Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
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.'' 1
PRODUIT ~ACTERICIDE, COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE CON-
TENANT ET ADDITIF ALIMENTAIRE.
La présente inven~ion concerne de nouvelles substances
5 bactericides, possédant un spectre d'ac~ivité étendu.
Parmi les substances bactéricides connues, on distingue
notamment un certain nombre d'antibiotiques, et les antiseptiques.
Les antiseptiques sont des agents chimiques qui s'opposen~ à la
prolifération des microorganismes et les détruisent. On peut citer par
l0 exemple la chlorhexidine, les halogènes, les sels de métaux lourds, les
ammonlums qualernaires, l'acide salicylique et ses dérivés.
Les antibiotlques sont définis à l'origine comme des substances
chimiques produites par des microorganismes et ayant le pouvoir d'inhiber
ou de détruire les bactéries et d'autres microorganismes, en solution diluée.
15 Un grand nombre de ces molécules sont actuellement préparées par
hémisynthèse ou synthèse chimique.
Ces molécules peuvent avoir une action ~actériostatique ou
bactéricide.
On distingue plusieurs grandes familles d'antibiotiques, en
20 fonction de leur structure et de leur mode d'action. Les principales sont lesbéta-lactamines (pénicillines et céphalosporlnes), les aminosides, les
cyclines, les phénicolés, les macrolides, les polymyxlnes et les qulnolones.
Les sulfamides constituent un autre groupe de produits antibactérlens.
Cependant, l'emergence constante de souches préseritant une
25 résistance aux substances bactéricldes connuès et la propagation rapide de
ce caractère, conduisent à rechercher en permanence de nouveaux prodults
actifs.
En outre, on recherche de plus en plus des antibiotiques
présentant des spectres limités ou destinés à des applications spécifiques.
30 de façon à ne pas bouleverser, notamment au niveau digestif, l'équllibre
microbiologique naturel.
L'un des intérêts du produit selon la présente Inventlon, est de
présenter une activilé intéressan~e sur des bactéries impliquées dans les
désordres du système digestif, en particulier les Clostridium.
3~
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21~3~X~ 2
En effet, on a découvert que des dérivés porphyriques
possèdent une activité bactéricide.
La présente invention a pour objet un produit bactéricide,
caractérisé en ce qu'il comporte un noyau porphine.
Le noyau porphine est le noyau fondamental des porphyrines,
constitué par quatre noyaux pyrroliques reliés par quatre chainons -CH=
et se trouve représenté ci-dessous:
--C H ~
~I~C~H ~ CHO
1 5 R~
avec R=R =R -H
L'invention se rapporte aux dérivés des porphyrines, pour leur
20 application en tant que substances thérapeutiquement actlves, en
particulier en tant que produits bactéricides.
Parmi les produits bactérlcides selon l'inventlon, on peut
notamment citer les produits comportant une molécule d'hématoporphvrine,
pour laquelle R-CH3, R 1 =CHOH-CH3 et R2=CH2CH2COOH.
D'autres produits bactéricides particulièrement adaptés selon
l'invention sont les produits comportant au moins une molécule choisle
parmi l'hémine et l'hématine; I'invention concerne également un produit
bactéricide qui comporte au moins une partie du groupement hème. ou au
moins une molécule dérivée des chlorophyllines~ qui sont des sels des
30 différentes chlorophylles.
Par fixation comple.xante d'un groupement métalllque auY
quatre atomes d'azote du squelette de base, on obtient une série de
groupements prosthétiques qui conviennent à la mise en oeuvre de
l'invention.
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Cependant, la présence de ce groupement métallique
n'apparaît pas essentielle, et sa nature peut être variable, avec conser-
vation de l'activité bactéricide des dérivés. Ces pararnètres seront adaptés
par l'homme du métier.
Le produit bactéricide selon l'invention peut être prépare par
synthèse, tout au moins pour sa partie porphyrlque; ceci présente des
avantages tant pour des raisons de sécurlté que de spécificité d'action.
Selon un autre aspect de l'invention, le produit bactériclde
peut être préparé par incubation d'un substrat contenant de l'hémoglobine
avec un mélange enzymatique contenant au moins une prc~téase (puis
récupération de la solution du prodult obtenue).
Le produit bactéricide peut être obtenu à partir de différents
substrats contenant de l'hémoglobine, notamment à partir de sang total. de
globules rouges, du contenu érythrocytaire ou d'hémoglobine purifiée.
