Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
W092/02627 PCT/FR91/0065~
2 ~ ~A r, ~
tNTEGRON DE CORY~'EBAC~ERI~, PR3CEDE ~ TRA~SFORMATION D'U~'E
CORYNEBACTE~IE PAR LEDIT INTE~RO~ ET CORY~EBACTERIE 08~EN~'E
La presente ~nven~ion concerne l'inté~ratlon ce séquences
d' ~,D'~i prédéterminées dans le ~énome des corynéDactéries.
Ce~te intégration peut avoir deux grandes finalités. Il peut.
d'une pars, s'agir de falre produire par une souche de corynébactérie une
5 protéine particulière, soit que cette protéine ne soit pas normalement
exprimée par la souche en cause, ou bien de lui faire surproduire une
protéine homologue. .Uais, d'autre part, il peut s'agir de bloquer
l'expression d'un ~ène en effectuant une interruption de celui-ci, ce qui
conduira à l'annulation de l'activité enzymatique correspondante et à
10 l~accumulation du susstr2~ de la reactlon dans la cellule.
Les CorynéDaC erles qui regroupent, outre Corynebacterium,
arevibac:er;um. sons ces bactéries dont la mampulation s'est révélée
jusqu~à present assez délicate:
- tout d'abord car il niex stait que peu ou pas de métnode permettant
leur transformat~on, et
- des barrières de restrictlon très importantes exlstent qui font que les
transformations mettant en oeuvre de l'ADN provenant d'autres sources
bactériennes sont la plupart du temps inefficaces.
Récemmen~, on a pu mettre en evidence la possibilité de
2~ transformer des corynébactéries par des méthodes d'électroporation.
Toutefois~ si les techniques de transformatlon par vecteur autoréplicatif
sont interessanses, il est préférable la plupart du temps, et au niveau
industriel, de disposer de bactéries qui ont été transformées par integration
dans le chromosome, c'est-à-dire des souches qui sont stables dans le temps,
25 tant quant au nombre de copies de l'élément intégré que quant à sa
localisation.
C'e~t l'objet de la pre5ente invention de proposer des systèmes
d'intégration dans le génome des corynébacséries,
La présente invention concerne des intégrons de coryné-
30 bactérics caractérisés en ce qu'iis comportent:- un gène assurant une sélection, appelé ci-apres "gène de selectlon",
efficace dans ladite corynébactérie,
- une sequence homologue du génome de ladite corynébacterie.
Iesdites séquences ayan~ été adaptées à ladite bactérie,
WO 92/02627 PCI /FR91/006~6
2Q~ ~2~ -
Par "integror". on en-end dési~ner un ~ec-e_r non répilcatif
avant la proprié~é ce s'intégrer dans le gér,ome d;Jne C~rvnéDaC-.éi-lC. ce~
ntégron pouvaî~ e:re sous forme lineaire ou clrcu.alre.
Toutefois. I'intégron provient, en gcnéra!. d'un plasmide
5 autoréplicatif qui permet la s~nthèse dans un hôte différent, Escher~_hia
coli par exemple. ~lais avant l'étape d'intégration, on supprimera. de
préférence, toute trace d'AD,~ d'origine non corvnébactérienne, sauf le
gène de sélection, et en particulier toutes les séquences impliquées dans la
réplication.
Les gènes de sélec ~on e'ficaces aans lesc~tes corvnéDactér~es
sont:
- 5;!!- ces ~enes ce resls.ance - ~ne s~as-ar,cC rar.icuiiere. an~l~iotique
notammen .
- soit des gènes conféran un phénotvpe clalrement Identifiable,
colorallon e:/ou compiémen.~ on par exemple.
Dans le cas présen;. Ie séleclion par resistance a un
antibiotique est plus partlculieremenl intéressanle. ~insi. on pourra
utiliser:
- les gènes ~phlll conféran. Ia résistance à la kanam~cine. noté KmR,
25 - les gènes Cat conféran~ la résistance au chloramphenlcol. noté CmR.
~la~s. d'autres genes peu-ert etre utilisés. notammen~ la resistance à
l'érvthrom- cine.
Par "séquence nomologue". on en~end désigner des sequences
qui correspondent à celles présen~es dans ia cor neDacterle transformée ou
25 qui présentent un taux d'homologie supérieur à ~ C~. il peut s'a~lr de
séquences de la meme espèce ou non, ces séquence5 peuvent d'ailleurs etre
synthétiques.
Les séquences devront être adaptées ou non, c'est-à-dire tenir
compte des problèmes de barrières de restriction existant chez les
30 corynébactéries, par des procédés dont certains sont décrits ci-après.
De préférence, cet intégron provient d'un plasmide qui
compor~e. outre l'intégron, une partie réplicative, I'inté~ron étant flanqué
de sites de restriction permettant son excision. e~ de préférence de
.
.
WO 92/02627 PC'T/FR91 /006j6
2~7~
séquences répétees mve~ses c~rres~ondant à un slte aP restric~lon non
present dans ll;ntog!on~ D_r eYemp~e ~otl. ~st`il o~ Sacl. ims.. par
algestlor à l'âlde ae !'en; me. c_; roconr,ail ieclt sl~e de restrlctlon. on
peut obtenlr dlrectemer,t l'lntégron~ lequel peut. si besom est. etre
clrcularisé. puisque les extremités obtenues sont complémentaires. avant
d'être utilise pour la transformation de la corvnébactérie.
Dans le système selon la présente invention. I'intégron fait
donc, de préférence, partie d'un vecteur plasmidique qui est suscep~ible de
se repliquer à l'aide d'origmes de réplicatlon, ou répilcon, placées dans la
1~ partle répllcati~e. Se!^n la r,ature ~ ré?llcor, present dans cet~e cassetterépilcati~e. ie plasrnlGP composlte peut se rér~llauer so~; unlquement dans
ies CorVneDaCTérles. s l. es. cons;ltue a un seul re~llcon endogPn,e. sol; à la
fois aans les cor~neoacterles et cans un hote etranger. Escherlcnla coii par
exemple. Iorsqu'on l'assocle au plasmlde deux réplicons differents. chacun
permet-an~ i_ réDnCa;lOn dans son hole propr~.
Dans ce cas. Ia constructlon du plasmlde pourra e~re efiectuee
dans des s~stèmes différents des corvnebactéries. ce qul peuT parfols
présenter des intérets compte tenu des difficul~és de construction dans
Cor- nebacterium et ~revlbacterium.
2û Grâce a la présence de séquences homologues présentes
slmul~anement dans l'in~egron et dans le genome. I'ln~egron va s'insérer par
recombinalson dans le chromosome. ,~unsi. aans le transIorman~ pr~malre. le
gene clone initialement au site muitlple de clonage de l'mtégron se
retrouve dupliqué dans le chromosome bactérien (~olr schema Figure 2a).
line telle dupllca~ion peut presen~er un m~éret technologlque
dans la mesure où le doublement du gène peue entralner un accroissement
de l'activité codee par ce gène. notamment l'activité enzymatlque
correspondante.
Comme la structure de l'intégran~ prlmaire correspond a une
30 duplication en tandem directe des sequences homologues encadrant le gene
de selec~ion. il es~ possible de prevolr une amplifica~ion de cette slructure
par sélection de la croissance de l'intégran~ primaire sur un milieu
permettan; de de;ecter les souches surexprlman; le gene ae seiectlon.
. .
-
WO 92/0262 / PCT/FR91/0065~ .
26~7'~
.
~insi. Iorsque le gene de sélec~lon est ie gène de réslstance à un
ant!bio:~que. ~n peu~ sélec~lonner les soucnes les piu~ réslstantes. sur
mlileu~ avec une ~eneLr croissante en antlDiotique. IescueJIes soucnes
de- ront corresponare ~ une surexpresslon des gènes correspondant aux
séquences homologues. mais également à tOUI gène ou sequence d'ADN qu
aurait été inséré dans l'intégron.
