : et
- correlation d.e la quantite d' enzymes liberties a
la concentration d'ECA humaine initialement presente
dans le prelevement :biologique.
Selon un autre mode de realisation de la methode
de dosage de 1'invention, les anticorps sus-mentionnes
ne sont pas marques et la detection des complexes
immunologiques forme;s entre les polypeptides et lesdits
anticorps est realisee a 1'aide dune immunoglobuline
marquee reconnaissant lesdits complexes.
La metho~ie de dosage selon 1'invention peut
egalement etrEa rea:lisee par une technique immuno-
enzymatique suivant un mecanisme de competition entre
les polypeptid~es suscceptibles d'etre contenus dans le
13~0~~~
19
prslevement biologic~ue, et des quantitss prsdsterminses
de ces memes polypeptides, vis-a-vis des anticorps
sus-mentionnss. Dan: ce dernier cas, les polypeptides
de 1'invention eon quantits prsdsterminse sont
avantageusement marquss a 1'aide d'un marqueur
enzymatique.
L'invention ne se limits nullement aux modes de
realisation dE:crits ci-dessus pour le dosage in vitro
des polypeptides de 1'invention, ce dosage pouvant etre
realise a 1'a_'Lde de touts autre msthode immunologique
approprise.
L'invention concerns sgalement une msthode de
dspistage, ou de do:>age, in vitro d'un acids nuclsique
codant pour touts ou partie de 1'ECA, rsalisse a partir
d' un prelevem~snt b:iologique susceptible de contenir
ledit acids nuclsique, caractsrisse en ce qu'elle
comprend .
- la miss en contact dune sonde nuclsotidique
dscrite ci-des;sus avec le susdit prslevement biologique
dans des conditions permettant la production sventuelle
d'un complexes d'hybridation forms entre 1'acide
nuclsique et l~~dite sonde ;
- la detection a 1'aide de tout moyen appropris du
susdit complexe d'hy:bridation.
Selon un mode de realisation de 1'invention, le
prslevement bio7Logique sue-mentionns est,
prsalablement ~~ la mdse en oeuvre du dspistage, traits
de maniere a ce que lee cellules qu'il contient soient
lysses et, e~rentue.llement, en ce que le materiel
gsnomique contESnu daps lesdites cellules soit fragments
a 1'aide d'enz:Ymes de restriction du type EcoRI, BamHI
etc..., ou que les ARN en soient isolss.
~3~0~6g
Avantageu.sement, les sondes nucleotidiques de
1'invention sont marquees a 1'aide d'un marqueur
enzymatique ou radio-actif. Les ADN, ou ARN, issus du
prelevement biologi.que sont places sur un support
approprie, notamment: sur un filtre de nitrocellulose ou
autre, par exE;mple membrane de nylon, sur lequel sont
ensuite additionnees; les sondes sus-mentionnees.
Selon un autre mode avantageux de realisation du
procede sus-mentionne de 1'invention, des coupes
histologiques sont realisees a partir du susdit
prelevement biologic~ue et les sondes nucleotidiques de
1'invention sent mises en contact direct avec des
coupes histologiques pour la detection des acides
nucleiques de 1'invention par hybridation in situ.
L'invention a ~egalement pour objet 1'application
des methodes de depistage, ou de dosage, sus-
mentionnees au diagnostic in vitro de pathologies
telles que 1"hyperitension, la sarcoidose et autres
maladies granulomateuses, les dysfonctionnements thy-
ro3diens et dune maniere generale toutes maladies
correlees a des teneurs dans 1'organisme (dans le
plasma ou d'autres tissus) en sequences d'acides
amines de 1'im~ention, situees a 1'exterieur du domaine
delimite par les valeurs extremes correspondant
generalement a 1'etat physiologique d'un individu sain.
Les methodes de dosage in vitro de 1'invention
procedant a 1'aide des anticorps sus-mentionnes
permettent egalement. le suivi dans 1'organisme de la
concentration <ies inlhibiteurs de 1'ECA par mesure de la
quantite d'ant:icorps n'ayant pu se fixer sur le, ou les
sites) act:if(s) de 1'ECA qui sont masques par
1'inhibiteur. Les methodes de dosage de 1'invention
sont donc part.iculiE~rement avantageuses dans le cadre
21
de la surveillance des traitements de patients par des
inhibiteurs de: 1' ECA.
L'invention a E~galement pour objet des necessaires
ou kits pour la rnise en oeuvre des methodes de
depistage, ou de doscage, in vitro sus-mentionnes.
A titre d'exemple, de tels kits comprennent
notamment:
- une quantit:e determinee d'un des anticorps
monoclonaux sus-ment:ionnes susceptible de donner lieu a
une reaction immunologique specifique avec 1'ECA ou
avec un des polypeptides derives de 1'ECA selon
1'invention ;
- et/ou une quantite determinee d'ECA ou un
polypeptide susceptible de dormer lieu a une reaction
immunologique avec les anticorps sus-mentionnes
- avantageusement, un milieu approprie a la
formation dune reaction immunologique entre 1'ECA ou
les polypeptides de 1'invention et les anticorps sus-
mentionnes ;
- avantageusement, des reactifs permettant la
detection des complexes immunologiques produits lors de
la reaction im~;nunologique sus-mentionnee.
Dans le cadre de la mise en oeuvre d' une methode
de depistage in vitro utilisant des sondes
nucleotidiques, les kits utilises comprennent par
exemple .
- une c~uantii:e determinee d' une des sondes
nucleotidiques sus-aientionnees susceptible de dormer
lieu a une re~~ction d'hybridation avec un des asides
nucleiques su:a-mentionnes codant pour 1'ECA ou un
polypeptide den~ive d~e 1'ECA selon 1'invention ;
1340~3~~
22
- avanta.geusement, des reactifs permettant la
detection des complexes d'hybridation produits lors de
la reaction d'hybridation sus-mentionnee.