On fait agir sur ce substrat un mélange enzymatique contenant
au moins une protéase, notamment de la trypsine; toutefois, de meilleurs
résul~ats sont obtenus en associant la trypslne à d'autres enzymes, tels que
celles trouvées dans le suc pancréatique ou dans les surnageants de fecès
d'animaux axéniques.
Le produit bactéricide peut également être obtenu par
incubation d'un substrat contenant de l'hémoglobine avec de la protélnase
K. L'hydrolyse est alors conduite de préférence à une tempéra~ure de
l'ordre de 50 C.
Les conditions de l'incubation dépendront de l'actlvlté du
mélange enzymatique et de l'origine du sùbstra~, mais la dlgestlon est
conduite de préférence à 37 C pendant envlron 24 heures, mals ll est
possible d'utiliser des tempéralures inférieures jusqu'à ~0 C, et des durees
de l'ordre de 1 heure à 72 heures.
Après incubation. Ie produit est récupéré en solution après
élimination des éléments solides résiduels.
Le produit selon la presente invention peut être prepare
notamment par le procédé sulvant:
a) on centrif uge un échantlllon de sang to~al de mammifère~ et on
recueille le culot co~tenant les érythrocvtes,
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212~ ~8~
b) après lavage (par exemple avec une solution tampon isotonique),
on met le culot en présence d'eau distillée pour provoquer l'hémolyse
des érythrocytes,
c) on centrifuge,
5 d) on fait incuber le surnageant obtenu à l'issue de l'étape c) avec du suc
pancréatique,
e) la solution de produit bactéricide obtenue est stérllisée par flltratlon
(0,45 ~m~.
Le sang peut provenir de différents mammifères. Il est
recueilli sur un anticoagulant comme l'héparine.
Les érythrocytes sont isolés, par exemple par centrifugalion à
2000 rpm, 10 min à +4 C, pUlS lavés dans le même volume de tampon~ de
préférence du tampon PBS; ils sont ensuite hemolysés par addition du
même volume d'eau distillée, et les débris cellullaires sont séparés du
contenu érythrocytaire par centrlfugation, par exemple à 13000 rpm, l
min à +4 C- L'extrait obtenu peut être conservé à s4 C ou congelé à -20
C, s'il n'est pas soumis immédiatement à l'action des enzymes.
L'incubation en présence du mélange enzymatique est plus
particulièrement e~fectuée à 37 C pendant 24 heures? en aérobiose, après
2~ dilution du substrat dans la préparation enzymatique.
Selon un autre des aspects de l'invention, le produ
bactéricide peut être obtenu par incubatlon d'hémoglobine purlflée
humaine ou animale avec du suc pancréatique. Ce prodult peut etre
stérilisé par filtration.
Dans le cas où l'incubation~ esl réalisée avec du suc
pancréatique, on u~ilisera de préférence du suc pancréatique de porc, dilué
à 2 %.
L'action d'un mélange enzymatique tel qu'il a été définl
ci-dessus, sur le sérum issu de la coagulation, le plasma des sangs héparlnés
30 séparé par centrifugation, ou les parois érythrocytaires séparées après
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hémolyse, conduit à un produit dépourvu d'activité bactéricide. De même,
I'incubation du mélange enzymatique avec la globine seule conduit à un
produi~ inactif, démonTrant la nécessité de la présence de l'hème lors de la
réaction. L'action du mélange enzymatique sur le sang total conduit à un
produit bactéricide ayant une activité inférieure à celle du produit obtenu
à partir du contenu érythrocytalre.
De manière générale, I'activité bactéricide du produit est
portée par ia fraction porphyrique, qui est insoluble dans l'eau.
Des produits solubles dans l'eau, préférés selon l'invention,
comportent donc le noyau porphine évenluellement substitué et/ou
complexé par un métal, et associé à un résidu de 3 à 10 acides amlnés, plus
particulièrement des acides aminés provenant des chaînes de globlne.
L'analyse par chromatographie d'hydrolysats d'hémoglobine
brute par la protéinase K permet de séparer et de purifier la plus petite
molécule soluble en eau portant l'activité bactéricide. Il s'agit d'un
composé absorbant à 214 nm et 380 nm, qui possède un poids moléculaire
apparent compris entre 600 et 1000 daltons.
Un tel composé présente une bonne activité bactéricide,
favorisée par une solubilité permettant une bonne répartition dans les
liquides biologiques.
