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W ~ 92~2I6~0 l ~ l L~ 9 PC~ 92/00~0
C O M POSES DERIYES DES AZA-6-lN D OLES, LIGAN DS D U RECEPTEUR DES
~ENZO DIAZEPINES ET M EDICA M ENTS LES C O NTENA~T ~;~
L'lnventlon se rapporte a des nouveaux dérlves de 6-azalndole
ilgands du récepteur de5 benzodlazép!nes, aux composltlons pharmaceu-
tlques conrenant ces composes, aux procédés d'obten~lon desdlts composés
et également aux composés u~lles notamrnen~ comme In~ermédlalres dans
5 les procédés de preparatlon. : ;~
Les benzodlazéplnes-1,4 (par exemple, le Vallum) cons~ltuent une
classe de médicarnents lar~ernent prescrlts à cause de leurs actlvl~es
anxlolytique, antlconvulslvante, sedatlve-hypnotique et myorelaxante. Le
rnécanisme d'actlon des benzodiazéplnes est resté longt~mps méconnu .
10 jusqu~à la mlse en évldence de Slte5 de fixatlon (ou "récepteurs") spéc~flques
pour ces molécu~es sur le5 membranes neuronales du systcme nerveux
cen~ral. L'lmportance physlolo~lque de ces récepteurs a é~e démontrée par
I'existence d'une bonne corrélation cntre, d'une part~ la valcur de l'afflnlté
des diffcrentes benzodiazéplnes pour le récepteur (mesurée par dépla-
15 cement d'une benzodiazéplne radioactive) et, d'au~re par~, leur efficacitéthérapeutique.
De m~me, on a ~rouvé que certaines ,5-c~rbollnes se
comportaien~ comme agonlstes du récep~eur des benzodiazépines.
Ainsl, I'Abécarnll, développc par les laborasoires Scherlng cornme
20 anxioly~ique,
~ /OCH~ f~ ~OCH,
~COOiPr o~COOE~
~HN~ ~ H
~: Abec3rnil OCH~
~: ~ . ~ ~R g3~3
~,COOE~
ZX 91926 ~:
- ~"'
Y `
W~ 92/21680 P~/FR92/~
est en cours d'essais cliniques. D'autres ~-carbolines apparentées telles que
le -K 93423 et le ZK 91296 possèdent également des proprietés analogues
à celles du diazépam in vivo (anxiolytique, anticonvulslvante...).
En recherchant un ligand endogène du récepteur des benzodiazé-
pines, Braestrup et coll. (Proc. ,~Jatl. ~cad. Sci., USA, 77, 2288-2292, 19~0)
ont mis en évidence une molécule, I'es~er éthyiique de l'acide ~B-carbo-
line-3-carboxylique (la l~-CCE,), ex~raite de l'urine hurnaine, qui se fixe
avec une tres bonne affinité aux récepteurs cen~raux des benzodiazéplnes
(C150 = 4nM, in vitro, cerveau de rat~. Par contre, la ~-CCE possede
1~ In vlvo des effets pharmacologiques opposés à ceux des benzodiaze-
pines. Ainsi, la ~-CCE est proconvulsivanee chez la souris, facili~ant les
convulsions provoquees par d'autres agents tels que le pen~ylène~é~razole.
""~'.^;'.
1~ ~C~
H
2 0
Le terme "agoniste inverse" est maintenan~ utilisé pour désigner
ces ligands du ré epteur des benzodiazépines qui possèdent des ac~vl~es
complètcmen~ ou par~iellemen~ opposées à celles des benzodiazeplnes.
;,
L'int~ret thérapeutique des ~-carbolines ~e situe à plusieurs ~ -
,
niveaux. Ainsi, I'équipe, auteur de la presente invention, a été la prem~ere
à~d~montrer que de telles molécu!es (par exemple, la ~-Cc~/l ci-dessous)~ ~
, ",
~O 0~ ~'
H ~
: : : .;.
:~ . .
,.~ .
;':'
'~:
. .'':~"
r
WO ~2i21~0 PCI/F~a92~0W80
2~
agonis~es inverses du récepteur des benzodiazépines, on~ un effet pos~tif sur
l'apprentisage et la mémorisation (Venault et coll., Nature, 321, 864-866,
1986). aien que la ~-CC.~l n'ait pu être testée chez l'homme pour ses effets
promnéslants dus à son actlvité fortement convulsivante, d'au~res analogues
tels que le ~K 93426 ou le Flumazenil~ des antagonistes du récepteur des ;
benzodiazépines, ont été tes~é chez l'homme où leurs propriétés promnési-
ques ont été mis en eYidence ~Duka et coll. Psychopharmacology, 93,
42-427, L987 et Lal et coll., Pharmacol. Biochem. Behav., 35, 747-750,
1 990).