L'invention concerne egalement 1'utilisation du
polypeptide d.e la figure 3 ou de tout fragment
peptidique appropri.e issu de ce dernier, pour la
conception de nouveaux inhibiteurs de 1'ECA humaine,
plus puissants, et/ou specifiques de cette derniere que
ne le sont les actue:ls inhibiteurs de 1'ECA.
L' invention a E;galement pour obj et une methode de
detection ou de dosage, d'un inhibiteur de 1'ECA, ou de
quantification de son pouvoir inhibiteur, qui comprend
la mise en contact d.u polypeptide de la figure 3, ou de
tout fragment peptidique issu de de ce dernier et
possedant une activi.te enzymatique du type de celle de
1'ECA, avec ledit i.nhibiteur, et la determination du
coefficient d'inhibition de 1'enzyme par 1'inhibiteur,
notamment par mesure de 1'eventuelle activite
enzymatique rEaidue:Lle sur un substrat approprie de
1'ECA.
L'invention concerne egalement 1'utilisation du
polypeptide de la figure 3, ou de tout fragment de ce
dernier capable d'hydrolyser les kinines, notamment la
bradykinine, ~dans le traitement des maladies in-
flammatoires, ou infectieuses, de la pancreatite
gigue, et plus ga_neralement de maladies ou une
liberation de kinineas dans 1'organisme pourrait jouer
un role pathogi:ne.
A ce titre, 1'invention concerne plus
particulierement des compositions pharmaceutiques pour
le traitement des maladies indiquees ci-dessus,
caracterisee par 1'~association de tout ou partie du
polypeptide de la figure 3, capable d'hydrolyser les
13~O~G8
23
kinines, nota:mment la bradykinine, avec un vehicule
pharmaceutique:ment acceptable.
La prese.nte invention a egalement pour objet
1'utilisation des sondes nucleotidiques de 1'invention,
capables de s'hybr:ider avec le gene responsable de
1'expression de 1'ECA humaine dans les conditions
decrites ci-dessu~~, pour la determination des
differentes formes a:lleliques du gene sus-mentionne.
Les hypertensions arterielles (HTA) sont classees
en deux grandes categories selon leurs etiologies . les
HTA secondaires eat 1'HTA essentielle. Les HTA
secondaires re:groupeant toutes les formes d'HTA que la
medecine peut ratt:acher de fa~on univoque a une
pathologie identifiee. I1 peut s'agir, notamment, dune
hypersecretion hormonale d'origine tumorale (repine ou
aldosterone, catecholamines, par exemple) ou vasculaire
(stenose d'u.ne ,artere renale provoquant une
hypersecretion de repine). Ces formes d'HTA secondaires
representent e~nviron 5 % du total des HTA. Sous le
vocable d'HTA essenitielle, sont regroupees toutes les
formes d'HTA pour lesquelles aucune etiologie nest
aujourd'hui identifiable et qui constituent les 95 %
restant des cars d'HT.A.
La patho~~enie de 1'HTA essentielle nest pas
aujourd'hui connue mais de nombreuses etudes opt montre
que des facteurs genetiques etaient impliques daps le
developpement de 1'HTA. Les etudes familiales opt
montre qu'il existait une agregation familiale des
valeurs de prEassion arterielle et qu'une correlation
existe entre l.a pression arterielle des parents et des
enfants naturels alors que cette correlation n'existe
pas avec les enfants adoptes. Les etudes menees sur des
jumeaux mono ou dlizygotes opt egalement confirme
13~0~6~
24
1'heritabilitE: du niveau de pression arterielle. Enfin,
1'analyse gen~etique de la transmission du niveau de
pression arte:riellea, chez 1'homme et dans les souches
de rats genetiquement hypertendus, a montre que
plusieurs genEa etaient impliques. La transmission de
ce caractere, variable entre les individus, quest le
niveau de pression arterielle passe donc par la
transmission de forznes alleliques de genes entre les
parents et lee erifants. Les genes que 1'on pent
designer "candidate;" a la responsabilite de cette
transmission sont, a.u premier chef, ceux impliques dans
les principau~; systemes de regulation de la pression
arterielle, tels que: lee genes, du systeme renine-
angiotensine, dont c.elui codant pour 1'ECA.
La methode de choix pour reconnaitre, aujourd'hui,
les formes alleliques d'un gene est d'identifier, pour
ce gene, le polymorphisme de taille des fragments de
restriction de ce gene (par taille des fragments de
restriction on entend le nombre de paires de bases que
comprennent lesdit.s fragments). Pour ce type
d'experience, lee ADN de plusieurs individus sont
isoles, clivEa pair une enzyme de restriction,
transferes sur une membrane capable de lee fixer de
fagon irreversible, et hybrides avec une sonde d'ADN
marquee corres~~ondant au gene etudie.
Cette mei~hode permet de distinguer lee formes
alleliques d'u.n meme gene qui different entre elles
d' un individu <~ 1' autre
- par leur cari:e de :restriction, et/ou
- par la pre:~ence dans T une des formes alleliques
dune insertic>n (fragment d'ADN supplementaire dans
1'allele le moins frequent), ou d'une deletion
(fragment d'ADN manquant dans 1'allele le moins
13~0~68
frequent) cet.te insertion n'existant pas chez les
autres formes alleliques.
