Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
1 1.3~0~9ï
Sondes à papillomavirus et procédé de diagnostic in
vitro d'infections à papillomavirus
L'invention concerne des ADNs de papillomavirus,
et plus particulièrement des sondes dérivées de ces
papillomavirus, ainsi. que des procédés les mettant en
oeuvre pour le diagnostic in vitro d'infections à
papillomavirus.
L'expression "papillomavirus" recouvre un grand
nombre de virus ayant en commun d'être tenus pour
responsables de plusieurs formes d'infections virales
s'étageant entre les verrues cutanées ou de muqueuses,
relativement bénignes, et des hyperplasies susceptibles
de dégénérer en néoplasies intra-épithéliales et en
cancers de la peau et des muqueuses. Parmi des infec-
fions à papillomavirus, on mentionnera également plus
particulièrement l'épidermodysplasie verruciforme, qui
sera quelquefois ci-après désignée sous l'expression
"EV".
Un certain nombre de types de papillomavirus a
déjà été décrit. La demande de brevet européen n°
85.402362.9-2105 déposée le 29 novembre 1985 et publiée
le 10 septembre 1986 sous le n° 0192001, décrit un
certain nombre de types et sous-types nouveaux de
papillomavirus qui ont été isolés à partir de verrues,
de lésions maculaires, susceptibles de donner lieu au
développement de cancers de la peau chez d'importantes
proportions des malades qui en sont affectés, et à
partir de lésions pré-cancéreuses de la peau, de lésions
d'hyperplasies orales et d'un cancer du col de l'utérus.
Le rôle majeur de divers types de virus de pa-
pillomes humains (HPV) dans la genèse des néoplasies a
été reconnu. leur pathogénicité est également influencée
par des facteurs génétiques divers, notamment immuni-
taires et/ou extrinsèques, tels que des rayonnements
actiniques ~ dans la pathogénèse des infections aux
13~U~9~
2
papillomavirus.
Plusieurs types et sous-types de papillomavirus
nouveaux ont été identifiés dans la demande antérieure.
L'utilisation, dans des techniques de diagnostic in
vitro plus affinées, des ADNs de ces papillomavirus
nouveaux, pris isolément ou en association, entre eux
et/ou avec des ADNs d'HPV antérieurement connus, a
également été décrite dans cette demande.
D'une façon générale, il a été remarquê dans la
demande européenne que les papillomavirus, bien que très
différents entre eux, avaient des tailles de l'ordre de
7000-8000 paires de bases. En outre, leurs génomes
peuvent présenter certains degrés d'homologie, évalués
en pourcentages d'homologies entre types et sous-types
de papillomavirus, dans des essais d'hybridation
réalisés dans des conditions dites non stringentes ou
non strictes ou encore dans des conditions d'hybridation
stringente ou stricte.
I1 a été dit que les papillomavirus qui pré-
Sentent des pourcentages d'homologie inférieurs à 50
dans des conditions strictes ou stringentes apparte-
naient à des types différents. Les virus pour lesquels
on observe, dans r_es conditions strictes ou stringentes,
des pourcentages d'homologie supérieurs à 50 ~ sont
considérés comme appartenant au même type. Ils peuvent
former des sous-types différents au sein de ce mie
type.
Les essais d'hybridation dans les conditions non
strictes ou non stringentes impliquent la mise en con-
tact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus
dans les conditions suivantes décrites par HEILMAN C.A.
et al. 1980, J. Virol., 36, 395-407, et CROISSANT et al,
1982, C.R. Acad. Sc. Paris, 294, 581-586 (molécules
hétéroduplexes).
Les essais d'hybridation dans les conditions
~3~~89_t
3
strictes ou stringentes impliquent la mise en contact
mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans
les conditions décrites par HEILMAN C.A. et al., 1980,
et KREMSDORF, D. et al. ((1982), J. Virol. 43:436-447 et
1983, J. Virol. 48:340-351) et DAVIS R.W. et al., 1971,
Methods Enzymol., 21, 413-418 (molécules hétérodu-
plexes).