~ien entendu, I'intégron comportera. de préférence, outre la
ou les séquences homologues, une séquence codant pour une séquence
d'intéret, notamment pour un peptide ou une pro~éine d'intérêt qui pourra
1~ être homologue. c'est-a-dire provenir d'une corynébac~érie. ou bien
hétérologue. c'est-a-d!!e provenlr d'autres especes bactériennes. mals
egalement e~re c'orl~lre eucarvote ou syntnétlque.
Ces séquences comporteront, de préférence. Ies éléments
assurant leur expression dans les corynébactér!es ou bien seront insérées en
phase pour pouvolr et!e exprimées par les eléments d'expresslon ae ia
bacterie hôte.
Dans le cas de Corynebacterium. il peut etre Intéressant par
exemple d'obtenir une surexpression de certaines enzymes. notamment gltA
ou gdhA.
Comme cela a ete indique precédemment, il est possible
d'utlliser ce système pour assurer l'interruption d'un gène en utilisant un
intégron selon l'inventlon. Par interruption ou par substitution, comme cela
est décrlt a la figure 2b. Ie gène correspondant est inactivé. ceci conduit a
une surproduction du substrat de l'enzyme codée par le gène correspondant.
En général, I'intégron sera-conçu sous forme d'une cas5ette
d'ineegration, c'est-à-dire qu'cn plus du gène de sélection et de la séquence
homologue, qui dans certains cas peuvent etre confondus, on prévoira une
séquence comportant plusieurs sites de clonage qui permettra d'insérer des
sequences d'ADN et/ou des gènes à volonté.
Dans tous les cas, à des fins de confinement génétique, on
essaiera de prévoir un intégron dépourvu d'ADN réplicatif d'une autre
espece.
Il est également possible de prevoir des systèmes d'intégration
plus complexes, en particulier des systemes d'intégration qui comportent en
WO 92/02627 PCT/FR91/006~;6
2~2~
outre les séquences d'u^, élerr,er~ transpos2b!e. ~GS secuer,ces d'élements
transposables peu\en- e re l'ersemrbie des sea,uer,ce~ au assurent la
transposltio^,. c l'e,~ce~ aGS r,ro-e~nes codées ,r, r i_ C3!~ rie~actér~e.
mais il peut egalemer,- slcr:r ce transposabies qu! son- aepour~us des
séquences codant pour les transposases.
Parmi les é!emen.s trans?osaDJes. il fau~ c~ter le pnacoe ~lu. en
particuJier sous la forme d'un phace mlni.~lu. Dans le cas des éléments
transposabJes comme Je phage mini.~lu. comme on le verra ci-après, on a
utilisé des marqueurs qui peu~ent ~aire partie du pnage ou d'origine
I G difIérente. par exemp!e des rr,arqueurs colorés.
L'in~ern;l?~ corcer?~G eg-!ernen- ces inte~rors util~sant des
éJémer:s Tr2nsDos;,~!es ~o~encr. ce d~fiereritej cor~neDccteries~ no.am-
ment Ge Bre~,~acTeriur,. er. p2~.lCUI!G! 15aB! -G~ cue cecr:-. carj ia f~gure 9.L'exemple !' ?resen~e la caractérlsatlon ae l'élement ISaBI et
I'e~emp!e I ! donne une meT:-ode généra!e perme~t_, t de sélect~onner et
d'identlIIer ce t\,r,e d'éiPme-.- trans?os2r,1e.
La présente in~entlon concerre egalemert IGS IntégrOnS
compor;an~ une séquence pro~enar,- des élén-~ents transposes. notamment
des éléments codant pour ies trar,s?osases eticu les répresseurs de la
2~ transposition,
Les integrons selon l'in~ention peu~ent comprendre tou; ou
parlie des séquences en cause. noTamment celle corres?ondan~ a ISaBI.
Ce type de str~-ture d'lntegratlon comportant un fragment de
phage mini.~lu. une séquence d''~D~ homologue et ur, gène de sélection peut
permettre. comme à l'aide aes s.ruc.u!es decrites precédemment. d'obtenir
soit une surexpression d'un gène particuJier, soit la disruption d'un gène
lorsque cela se revèle nécessalre.
Ces dernieres structures. bien que di~ferentes des s~ructures
précédentes seront néanmolns appelees par simplification "intégron".
La présente in~ention concerne egalement des souches de
corynebacterie obtenues par transformation intégrative à l'aide des
intégrons décrits précédemmenl. notamment lorsque l'intégron a eté
introduit par électrotransformation,
Parmi les soucnes de corynébactéries utilisables. il faut citer
3 j plus particulièrement
WO 92/02627 r'CT/FR91/0065t~ .
2~'~72~
- B. Iactofermentum.
- B. fia~urr.
- C. glutamlcu,.-,.
- C. melassecoia.
pour leur intérel induslriel.
Dans le cas où le clonage es; realisé chez un hôte difiérent de
la corynébactérie hôte final de l'intégron, le transfert de l'intégron peut
mettre à profit les propriétés rëplicatives éventuelles de la construction;
dans la corynébactérie afin d'adapter l'intégron à la corynébactérie. Ainsi
on commencera par introduire le plasmide comportan" outre l'intégron, une
partie ré?licati~e. dans 12 soucne merre ou s'e-iecTuera l'intégration, puis
cet inte ro-, amsi aaaa:e ser- récuDerG D_' e~-.r_cllon au plasmide puis
diges~ior, p2' ia OJ les er,z~mes "'J. liaore-- I ;~legror. !e fra~ment purlfié
étant alors autoligué ou non e: le Drodu~ . de ligation utilisé pour la
transformatior; inle~rati\e : aars ce cas Jes Darrieres de res~riction ne
constituer,T pi~s une diii,cu!te.
DaAs certains cas il peul êlre utile de passer par une
corynébactérie intermédiaire. notamment dans le cas où J'AD.~ est d'origine
E. coli. il peut ê~re intéressai ~ d'adapter l'intégror, à ~re-ibacterium
lactofermentum a~ant de l'ada?ler à CorvneDaCterium melassecola.
Er.fin. I'in~ention cor.cerne l'utilisallon des Corvnébactéries
selon l'invention dans le cadre de procédes indus~riels, notamment pour la
préparation de proteines ou de metar,oliles mettant en jeu l'intégron selon
l'invenlion.
Les e~;emples ci-apres permetlron~ de mieu.~; mettre en
évidence les a~antages de la présente in~ention.
Sur les figures annexées:
- la figure I schématise la préparation d'un in~égron en partant d'un
plasmide réplicatif,
30 - la figure 2 schématise l'insertion d'un intégron.
. par simple recombinaison (a)
. par double recombinaison ((b).
- la figure 3 schématise la structure de pCGL519.
- la figure ~ schématise le pourcentage de résis-ance à la kanam~cine en
fonction du temps pour deu.~: souches transiormées.
- .
WO 92/02627 PCT/FR91/00656
2 1~ ,~;t 7 2 ~
- la figure 5 schématise lâ structure des mini\l~
Mudll 1681.
. .~ludll 1681-Ca
- la figure 6 schématise les plasmldes
. pCGL 107 et
pCGL 107::Mud-,
- la figure 7 schématise l'intégration des intégrons désirés contenant ou
non le miniMu.
- la f igure 8 représen~e la carte de restriction de l'élément d'insertion
de Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B115) cloné à partir d'une
insertion dans l'e~:trémité terminale 3' ae l'opéron lac.
- 12 figure 9 représente la séquence IS2~.
- 12 fi~tJre 1~ représen~e 12 c2r~e ce restricticn de lSaBI
- la figure 11 représente la carte de restriction du Dlasmide pCGL33~,
- la figure 12 représente la carte de restriction du plasmide pCGL331.
EXEMPLE I
Construction d'une banaue d'ADN chromosomique de Corvnebacterium
melassecola ATCC17965 et clona~e du ~ène ~ItA
- L'ADN chromosomique de la souche de C. melassecola ATCC
17965 a été préparé sui-ant la méthode adaptée de Ausubel et al. (1987).