Dans le premier cas sus-mentionne (differences
fondees sur la carte de restriction, ou encore
polymorphismes de sites de restriction), sous 1'effet
de la digestion par une enzyme de restriction donnee X,
1'allele possE:dant, au niveau dune region precise du
genome, un site de restriction reconnu par cette enzyme
est coupe par ladite enzyme, et celui ne possedant pas
un tel site, au niveau de ladite region, nest pas
clive. A 1'aide d'u.ne sonde nucleotidique susceptible
de s'hybrider au ni~,eau de ladite region, on peut donc
detecter deux fragments de restriction de tailles
differentes selon que la region concernee a ete clivee
ou non. A chac.une de: ces tailles correspond une forme
allelique.
Dans le :>econd cas (presence dune insertion, ou
dune deletion), leis fragments d'ADN genomique cor-
respondant aux deux formes alleliques sont clives par
1'enzyme de restriction X au niveau d'un site iden-
tique. On peut detecter, a 1'aide dune sonde telle que
definie dans le paragraphe precedent, deux fragments de
restriction de tail:les differences. A chacune de ces
tailles correspond une forme allelique, la taille la
plus elevee correspondant a la forme allelique
comprenant 1'insertion sus-mentionnee.
Dans les deux cas precedents et chaque fois que
1'on detecte des fragments de restriction de tailles
differentes (ou encore fragments de restriction
polymorphes) d.ans un gene donne et d'un individu a
1'autre sous 1'eff~et de f action dune enzyme de
restriction X, il se:ra fait reference au "polymorphisme
X" de ce gene (par exemple "polymorphisme EcoRI" si
13~08~8
26
1'enzyme de restriction X est 1'enzyme EcoRI, ou
polymorphisme TaqI si 1'enzyme de restriction est
TaqI).
L'etude d'un polymorphisme X d'un allele choisi,
dans une population donnee d'individus, presumes sains,
permet de constater 1'existence de ce polymorphisme
dans une proportion determinee des individus de cette
population. La mesui°e de cette proportion conduit a ce
que 1'on appelle ci-apres la "frequence allelique de
reference".
Si la frequence: d'un allele choisi, mesure suivant
la meme methode au sein dune population d'individus
presentant une pathc~logie determinee, est differente de
la frequence de reference, on pourra alors emettre
1'hypothese que 1'a7Llele en question est lie a ladite
pathologie.
De meme, on pourra impliquer un allele dans le
developpement de l.a maladie s'il existe une co-
segregration entre l.a transmission de la maladie, dans
les familles atteintes et informatives pour le
polymorphisme, et la transmission de 1'allele permet
d'impliquer cet allele dans le developpement de la
maladie. (on dit dune famille qu'elle est informative
pour le polym.orphiscme si le parent atteint par la
maladie est helterozy~gote pour le site de restriction ce
qui permet de' suiwre dans la descendance 1'allele
responsable de la maladie).
La presente invention concerne les fragments de
restriction po:Lymorplhes susceptibles de s'hybrider avec
une sonde nucleotidique de 1'invention, notamment dans
les conditions decrites ci-dessus, et qui sont issus du
clivage des differentes formes alleliques du gene
~~~fl~6
27
codant pour 7.'ECA a 1'aide d'enzymes de restriction
determinees.
L'invention concerne plus particulierement les
fragments de restriction polymorphes susceptibles de
s'hybrider avec une sonde nucleotidique selon
1'invention, E~lle-mi=me susceptible de s'hybrider avec
1' extremite 5' de 1' acide nucleique de la figure 3 et
qui sont les suivanta .
- les fragments. de 5,8 kb et de 6 kb correspondant
au polymorphisme TaqI,
- les fragments. de 8,8 kb et de 9 kb correspondant
au polymorphisme Dra.I,
- les fragments de 8,5 kb et de 9 kb correspondant
au polymorphisme BglII,
- les fragments de 10,6 kb et de 11 kb cor-
respondant au ;polymorphisme KpnI,
- les fragments de 8,4 kb et de 8,8 kb cor-
respondant au ;polymorphisme HindIII,
- les fragmentssl de 4, 2 kb et 3, 0 kb dune part,
et de 4 kb et 2,7 kb d'autre part, correspondant au
polymorphisme ;BglI,
- les fragments de 5, 2 kb et de 5, 7 kb
correspondant au po:lymorphisme RsaI (avec presence ou
non d'un fragment de 3,0 kb),
- les fragments de 4,3 kb dune part, et de 2,2 et
2,5 kb d'autre part, correspondant au polymorphisme
PvuII,
- les fragments de 3,5 kb et de 3 kb correspondant
au polymorphismes Xb;aI,
- les fragments de 4,3 kb et de 2,7 kb cor-
respondent au polymo:rphisme TaqI.
La difference de taille des fragments alleliques
reconnus par les sondes de 1'invention chez les
13~0~~8
28
differents individu;s, correspond a une insertion d'un
fragment genomique d'environ 400 paires de base avec la
marge d'erreu.r due: a 1'analyse de taille de ces
fragments par electrophorese sur gel d'agarose.
Cette insertion peut etre detectee a 1'aide de
toute enzyme de restriction clivant 1'acide nucleique
sus-mentionne du moment que les fragments engendres
soient capables de s'hybrider au moins en partie, avec
la sonde corresponda.nte.
La presente invention concerne un procede de
depistage, in. vitro des polymorphismes du gene codant
pour 1'expres~;ion de 1'ECA humaine, realise a partir
d'echantillons biologiques, tels que le sang, sus-
ceptibles de <:ontenir de 1'ADN genomique, et qui ont
ete preleves dans une population donnee d'individus ne
presentant pas d'HTA (ou encore individus normotendus),
ou d'autres maladies de 1'endothelium vasculaire.
Les echantillons sus-mentionnes sont analyses
suivant la metlhode suivante comprenant .