Partant de ces considérations, plusieurs virus
nouveaux ont fait l'objet d'une description dans la de-
mande antérieure. De mëme ont été décrits des recombi-
nants génétiques comprenant tout ou partie des génomes
(dénommés ADN-HPVs) de ces virus. L'invention de la
demande antérieure concernait par conséquent chacun des
ADN-HPVs choisis parmi l'ensemble des ADNs qui pré-
sentent des tailles qui s'étagent entre 7000 et 8000
paires de bases et sont caractérisés par les cartes de
restriction qui apparaissent dans les dessins également
reproduits dans cette demande, en ce qui concerne plus
particulièrement les ADN-HPVs obtenus à partir des
PaPillomavirus et qui répondent aux désignations HPV2d,
HPV10b, HPV14a, HPV14b, HPV15, HPV17a, HPVl7b, HPV19,
HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV28, HPV29, HPV31,
HPV32, HPV-IP2 et HPV-IP4.
L'invention de la demande antérieure concernait
également des mélanges ou "cocktails" d'ADN-HPVs isolés
à partir des papillomavirus nouveaux ou antérieurement
connus, à la date de dépôt de la demande antérieure, ou
des sondes d'hybridation les contenant et. susceptibles
d'être mis en oeuvre plus efficacement pour le
diagnostic de diverses catégories d'infections, voire
des niveaux de risques qu'accompagnent la découverte
chez un patient de papillomavirus déterminés. Le nombre
des sondes à papillomvirus décrites dans la demande
antérieure, auxquelles s'ajoutent celles constituées à
Partir des ADNs génomiques de papillomavirus déjà isolés
précédemment et leurs associations dan;; des mélanges
1~~~~9i
4
déterminés, permet donc la réalisation de diagnostics
affinés, notamment une grande discrimination des di-
verses catëgories d'infections imputables aux divers
types de papillomavirus ou susceptibles de se développer
sous l'effet de ces derniers types et, au sein d'une
catégorie d'infections déterminées, de mieux pro-
nostiquer le degré de risque que ces derniéres se trans-
forment en des maladies plus redoutables. En particu-
lier, l'invention de la demande antérieure fournissait
des moyens permettant, dans le cas des infections se
manifestant par des épidermodysplasies verruciformes, de
mieux apprécier le degré de risque que ces dernières
évoluent vers des cancers cutanés.
A ce titre, l'invention de la demande antérieure
concernait plus particulièrement des compositions de
diagnostic ; un groupe de compositions préférées était
défini comme contenant .
1) au moins l'ADN de l'HPV2d,
2) au moins l'un des ADNs de HPV10b, 28 et 29,
3) au moins l'un des ADNs de HPV17, 24,
4) au moins l'un des ADNs de HPV14, 15, 17,. 19, 20, 21,
22, 23 et IP4,
5) au moins l'un des ADNs de HPV15 et 17,
6) l'ADN de HPV24,
7) l'ADN de HPV14, 32 et IP4,
8) l'ADN de HPV31,
9) l'ADN de HPV32,
10) au moins l'un des ADNs de HPV16, 18 et IP2,
étant entendu que les ADNs des dix groupes étaient choi
sis de façon à être en toutes circonstances différents
les uns des autres.
Dans le groupe 10) l'ADN de HPV-IP2 est, de
préférence, associé à l'ADN de HPV16 ou de HPV18.
Dans les figures 1 à 10 des dessins ci-annexés,
sont représentées les cartes physiques de restriction
des ADN-HPVs concernés.
134~û~9.i
Les cartes physiques donnent les positions de
sites de coupure par diverses endonucléases de restric-
tion. L'origine des cartes est généralement constituée
par un site unique de coupure. Les distancies à l'origine
5 sont exprimées en pourcentage de longueur de génome.
La présente invention concerne des papillomavi-
rus nouvellement isolés, les ADNs génomiques qui peuvent
en être extraits ou des fragments de ces ADNs génomi-
ques, ainsi que de nouvelles sondes d'hybridation qui
peuvent être formées à partir de ces ADN-HPVs ou frag-
ments d'ADN-HPVs.