Une digestion ménagée par l'enaonucléase de restriction Mbol (~oehringer)
a ete réalisée sur I 0 ug de cet ADN en suivant le protocole décrit dans
Maniatis et al. (1982). Les fragmen~s d'AD~3 ont été séparés en fonction de
leur taille sur gradient de sucrose comme décrit par Ausubel et al. (1987).
Les fragmenls d'une taille comprise entre 6 et 15 kb ont été retenus pour
la construction de la banque.
Le plasmide de clonage pUN121 ~Nilsson et al., 1983) a été
préparé par la méthode de ~irnboim and Doly, (1979) à partir de la souche
de E. coli G~12199 disponible librement. Le plasmide a été linéarisé par
I'endonucléase de restriction ~cll (~oehringer).
La banque a été construite par ligation avec la T4 DNA li~ase
(E~oehringer) dans les conditions décrites par ~usubel et al. (1987), de 1 ~8
de plasmide pUN'121 linéarisé par ~cll et de 2 IJg des fragments d'ADN de 6
à 15 kb décrits ci-dessus. Le mélange de ligation a été introduit dans la
souche de E. coli DH5alpha par électroporalio n en sui~!ant le prolocole
WO 92/02627 PCI/FR91/006~6
2~72~'~
décrit par Dower et al. ( 1988). Les ciones de E. co!i portant les plasmides
recombinants ont é~é sélectlonnés directement par leu, capacité à croître
sur milieu LB con~enan~ I G ~iml de tétrac~cline. Les plasmides de la
totaJité des clones résistants à la tétrac~cline ont éte preparés par la
5 méthode de ~irnboim et Doiy (1979). LlensembJe de ces plasmides
correspond à la banque d'AD~.
La souche de E. coli W625 déficiente pour l'activité citrate
synthase a été transformée avec la banque d'ADN de C. melassecola
ATCC17965. Un clone transformant de E. coli W62û capable de croître sur
IG milieu minimum de sélection contenant de la tétracyciine a été sélectionné.
Ce clone est porteur d'un p~asmide recombir,an. pCGL5GS. Différents
sous-clonages on. perm!s be raccourcir !e fragment d'AD~; de C.
melassecoia porlant le gène glt~ compie~ à un fragment d'~,D~; de 3,5 kb
délimité par deu~; sites de restriction Hindlll.
15 EXEMPLE 2
Inté~ron pCGL5 19
Le schéma de préparation de l'lntégron est représenté à la
Figure 1.
Le gène aphlll a été choisi comme gène de sélection; il
20 confère la résistance jusqu'à 605 I~g/ml de kanamycine lorsqu'il est intégré
à une copie dans le chromosome. On travailJe habituellement à 25 ~g/ml.
Le fragment Hindlll de 3.5 kb portant le gene de structure gltA codant pour
la citrate svnthase de C. melassecola obtenu à l'exemple 1 a été choisi au
depart comme fragment d'AD~! homologue du génome des Corynébactéries
25 et inséré dans l'un des sites uniques du site multipie de clonage (le site
Hindlll). Les sites de restriction bordant l'intégron prévus pour être les plus
utilisés dans la stratégie d'intégration sont les sites Notl qui corre5pondent
à une séquenCe à 8 nucléotides, et les sites 3stXI. L'enzyme 3stXI reconna~t
la séquence (CCAN5NTGG); de ce fait elle coupe aussi fréquemment qu'une
30 enzyme à 6 nucléotides et on peut s'attendre à générer plusieurs fragments.
Mais les fragrnents libérés se réassocient en fonction de la nature des
séquences internes des différents sites ~stXI, ce qui doit conduire
~inalement à la seule reconstituTion du fragment de départ.
Le plasmide pCGL519 (Figure 3) est un exemple de plasmide
35 versatile susceptible de génerer un intégron, On a testé l'intégra~ion dans
WO 92/02627 PC r/FR91 /00656
9 2~7~
C. melassecola de sa cassette inté~rati~e ~ partir d'un plasmide issu au
départ de E. COI!. pCGL519 est constltué des deux ~ragments replicati~s et
intégratifs bordés par les sites Notl. Le premler Ira~mer,. correspondan~ à
l'intégron qul comprend un slte muJ~iple de cJona~e. Ie ~ène de séJection
5 aphlll et un fragment Hlndlll homologue du chromosome portant le gène
gltA qui code pour Ja citrate synthase. Le second fragment comprend la
partie réplicative du plasmide pBLI (fragment 5spl-Hpal de 3 kb) qui se
réplique chez les corynébactéries, la partie réplicative du plasmide
pACY184 qui se réplique chez E. coli, ori pl5A, et l'ori~ine de réplication
10 du phage ,~113 compJémentable en trans. Le plasmide pCGL519 a été
construit dars E. coli, pa! insertion d'un fragment Hindlll de 3.5 kb
contenant le ~ène ~It.~ dans un ~ecle ,r pCGL2' 3.
Comme représen~é dans la Figure J . après clonage pCGL519
est utilisé pour transformer B. Jactofermentum. Au moment dù transfert de
15 pCGL519 dans Bre~ibacterium lactofermentum CGL2G52, le fragment Notl
con~enant les ori~ines de réplication a été sui~s-itué car la partie
replicative de pBLI s'était inactivée dans E. coli. Ceci montre un avantage
supplémentaire de la structure en cassette.
E~EMPLE 3
2G Inté~ration
Le transfert de pCGL519 dans Cor,vnebacterium melassecola
ATCC 17965 Irès restricti~ e vls-à-~is de E. col i a été réalisé à partir du
même plasmide exlrait de B. Iactofermentum. Le système proposé permet
d'isoler le plasmide pCGL519 de la souche de C. melassecola ATCC17965
25 qui est totalement restrictive Yis-à-vis de E. coli mais seulement
partiellement vis-à-vis de B. Iactofermentum. Ainsi, une cassette inté~rative
possédant la modification de la souche réceptrice a été préparée,
Après digestion du plasmide pCGL519 issu de C. melassecola
ATCC17965 par l'endonucléase de restriction Notl (Boehringer), I'intégron
30 contenant le gène gltA et le gène de sélection Aphlll a été isolé et purifié
à partir d'un gel d'agarose à bas point de fusion. L'intégron ainsi purifié a
ensuite été soumis à une autorecircularisation par ligatlon. Le mélange de
ligation a ensuile é~é introduit dans la souche de C. melassecola
ATCC 17965 par electroporation (Bonam,v et al., 1995). Les clones de
35 C. melassecola résistant à 25 ,ug/ml de kanam~cine on~ éte soumis à
l'anal ,vse.
- ', . ..... , :
WO 92/02627 PCr/FR91/00656
I ! .
2~67~
5G5 transforman~s on~ été oblenus. 3 i parmi les 50 analysés
ne possédaient pas le piasmide pCGL519 et 20 d'en-re eux ont été analysés
par southern DlOt après dlgestlon Xbal. Tous correspondent à un même
évènemenl d'intégration s'efIecluant par recomblnaison homoJo~ue dans la
5 région gltA. Selon la nature du produit de li~alion (molécuie monomérique
circulaire ou molécule polymérique linéaire ou circulaire), les intégrants
primaires peuvent être interprétés comme issus d'un "crossing-over" simple
ou double. Une analyse en champ pulsé après digestion Notl suivi d'une
hyridation par une sonde correspondant au fra8ment Hindlll de 3,5 kb
10 contenan~ glt~ a été réalisée. L'intégration d'une seule copie de l'intégron
est conf~rmée par cetle analyse.
Le modèle Impllque la duplication ce la cooie sau~age du gène
- glt.~: I'acti~lté enz-matlque a élé mesurée. elle es~ mu~tipilée d'un facteur
1,82 en accord avec l'interprétation des blots e~ montre que la copie
15 inTégrée n'es. pas Inaclivée. Les résultats sont rassemblés au tableau I par
rapporl à la souche sauvage et c la souche transformée par un plasmide
réplicatif. La stabilité de la struclure intégrée a été mesurée quant au
pourcentage de cellules Kanamycine résistantes après une trentaine de
génération (Figure 4) et quant à l'acti-ilé enzymatique de la citrate
20 synthase qui restent s~ables.