L'administration per os de ce produit à une souris axénlque
permet de constater que l'activité du produit est maintenue dans le contenu
intestinal. Il s'agit donc d'un produit qui n'est pas absorbé et resle dans la
lumière du tractus digestif; en outre ce produit n'est pas dégradé par les
enzymes digestives.
Si on le souhaite, le produit bactéricide peut comporter un
nombre plus grand d'acides aminés. ce qui augmente sa solubililé et permet
son passage éventuel à travers la barrière digestive pour avoir une ac~lvlté
systémique.
Les molécules actives ont comme structure commune le
groupement porphyrinique et différent par les résidus d'acides ammes
maintenus associés au noyau porphyre.
Elles sont autoclavables.
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2l2~8~
Le produit bactéricide selon l'invention esl un produit ayant
une partie substantielle de nature peptidique pouvant provenir de la
globine. Le produit obtenu est certainement constitué par un mélan~e de
molécules qui diffèrent par leur nombre d'acides aminés.
11 s'agit d'un produit résistant, dont l'activité perslste après un
traitement à 60 C, pendant 15 heures~ Ce produit est Iyophilisable.
Il résiste en outre à l'action de la protéase K, 24 heures à
50 C.
Ce produit est sans doute dérivé de l'hémoglobine comportant
tout ou partie de l'hème. Le produit bactéricide selon l'invention est actif
sur des bactéries gram anaérobies strictes, en particulier sur des bactéries
du genre Closlridium, tel que Clostridium per~ringens, Clostridium
butyricum, et des sporulés isolés de la flore humaine. Il n'est pas actif sur
plusieurs souches de Clostridium difficile. 11 est actif sur d'autres souches
de la flore dominante de l'homme adulte, tel que bifides, les peptoslrep-
tocoques, et Eubacterium.
Son activité s'exerce également sur les bactéries du genre
Bacillus.
Ce produit est donc particulièrement intéressant puisqu'il
s'agit d'un produit d'origine naturelle, actif sur des germes responsables
d'infections particulièrement dangereuses; par exemple Clostridium
butyricum est impliqué dans l'entérocolite ulcéronécrosante du nouveau-né.
Ce produit donne donc naissance à une nouvelle génération de substances
inhibitrices, Iyophilisables, stérilisables par filtration. Ce produit purifié
pourra être utilisé notamment comme additif alimentaire, par exemple
pour éviter les troubles observés lors du sevrage du porcelet.
Les produits bactéricides selon l'invention peuvent é~alement
être utilisés comme conservateurs.
La présente invention concerne donc des composltions
médicamenteuses comportant à titre de principe actif un produit selon la
présente invention avec un excipient compatible avec une applicatlon
thérapeutique notamment par vole orale.
2123 .~7
WO 93/10153 7 PCI`/FR92/01063
Il pourra s'agir notamment de compositions telles que des
tablettes, comprimés? poudre ou autre f orme administrable per os.
La présente inventlon concerne également des comprlmés
destinés à l'alimentationl notamment animale, contenanl SOlt des
5 concentrés du prodult selon l'invention destinés à être ajoutés aux allments
proprement dits, soit à l'eau de boisson ou bien des pré-mélan~es
d'aliments animaux contenant le produit selon l'invention.
D'autres carac~éristiques et avantages de la présenle Inventlon
apparaitront à la lec~ure des exemples qui suivent.
Figure l: Mise en évidence de l'ef~et bactériclde des
substances lnhibitrlces produltes par l'hydrolysat ES
EXEMPLE l: PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDF A PARTIR
DE SANG TOTAL
Du sang total ou ses fractions (globules rouges lavés, contenu
érythrocytaire) sont traités par des enzymes digestives.
a) Ptéparation des substrats sanguins
~0
On utilise le sang de n'lmporte quel mammifère, homme ou
animal, SOlt ses différentes fractlons obtenues par les technlques ciasslques
de fractlonnement du sang:
- le sérum issu de la coagulatlon,
- le plasma: surnageant de sang héparlné cer.trlfugé 2000 tours. l0 mln.
+4o C
- les globules rouges; culot de centrifuga~ion des sangs héparlnés lavés 3
fois en PBS 0901 M,
- les parois des globules rouges obtenues après hémolyse dans l'eau
dlstillée des globules rouges lavés centrlfuges ( 13000 tours. l 5 mln.
l 4C)
- le contenu érythrocytalre (E) surnageant de centrlfugatlon de l'hemo-
lysat des globules rouges.