L'invention concerne aussi un procédé de fabri-
cation d'une sonde d'ADN-HPV, caractérisé par le clonage
d'un vecteur dans un hô te approprié, ce vecteur ayant
Prëalablement été modifié par recombinaison in vitro de
tout ou partie d'un ADN d'un virus choisi parmi HPV-IP5
et HPV-IP6 et d'un vecteur approprié, pour obtenir un
ADN-recombinant contenant cet ADN dans un site de ce
vecteur permettant son clonage dans cet hôte, notamment
dans une bactérie, et par la récupération et la purifi-
cation de l'ADN recombinant cloné. Avantageusement, le
vecteur utilisé est un plasmide ou un phage capable
d'être répliqué dans un micro-organisme procaryote, tel
que ~ coli.
De Préférence encore cette sonde.ADN-HPV est
encore marquée, pour faciliter les conditions de son
utilisation. On peut avoir recours à tout principe de
marquage radioactif immunofluorescent enzymatique, etc..
L'invention concerne encore des "cocktails"
nouveaux de sondes les contenant ou leur utilisation
dans des "cocktails°' de sondes déjà décrits dans la
demande antérieure, cependant complétés avec l'un ou
l'autre des ADN-HPVs faisant l'objet de la présente
demande et, par conséquent, des trousses ou "kits" de
diagnostic encore davantage perfectionnés.
Les ADN-HPVs selon la présente invention sont
6
caractérisés par les cartes de restrictions faisant les
objets des figures J_'~ w!-. i.L ~'~ respectivement dénommés
HPV-IPS et HPV-IP6.
Les sondes d'hybridation construites à partir du
génome de HPV-IP5 ou du génome de HPV~-IP6 sont particu-
Lièrement utiles, pour le diagnostic et/ou le dépistage
.in vitro, dans les conditions, qui ont été décrites dans
:La demande antérieure et qui seront encore décrites plus
loin, des types de papillomavirus qui constituent un
:risque pour le développement de néoplasies génitales et,
en particulier, de cancers du col de l'utérus.
Ces sondes d'hybridation seront avantageusement
incorporées aux mélanges de diagnostic des affections du
même type sur lesquels il sera revenu plus loin.
~5 L'invention concerne également des fragments des
ADN-HPVs précédents ou capables de s'hybrider avec ceux-
c:i, notamment dans des conditions strictes. De mê me,
elle concerne les ADNs recombinants contenant tout ou
partie de chacun des ADN-HPVs sus-indiqués, et plus par-
20 ticulièrement des ADNs recombinants contenant des frag-
ments correspondant aux gènes E1, E2, E6-E7,- L1, L2 et à
.La région intergénique, NC, respectivement ou encore des
fragments contenant des séquences correspondant aux ré-
gions intergéniques desdits ADN-HPVs. Elle concerne en-
25 f:in les sondes qui peuvent être constituées à partir de
ces ADN-HPVs respectifs ou à partir des fragments cor-
respondants, et les procédés de diagnostic ~ 'tro met-
tant en jeu lesdites sondes.
Les préparations d'ADN viral ont été extraites
30 selon les techniques qui seront décrites ci-après dans
l.es exemples 1 et 2.
Dans ce qui suit seront décrites de façon plus
précise les conditions dans lesquelles les virus ont été
isolés, puis les conditions dans lesquelles ont été
35 obtenus les ADN-HPVs à partir de ces virus.
~~~t~~~.~.
7
Clonacre moléculaire et caractérisationd'un nouvau type
d'HPV associé à des néoplasies crénitales et à des can-
cers du col de l'utérus (HPV-IP5)
L1n nouveau type d'HPV a été mis en évidence dans
l'ADN extrait de biopsies de néoplasie~s intraépithé
liales (papules bowenoïdes du pénis), par hybridation
moléculaire sur réplique, dans des conditions non
strictes, avec une sonde d'ADN radioactive spécifique du
HPV6 ou du HPV10. L'étude de la sensibilité de l'ADN de
Cet HPV à plusieurs endonucléases de restriction a
montré que l'enzyme EcoRI coupe une fois l'ADN viral.