L'amplificaTion de la strucTure intégrée a é~é réalisée par
sélection de croissance sur boîle conlenant une exces de kanamycine,
sélection à 80G l~g/ml puis I 000 ~g/ml puis 1 050 ~g/ml de kanamycine et
de néomycine. Une amplification en tandem direct a été obtenue. Malgré la
25 stabilite de la slructure amplifiée et de la résistance à la kanamycine, le
haut niveau d'activité enzyma~ique ob~enu au départ dans le cas de la
citrate synthase ne s'es~ pas maintenu ul~érieurement. Il est possible qu'une
inactivation spécifique du gène gltA se soit produite.
EXEMPLE 4
30 Construction à base de miniMu
Les dérivés de Mu choisis dans cet exemple sont Mudll 1681 eT
Mudll 1681-Cat (respectivement KmR et CmR) qui ont une taille de 14,8 kb
et 16,6 kb respectivement (Figure 5). Le minilMu Mudll 1681-Cat est un
déri-atif_du transposon Mudll 1681 (Castilho et al.. 1984). Ils possèdent les
35 éléments nécessaires à la Iransposition énoncés précédemment (excepté
.
WO 92/02627 . PCI`/FR91/00656
1 1
~o72~i't)
HU) ainsi que le gène du répresseur thermosensible C (regulateur de
l'expression des transposases ~ el B). un ~ène de résistance aux
antibiotiques (respectivement aphll et ca~) et les gènes lac:~ lac~ el lac '.
Ce dernier commence au 8ème codon et permet de détecter des fusions
5 traductionnelles de protéines lors~ue Mud s'insère dans un cadre de lecture.
(~n a transféré ces transposons dans les Corynébactéries. Après
intégration des transposons dans le chromosome, une méthode, décrite à
l'exemple 8, a permis d'amplifier la copie intégrée. Associée à cette
amplification, le gène cible de l'évènement d'intégration (le gène de
10 structure de la glutamate déshydrogénase) a dans de nombreux cas été
également ampliiié avec une augmentatior, jusqu'G un facteur 25 de
I'activité enz~matique cor!espondante.
EXEIAPLE 5
Construction de vecteurs pour le transfert des miniMu
Le vecteur intégratif (pCGL107 - Figure 6) contlent le gène
gdh t (Gdh') interrompu par le marqueur de réslstance à la kanamycine
KmR ~aphlll), le réplicon (ori) de pU.!~1121 (l~lilsson et al., 1983) et les gènes
conférant la résislance à la tétracvcline (TetR~ et à l'ampicilline (AmpR).
Ce vecteur n'étant pas réplicatif dans Brevibacterium lactofermentum
2G s'intègre par simple "crossing-over" au site d'homologie du gène gdhA.
Mudll 16S l-Cat a été introduit dans le vecteur in~égratif
pCGLlG7 par minimuduction à partir de E. coli OR1836 dans la souche
MC4100. Parmi les diverses insertions obtenues, une d'entre elles a été
retenue donnant un phéno~ype lac- en E. coli (pCGL107::Mud-, Figure 6). A
25 partir de ce même plasmide. a eté preparé un Mud désarmé pCGL107::Mud-,
Figure 6) chez lesquels les gènes des transposases A et ~ ont été délétés
par digestion Hindlll.
D'autres stratégies de transfert on~ été testées; Mudll 1681 a
été introduit chez les Corynébactéries en plaçant le transposon sur deux
30 autres types de vecteurs:
- Vecteur suicide (non réplicatif, non intégratif) pEV I l::Mud,
il s'agit d'un dérivé de pl~C18 dépourvu des gènes lac dans lequel Mudll
1681 a été introduit.
WO 92/026i7 PCI`IFR91/00656
12
2~72~
.
- Vecteur navette (pCGL229) possédan~ le réDlicon de pBL I (fra~ment
Hindlll-Hpal), le répJicon pl5~ et le gène C2t de Tn9.
Mudll 1681 a élé introdul- sur le vecteur na~et.e par minimuduction
chez E. coli Rec-. Parmi les diverses insertions obtenues. une d'entre
elles a été retenue donnant un phénotype Lac- (pCGL229::Mud; ). A
partir de ce vecteur, a été préparé un Mud désarmé pCGL229::Mud-
chez lequel les gènes des transposases A et B ont été délétés par
digestion Pstl.
EXEMPLE 6
10 Efficacité d'électrotransformation des constructions et leur transfert dans
E~revibacterium lactofermentum
Avec les ~ecteurs précédemmenT décrits. o~ éiectrotransforme
une souche d'E. coli (DH5alpha) e~ deu~; soucnes de Brevibacterium
lactofermentum CGL2052 et CGL20C5 (B115). Ces deu~ souches sont
15 partiellement permissives vis à ~is de l'AD~ issu de E. coli. Ces expériencesont apporté les résultats présen~és dans le tableau 2. On peut faire les
observations suivantes:
- Dans E. coli, que ce soit dans le cas du vecteur navette pCGL229 ou
dans le cas du vecteur pCGL107 (qui peut s'y répliquer), I'efficacité de
transformation est nettement diminuée lorsque Mud~ est présent sur le
vecteur ce qui n'est pas le cas lorsque les ~ènes de transposition ont
été délétés. Ce phénomène typique des pJasmides réplicatifs portant
des dérivés de Mu actifs peut être attribué à une très ~orte expression
de la transposase de ~1u dans son hôte naturel. Ceci montre que dans
les constructions présentées ci-dessus, les Mud- utilisés (Mudll 16~1 et
Mudll 1681-Cat) sont bien actifs.
- Dans aucune des souches de Corynébactérie testées il n'est possible
d'obtenir de transformants avec les vecteurs navettes pCGL229~ 1udl
ou - (ni avec le vecteur suicide pEVl l::Mud). Dans le cas des dérivés de
pCGL229, il est possible que lors de la minimuduction dans E. coli Rec-
le réplicon pBLI ait été inactivé expliquant l'incapacilé du vecteur à se
multiplier dans B. Iactofermentum.
- Des transformants ont été obtenus dans B. Iactofermentum r JL20G5
(B115) avec le vecteur intégratif pCGL107 et ses dérivés. L'efficacité
de transformation obtenue avec pCGL107~ 1ud- eT pCGLlG7::Mud- esT
'
WO 92/02627 PCI /FR91/00656
1 3
~7~
semblable. ce qui indique que le ~1inii~1u ~1udll 16~1 -Cat A-B- ne se
transpose pas à haute efflcacité lorsqu'il es- in.rodul~ dans
B. Iactofermentum à l'aide d'un ~ecteur in~éorat: .
La dim~nution observée (facteur 25) dans l'efficacité de
5 transformation des deux déri-~és de pCGL I G7 comparés à pCGL 107
lui-meme est vraisemblablement due à l'augmentation de taiJle du plasmide
transformant (10 kb dans le cas de pCGL1~7! 26,7 kb dans le cas de
pCGL107::Mud+ et 22,1 kb dans le cas de pCGL107::Mud-).
EXEMPLE 7
IG Etude des évènements d'inté~ration de pCGL107::Mud+ dans
B. Jacto~ermentum CGL2005 (B115)
Lc transformatlon de Ja soucne C~.L2' r j (Bi l 5) par
pCGL1~7::~\1ud- (cl-après dénommé pCGL32~) a permls d'oDtenlr 147 clones
resistant à Ja kanamvcine (25 ,uo/ml) mais aucun transformant en
15 sélectionnant pour la résistance au chloramphénicol ( 5 ~g/ml). Cependanl,
après réplique su~ chioramphénlcol! I r 3 de ces clones son~ résistants au
chloramphénicol. Il s'avere donc que le gène cal de Tn9 ne s'exprime pas
suffisamment a une seule copie pour permettre une sélection primaire en
colonies; par conTre. cette expression est suffisante pour déterminer un
phenotype résistant par des tests ullérieurs en strie. Tous les clones
obtenus sont de phénotype lac-, ce qui correspond au phénotype observé
chez E. coli.