1 0
ol CH~ COOEt
F~N~
Z~9342~ U~Tl~slil ~ ::
Ainsi, il semblerait que des antagoniste5 ou des agonlstes
inverses partiels du r~cepteur des benzodiazépines soient utiles dans le
traltement de ~ertai s problèmes cognitifs tels que la maladie d'Alzhelmer.
On~ connait par ailleurs, des dérivés d'aza-6-indole dont cerlains
ont été testés pour leur propriété sur le système ner~/:eux central.
: 25 Alnsi, les auteurs de la~ présenle invention ont décrit la synthèse ~ .
du 2,5-dicarboethoxy-aza-fi-indole par la méthode de Frydman ~ Dodd et
coll., Heterocycles9:28~ 1101~1113, 19$9~. Cette moLécule ne possède qu'un ~ ~-
très~ faible affinité pour le récepteur des benzodlazépines in vitro ~C1
84 000 nM~
3 0
~: ~
'''''
WO 92/216~0 PCI/~92/~
æ ~ J (3 9
,~..
D'aut~es composés ont été décrlts par certains des auteurs de
l~nvention en collaboration avec d'autres chercheurs (Dodd et coll~ J. ~led.
Chem.. 32. 1272-1276, 1989 et Dellouve Courillon et coll.. Tetrahedron, 46,
3245-3266, Ig9~
lais aucune indication concernant leur proprié~és vis-à-vis des
récepteurs de benzodiazépines n'a été rapportée.
Par e ~emple, le composé de formule:
O
10 ~ ~'
~,
15 a été décri~ dans la publication de Dellouve-(~ourillon précitée.
De mêrne, les aza-6^indoles (mono, di et tri-substitués) cité5 `
ci-dessous ont été décrits dans la littérature (Frydman e~ coll., J. ~
Chem. Soc. 87, 3530-3531, 1965); Frydman et coll., J. Org. Chem. 33,
3762-3766, 1968; Fi5cher et coll., J. Med. fhem., 15, 1168-1171, 1972;
2~ Prokopov et coll. Chem~ Het~ Compounds. 4, 406-410, 1978; C:lark et coll. J.Chem. Soc. ~C), 498-5Ql, 1970; Fischer et coll. . J. Itet. Chem. 6, 775-776.
1969 ; Yakhontov e~ coll. Russian Chem. Rev., 49, 428^444, 1980~.
R ~R
R = H9 O~ H3. 0~2C6H~ ;
R' = H. CH2CH2CO2H. CH2Nt~H3)2, C~}O, CH=N9H
CN~ CH3, CH~NH., NO2, Br
R" - H, C:02H. CO2C2H~, CONH2. ~::N, C6H~, CHO. CH20H
,
, '
,i:`::'
~YO 92~16~0 PCr/FP~g2/00480
5 '~
:,:
'~ucune des ces molécules n'es~ connue pour Inleraglr avec le ~;
récepteur des benzodlazéplnes.
Enfln, le brevet DE-~-3 525 928 décrlt la synthèse de dérlvés de
la 5, 6, 7, S-tétrahvdro~ carboline.
En conséquence, un des buts de la présente inventlon est de
proposer de nouveaux composés présentant une affinlté avec le récepteur
des benzodiazeplnes roUt en ayant un effet agonis~e inverse au molns
partiel.
Un autre but de la présente Invenrion est de proposer de
1~ nouvelles composltlons thérapeu1lques utlles notamment clans Je traltement -~
de ~roubles nerveux.
Un autre but de la présenle Invention esr de proposer de
nouvelles cornpositlons thérapeutlques ayant un effet positif sur l'appren-
tissa~e e~ la mémorisation et pouvant être utilisables pour le traiternent i-~
des problèmes cognitifs comme par exemple, dans la maladie d'Alzheimer.