Après digestion de l'ADN extrait des lésions par
l'enzyme EcoRI, la fraction renfermant des molécules
d'ADN de 8 kb a été purifiée par centrifugation dans un
gradient de saccharose. Les molécules d'ADN de 8 kb ont
été insérées, par le site EcoRI, dans l'ADN du bacté-
riophage ~gtWES~B. Après encapsidation de l'ADN
recombinant et infection de bactéries Escherichia soli
K12 (souche LA101), les bactériophages recombinants
ayant intégré l'ADN de HPV ont été sélectionnés par la
technique d'hybridation sur plages de lyse (Benton et
Davis), en utilisant une sonde d'ADN radioactive
spécifique de l'ADN du HPV6, dans des conditions non
strictes. Plusieurs bactériophages recombinants,
contenant la totalité des séquences virales, ont été
isolés. La coupure de l'ADN des bactériophages
recombinants par l'enzyme d'insertion EcoRI engendre un
fragment de 8 kb hybridant avec l'ADN du HPV6 dans des
conditions non strictes. La coupure de l'ADN des bacté-
riophages recombinants et de la préparation ADN extrait
d es lésions par le mélange des endonucléases EcoRI et
1?stI engendre les mé mes sept fragments, dont le poids
moléculaire total correspond à celui d'un génome de HPV
~( 8 k b ) .
L'ADN du nouvel HPV a été excisé des séquences
de l'ADN phagique et recloné dans le plasmide pSP65. Une
~. a 4 ~.i ~ .~ ~_
8
carte de restriction de l'ADN viral a été construite à
partir de l'étude de la sensibilité de cet ADN à 16
endonucléases de restriction. 22 sites de coupure ont
ainsi été localisés (fig. 1Q). La carte de restriction
du nouvel HPV est différente de celle de tous les HPV
identifiés à ce jour. Le degré d'homologie entre l'ADN
du nouvel HPV et l'ADN des HPV identifiés à ce jour a
été analysé par des expériences d'hybridation sur ré-
plique, dans des conditions strictes, en utilisant une
sonde radioactive préparée à partir de l'ADN purifië du
nouvel HPV. Une homologie partielle a été détectée avec
l'ADN du HPV18 et, à un degré moindre, du HPV26 et une
homologie faible a étë détectée avc l'ADN des HBVs types
2, 6, 10, 13, 29, 31 et HPV-IP2. Le degré d'homologie
entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN du HPV18 a été
déterminé plus précisément par des expériences de
réassociation ADN-ADN en milieu liquide, suivie par un
traitement des hybrides par la nucléase S1. Un taux
d'hybridation de 2 ~ a été détecté entre ces deux ADNs.
2~ Le nouveau virus caractérisé à partir de papules
bowenoïdes du pénis constitue donc. un nouveau type
d'HPV, provisoirement dénommé HPV--IP5.
L'analyse, au microscope électronique, de molé
cules hétéroduplexes formées, dans différentes condi
fions, entre l'ADN de HPV-IP5 et l'ADN du HPV-16 a per
mis d'aligner les cartes physiques de ces deux génomes
et de définir les positions théoriques de différents
gènes portés par l'ADN d'HPV-IPS, par rapport à l'ori-
gine de la carte de cet ADN. Les positions sont
exprimées en pourcentages de longueur du génome à partir
de cette origine (point 0 sur la carte de restriction de
la fig. 1Q ) .
1~~0~91
9
Localisation putative des principaux
gènes et de la région intergénique (NC)
du HPV-IP5
IP5
E6-E7 18-28
E1 28-53
E2 51,5-66
L2 69,5-89
L1 87-8
NC 7, 5-18
L'utilisation de sondes radioatives préparées à
partir de l'ADN du HPV-IP5 purifié a permis de
déterminer le pouvoir pathogène de ce virus. Au cours
d'une étude de 1522 prélèvements de cellules
cervico-vaginales, destinées à précier la fréquence de
l'infection de l'épithélium du col de l'utérus par un
HPV, HPV-IP5 a été mis en évidence dans 5 des 110
prélèvements contenant un HPV. D'autre part, HPV-IP5 a
été détecté dans 3 des 93 biopsies de cancers invasifs
du col de l'utérus analysées. Dans ces trois cas,
l'intégration de la totalité des séquences d'ADN du
HPV-IP5 dans l'ADN cellulaire a été observée.