Les deux types d'intégrants obtenus (les transformants de type
1, KmRCmS et de type 2, KmRCmR) peuvent correspondre respectivement
à la substitution du gène gdh'A par évènement de couble "crossing-over" et
à l'intégration du plasmide complet au site gdhA par évènement de simple
"crossing-over" (Flgure 7). Les données en faveur de ceste interprétation
sont les suivantes:
- Le dosage de la glutamate déhydrogénase ~selon la technique de Meers
et al., 1970) chez les transformants de type I et 2 (Tableau 3): 5 sur 7
transformants de type I (pour exemple K2 et K3. Tableau 3) ont une
activité gdh nulle, ce qui est en accord avec la substitution du gène
gdhA par le gène interrompu. 4 des 5 transformants de type 2 ont une
activlté gdh semblable au témoin (KC et KC~ par exemple,
Tableau 3).
' '- :
. ' , -
WO 92/02627 PCT/FR91/00656
2~7~
- Les anaJyses moleculaires er Southern ~iot correspondant à la
di~estion BamHI des trans~ormants de t~pe I (1~2) et ae type 2 (KC2 et
KC' ) et ré~élation des bandes caractéristlaues (~isualisées sur la
Figure 7) par la sonde plasmidlque pCGLlG7 ~résultats non présentés).
Celles-ci indiquent que 12 structure moléculaire des transformants gdh-
(K2) est conforme à une substitution de gène. Elle confirme aussi que
Jes transformants gdh- (évènements de type 2 tKC2 et KC4) et
quelques uns de type I (Kl) sont obtenus par intégration du plasmide
au site gdhA.
10 EXEMPLE 8
Sélection des éventuelles transDositions
Les transiorman~s de tvpe 2 (Krn~ et CmR) n'expriment pas
suffisamment le gène de résistance au chloram?nénlcol pour obtenir la
croissance de colonies Isolées en présence de chloramphénicol 5 ~g/ml.
15 Nous avons donc recherché chez ces transformants des sous-clones Cm en
espérant sélectionner des ~ranspositions de ~lud (qui porte le gène cat). Ces
sous-clones ont été obtenus à une fréquence voisine de 1 pour 155 cellules.
Après réplique sur Xgal, ces clones présentent toute une graduation de
couleurs du blanc au bleu (35 ~o sont nettemenl bleus). Ce résultat est
20 confirmé par la mesure des activités béta-galactosidase (Tableau 4). Ceci
pourrait indiquer une transposition de Mud, amplifiant la résistance au
chloramphénicol'et faisant apparaître des activités béta-galactosidase par
fusion de protéine au si~e d'insertion. En fait, les mêmes expériences
réalisées avec le pCGL1~7~ 1ud- ont abouti au même résultat indiquant que
25 ces évènements ne sort pas dus ~ des évènements de transposition.
EXEMPLE 9
Mise en évidence de l'amplification en tandem su_e_chromosome du
plasmide pCGL I 07i-Mud
Il s'avère que la quasi totalité de ces clones Lac+ isolés
30 précédemment (à l'exception de KC3T4) ont aussi une activité gdh
amplifiée (Tableau 4). De plus. sauf une exception (KC3T4), les activités
béta-galactosidase (dosée selon Miller, 1972) et gdh sont quasi proportion-
nelles. La même observation peut être faite concernant le dosage de la
chloramphénicol acét!d transférase (selon la méthode de Shaw, 1975,
35 Tableau 5). Ce résultat es~ conlradictoire avec la ~ransposition de Mud qui
WO 92~02627 PCr/FR91/006~6
~72 ~
n'emporte jamais de séquences adjacenles lors de sa Iransposi~ion. Il indique
plutôt une amplifica~ion en tandem sur le chromosome de l unité de
répétition p~ 1ud-~dn qui est bordée par aes homoiogles de sequence. Ce
point a été confirmé par digestion de l''AD~ ~énom1que des soucnes KC3,
5 KC3TI et KC3T3 par BamHI, Notl et Xbal. Non seulement la bande l~amHI
interne à Mud (et égale à 7 kb) es; amplifiée mais aussi les bandes
contenant les extrémités de Mud ( l l kb et 2,4 kb) ce qui est conforrrie à
une amplification en tandem et ce qui s'oppose à un évènement de
transposition. De plus, les digestions Notl (qui coupe une seule fois dans
0 Mudll 168 l-Cat) et Xbal (qui coupe une seule fois dans gdh') amplifien~
nettement la bande de 2', kb de l'unité de répétition.
Cette ampiificatior semble relatlvemen-. stable dans la
mesure où l'acli~ité béla-galactosidase res.e ~ un niveau de 7G O de
l'activité de départ après 15 générations sans pression de sélection. Les
15 acti~ités Cat et Gdh présentent également une per~e de 3~ i après 25
générations. Cetle ampiification en tandem rappelle des résul~ats
d'Albertini et al. (1985) et de Jannière et al. (19~5) chez Bacillus subtilis.
On attribue l'activité béta-galactosidase des clones amplifiés à une
traduction parasite amplif iée (hors du cadre de lecture du gène de
20 résistance à l'ampicilline où l'opéron lac est fusionné) présente chez
B. Iactofermentum et indétectable chez E. coli.
EXEMPLE 1 0
Etude et caractérisation de l'élément d'inse!tion ISaBI
I in élémen. d'inserlion a élé isolé par récupération de
25 plasmides dans E coli DH5alpha à partir de l'ADN amplifié de KC3T4.
L'ADN génomique de la souche de B. Iactofermentum CGL2005 (~115), de
quelques dérivés et d'autres souches de corynébac~éries, a élé sondé par
une sonde contenant l'élement d'insertion précédemment isolé. Tout
d'abord, le fragment PYUII de 3,5 kb interne à Mu, issu de l'ADN amplifié
30 chez KC3T4 et contenant l'élément d'insertion, a servi pour sonder le blot
initial qui contient les digestions d'ADN par BamHI d'intégrants et de
souches amplifiées variées (dont KC3T4). Comme l'insertion ne contient pas
de site BamHI, cetle expérience permet de révéler les fragments
génomiques BamHI contenant au moins une insertion ou un fragment
35 d'insertion. Dans la souche Kl- (aui correspond à un inté~rant substitué de
type 1 obtenu à parlir de pCGLI07:Mud-), cmq bandes apparaissen~ ré~élan~
la présence de plusieurs copies (en~!ères ou nor) co l'mser~ion.
WO 92/02627 PCI/FR91/00656
16 .
20~72~
-
La digeslion BamHI des AD~ génomiques issus de
B. Iactofermentum CGL2555 (B115) a montré qua~re bandes communes avec
Kl- (de taille respecti\e 18 kb, 5.9 kb. 5 kb e~ ~.5 kb); la cinquième bande
présente dans les auTres souches Kl-, KCl- et KC3 (de taille 6,5 kb) peut
5 traduire une transposition dans un ségrégan~ de la souche CGL2005 (B115) à
I'origine de ces souches.
En~re deux lignées de brévibactéries différentes (i)
Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (Bl 15), et (ii) ~revibacterium
lactofermentum CGL2002~ deux, bandes communes apparaissent de tailJe
1018 kb et 4,5 kb; par conlre la souche CGL2C02 n'a pas d'autres bandes. Ceci
traduit une mobilité ae l'élément. Les souches ae Corynebacterium
melassecola donnen~ des siPnau~ d'h~bridation .aibies avec l'insertion
traduisant l'existence d'2ulres séquences différentes mais apparentées chez
cette espèce.