Liinvention concerne en premier lieu les 6-azaindole de formule:
R~C--
Q
dans laquelle :
R l représente I'atome d'hydrogène ou un groupe R 5^O-CH2- dans
25 laquelle R5 corresp~nd à un radical alkyle éventuellemen~ substlrue par
un ou plusieurs groupes alkoxy, alkylthlo, alkylcarbonyl9 amlno, nlrro,
cyano ou à un groupe de formule Ar-Z,
dans laquelle:
Z est un radical divalenl ayant de I à 5 atomes saturé ou insaturé de
301 préférence9 choisl parml -CH2-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -CH~CH-CH;~
~ ,~
:
,'",',
~ :
W~3 92/2~0 P~/FP~92/0~480 - 9 '-~ 6
~.~
., . ~
- ~r est un radical phényle ou hétéroaryle~ comportant 5 à 6 atomes dans
le cycle dont 1 à 3 hétéroa~omes, eventuellement substitué.
- R2 est un radical alcoxy, cycloalcoxy, aryloxy, aralcoxy, amlno~ alkyle
substltue, amino~ cycloalkyle substitué7 amino-N-phénvle substltué, les
5 par~ies aromatiques pouvant être éventuellement substltués,
R3, R4 représentent indépendarnment l'atome d'hydrogène ou un radlcal
alkyle,
à l'eYceptlon du composé où Rl, R3, R4 sont l'a~ome d'hydrogène, R2 est
le radical amino-N-(2-carboxy phényle),
1~ et les sels de ces composés pharmacologiquement acceptables. ;
Dans la présente description, les radicaux alkyle, alkoxy ont de
préférence de I à 6 atomes de carbone et peuvent être linéaires ou
ramifiés (de préférence linéaires). Les radicaux aryle, aryloxy ont de
préférence 6 à 10 atomes de carbone et les radicaux aralkyle, aralcoxy de
15 7 à I I atomes de carbone.
Parmi les radicaux hétéroaryles~ on peut iter les radicaux 1- ou
2- ou 3-pyridyle, 1- ou 2- ou 3-pyrrolyle, 2- ou 3-thiophényle, 2- ou
3-furanyle, 1- ou 2- ou 3- ou 4-imidazolyle, les divers radicaux pyrimydlnyle. ~;
Parmi les substituants des composés phényle ou hétéroaryle, on
2~ ~eut clter les radicaux donneurs de faible encombremen~ comme les atomes
d'halogène, les radicaux nitro, cyano, alcoxy éventuelleme~- halo~énés,
Cl-C3 alkyle linéaire pour C3, éventuellement halogéné, CF3 notamment~
503 H~
Par ailleurs, certains composés présentent un ou plusieurs cen~res
25 d'asymétrieO lls peuvent donc exis~er sous une ou plusieurs forrnes
optiquement actives. D~ns ce cas, I'invention cornprend lesdites formes
optiquement actives~ de ces composés.
Parmi les sels, on peut citer: les chlorures, les chlorhydra~es,
tartrates, f uma~ates.
~ q
WO 92/2~6~0 PCr/FR9~004gO ~ '
2 ~
Selon une varlan~e préférée~ le ~roupe R l correspond au groupe
de formule :.:
( X),~
':
dans laquelle .
1~ - X est un radical électron donneur, de fai~le encGmbrement,
- n est un nombre entier positif ou nul, inférleur à 6, les groupernenrs X
poùvant être identiques OlJ différents lorsque n est plus grand que 1, ~ ';'
Parmi les radlcaux X électron donneur, on peut citer de ~ ~
préférence les atomes d'halogène, les radicaux ni~ro, cyano, alcoxy ~'~''`
éventuellement ~alogéné C l-C3 alkyle, linéaire pour C3, éve'ntuellement -~ `
halogéné, CF3 notamment, SO3H, et de préférence n = 0, 1, 2, 3 ~;
Selon une varianle préferée, le groupe R~ correspond au groupe''
de formule lII: ~ .
..,~.,
:::
(~ ) n ~ CH~ - O - C ~L-- ~ I ~
. ...
ou R l est un groupe méthyle substltué par un radic~l alcoxy et de
:: ~ préférenceS COR2~ est une fonetlon es~er~
Selon une autre~ ~varlan~e préférée, Rl est un atome d'hydrogène :-
et ~de ~préference~COR2 esT une'fonction amide, vantageusement R2 étant
un ~N-aryl amide, no~arnment N-phénylamide éventuellement substitué par
301 un ou plysieurs radicaux choisis parmi les radicaux carboxy, s~lfonate ou
phosphona~e acide. :
.