HPV-IP5 constitue donc un type d'HPV génital,
présentant un potentiel oncogène. I1 est donc souhai
table de l'incorporer à tous mélanges d'ADN de HPV des
tinés à la préparation de sondes moléculaires, en vue du
diagnostic ou du dépistage des types d'HPV constituant
un risque pour le développement de néoplasies génitales
et, en particulier, de cancers du col de l'utérus.
~lonage moléculaire et caractérisation d'un nouveau type
d'HPV associé à des lésions Qénitales (HPV-IP6
Un autre nouveau type d'HPV a été mis en éviden-
ce dans l'ADN extrait de lésions vulvaires décrites
comme des papillomes montrant ds atypies cellulaires
minimes, par hybridation, dans des conditions strictes,
avec une sonde d'ADN radioactive spécifique du HPV-31.
1~~-~8~.~
Une étude de la sensibilité de l'ADN de cet HPV à
plusieurs enzymes de restriction a montré que l'enzyme
BamHI coupe une fois l'ADN viral. Après digestion de
l'ADN extrait des lésions par l'enzyme BamHI, les
5 molécules d'ADN de 8 kb ont été purifiées par
centrifugation dans un gradient de saccharose, puis
insérées par le site BamHI dans l'ADN du bactériophage
lambda L 47.1. Après encapsidation de l'ADN recombinant
et infection de bactéries Escherichia coli K12 (souche
10 LA 101), les bactériophages recombinants ayant intégré
l'ADN du nouvel HPV ont été sélectionnés par la tech-
nique d'hybridation sur plages de lyse (Benton et
Davis), en utilisant une sonde d'ADN radioactive
spécifique du HPV31 dans des conditions strictes.
Plusieurs bactériophages recombinants contenant la
totalité des séquences virales ont étê isolés. La
coupure de l'ADN des bactériophages recombinants par
l'endonucléase BamHI engendre un fragment ~ kb hybridant
avec l'ADN du HPV31 dans des conditions strictes. La
coupure de l'ADN des bactériophages recombinants et de
la préparation d'ADN extrait des lésions, par le mélange
des endonucléases BamHI et PstI, engendre les mêmes 7
fragments, dont le poids moléculaire total. correspond à
celui d'un génome de papillomavirus.
L'ADN du nouvel HPV a été excisé des séquences
d'ADN phagique et recloné dans le plasmide pSP64. Une
carte de restriction de l'ADN du nouvel HPV a été cons-
truite à partir de l'étude de la sensibilité de cet ADN
à 20 endonucléases de restriction. 26 sites de coupure
ont ainsi été localisés (fig. 10). Cette carte est dif-
férente de celle de tous les HPV isolés à ce jour. Le
degré d'homologie entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN des
HPV identifiês à ce jour a été analysé par des expérien-
ces d'hybridation su.r réplique, dans des conditions
strictes, en utilisant une sonde d'ADN radioactive spé-
cifique du nouvel HPV. Une hybridation partielle a été
~:~~0~~ o:
11
observée avec l'ADN du HPV31 et une hybridation croisée
faible a été obtenue avec les ADNs des HPV6, 13 et HPV-
IP2. Les homologies entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN
du HPV31 ont été déterminées plus précisément par réas-
sociation ADN-ADN en milieu liquide, suivie par un
traitement des hybrides par la nucléase S1. Une hybri
dation de 20 ~ a été détectée entre les deux ADNs. Le
virus isolé à partir de papillomes boweno3des vulvaires
constitue donc un nouveau type d'HPV, provisoirement
dénommé HPV-IP6.
L'analyse, au microscope électronique, de molé-
cules hétéroduplexes formées dans différentes conditions
entre l'ADN de HPV-IP6 et l'ADN du HPV31 a permis d'ali-
gner les cartes physiques de ces deux génomes et de dé-
finir la position théorique des différents gènes portés
par l'ADN de l'HPV-IP6, comme indiqué ci-après et par
rapport à l'origine de la carte de la fig. 11 et en
pourcentages de longueur.