15I_n premier élémen~ d'insertion mobile spécifique de
B. Iactofermentum a é~é identifié et cloné: nommé ISaBI. il peut être
présent à plusieurs copies (2 à 5 copies) dans le génome. Il est susceptible
de se transposer plusieurs fois en des sites différents dans une région
amplifiée. Sa carte de restriclion fine est connue. Des séquences
20 différentes mais apparentées exis~ent dans le génome des autres
corynébactéries.
ISaBI est constituée de 128~ paires de bases; les extrémités
peuvent être identifiées car ISaBI s'est insérée dans un fragmenl qui
correspond à la région terminale (3') de l'operon lac qui a été séquencé par
25 Hediger e~ al. (Biochemls~ry Proc. Natl. Acad. Sci. E'SA 82~ 1985). ISaBI s'est
inséré entre le nucléotide 5575 et 5576 en duplicant une séquence cible de
5 bp ~CCGAT) (Figure 8). La séquence entière de ISa~l est donnée dans la
Figure 9 et la carte de restriction dans la Figure 10. Deux phases ouvertes
de lecture ont été identifiées qui pourraient correspondre, étant donné les
30 analyses de séquence, au gène de structure de la transposase et au gène
répresseur de la transposition.
EXEMPLE 11
~'ecteur pièRe pour les éléments d'insertion et les transposons
- L'inser~ion ISaBI a é~é oblenue au cours des études d'ampli-
35 ficalion de gène dans le chromosome de B, lactofermenlum (Bl 15). Afin
d'isoler tous les élémenls d'inserlion susceptibles de se ~ransposer dans les
,
WO 92t02627 PC~/FR91/00656
~72~
corynébactéries, on a cons~rui~ des ~ecteurs intégrati~s partlculiers:
pCGL330 et pCGL331 (Figures 11 et 12). Ces deux ~ecteurs son; consti~ués
d'un premier fragment déri~é du ~ecteur pli~;l21.` Le piasmide D~121 es-
réplicatif dans E. coli et porteur de la résistance g I'ampicilline; il porte
une séquence codant pour le répresseur cl du phage lambda qui inhibe
l'expression d'une fusion d'opéron ensre le promoteur PL du phage lambda
et un gène de résistance de la tétracycline. L'insertion dans le gène cl
inactivera de ce fait le répresseur qui permettra alors l'expression du gène
de résistance à la tétracycline qui s'exprime chez les corynébactéries sous
le contrôle de PL. On peut ainsi sélectionner les é~ènements d'insertion par
la résistance à la tétracycline. On a linéarisé p~ 121 au site Ssp1 e
fusionné à un deuxième fr2~men~ obtenu par digeslion du ~eCIeur pCGLlG7
par EcoRI rempli c 12 Kleno~ pou. donner après Iransformatlon de E. coJi
DH5alpha, les vecteurs pCGL33G el pCGL331 qui diffèrent enlre eux par le
sens du clonage. Le fragment Eco~l dérivé de pCGLlG7 conlienl un gène de
sélection pour la transformalion direc~e des cOr,vneDacléries (le gène aphlll
qui confère la résistance à la kanamycine) e; un ~ragment contenant une
partie homologue du gène gdh,~ (gène de s~ructure de la glutamate
déshydrogénase) qui servira de poinl d'intégration dans le chromosome des
corynébactérieS-
Les souches de ~. Iacto~ermentum CGL2055 (BL 15) et
CGL2002 ont été électrotransformées pour la résistance à la kanamycine
par les plasmides pCGL33û et pCGL331. La fréquence de transformation a
été a peu près de IG3 par ~g dans chacun des cas. ce qui est compatible
avec une in~égration des plasmides. Les transformants (comme
CGL2005::pCGL330 et CGL2005::pCGL331) sont sensibles à la ~étracycline
ce qui confirme que la régulalion de PL par cl ~onctionne bien chez les
transformants. La ~réquence des ségrégan~s résistants à la tétracycline a
été mesurée après environ 10 générations.
Des mutations inactivant le gène cl apparaissent dans les
souches possédant les plasmides in~égrés pCGL330 e~ pCGL331 à une
fréquence de 2xl06 par génération.
Une récupération de plasmide a été réalisée à partir de l'ADN
génomique extrait de ségrégants tétracycline résistants isolés à par~ir des
souches CGL2005::pCGL331 e~ CGL2005::pCGL330 et digéré par l'enz~ me
Pst 1.
- ` , ~
.
- WO 92~02627 PCr/FR91/006S6
2a~72~ S
Ces AD~ digérés on~ élé li~aturés et le produit de la ligalion
a servi à transformer la souche DH5alpha de E. COI! pOur la résis~ance à la
tétracycline. Les plasmides récupéres on~ été anal~sés e~ dans J cas sur 9
clones résistanls à la tétrac~cline, ur élément d'inser~ion a été identifié.
5 Dans un cas (issu de CGL2005::pCGL331), un élément d'insertion identique
à ISaBI a été identifié (1,2 kb de taille, possédant les sites uniques Accl,
EcoRV et Xhol) avec une localisation inlerne à cl. Dans un autre cas (issu
de CGL2005::pCGL330), un élément d'insertion différent d'lSaBI (taille de
1,0 kb, possédant un site AccI mais pas de site EcoRV ni Xhol) a été
10 identifié.
Le vecleur de piège à transposon Ionctionne; dans la majorité
des cas, la muta;lon oblenue est une inser~ion: les tréquences de résistance
à la téIrac~cllne mesurent donc assez correctement les fréquences de
transposition; les élémen~s les plus mobiles ont donc été identifiés; parmi
5 ceux-ci. ISa~l a é~é réisolée et un autre éiément d'insertion différent
d'lSaal a été identifié.
Les souches citées ont les origines suivantes:
Escherichia coli
.
. DH5alpha : Gibco BRL
20. MC410G : Casadaban (1976)
OR 1836 : Reyes
Brevibacterium lactof ermentum
CGL2002 : Bonamy et al. (199G)
. CGL2005 (~115) : Bonnassie e~ al. (199~)
Corvnebacterium melassecola
. ATCC17965 : ORSAN
. ATCC17965::gltA: (la présente demande)
Quatre de ces souches ont été déposées dans la Collection
Nationale de Cultures de 1~4icroorganismes (CNCM) de l'lnstitut Pasteur
(Paris) le 23 juillet 1991
- Corynebacterium melassecola ATCC 17965::gltA : n 1-1124
- Escherichia coli OR1836: r~ 1-1125
- Brevibacterium lactofermentum CGL20û5 (B115): n 1-1126
- Brevibacterium lactofermentum CGL2002: n 1-1127.
La souche DH5alpha est disponible dans le catalogue de
Clontech Laboratories. n C1521-1. (Palo ~Jto. C~ 'SA) et la souche
l~lC41GG à l'ATCC sous le n 35695.
~ ~ .
..... . , ' .
.
WO 92/02627 PCI/FR91/006~6
la 20~7~ d
FEUILLE ~SE P~EiV.~L~ El~tlENT
-
.
., . . .. ~ . . - . ~ . :
WO 92/02627 PCI/FR91/00656
2 ~ ~i 7 f'~
Table~u 2: Efficacit~ de transfomlation des vecteurs portant les MiniMu
Souches bactériennes
E.coli DHSc~ B.lactofemlenturn B.lactofe~menturn
CGL2002 CGL2005 (911 5
pCGL229 5xlO 10 5 6
pCGL229::Mud+ 2xlO n.d.
pCGL229::Mud- 4xlO n.d.
3 4
pCGL107 10 3xlO 10
pCGL107::Mud+ 5xlO 4xlO 2
pCGL107~ ud- lO n.d. 5xlO
.
.
PCI/FR91 /006~6
WO 92/02627
21
2~72~
TABLEAU ~: DOSAGE DE LA GLUTA~ATE DESHYDROGENASc
DANS LES TRANSFOR~ANTS PRI~AIRES
Souche bacterienne Activité spécifique Gdh en llmole de
NADPH2consomme/mln/mg protelne
-
souche de départ Km Cm
CGL200s (Bll ' ) 2, 1 8
transformant Km~m
Kl 2,0
K2 50,06
K~ ~0,06
K4 ~0,06
K5 . ~0,06
K6 2,18
K7 ~0,06
R R
transformant Km Cm
KC2 2,24
KC~ . 2,12
KC4 2,18
KC5
KC7 2,06
.