. ,
,-, :.~
W~ 92/2~680 P~FRg2/0~0
~ l 1 0 ?i 9 ~ 8
Il a en effet été trouvé de façon parfallement inattendue que `
certaines amides selon l'inven~ion prés~ntaient des affiniTés vis-à-vis du
cortex de rat, supérleures à celles des esters.
Aussi, dans la série des ~-CC.~1, il est fourni pour la première
fols des rnolécules à groupe amide possédant de bonnes propriétés relatives ;
au but recherché. Ces molécules présentent en outre plusieurs avanta~es: ;
- une mellleure stabilité hydrolytique;
- un nouveau point d'interaction avec le récepteur des
benzodiazépines.
L'invention concerne égalernent les procédés de préparation des
composés selon l'inven~ion.
Dans la description qui suit, sauf indication contraire, les
substiluants R 1 à R 5 ont la même signafication que précédemment. ~ ,-
a) procédé de préparation des composés de formule 1, dans
laquelle R2, R3, R4 ont l'une des significations sus indiquées et R
correspond au groupe R5-OCH2. ~ ~
Ce procédé consiste à faire réagir un composé de formule: ;;
:., ,: .
N ~ ~ OOR8
3 N
,:
~; dans la~uelle R~;, R7 indépendamment sont l'atome d'hydrogène OU un
2 5 radical C l -C4 alkyle,
R8 est (Cl-C4) alkyle, (C3-C6) cycloalkyle, (C6-C10) ar,vlel (C7-Cl 1
aralkyle7 les noyaux aromati~ues etant substitués éventuellement comme
. ~
pour R2,
en présence du 5el de sodium d'un acide carbox~rlique Rg COOH
30 ~(Rg = C~-C4 alkyle), notamment l'acide acétique dans I I'anhydrlde
correspondant au reflux afln d'obtenir le cornposé de formule:
: ; ,"''
" `~
WlD 92t21680 PCI/FR92/004~0 :;~
C~ ~ ?J ~ ~ 3 ~ ~
4 ''
~0--~ V "'
p~go c R ~1 N - :
C~ g
pUiS de faire réa8ir ce dernier composé avec un alcool R50H, en presence ;;
d'un acide faible (par exemple l'acide paratoluène sulfonique) et d'un
solvant polaire aprotlque tel que l'acé~onltrile, ce qui conduit au composé
de formule 1 souhaité. On ~ransforme la fonction ester en -5 en fonction:
amide de manière connue. On peut également en prernier lieu transformer
le groupe ester COOR8 en groupe amide (composé Va) puis faire réagir le
groupe R,~OH. :~:
Le composé de formule IV est préparé par réaction d'un composé ;~:
de formule
~5 Vl
R3
~ ~avec un haiogénure d'un ~cat~on CH2~ = N
: ~ 25: ~ : ~ : : R
~ : 7
de maniere connue.
b) procédé de;~prépar:atlon des~ composés de formule 1, dans
~:: laqu~lle ~
R2, R~:3,~; R4 ont l'une des sign~ifica~ions sus indiquées et Rl correspond à
3q ~l'atome d'hydrogène.~ 3~,
:
: ~ - ' : ~ ' ` ~ ,.
,~ '`,
:,~
. '~,
' ~' .'
WO 92r21680 P~/~iR92/~)~480
.
'2 ~ 1 Q `~ ~3 ~
Ce procédé consiste à transformer en fonctlon amlde ou ester le
composé de formule
1 4 :~
R3~CO _ oH Vl
de manière connue.
l O Par exemple, I'obtention de la fonction amide est assurée selon
les indications de la publication de Dellouve-Courillon précltée.
Ainsi, un des objets de l'invention est également les composés de ~ ~ .
f ormule
.
l4 R4 :::
OOP8 ~CO<~
P~o R3 1 ~3~ "
COR~
2 0 V V l -:
et Va utiles notamment cornme intermédiaires dans les procédés de
: préparation ci-dessus indiqués.
; ~ ~ Le compo5é de formule Vll est préparé par esteriflcat~on de
l'acide corre~pondant vï qui es~ lui-mêrne ~préparé par oxyda~lon de . ~`
I'aldéhyde VlIIo Celui~ci est ob~enu de manière connue par exernple selon le
schéma reactionnel décri;t~dans la pu~lica~ion~ de Dell~uve-Courillon e~ coll. ;.
pré~it6e.