- le tra:itement des acides nucleiques issus des
echantillons biologiques sus-mentionnes a 1'aide dune
enzyme de restriction determinee daps des conditions
permettant 1'obtention de fragments de restriction
issus du cliva~~e desdits acides nucleiques au niveau de
leurs sites de restriction reconnus par ladite enzyme,
- la mise en contact dune sonde nucleotidique
selon 1'invention susceptible de s'hybrider avec les
fragments sus-mentio:nnes dans des conditions permettant
la production event:uelle de complexes d'hybridation
entre ladite sonde et les fragments de restriction
sus-mentionnes,, notamment daps les conditions
d'hybridation definies ci-dessus,
I3~0~6g
29
- la detection des susdits complexes d'hybri-
dation,
- la mesure de la taille des eventuels fragments
de restriction polymorphes engages daps les complexes
d'hybridation sus-me:ntionnes.
Parmi les sondes utilisees pour la mise en oeuvre
d'un tel procede, on citera notamment 1'ADN com-
plementaire (ou ADNc) de 1'acide nucleique decrit a la
figure 3, ou, avant:ageusement, une fraction de cette
ADNc susceptible de s'hybrider avec les differents
fragments de restricaion correspondant aux differentes
formes alleliques du. gene de 1'ECA.
Avantageusement., la sonde utilisee dans le procede
sus-mentionne est marquee, notamment de maniere
radioactive ou non radioactive, sous forme notamment de
sonde biotinylee, pour permettre la detection des
differents fragment, de restriction restant hybrides
avec ladite so:nde.
La mesure de la taille des differents fragments de
restriction p~olymorphes engages Bans des complexes
d'hybridation avec :La sonde sus-mentionnee, peut etre
realisee par mute methode connue en soi par 1'homme du
metier ; la determination de la taille de ces fragments
de restrict:Lon est realisee notamment par
electrophorese sur gel d'agarose et evaluation de la
taille desdit;s fragments par rapport a celles de
fragments temo:ins.
La comparaison des tailles des fragments de
restriction mesurees chez les individus de la
population etudiee, permet d'etablir, au sein de cette
population d'individus, les frequences alleliques de
reference.
1.~40~~~
L'inventi.on concerne egalement la detection des
differentes fo~rmes alleliques du gene codant pour 1'ECA
humaine, susceptibles d'etre liees au developpement
chez un indi'ridu dune HTA, ou autres maladies de
1'endothelium vasculaire, notamment de
1'atherosclerose. Ce~tte detection est realisee suivant
la meme methode au sein dune population d'individus
presentant une pathologie sus-mentionnee. Si la
frequence d'un allele mesuree au sein de cette
population est diffe:rente de la frequence de reference,
on pourra alors emet;tre 1'hypothese que cet allele est
probablement lie a 1'HTA.
De meme, on pourra impliquer un allele dans le
developpement de l.a maladie s'il existe, dans les
familles atteintes x>ar la maladie et informatives pour
le polymorphisme, une cosegregation entre la trans-
mission de certaines formes alleliques du gene de 1'ECA
et la transmission de 1'HTA et/ou des maladies de
1'endothelium, notamment de 1'atherosclerose.
L'inventi~on a ~egalement pour objet 1'application
des resultats de 1'etude des polymorphismes du gene
codant pour 1'ECA humaine au diagnostic in vitro de
1'eventuelle predisposition genetique probable d'un
individu a 1'hypert:ension arterielle, ou a d'autres
maladies de :1'endothelium vasculaire, notamment de
1' atherosclero;se .
13~0~6~
31
La methode de diagnostic in vitro sus-mentionnee
comprend la dE~tection eventuelle de fragments de res-
triction polymorphe:~, issus du clivage par une enzyme
de restriction determinee d'alleles probablement lies
au mecanisme de 1'HTA, a 1'aide de sondes
nucleotidiques selon 1'invention, susceptible de
s'hybrider avec lesdits fragments de restriction
polymorphes.
Les conditions daps lesquelles une telle methode
de diagnostic in vitro pent etre mise en oeuvre sont
celles decrites dins les articles concernant les
techniques de detection des polymorphismes de longueur
des fragments de re:atriction, plus connues encore sous
1'abreviation RFL:P (Restriction Fragment-length
Polymorphism). De telles conditions sont plus
particuliereme:nt decrites dans P article de GUSELLA
J.F. 'Recombinant D:NA techniques in the diagnosis of
inherited disorders" paru dans Journal of Clinical
Investigations (1986), 77, 1723-1726.
Selon un aspeci~ avantageux de 1'invention, outre
le depistage des polymorphismes du gene codant pour
1'ECA humaine, la mE~thode de diagnostic in vitro sus-
mentionnee compren~d egalement le depistage de
polymorphismes d'un ou de plusieurs genes codant pour
des proteines differentes de 1'ECA et impliquees dans
le mecanisme de la regulation de la pression
arterielle.
A ce tit:re, la methode de diagnostic in vitro
selon 1'invention comprend le depistage de
polymorphismes du gene de 1'ECA, et du gene de la
renine, et/ou du gene de la kallikreine, et/ou du gene
de 1'ANF.
~3~086g
32
Parmi le:: polymorphismes sus-mentionnes des genes
codant pour la renine, la kallikreine, et 1'ANF, on
citera notamment ceux qui ont ete plus particulierement
decrits dans .La demande de brevet PCT publiee sous le
numero W087/02709 dE:posee le 23 octobre 1987.
A 1'aide de sondes appropriees, les auteurs de
cette demande PCT ont decouvert les fragments de
restriction suivants; .