Localisation putative des principaux
gènes et de la région intergénique (NC)
du HPV-IP6
IP6
E6-E7 11,5-21,5
E1 21,5-46,5
E2 45-59,5
L2 63-82,5
L1 80,5-15
NC 1,5-11,5
L'utilisation de sondes radioactives préparées à
Partir de l'ADN HPV-IP6 purifié a permis de déterminer
le pouvoir pathogène de ce virus.
Des prélèvements de lésions prolifératives bé-
nignes (condylomes, papillomes) ou de néoplasies intra-
épithéliales des organes génitaux externes, de la région
périanale et du col utérin provenant de 163 malades ont
été analysés. L'ADN du HPV-IP6 a été détecté chez 10
134i~~9~
12
malades présentant des lésions bénignes (condylomes, pa-
pillomes).
Au cours d'une étude de 1522 prélèvements de
cellules cervico-vaginales, destinée à préciser la
fréquence de l'infection de l'épithélium du col utérin
par un HPV, l'ADN du HPV-IP6 a été mis en évidence dans
9 prélèvements correspondant à une cytologie normale ou
inflammatoire ou à une dysplasie légère sur 110 prélè-
vements contenant un ADN d'HPV.
Le HPV-IP6 constitue donc un type additionnel
d'HPV génital relativement fréquent, ne possédant vrai-
semblablement qu'un potentiel oncogène faible. I1 est
donc souhaitable de l'incorporer à tous mélanges d'ADNs
de HPV destinés à la préparation de sondes moléculaires,
en vue du diagnostic ou du dépistage des types d'HPV
sexuellement transmis, agents de tumeurs génitales
bénignes, ne constituant pas un risque majeur pour le
développement de néoplasies génitales et, en
particulier, de cancers du col de l'utérus.
Etant donné la grande diversité des HPVs sus-
ceptibles d'ë tre isolés à partir des différentes formes
de verrues ou autres lésions cutanées ou de muqueuses,
il est cependant préféré d'utiliser, pour le diagnostic
de chaque type d'affection mentionné dans le tableau,
des mélanges comportant plus d'un ou deux ADN-HPVs, dès
lors que d'autres ADN-HPVs ont été reconnus comme pou-
vant également intervenir dans le développement du mine
type d'affection. Le diagnostic de la nature de l'infec-
tion et de son évolution possible sera d'autant plus
efficace que le nombre de sondes utilisées sera plus
élevé. En outre, des essais d'hybridation réalisés avec
ds mélanges différents de sondes permettra des diagnos
tics différentiels présentant un degré de probabilité
également plus important de la nature du mal dont
souffre le patient.
L'invention concerne donc plus particulièrement
1344~~i
13
encore des mélanges ou cocktails de différents ADNs-HPVs
(ou sondes contenant ces ADNs-HPVs ou de séquences de
ces derniers?, susceptibles d'être utilisés en combinai-
son pour réaliser des diagnostics globaux des différen-
tes formes d'infections à papillomavirus, cwentuellement
aux fins de pronostiquer l'évolution possible de l'in-
fection.
Des mélanges préférés conformes à l'invention
sont identifiés dans le tableau ci-après .
134~89~.
14
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Le tableau susdit indique également les natures
des affections susceptibles d'être plus particulièrement
diagnostiquées par l'utilisation des mélanges figurant
dans la partie gauche du tableau. I1 est rappelé que les
5 cartes de restriction des autres ADN-HPVs identifiés
dans le tableau qui précède sont cont:mues dans les
figures 1 à 9.
I1 est à remarquer que les HPV--IP5 et HPV-IP2
peuvent être considérés comme particulièrement représen
10 tatifs de sondes utilisables pour la détection des ris
ques de développpement de cancers du col de l'utérus et
le IP6 comme représentatif des sondes utilisables pour
la détection des infections à papillomes bénignes.