~ ,.
~ ~ L'in~:n~ion concerne également les médicamen~s consistan~ en un ~:
30 des composés selon l'lnventlon, e~ le compos~ de formule I dans laquelle
Rl, R3, E~4 sont l'atome d'hydrogène et R2 le radical amlno-N-~2-carboxy
phén~yle) tels ~u'ils viennent d'être décrlts ci-avant et !es composltlons ~`
'' :'
, ~ . :~"''''
: ~ ~ , .''';'
;
WO 92/21680 11 PCl/F~92/004~0
3 ~ 9 ~ ~ ~
pharmaceutiques con~enant au rnolns un de ces médicamenls et un support
acceptable. Ces médicaments et composltlons sont utiles pour le traltement
méd~cal ou vé~érlnaire de certalns troubles lies au fonctlonnement du ~
systeme nerveux. ~;
Ces médlcaments et compositions sont particulièren~ent destlnés
à être utilisés en combinaison avec des benzodiazéplnes afin de compenser
les effets néfastes dus à l'emplol de ces dernières. Ces composés
eux-mêmes ~avorlsent également l'appren~lssage et la rétentlon d'infor-
mation chez l'homme.
Ces médicaments et compositions peuvent ainsi être avantageu^
sement destinés à par~iclper à une thérapie efficace contre les maladies
dégénératives du systerne nerveux en partlculier des démences du ~ype
Alzheimer
l~es compositlons pharmaceutiques sont notamment formulées
pour être ingérées oralement ou pour être injectées. Néanmoins, d'autres
présentations peuvent é~alement être envisagées dans le cadre de la
présente invention.
I a posologie dépendra pour partie de la maladie à traiter alns
que de sa gravité et également du rype de l'individu (poids, âge).
11 pourra etre avantageusement envisagé une posologie allan~ de
0,1 mg/kg à 20 mg/kg. -
Les exemples ci-après illustrent l'inventlon:
`:
25 Exernple 1:
carboxvla~e
~ ,~
~ COOMe
H 7
. .
;~.
' ,:'
:. ~
. .
W~ 92/216~û PCI/FlRg2/0~ ~
2 1 1 ~ 1 2 1 ~
; -~
A - PréDaratlon du méthvle 3-N.,'~I-diméthvlamino-mé~hvl-6-azaindole-5- ; ~:
carbo~e
, .
"":'''. "
CH,~ ~ ~ COOMc
' :"'..' '
A 296,0 mg (1,68 mmol) d'es~er (Rl - R3 - R4 = H; R2 = OC:H3) ~; .
1~ dans 30 ml d'acé~onltrile sec sont ajoutés 234,4 t2,50 mmol) de chlorure deN9,~J-diméthylméthylène iminium et le ~out est por~é au reflux toute la nui~
L'avancement de la réaction est sulvi par CC~l (chloroforme-mé~hanol
gO:20). Le milieu réactionnel est ensuite refroidi et concentré sous vide. îl ~ ~.
est ensulte alcalinisé avec une solution sarurée de bicarbonate de sodium~:
pUi5 I'extraction :est effectuée avec du dichlorométhane. Les phases
or~aniques sont réunies, lavées avec de l'eau puis une solution de chlorure ;~
de sodium est séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant est evapQré sous
pression réduite, laissant un résidu qui est cristallisé dans un mélange de
dichloromethane et d'acétonitrile pour conduire à 171,2 mg (43 O)
Z0 d'azagramine. `
F(dichlorométhane-acé~onitrile) = 21 7C. ~-
B -o PréDaratlon du_ne~h,~ le N-ace~v ]-acéto~xvm thvl-6-azaln-
dole-5-carboxylate
2 5
f ~Jc~e
COCH3 ,
3Q
51,2 mg ~0,22:mmol) de l'azagramine précéden~e e~ 44,6 mg ~O,S4 ~
mmol) d'acé~ate de sodium anhydre sont dlssous dans 1 ml d'anhydrlde ~;
.~-
WO 92/21680 P~/~R92/nO480
2 ~ 2 3 `~
acé~lque distillé et le IOut est porté au reflux I heure. L'avancement de la
réaction est suivi par CC~l (chloroforme méthanol 80:20) et lorsqu'elle est
complète, le milieu réactionnel est refroidi. Il est ensuite neutralisé avec
une solution saturée de bicarbonate de sodium et extralt par du
5 dichlorométhane. Les phases or~aniques sont réunies, lavées à l'eau et
séchées sur sulf ate de magnésium. Le solvant est évapore sous presslon
rédulte, laissant un résidu qui est chromatographié sur plaque préparative
(dichlorométhane-étahnol 97,5:2,5)pour conduire au dérivé diacétylé qui est
cristallisé dans un mélange de chloroforme, d'acétate d'éthyle et de
I O nHe~cane (50,4 mg: 79 %). ~;
F(chloroforme-acétate d'éthyle-nHexane) = 170 1 72C.