- 5 kb et 9 kb correspondant au polymorphisme BglI du
gene de la renine,
- 0, 9 kb corr~aspond~ant au polymorphisme BglII du gene
de la renine,
- 20 kb et 24 kb correspondant au polymorphisme RsaI du
gene de la renine,
- 6,2 kb et 9 kb correspondant au polymorphisme HindIII
du gene de la renine,
- 9, 8 kb et 1:1 kb c:orrespondant au polymorphisme TaqI
du gene de la :renine,
- 3, 9 kb correapondant au polymorphisme EcoRI du gene
de la renine,
- 1,4 kb et 1,~8 kb correspondant au polymorphisme BanII
du gene ANF,
- 4,1 et 6,2 kb correspondant au polymorphisme BglI du
gene ANF,
- 9,1 kb et 6,!5 kb correspondant au polymorphisme BglII
du gene ANF,
- 5,2 kb et 11,8 kb correspondant au polymorphisme
EcoRI du gene i~IJF,
- 15 kb correspondant au polymorphisme EcoRI du gene de
la kallikreine,,
- 3,1 kb correspondent au polymorphisme PstI du gene de
la kallikreine,,
~~~os6s
33
- 4,5 kb corre.spondant au polymorphisme StuI du gene de
la kallikreine.
L'invention a egalement pour objet des kits pour
la mise en oeuvre de la methode de diagnostic in vitro
definie ci-dessus.
A titre d'exemple, de tels kits de diagnostic
comprennent .
- une qu~antite determinee dune ou de plusieurs
enzymes de restriction,
- une quantite determinee dune sonde
nucleotidique susceptible de reconnaitre les fragments
de restriction issu.s du clivage du gene codant pour
1'ECA par 1'(ou les ) enzyme(s) sus-mentionne(s),
- eventuelleme:nt une quantite determinee dune
sonde susceptible de reconnaitre les fragments de
restriction i:~sus du clivage du gene codant pour la
renine par 1'(~ou les) enzymes) sus-mentionnes(s),
- et/ou une quantite determinee dune sonde
susceptible d~e reconnaitre les fragments issus du
clivage du gene codant pour la kallikreine par 1'(ou
les) enzymes) sus-mentionne(s),
- et/ou une quantite determinee dune sonde
susceptible de reconnaitre les fragments de restriction
issus du clivage du gene codant pour 1'ANF par 1'(ou
les) enzymes) sus-mentionne(s).
Les techniques classiques d'amplification genique,
notamment celle decrite dans le brevet US n°4,683,202
depose le 25/10/1985, sont utilisables pour detecter le
polymorphisme du gene codant pour 1'ECA en utilisant
des amorces s'hybridant avec ce gene de part et d'autre
de 1'insertion d'e:nviron 400 paires de base sus-
mentionnee. Le:~ fragments d'ADN ainsi amplifies ont une
13~0~~~
34
taille differe.nte se:lon que le fragment d'ADN genomique
contient ou ne conti.ent pas ladite insertion.
A ce titre, 1'invention a plus particulierement
pour obj et toute sequence nucleotidique d' environ 10 a
40 nucleotides issue: de la sequence nucleotidique de la
figure 3, ou sa sequence complementaire, ou susceptible
de s'hybrider avec une partie de la sequence de la
figure 3 ou avec la sequence complementaire de cette
derniere, ut.ilisable en tant qu'amorces pour
1'amplification du gene codant pour 1'ECA.
Des caracte:ristiques supplementaires de
1'invention appara:itront encore au cours de la
description qu~i suit du clonage de 1'acide nucleique
codant pour 1'ECA humaine, ainsi que des sondes
utilisees pour ce clonage, etant entendu que cette
description ne saurait etre interpretee comme tendant a
restreindre la portee des revendications.
I - PURIF'ICATIDN ET SEQUENCAGE DE L'ECA
L'ECA hum,aine sous sa forme complete membranaire a
ete purifiee a partir de microsomes renaux. La fraction
microsomale a ete preparee a partir d'homogenats de
reins de cadavres humains de la fagon suivante . 600 g
de cortex de rein ont ete haches, suspendus dans un
tampon de phos~~hate de potassium 20 mM, pH 8, contenant
250 mM de saccharo:~e et un melange d'inhibiteurs de
protease (tetrathionate de sodium 5 mM, N-ethylma-
leimide 10 mM, fluorure de phenylmethanesulfonyle 2
mM), et homogeneise~~ pendant 3 minutes. Les debris de
tissu ont ete elim:ines par centrifugation a 5000 g
pendant 20 minutes et la fraction particulaire a ete
sedimentee par centrifugation a 105000 g pendant 1
heure. Le culot a ete resuspendu dans un tampon de
phosphate de potassium 150 mM,; pH 8 (tampon I, 200 ml)
1~~~~~6g
et traite pendant 18 heures avec le detergent CRAPS 8
mM (Serva). Le surnageant, apres centrifugation
5 105000 g pendant 1 heure, a ete dialyse contre le
tampon I pendant 24 heures afin d'eliminer le CHAPS.
Puis il a ete depose sur une colonne de phenyl-
Sepharose* 4B (Pharmacia) et Blue a un taux de 24
ml/heure ; 60 % de 1'activite enzymatique a ete retenue
10 sur la colonne et eluee sous forme d'un pic unique
apres avoir applic~ue un gradient lineaire de CHAPS
(3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propanesulfona-
te) jusqu'a une concentration de 10 mM (800 ml).
L'eluat a etE: enrichi avec du ZnS04 et du KC1 a des
15 concentrations finales de 0,1 mM et de 330 mM
respectivemen~t de maniere ~ obtenir une liaison
optimale avec 1'inhibiteur, puffs la purification a ete
completee sur une colonne de lysinopril-Sepharose 4B
comme il a etc~ decr.it dans BULL, N.G. et al, (1985), J.