L'ADN de HPV-IP6 peut être associé à l'ADN de
15 HPV-6 et/ou HPV11.
Enfin l'invention concerne aussi. le mélange de
toutes les sondes.
De même l'invention concerne plus particuliè-
rement un cocktail de sondes contenant l'ADN des HPV
spécifiques des cancers génitaux, ce cocktail conte-
nant .
HPV-IP2
HPV-IP5
HPV-IP6
HPV6
HPV11
HPV16
HPV18
HPV31
HPV35 .
L'IP6 est représentatif de sondes utilisables
pour la détection d'infections à papillomavirus bé-
nignes. L'ADN de l'IP6 peut ë tre associé à l'ADN de HP6
et/ou de HPV11.
L'invention concerne donc plus particulièrement
encore des trousses ou "kits" de diagnostic comprenant
~340~9~
16
au moins 11 groupes figurant dans les groupes numérotés
de 1 à 11 dans le tableau sous la rubrique "Désignation
des mélanges".
Dans ce qui précède, on a surtout envisagé
l'utilisation, à tigre de sondes, des ADN-HPVs entiers
clonés. Ceux-ci peuvent cependant être substituês par
des fragments clonés de ces différents ADNs, notamment
par les gènes E1 ou L1 et par les gènes E6-E7.
Le principe de base des détections in vitro
d'ADN-HPV mettra naturellement en jeu des hybridations
opérées dans des conditions strictes ou moins strictes.
On peut opérer par exemple comme suit, étant naturelle
ment entendu que les essais de diagnostic décrits ne
sauraient être considérés comme limitatifs des condi
fions d'emploi des sondes ou mélanges de sondes selon
l'invention.
L'objet des examens mettant en jeu des sondes
préparées à partir de mélanges d'ADNs de HPVs clonés est
de mettre en évidence un HPV et d'identifier le type
d'HPV dans une biopsie, dans des cellules obtenues par
grattage de lésions, ou dans des coupes de biopsies
fixêes par exemple par le mélange de Carnoy (éthanol,
chloroforme, acide acétique 6:3:1) et incluses dans la
paraffine. L'examen nêcessite l'extraction préalable
de l'ADN des nrPlPVPmantS ~Plnn ~A
2r
1340~~1
méthodes dont le principe est connu et met en jeu l'analy-
se de cet ADN par des expériences d'hybridation molécu-
laire, effectuées dans des conditions strictes ou moins
strictes, à l'aide de sondes radioactives (marquées au 32P
au au 35S) préparées à partir de mélanges d'ADN-HPVs. Cha-
que examen requiert, en général, l'utilisation de plu-
sieurs mélanges de sondes.
Plusieurs méthodes d'hybridation peuvent étre uti
lisées. On peut, par exemple, mettre en oeuvre.la méthode
~0 d'hybridation sur ;.ache. Cette méthode comporte, après
dénaturation Ce 1~ADN, le dépôt d'une quant; té aliquote
d'ADN sur des membranes (nitrocellulose ou
C~enesc_eenplus), l'hybridat_on de chaque membrane, dans
les conditions usuelles, avec un mélange de sondes et la
~5 détection des hydr~des radioactifs par expos~:lon des
membranes au contact d'un film radiographique. On peut
aussi utiliser une méthode d'hyb:idation sur réplique.
(.este méthoCe comprend la séparation électrophorétique en
gel d'agarose des fragments d'ADN engendrés après
~0 traitement de l'~C~N par des enTymes de restrictmn, le
transfert des frd_ments , apr ès Céna tur a t:on alca? _ne, sur
des membranes (ni:rocellu=ose, Genescreenplus) et leur
hybrldatlUn, Cans j.es COnd;tlOnS usuelles, avec d_f~érents
mélanges de sondes. La formation d'hybrides radioactifs
~5 est détectée après exposition des membranes au contact
d'un film radiographique.
On peut aussi avoir recours à une méthode d'hybri-
dation in situ, par exemple sur des coupes de tissus fixés
par lE mélange de Carnoy et incluses dans la paraffine.