,
C - PréDaration du méthyle 3-benzvlox~éthvl-6-azairdole-6- ~;
carboxylate
1 5 ~
,:~,
~COt1Mo
f
9,6 mg (0,03 mmol) du diacetate précédent 9,8 mg (0,05 mmol)
d'aclde paratoluènesulfonique monohydra~e et 4,1 ul ~0,04 mmol) d'alcool
benzyllque dans ;3 ml d'acétonitrile sec sont portés à reflux pendant 48
25 heuresO l a disparition du produit de depart est suivie par CC~U (dichloro~
.
méthane^ethanol ~:10). La solution est refroidie, alcalinisée aYec une
solution saturée de bicarbonate de sodium et extraite au dichloromé~hane.
Les phases Qrganiques son~ réunies, lavées à I'eau puis avec une solutlon
saturée de chloru~e ~de sodium, séchées sur sulfate de magnésium puls
30 ! éYaporéeslsous vide. Le résidu est chromatographié sur plaque préparatlve-;~dichlorométhane-éth~nol 90:10) ~ puis cristallisé dans un mélange de
chloroforme et de nHexane, conduisant à 5,4 mg (55 ~O) du dérlvé
3-benzyloxyméthyle. ;
F(chl~oroforme-nHexa~ne) - 191 ~C.
'.
,~
~'~
WO 92/~1680 PCI/FR92/0~80
?~ 1 1 0 2 ~ 14
:, '
En employan~ le même procédé de syn~hèse, mais avec les
prodults ~e départ appropriés, les composés suivants ont été ob~enus: `
R,oO
Exemples R 10 P~F
I O . _ _ ,
2 CH3 156
2F-PhCH2
3F-PhCH2 171 :
.4F-PhCH2 201
6 2NO;~-PhCH2 266
7 3NO2-PhCH~ 260
8 4NO2-PhCH2 238
9 :3MeO-PhCH2 188
I O PhCH~CH2 233
20 11 Pht::H=CHCH2 228
: ~ Exernple l? - PréParatlon de l'aclde 5-Dhénvlamido-6-azalndole-2~-carbo-
.
xv~ : ;
2s ~ ~ ~ 3~;_c ~ 3 3
16 : : t2
i ~ ~ 3 0
L acide ~ (Rl R3 = R4 - H; ~R2 - OH) ~31,2 m~; 0,19 mmol) es~
diss~us dans 3 rnl de tétrahydrofurane sec auquel on ajoute 120 ~1 de `~ ~
~ ~ '
WO 92/2J6~0 PCI/FRg2/0~480 ~
15 2 ~
tr~éthylamine distillée. Le milieu réactionnel est refroidi à 0C, e~ on i;
ajoute goutte-à-goutte 50 l~i (0,64 mmol) de chloroformiate d'éthyle
distillé. On laisse la solution revenir à température ambiante, puls la
température est portée à 40C. L'avancement de la réactlon est sulvl par
5 CC;~/I (dichlorométhane), et lorsqu'elle est complète, le milieu est refroldi
e~ évaporé à sec. On y rajoute 5 ml de tétrahydrofurane sec et 26 ~1 (0,20
mmol) d'anthranilate de méthyle, et le tout est porté au reflux.
L'avancement de la réaction est suivi par CC,~/l (dichlorométhane), et
lorsqu'elle est complète, le milieu est refroidi et évaporé à sec. Le résldu ~ `
10 es~ repris au dichloromé~hane et alcalinisé avec une^ solul:ion saturée de
bicarbonate de sodium. La phase aqueuse est extraite au dichlorométhane.