20 giol . Chem. , :?60, 2963-2972.
La prote:ine ainsi isolee ( 1, 2 mg) a ete analysee,
apres reduction (2 mercaptoethanol a 5 %) et
denaturation (ebullition pendant 3 minutes), par
electrophoress~ sur gel de polyacrylamide Bans 6 % de
25 gel contenant NaDodS04 (LAEMMLI, U.A., (1970), Nature,
227, 680-685).
L'enzyme purifiee hydrolyse 1'angiotensine I, la
bradykinine et: plusieurs substrats synthetiques, et est
inhibee par l.e captopril et d'autres inhibiteurs de
30 1'ECA . la dEaermination de 1'activite enzymatique a
ete realisee a 1'aide du substrat furanacryloyl-L-
phenylalanyl-g~lycyl--glycine (FAPGG) dans les conditions
decrites daps HOLMQUIST et al (1979), Anal. Biochem.,
95, 540-548. hes pa:rametres de la reaction enzymatique
35 determinee a pH 7,5 sont de 136 ~m pour Km et 22100
* trademark
~.~~0~68
36
min.'s pour Kcat ; un traitement a 1'aide de bromure de
cyanogene a et:e utilise pour cliver 1'enzyme au niveau
des residus methionine generant ainsi des fragments
pour le sequE~ngage. L'ECA purifiee (0,5 mg) a ete
dissoute dens 1'acide formique 70 % (0,2 ml) et le
bromure de cy~anogene (2,0 mg) a ete ajoute. Apres 16
heures de reaction a: temperature ambiante dens le noir,
la solution a. ete diluee 20 fois avec de 1'eau et
lyophilisee.
Les fr~~gments peptidiques ont ete isoles par
HPLC en phase' inverse, en utilisant un systeme de
gradient acide trifluoroacetique (TFA)-eau-acetonitrile
(tampon A . 0,1 M d.e TFA dens 1'eau ; tampon B . 0,1 %
de TFA dens 1'acet.onitrile ; 1-100 % de B sur 32
minutes, taux d'elution 1 ml.min.'~). Les fractions
correspondent a des pics differents ont ete separees et
lyophilisees, et sequencees a 1'aide d'un sequenceur
automatique. I~es fragments peptidiques ainsi obtenus
ont ete regroupes sur le tableau I. La sequence amino-
terminale de la proteine a ete determinee par la
methode d'Edma:n a 1'aide d'un sequenceur automatique en
utilisant la p:roteine ECA entiere.
La sequence suivante de 16 acides amines a ete
obtenue
NH2-Leu-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-Asp-Phe-Ser-Ala-
Asp-Glu-Ala-G1:~-COOH
II - CLO:NAGE DE L'ADN COMPLEMENTAIRE DE L'ARN
MESSAGER
A) Sonde nucleotidigue
- a parti~r de la sequence peptidique
Met-Trp-Ala-Mei~-Trp-,Ale-Gln-Ser-Trp-Glu-Asn-Ile (con~ue
d'apres la sequence: CNBb du tableau I), 64 sondes
nucleotidiques denom~mees HACE6 ont ete synthetisees a
13~08fg
37
1'aide d'un synthstiseur d'ADN automatique en utilisant
la msthode au phosphoramidite.
Met-Trp-~,la-Lys-Ser-Trp-Glu-Asp-Ile- 3'
TAC-ACC-C'.GA-TT'T-ACG-ACC-CTT-TTG-TA 5'
G G: TG C A
- Marquage radio-actif . la sonde HACE6 a sts
marquee au [yP3Z] ATP (activits spscifique . 5000
curies/mmole) a son extrsmits 5' par la T4
polynuclsotide kina~se. L'activits spscifique de la
sonde est de 5 x 106 cpm/pmole.
B) Cribbage dune banctue d'ADN complementaires
construite a partie d'ARN de cellules endothsliales
Une banque d'ADNc de cellules endothsliales de
veins ombilicale hu:maine amorcse avec de 1'oligo(dT),
construite dams le phage agtll (Clontech Laboratories
Inc.), et constituse de 1,5 x 106 recombinants
indspendants, a sts criblse en utilisant la sonde HACE6
marqus au P32. L'AD:N des phages a sts transfers sur
filtre de nitrocellulose selon la msthode de Benton et
Davis (rsf. BE:NTON, W.D., et DAVIS R.W. (1977), Science
(Wash), 196, 180-182.). Les hybridations avec HACE6 ont
sts rsalisses dans . 6 x SSC, 0, 1 % de NaDodS04,
tampon NaP04 50 mM ~~ pH 6, 8, 5 x Denhardt, 0, 1 mg/ml
d'ADN dsnaturs de sperms de saumon a 50°C. Le lavage
final des fili:res a sts effectus deux fois dans 2 x
SSC, 0,1 % SDS, a 55°C pendant 15 minutes.
Dans ces conditions deux diffsrents types de
clones hybrida:nt fortement avec la sonde HACE6 ont sts
obtenus. I1 s'~agit des clones aHECl922 et aHEC2111. Les
fragments d'AD1V inssrss dans les phages ont sts isolss
apres coupure des phages par 1'enzyme de restriction
EcoRI, et inssrss dins les deux sens dans le plasmide
bluescript (St:ratagene) , au niveau du site EcoRI de ce
38
dernier. A partir de ces plasmides doubles-brins des
matrices mono-~brins ont ete obtenues en reinfectant des
cultures bactnriennes portant ces plasmides a 1'aide
d' un phage helper KC>7 .