30 Les sondes radioactives sont constituées soit par
des ADNS d'HPVS marqués par la méthode de "nick-trans-
lation", soit par des ARNS préparés par transcription
d'ADNS viraux insérés dans un vecteur, par exemple de type
p~P6. L'utilisation de sondes radioactives présente
35 l'avantage d'une grande sensibilité, mais ceci n'exclut
pas l'utilisation de sondes non radioactives par exemple
* Trademark
r
1340~9~
- lt3
bi.otinylées et susceptibles d'étre reconnues par des
anticorps soit marqués eux-mémos, soit eux-mémos reconnus
par des anticorps portant un marqueur enzymatique, fluo-
rescent, etc..
L'invention concerne donc encore des nécessaires
ou "kits" contenant une pluralité des sondes sus-indi-
quées, et comprennent .
- HPV-IP5 et HFV-IP6 respectivement pris de façons iso-
lNes,
- soit les sondes précédentes, en mélange avec d'autres,
notamment celles définies plus haut,
ces "kits" étant destinés à des études de diagnostic .n
vitro par hybridation entre des préparations mrales ob
tenues à partir de patients et les dmers groupes ou
~5 mé langes.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs
déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement
- à ceux de ses modes d'application et de réalisat~.on qui
ont été plus spécialement envisa4és , elle en emb:asse au
p contraire toutes les variantes , notamment la ré~é:ence
dans les revendications à une désignat;~n ADN-HPV suivie
d'un nombre déterminé, et à laqueîle cor_espond un ADN-HPV
dont la ca: te de r este ict? cn a été four nie dans les Ces
s.ins, s'entend comme signifiant crue ces revendvcations
~5 couvrent tous les ADN-HPVS qu1 ont en commun avec cet
ADN-HPV particulier de pouvoir titre classés dans le mémo
type, selon la définition qui en a été donnée plus haut,
et a fortiori aux ADN-HPV appartenant au mémo sous-type.
On notera que les ADNS recombinants désignés
30 ci-après ont été déposés le 21 janvier 1986 à la C.N.C.M.
(Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes de
l'INSTITUT PASTEUR de Paris), sous les numéros apparais-
sant ci-après .
pSP65/IP5 (plasmide àans E> coli) . n° I-507
35 pSP64/IP6 (plasmide dans E. coli) : n° I-508
1340~~1
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20
Les lments bibliographiques qui suivent
doivent encore tre pris en considration (certaines
rfrenc es sont prcdes des dsignations de certains
HPV, lo rsque ceux-ci ont t dcrits pour la premire
fois par les auteurs correspondants) .
HPV18 . HOSHART M. et al., 1984, EMBO J., _3:1151-1157,
HPV-IP2 . HEAUDENON S. et al., 1986, Nature,,~?1:246,249,
BEAUDENON S. et al., 1987, J. Inv. Dermatol.,
Ei 88 N' 1 ,
KAWASHIMA M. et al., 1986a, J. Virol.,
57:688-692,
KAWASHIMA M. et al., 1986b, Virology,
154:389-394,
HPV6 . DE VILLIERS E.M. et al., 1981, J.Virol.,
40:932-935,
HPV11 . GISSMANN L. et al., 1982, J. Virol.,
X4_:393-400,
HPV31 . LORINCZ A. et al., 1986a, J. Virol.,
58:225-229,
HPV35 . LORINCZ A. et al., 1986b, Bambury report,
x:225-237,
HPV16 . DURST et al., 1983.
Les dnominations de certains des HPVs
dcrits dans cette demande ont t modifies dans la
nomenclature
internationale
maintenant
en vigueur.
En
particul ier, les isolats identifis droite dans le
tableau qui suit (et tels qu'ils sont dsigns dans le
prsent texte) portent dsormais les dsignations
indique s gauche .
HPV32 au lieu de HPV31 (BEAUDENON S. et al., 1987),
HPV34 au lieu de HPV32 (KAWASHIMA M. et al., 1986),
HPV33 au lieu de HPV-IP2 (BEAUDENON S, et al., 1986),
HPV36 au lieu de HPV-IP4 (KAWASHIMA M. et al., 1986),