Les phases organiques sont réunies et lavées avec de l'eau puis une solu~lon
sarurée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium. Le
solvant est eYaporé sous vide, laissant un résidu qui est chromatographié sur
15 plaque préparative (dichloromé1hane). l e composé 16 est cristallisé dans un
mélange de dichlorométhane et de nHexane (31,2 mg; 44 ~
F(dichlorométhane-nHexane) = 198-1 9g~C
Selon la même méthode, mais avec les amines aromatlques
correspndantes ont été obtenus les composés suivants
~ ~ R
R P.F ~i
': .'-,
13 H 225 ; -`
14 3-COOH 310~ (décomp)
1~ 4-COOH 305 ~decomD)
':;'''
..
:~ ~
,. 7,, .~
WO 92/2l68û 1 1 0 2 ~ 3 1 6 ~Cr/FR92/û~4~0
Le composé 16 (31 mg ; 0,08 mmol) est dlssous dans 5 ml
d'éthanol aqueux à 10 ~O auquel on ajoute 420 ~1 de soude lN, e~ le tout es~
porté au reflux. Après une heure, la réaction est complète (dichloromé-
thane-éthanol, 95:5). Le milieu réactionnel est refroidi, et l'éthanol est
5 évaporé. Quel~ues gouttes d'eau sont ajoutées, et l'acide 12 est préciplté
par addition contrôlée d'acide acétique. Après une nuit à 4C, le preclpité
est filtré, lavé à l'eau et séché pour donner 21,5 mg (91 'o) d'acide 12.
F(H C~ = 286-297C
Propriété biolo~iques
~ j ,
A - Tests in vitro sur membrane de cortex
Les composés des exemples 1 à 14 ont été testés sur membrane
de cortex de rat afin de déterminer leur affinité pour le récepteur des
15 benzodiazépines.
Le tableau ci-dessous résume ces mesures. ;~
~ ~ ~ ExemDles
; ~ 2 0
7 50
2 1 500
-~
4 100 ;~
~ 5
6 1200
; 7 1300
8 ~ 300 ~s
9 ~ loaoo
1 SO ,
12 ~300
1 3 7 0 0 0
1 4 5 5 0 9
15 ~ ~ ~ 23~0 ~ `~
:
WO 92/21680 PCI/~iR9~/00480
17 2~1~29'~ ;
..,.:,
B - ProPr_e~é pharmacolo~lque du composé de l'exemple I
"`
Dé~ermlnat~on du_profil pharmacolo~Le
..,, .:
Cette étude conslste en un test électrophysiologlque sur oocyte
5 de Xénope. Les cellules des lobes opti~ues de poulet présentent fortultement
une bonne réponse au GABA. Les ARN totaux en sont ex~raits et passés sur
colonne d'affinité oligodT, permettant ainsi d'en séparer les ARN messagers
bruts, car ceux-ci ont une extrémité terminale polyA qui va s'associer par
complémentari~é avec les résidus oligodT de la colonne. Ces ARN
10 messagers seront ensui~e In jectés dans un oocyte de Xénope, qui n'est
qu'une seule et unique cellule. Ces oocytes seront alors mis à incuber, et en
deux jours, les ARN messagers se seront exprimés et auront alnsi, ~râce à
la machinerie cellulalre de l'oocyte, produit des complexes récep~eur au
GAaA - récepteur des benzodiazépines - canal chlorure. Ces grosses entités
15 protéiques rnigreront alors dans la cellule et ga~neront la membrane,
permettant ainsi à ce récep~eur et au canal ionique transmembranaire qul
lui est associé de prendre sa place.
L'oocyte est alors placé dans un bain de GABA 10 5.~1 dans du
soluté de RINGER et deux microélectrodes A et B y sont introduites, une
20 trosième microélectrode étant placée à l'extérieur de la cellule pour servlr
de référence. La microélectrode A servira ~ mesurer la différence de
potentiel (DDP) entre l'intérleur et l'extérieur de l'oocyte. On impose à
I'oocyte une DDP de 60 mV, et la microelectrode B servira à maln~enlr
cette DDP voulue.
25 ~ ~ ~ E~n perfusant un ~a~onlste ;comme le diazépam, ce dernier et le
GABA présent dans le milieu exerce~ront un effet allas~erique au nlYeau du
récepteur avec comme~ corollaire llouverture du canal ionique. Il y aura
: ~ donc entré~ de chlorure dans l'oocy~e, et la DDP augmentera beaucoup. Par
contre, un agoniste Inverse comme la 1~_CCM provoquera une diminu~ion de
30 1 la fixation du GABA sur le receptcur avec comme conséquence ~ une
;~ ~ dimlnution du temps d'ouverlure du~ canal chlorure et une DDP plus falble
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~8 ;
3 9
Un antagonlste occupera le slte de llaison du récepteur des
benzodiazépines mais n'aura aucun effe~ sur la fixatlon du GABA.