La deternnination de la sequence nucleotidique de
ces clones a ete Eaffectue par la methode de Sanger
(SANGER, F. et: al (:1977) , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,
74, 5463-5467) en utilisant soit 1'ADN polymerase de
klenow, soit 1'ADN polymerase de T7 modifiee
(Sequenase, U:c Bioc:hemical). Quelques regions ont ete
sequencees en utilis,ant a la place de la deoxyguanosine
tri-phosphate (dGTF~), le deoxyinosine tri-phosphate
(dITP) ou le deaza-deoxyguanosine tri-phosphate (7-
deaza dGTP). L'elect.rophorese des fragments marques par
le [S35] dAT:P a ete pratiquee sur gel d'uree-
polyacrylamide. Les sequences ont ete determinees en
synthetisant des oligomeres de proche en proche toutes
les 350 paires de base environ qui ont servi d'amorces
echelonnees le long de la sequence.
Les sequences nucleotidiques inserees dans ces
deux phages so:nt chevauchantes sur une longueur de 2323
paires de base:. La sequence peptidique deduite de ces
clones contient 1'e:nsemble des sequences peptidiques
obtenues par purification de 1'ECA humaine, et qui sont
representees sour le: tableau I, a 1'exception de la
region amino-t~~rminale.
De maniE:re zi obtenir 1'ADN complementaire
correspondant ~~ 1'extremite 5' de Y ARN messager codant
pour 1'ECA, une autre banque d'ADNc a ete construite en
utilisant 5 ~g d'ARN poly(A) isole a partir de cellules
endotheliales de 7La veine ombilicale en culture
tertiaire. CEas cE:llules ont ete obtenues par
dissociation ~~ 1'aide de collagenase comme il est
39
decrit daps J~~FFE et al (JAFFE J.M. , et al (1973) , J.
Clin. Invest., 52, 2745-2756), et ont ete cultivees en
presence de 20 % de serum foetal de veau, 100 ~g/ml
d'heparine et de 2ng/ml de FGF (facteur de croissance
de fibroblast~e) (GOSPORADOWICZ, D. et al (1983) J.
Cell . Biol. , 9~7, 16'77-1685) . L'ARN total a ete extra it
des cellules ~~pres 3 sous-cultures par la methode de
Chirgwin et al (CHIRGWIN, J.M. et al (1979)
Biochemistry, 18, 5:?94-5299), et purifie sur cellulose
oligo-d(T)7 (Pharmac:ia). La banque d'ADN complementaire
a ete construite se7Lon la methode de Gubler et Hoffman
(Gene (1983) 25, 263-269), en utilisant comme amorce un
melange de deux oligonucleotides. Le premier
oligonucleotide est une amorce specifique de 1'ARNm de
1'ECA, determine par la sequence des clones
precedemment obtenus. I1 s'agit d'un oligomere de 17
bases (CP5-21) complementaire dune sequence localisee
pres de 1'extremite 5' de 1'ADNc de 1'ECA (nucleotide
234 a 250 de la figure 3). La seconde amorce correspond
a 1'oligo-d(T)12-18 mers (Pharmacia). Les ADNc ont ete
traites et inseres dans le phage gGTlO coupe par
1'enzyme EcoRI selon la methode de Koenig et al
(KOENIG, M. et al (1987), Cell, 50, 509-517).
Les phages recombinants ont ete cribles a 1'aide
d'un fragment d'ADN genomique humain de 300 paires de
base isole a partir dune banque genomique clonee daps
le phage CHAR01'~4A et qui s'hybride avec CP5-21, et avec
1'oligonucleot.ide de' 44 bases obtenu a partir de la
sequence amine-terminale deduite de 1'ECA purifiee
selon la metho~3e decrite ci-dessus.
Ce fragme:nt de restriction (SacII-SacII) de 300
paires de base comprend la partie la plus 5' terminale
de YARN messager de' 1'ECA ; il a ete marque avec une
13~0~~8
haute activitE~ specifique en utilisant la methode de
marquage decri.te daps FEINBERG A. P. et al ( 1983 ) Anal .
Biochem., 132, 6-13, et utilise pour cribler 1,5 x 106
clones dans des conditions de stringence elevee.
Parmi leis clones positifs obtenus, le clone
aCHDT32 a ete selectionne et sequence selon la meme
methode decrite pour les clones precedents. I1 a ainsi
ete determine que ce clone contenait une insertion de
246 paires de base cat qu'il demarrait 7 nucleotides en
amont de 1'a~morce CP5-21 et qu'il s'arretait 25
nucleotides en amont de 1'ATG d'initiation de la
traduction.
L'insertion daps ce clone partage 60 paires de
base avec le c:lone ;~HEC2111 et contient 1' extremite 5'
de la sequence codant pour 1'ECA.
La sequence nucleotidique de 1'ADNc codant pour
1'ECA obtenu par sequen~age des trois clones precedents
comprend donc 4024 nucleotides. L'extremite 3' de cette
sequence ne co:ntient pas de signal de polyadenylation.
La phase ouverte de lecture partant du premier
codon ATG jusq~u'au codon stop TGA code pour 1306 acides
amines. La :Leucine amino-terminale determine par
sequen~age de la proteine est localisee apres un
peptide signal de 29 residus.
Le clone aHEC19~22 a ete utilise comme sonde pour
etudier 1'expression du gene codant pour 1'ECA par la
methode dite "l~lorthern-blot" selon le procede de Thomas
et al (THOMAS, P.S. et al (1983) Methods in Enzymology,
N.Y. Academic Press, 100, 255-266). Un ARN messager
d'environ 4,3 kb dEa cellules endotheliales de veine
ombilicale en culture s'hybride avec la sonde sus-
mentionnee. Dans ls' testicule, seul un ARN messager,
plus court, de 3 kb a ete detects. Dans les reins, qui
~34~~6g
41
sont une source riche en ECA, aucune hybridation n'a
ete detectee d.ans leas conditions utilisees en utilisant
20 ~g d'ARN ;poly(A), ce qui laisse suggerer que la
synthese et les tau~,: de turn-over de 1'ECA sont faibles
dans cet organe.