:- . .
.: ~. : . . .
.
: .
WO 92/02627 PCT/FR91/0065
22
20~72~0
TABLEAU 4: DOSAGE DES ACTIVITES 13GALACTOSIDASE ET
GLUTAI~ATE DESHYDROGENASE DANS LES INTEGRANTS A~PLIFIES
.
Souche ~actérienne Activité Activité spéctf ique
nga l ac tos i aase g l utam ate deshydrogenase
.
soucne ae d~ art K.-S ~s
CGL2005 (B115) ~ 7 2,48
' 1ntegrants primalres Kr?` Cr,P~
KC2 6,2 2,24
KC~ 4,5 2,05
ntégrants amp1ifies
KC~T I 27,9 18,2
KC~T2 20,7 16,0
. KC3T~ 48,2 49,6
KC~T4 ~2,2 2,2
KC~T5 19,7 8,55
KC~T6 19,0 11,9
KC~T7 ~4,5 28,0
:. KC2T I 7,4 2,7
' ',
WO 92/02627 . PCI /FR91/006~6
23
~72s:~
TABLEAU 5: DOSAGE DES ACTIVIT~S CAT, ~GAl et GDH
DANS LES SOUCHES A~lPLlFlEES
Souche ~acterienne Activité ~3 al Activité Actlvité
9 spéciflque Cat spécifique Gdh
souche de départ Kn~Cm
- CGL2005 (Bll ~ 7 ~0~07 2,18
~ C
ntég, an. prlmalre Km`Cm~
K2 ~0.07 S.0,006
~0,0- ~0,006
intégrant primaire KmRCm R
KC3 4,5 2,72 2,06
KC7 ~,4 1 ,82
intégrants ampliflés
KC.T 1 ~7!a 19,7 18,2
KCJ-I 3 48,2 ~3,3 49,6
KC3T4 ~2,2 18,4 2,24
KC~T5 19,7 13,6 8,55
.:
,
: .
WO 92~02627 PC'r/FR91/00656
2'
2~72~'~
REFERENCES
Albertini A.'~1. and Galizzi A. (1985). Amplif~ca~lon o~ 2 cnrornosomal region
in Bacillus subtiJis; J. Bacleriol., 162: 12G3- 1211)
Ausubel M.A., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A.
and Struhl K. (1987) in "Current protocols in Molecular Biology", Greene
Publishing Associates and Wiley - Interscience-'
Birnboim H.C. and Dol~ J., (1979) A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid D!~ . Nucleic Acid Res. 7:1513-1523
Bonam~ C., Guyon~arcn `~.~ Reves O., David F. and Leblon G. (1990)
Interspecies electro-transformation in Corynebacteria. FEMS Microbiology
I S Letters 66:263-27G
Bonnassie S. Oreglia J. Trautwetter A. and Sicard ,~ I. (199G) Isolation and
' characterization of a restriction and modification deficient mutant of
Brevibacterium lactofermentum, FEMS Microbiol. Letters, vol. 72:143-146
`' 20
Casadaban M.J. Transposition and fusion of the lac gènes to selected
promoters in E. coli using bacteriophages lambda and Mu. J. Mol. Biol. 104
(1976) 541-555
` 25 Castilho B.A.. Olfson P. and Casabadan .~t.~. (1984) Plasmid insertion
mutagenesis and lac gene fusion with miniMu bacteriophage transposons,
J. Bacteriol. 158:488-495
Dower W.J., Miller J.F. and Ragsdale C.W., Hi~sh Efficiency transformation
30 of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic ACid Res. 16 (1988)
6127-6145
Jannière L., Niaudet B., Pierre E., Ehrlich S.D. (1985) Stable gene
amplification in the chromosome of Bacillus subtilis. Gene 40:47-55
.
:: ... .. :
,
: ~ . . . .
- . - . .
.
. :
WO 92/02627 2 5 PCr/FR91/00656
2~7~
Maniatis T., Fritsch Ed. and Sambrook J. (1982). Moiecular cloning : A
laboratory manual. CoJc. Sprmg Harbor Laborator~ Press. Colc Spring
Harbor, N'~
5 Meers J.L. Tempest D.\~. and Brown C.M. Glutamine (amide):2-Oxoglutarate
Amino Transferase Oxido-reductase (NADP), an Enzyme Involved jn the
Synthesis of Glutamate by Some Bacteria J. General Microbiology 64 (1970)
187-194
10 Miller J. (1972) Experiments in Molecular Gene~ics (Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Sprlng Harbor, ,'~'Y)p352-355
Nilsson B.. Uhién M.. Josepnson S.. Ga~enDeck S. et Phillpson L.. 1983. An
improved positive selection plasmid vector constructed by oligonucléotide
5 mediated mu;agonesis. Nuc. Acic. Res. I l . 8019-853'
Shaw ~ '. (1975) Chloramphenicol acetyl transierase from chloramphenlcol
resistant bacteria. 1~1etho. in Enz. 43: 737-755
~ .
,.
~,
.
30
'
.
. ..
, .
WO 92/02627 2 6 PCI /FR91/00656
20~7240 N~ d~ lii domand~ interntnlonnle PCTI FR91 / C ,~
MlCRO~t~JiRGANlSMES
r~ub heuh~tthr r tr tb- u m e~o-oro-n~-m- m-mionnt n D-o~ 9 . Uon~ 2~ d- 1- rJ-~Crlr~Uon
_ _
A. IDE~TlrlCAT10~1 DU Dt~oT
D'-ut o-oo~e eont ~q-nti~i-- ur un- I-uill- eur~DI-m-nl-lr-
~om rl- I'lnotltutron o- dtoO~ ~
Collection Nationale de Cultures de Microor~anismes
.lnstitut Pasteur
_ _ _ . __ _ _ _
~orolto- rl- I'inotitution rJ- rJ~pot (tr eomono lo eooo ooot-l 11- p- r-)
25 rue- du Docteur Roux
75724 PARIS CEDEX 15
. FRANCE
D 1- du rl~r~ol ~ o~ord - ~
23 Juillet 1991 1-112L
OleaT10~ S SU~Lt~lL~TAl~tEs t 1~ n- r-mDIlr qu~ ~, n-c-e ~o)~ Uno buiii- ~eD-r~- -u lolme DCUr 1- euno o- c--
rr~no- ~n-m-nt~ ~
. I
C tTATS DtSlCNts I~OUR L-SOUELS LS II~DICATIO-IS SONT DOI~itES ~ (~i l-C mdlceoone n- eont pe~ oonnoe~ Dour
toue 1-~ Et-~e ote~on~c)
, _
.
D I~DICATIOIIS FOUI~NIE~I St~ MENT ~ (~ n- r-mp/lr oue ~I n~ce~ee~re)
.
L-o Inolot~on~ ~num~oe e~ oor~e ooront eoumle~e ull~r~ou~om~nl eu Eur~ou ~morn~l~oncl ~ ~eo~einor lC nClur~ o~nh~l~ oell mo
e tton~ p ~ No d'ororo ou ~110~ ~
J~L- o ~nto builh o ~t~ r~eut ~-e le o~m~noe mtcrnollon~b lor~qu~ e-ll- el c 1- a~Do~ hlr~er o-r l'o/r~eo r~c~Dtour)
- 8 AOi'l~ Jgg~ a~ ~ERQU~
(FoncUonn-lr- eutO~
I. '~. 'F. 'r.
~ Dete qe ~cootlon (en Dro~enenco qu O~DO~cnt) Der Ie tur-~u Int~rn-uon~ p ~"~ , r,~d
^ ~ oa
(Fonctionneuo outori~)
Formuluro PCT/R0/13t (O-nlr~or lltttl)
WO 92/02627 2 7 2 0 ~ 7 2 ~ ~) PCI /FR91/00656
No d~ IZt d~m~tndlt int~rnation~le: PCTI FR91 / 00656
__
MICRO ORGANI~MES
Frwilb beulr ll~o r l~ r- u mic~o oro-n~cm- m-noonn- n P-9- 12 . Ilon~ lL . do b doccrio~on
IDEllTlFlcATloN DU Dt~o~ t
O ~utr-e rJ~Polc oont idonllli~o cur un- loulilo cuoDl~monto~o ~ 5
.