L'ouverture du canal chlorure ne sera donc pas perturbée, et la DDP ne
variera pas. ;~;
Le composé l a été perfusé dans le milleu baignant l'oocyte a la
concentration de lO ,~1, provoquant, par rapport à la forte augmentation du
diazépam et à la diminution importante de la ~-CC~I, une légère
diminution de la D~P. La molécule l est donc un agoniste inverse partiel,
alors que le ZK 91296 est un agoniste partiel.
': '~
Tests in vivo
Le composé l a d'abord été testé pour ses propriétés convul~
slvantes. I e test a été effectué sur l4 souris (5 mâles et 9 femelles) de
deux mols appartenant ~à la souche ABP/Le. Cette souche particulière est
très sensible aux convulsions induites par les @-carbolines. Le composé l a
été administré par voie intra-péritonéale à la dose de 20 mg/kg et ~-
I'observation a eu lieu après 3Q minutes. Aucune des souris n'a présenté la ~;
moindre convulslon. Le composé n'est donc pas convulsivant.
Le cornposé l a ensui~e eté ~esté sur l'apprentissa~e. Ce test,
I'évi~ement passif avec apprentissage en un seul e sai9 a éte effectué sur 30
souris femelles Swiss ~e deux mois. Le composé~ l a été administré à
souris à la dose de 20 mg/kg, les 15 autres recevant une injection de serurn ;~
:~ physiologlque.
~, -
L'appareillage consiste en une boîte blanche reliée à une boîte
noire par une poFte. La boîte blanche est éclairée par une larnpe de lO0 W ~ ~placée~ à 25 cm, et la~ boîte nolre, dans laquelle la souris ira spontanément~ ',A,
car élle se sent en sécurité ~ dans l'obscurité, c~mporte une plancher
rnétalllque ~iectriflé. Les boites sont enduités d'odeur ~ de sourls par un
animai placé dedans aYant chacune des ~ deùx séries de 15 souris.
30 ! ; ILe test se déroulè en deux sessions: la première est l'apprentlssa~e,
et la seconde, qui se pas~e 24 heures après9 est le test d'évitement
propremen~ dit. ~ ` `
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1 9
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DlY mlnutes avant l'apprentlssage, les sourls marquées reçoivent
une injection Intra-péritonéale de sérum physiologique ou de composé 1.
L'lnjectlon est faite avec l'épreuve afin de vérifier si la molécule testée
agit sur la mémoire au niveau du phénomène d'acquisltlon. Si la phase de
rétention de l'information avait é~é étudiée, l'injection aurait eu lleu après ;`
I'épreuve d'apprentissage. Les souris sont ensuite placées une par une dans
la bolte blanche éclairée, et la la~ence d'arrivée dans la boîte nolre est
notée. Ce temps est en moyenne de 24 secondes, et le critère utilisé es~
que les quatre pattes de la souris soient dans la boîte nolre. A cet instant ;~précls, un choc électrlque de 75 ~A de courant continu est déclenché
pendant deux secondes.
Après 24 heures a lieu le test d'évitement: la souris est placée ~;
dans la boîte blanche et l'entrée ou non dans la boîte n~ire en trois ~-
minutes est notee sans qu'aucun choc électrique ne soit provoqué. Si la
souris entrée dans la boîte nolre en moins de trois minutes, Ia molécule ~ ~;testée n'a pas amélloré l'acquisition de llinformation "boite noire = choc
éleclrique", mals si le temp5 noté est supérieur à trois minutes, la molécule
est supposée avoir agl.
:: ,
2 0
. . . ..r , "
3 mm ~ 3_rnm _
traltées 4 11
_ _ . ~ . ... ,~ ,
_ non ~raitées 8 7
2 5
On note que chez les animaux traités avec la molécule, une
~ i
majorité (75 ~6) d'entre eux a appris à év~ter le choc électri~ue. On a donc
mis en évid~n~e l'effet promnésiant du composé lors du test d'evltement
passif avec apprentlssage en un seul essai. ;;
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