Une anal~~se par "Southern blot" de 1'ADN humain
dans des conditions stringentes a ete realisee avec un
fragment EcoRI-BglII: de 300 paires de bases localise a
1'extremite 5' du clone aHEC2111. L'ADN humain a ete
isole a partii~ de noyaux de cellules du placenta, par
traitement avec la proteinase K suivi d'extractions par
le melange phenol-c:hloroforme. L'ADN (14 ~cg) a ete
digere avec HindIII,, separe sur gel d' agarose a 0, 7 %
et analyse par hybridation selon la methode "Southern
Blot" (SOUTHERN, IE.M. (1975) J. Mol. Biol, 98,
503-517).
Les fragments d'ADN ont ete marques selon la
methode decrite dans~ FEINBERG, A.P. et al (1983) anal.
Biochem., 132,, 6-1a. Cette sonde s'hybride avec un
fragment de restriction unique de 9,5 kb.
Des resultats similaires ont ete obtenus en
utilisant un fragment d'ADNc proche de 1'extremite 3'.
Ce result~at confirme la presence d'un seul gene.
La determination de 1'activite enzymatique de
1'ECA codee par le gene ainsi isole, ou de tout
polypeptide actif s~elon 1'invention et issu de cette
derniere, peut titre determinee notamment par la methode
decrite par Ho:Lmquist et al (1979) precedemment cite.
Le dosage de ceatte ECA humaine peut titre realise
par des techniques radioimmunologiques (RIA) decrites
par HIVADA K., et al (1987) Lung, 267, 27-35.
III POLYM:ORPHI~51KES DU GENE DE L' ECA
~~4~~ss
42
L'ADN de plusie:urs individus a sts isoles a partir
des cellules nuclsees par lyse des globules rouges
suivies dune lyse files globules blancs, d'un traitement
a la protsinase K et: par extractions successives par le
phenol et le c:hloro:Eorme suivies dune precipitation a
1'isopropanol.
Une quant,its dsterminee d'ADN est ensuite digsrse
par une enzyme de restriction et migrse sur un gel
d'agarose qui separe. les fragments d'ADN en fonction de
leur taille. L'AD1V est ensuite denature par un
traitement avec de l.a soude 0,5 N et transfers sur une
membrane de nylon par buvardage pendant 12 heures.
L'ADN est ensuite fixe a la membrane par passage au
four pendant 2 heures a 80°C.
La membr<~ne e;st ensuite pre-hybridee avec une
solution 4 x SSC, 10 x Denhardt pendant au moms 6
heures a 65°C,. La membrane est ensuite hybridse avec
une solution tampon 4 x SSC, 1 x Denhardt, 25 mM NaP04
pH 7, 2 mM ED'TA, 0,.5 % SDS, 100 ~Cg/ml d'ADN de sperms
de saumon sonique comprenant la sonde marquee
denatures par :La chaleur a 100°C pendant 3 minutes.
La sonde marquee est un melange des fragments ADNc
de 1'ECA contenu dans les clones aHEC1922 et aHEC1922.
Les fragments d.'ADN purifies sont marquss a haute
activits specifique~ par la technique d'amor~age
statistique ut:ilisant le fragment de Klenow de la
polymsrase de E. co7Li et un dsoxynuclsotide marqus au
P32 a haute activits spscifique.
Les membranes sont hybridses en presence de la
sonde pendant :l2 heu:res a 65 ° C .
Apres 1'hybrida~tion, la membrane est laves dans
une solution 2 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5 % SDS a 65°C
pendant 45 minutes a quatre reprises, laves ensuite
43
Bans une solmtion 0,2 x SSC, 0,1 x SSC pendant 45
minutes a 65°C a deux reprises, puffs daps une solution
0,1 x SSC, 0,1 % SDS~ pendant 45 minutes a 65°C.
Les sequE~nces ayant hybride avec la sonde sont
ensuite visua:Lisees par autographie des membranes a
-80°C en presence ~d'un ecran intensificateur sur un
film.
L'analyse de 1'ADN de plusieurs individus avec les
sondes ADNc de 1"ECA ou des sondes equivalentes
c'est-a-dire raccourcies a T une des deux extremites,
ou allongees veers l.'extremite 3' ou 5' de la partie
transcrite ou non transcrite du gene, ou des fragments
d'ADN synthet:iques guff gardent la propriete de
s'hybrider avec les fragments de restriction sus-
mentionnes, pE:rmet de distinguer plusieurs types de
fragments de restriction en fonction des coupures
enzymatiques d~e 1'ADN. Ces fragments sont les suivants:
- 5,8 kb ou 6 :kb par digestion TaqI,
- 8,8 kb ou 9 kb par digestion DraI,
- 8,5 kb ou 9 kb par digestion DglII,
- 10,6 kb ou 11 kb par digestion KpnI,
- 8,4 kb ou 8,.8 kb par digestion HindIII,
- 4,2 kb et 3,0 kb ou 4 kb et 2,7 kb par digestion
BglI,
- 5,2 kb ou 5,'7 kb par digestion RsaI, avec presence ou
non dune bande a 3,0 kb.
- 3,5 kb ou 3 l~cb par digestion XbaI,
- 4,3 kb ou 2,'7 par digestion TaqI.
Par digestion par 1' enzyme PvuII, on obtient deux
profils ou pattern de restriction comportant la
presence ou non d'un~e bande a 4,2 kb guff est associee a
une bande plu:a faible de 2,2 et de 2,5 kb.