Nom do t molltulion r~- O-DOI ~ .
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ;
Institut P asteur
~dro~c- rJ- I InUIIut~on d- r~pol ~1 eomD IC ~- ~- Po~-~ ~- P- ~-
~
25 rue du Docteur Roux
. 75724 PARlS CEDEX 15 .
FRANCE
D-l- dr~ d Pot '~ I N d ordr- -
23 Juillet 1991 1-1127
_ I
INDICATIONS SU~PLÉMENT~IRES ' (~ n, ~mPIIr qu~ ~, n-c~cc~lr-) Un~ Nulll- ~oPor~ t ;olm~ pour 1- UIl- a- co~
n--lon-m-nt- 5
_
C tTATS DtSlCNts POUR LESOtJeLS EES INDICATIONS SONT DoNNtES ~c~ h~ Indlcot~on~ n~ cont P-- oonnoo~ DOU~
touc lo~ Er-~ oouon~s)
_ _
D. INDIC~TIONS FOUltNlES Stl'~RtMENT ' /~ no rompl~r qu~ cl nococcolro)
~ e Ind~cellono ~num~r~-c e~-eDr~ --ront ~oum~c-~ u~t-neur-monl Cu ur--u ~nlorneuon~ nr r n~ r - ~rl n~.
rJ tlonc p o~ No d orr1ro du d~pOt r ~
L E~Le pr~cont~ buillo o ~t~ rocuo o~oc 1~ oom~nrJc Inlornooonclo lorcquo e-ll- Cl o ~t~ rJCooc~ r~ri~-r p~r l oll~eo /~C~pt~UI)
- 8 AOUT 1991 R! ~RQ~r
(Fonctlonnuro ~u~or~
C~ D-~o do rocoplion (on Dro~r-n-nc- ou r~-oo~m) p~r 1~ Bu ~u ~m~ n-~on~ ~ tB ~ r
7_ G
(Fonc~onnr~u- cutori~e)
Formui-lr- FCT/Ron3~ (u-n~or 19011
, .
WO92/02627 2 ~ ~ 7 ~ 28 PCl/FR91/00656
NO d~ b d-m~ne~ Int~rnrttionritle PCT/ FR9i i ~ j6
. MICRO-ORGANISMES
F beuttJtl~r- n bli~- u mie o oroomom- m-ntlonn~ n pop- 18 , llon~ 32 d- 1- d-cerlo~lon
. . _
. IDSI~iTlrleATlON DU DtroT
D~outr - Ci~Dotc cont id-ntifi~c cur un- f-uill- ~uDd-m-n ~ir-
_ _
Nom o l'lneututlon d- o~oot ~
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
Institut Pasteur
~o~oo dO l'mobtulion rl- d~oOI (t~ eomDrl- 1- eorl- ooct-l t 1- P~r~l
25 rue du Docteur Roux
75724 PARIS CEDEX lS
_ F12A~CF ,,
D~ du o~l~o~t ~ ¦ N- d'ord-- ~
23 JUILLET 1991 1-1125 I .
INDIC~TIONS SU~PLt~ENTAlNEs ~ 1~ n- r-rnont qu- ci n c-cccirc~ Unc buillc c~Dorc~ oct jolnlo Dour Ic cunc oc cc~
nod~n-m-nt~
_ __
C. ITATS Dt--lCNtS ~OU~ LE--OUELS LES INOICATIONS SONT DoNNtES ~ cc moic-uonc n- cont DCC oonn~ Dour
touo bc Et te d~cir~ncc)
O. INDIC~TIONS ~OU~tNl~Si stl~Allttl~ENT ~1~ n- r-mr~lir qu- Cl n-e--c l--
-- . _
Loo Inoieo~lone ~num~-~o~ C~o -- - on~ eoumb~ uU~nou~on~-nt eu Buroou Inl-rnellon~ -D-CIn-~ IC n~lure o~n~r~l~ det~ Indu
e r~-ne p ~ NO d'ordr du d~po~
L. ~ Lo Dr~COnl- buillo o ~1~ roCuo otroe lo d-m-no- Int-rnotloncl- lorcouo e-ll- el o ~1~ d~Doc~e ~ ~r~rllie por l'olr~ee rec-pteur~
- ~ Aû'JT ISS, R~ ~ERQtJ~
~Fonctlonnclro cutorl~e)
C Dot- d- r~c-otlon ~cn Dro~-nCnC- du d~Do~cntl Dor lo Bur-cu mtcrncuoncl ~ " ~ t' F-~ : L '---~
. 7 5 i, r ~ &; ~
~Foncllonn-ir- utori~e)
Formubirc PCT/RO/13~ I lon rl-r 1~1 )
~ .
':
;.
WO 92/02627 9 2 9 ~ 7 ~ ~ ~ PcrtFRgl/006s6
No dlt la d~m-ndu inturnation(tle: PCTI FR91 / 00656
,1 ~
MICRO-ORGANISMES ~ ~} ~
r utlh beulutl r- r l~ r~ u mlerr~orrJ-n~urn- m-nbonn~ n peo~ 12 . Ilon- 1 ~ d- 1- d-~crrDrlon
. IDEflTîFlC~nO1 OU otro
D outr-c cJ~Dot~ conl !d-nlifi~c cur un- I-uill~ ~uDDlcm~nuir~
t~om D~ l ln~t~lullon D- d-Pot '
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
. Institut Pasteur
, ~
~Drrnc--d- I moUlution rJ- d-DOt (Ir comD~l~ 1- eod- oo-l-~ t 1- D-lr-)
25 rue du Doctcur Roux
75724 PARIS CEDEX 15
_ FRANCE
Or to r u rJ~*I ' 1 d ondr- '
23 JUILLET 1991 1-1126
_ . . ~
S. IIIDICATIO) S SUr~Ltl~E/lTAlttEs ~- n~ r~m~llr qu~ ~ nr~e~u~u~r~l tJnr~ tr~udl- rurDcrc- er~t lomto Dour Ic cuu~ o- eec
nor~rpn-m-nt~
I
C tTATS OtSlCJltS POUR USOUlLS US ll~tDlCATlOt~S SO~l t DO~Jt~tES ' (c~ 1-- moiecllonc n- cont D-C Donn~-~ Dour
louc l-c Eteu ù~e~ne~)
_
D. I~DIC~TIO~S FOURI~IES StPARtME~lT ~ (~ n~ r~mDllr quo ci n~e-c~-~ro)
_ _
L c ~ndleU~on~ ~num~r~-c ei~ODr~ c-ron~ -oum~o-~ ullerleur-m-nl u Bur-eu Inl-rn~lon~ o~clfi~r 1- nolurc r~n~r~l~ OCi md~
eullono p -~ o d o~r- du rJ~pol)
E ~5 Lo pr ~-m- huUI- e ~t- reCuc ~r~c lo oemonde mt~rnctlon~ Drcrtuo e-ll- a ~t~ d~porJ- (~ ~r~nfi-r P-r I orfie- r~eoptour)
- 8 ~0~ ~ ~.EP~
(Foncllonnolre outorh~) I N P
~I Det~ d~ r~ccDllon (en provonenc~ du d-Do~n11 Prr Ic fJureou mlorncllonnl ~1 ~'5 ~ u_~ ~'D l.o:-~n~r~
755G2 i~ , CE~EX O~
(fonc~lonnolro ~utorlre)
-
Formuleire PcTlRO/13~ ~-mrier 1~81)