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2123S87
b) Préparations enzymatiques
On util ise :
- le surnageant des féces fraichement collectées sur rat ou sourls
axéniques (sans germe) diluées au l/lOè,
- le suc pancréatlque Iyophilisé de porc (S) à raison de 2 g/100 ml de PBS
0,0 l M,
- la trypsine purifiée de bovin (Sigma T8642) à 5 mg/ml de P~S.
Suc pancréatique et trypsine sont préparés extemporanément.
c) Incubation des substrats dans les préparations enzymatiques
Les su~strats sanguins fraîchemen~ préparés ou stockés,
ali~uotés à la température ambiante ou au froid, sont dilués au l/lOè et au
I t20è dans les préparations enzymatiques, ils sont incubés pendant 24h à
37 C.
EXEMPLE 2: ACTIVITE BACTERICII)E DE PRODUITS C)BTENUS A
l'EXEMPLE I
Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
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... ~ 9
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WO 93/101~3 PCI/FR92/01063
`'`' ~
~l23~87
L'incubation de sang humain total, d'un culot de globules
rouges lavés ou de la fraction soluble de glohules rouges hémolysés avec les
enzymes pancréatiques génère in vitro une activité bactéricide. L~
production des substances inhibitrices est le résultat d'un processus
5 en~ymatique: les témoins substrats sanguins et enzymes seuls sont sans
ef f et.
Les substrats ne sont pas les constituants du sérum et du
plasma. L'activité enzymatique s'exerce sur les globules rouges, non pas sur
la paroi, mais sur le contenu érythrocytalre.
L'effet bactericide est moins fort avec le sang total; ceci est
sans doute lié à la présence d'inhibiteurs trypsiques. L'actlvité bactériclde
est plus forte après l'action de mélanges enzymatiques comme ceux
présents dans les féces des animaux axéniques ou dans le suc pancréatique
qu'avec la trypsine seule~
EXEMPLE 3: PREPARATION DE SU~STANCE BACTERICIDE A PARTIR
D'HEMOGLOBINE
Des hémoglobines brutes, de préférence purifiées (H) d`origine
20 humaine (Hl) ou animale (H2~ sont traitées par n'importe quel type de
protéase, pas nécessairement digestive. On utilisera de préférence la
protéinase K purifiée qui hydrolyse les proléines, glycoprotéines. peptldes
e~ esters d'acides aminés.
2 5 a) Préparation des solutions d'tlémoglobine
Hl: hémoglobine humaine purifiée ~Sigma H7379). Hl est
diluée et utilisée à même concentration que celle du san~ d'un homme
adulte. On dilue 12,5 à 15 g d'hémoglobine dans 100 ml de P~S 0~01~
H2 : hémoglobine bovine brute ou purifiée (Sigma H262 5-
H2500). H2 est préparée comme Hl mais diluée 10 fois soit 1~2 à l.S
g/lOOml de PBS.
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1 1
b) Préparation enzymatique
Une solution mère de protéinase K à 10 mg/ml est préparee
en tampon Tris 0,OlM-pH=7,9. Cette solution est stabilisée avec 2 mM de
5 Ca+ sous forme de CaC12.
c) Conditions d'hydrolyse
La protéinase K est utilisée à plusieurs concentralions, de
10 préférence à la concentration finale de 0,1 mg/ml d'hémoglobine à
hydrolyser. L'hydrolyse est conduite de préférence à 50 C sous agilation
lente. La durée d'hydrolyse est variable de I heure à 24 heures. Les
hydrolysals oblenus après 2 heures d'incubation génèrent une bonne
activité antibiotique.
EXEMPLE 4: EFFICACITE INHIBITRICE DE DIFFERENTS TYPES
D'HYDROLYSATS
Les résultats d'hydrolysats obtenus montren~ que le contenu
20 érythrocytaire ou l'hémoglobine purifiée traités par la protéinase K à 0,1
mg/ml génère une substance inhibitrice sur BFR efficace jusqu'au 1/128. La
quantité de substance bactériclde produite dépend de la concenlration
d'hémoglobine à hydrolyser. L'hvdrolysat du contenu érvthrocytalre par le
suc pancréatique produit une substance plus diffusible donc plus soluble.
Les résultats sont présentés dans le tableau 2.
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2123~87
5 ~ _ _ _
~ C U~ ot~ U~ U~ U~
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oo oooo oo ~ .,,
_ ~ ~~ ~ ~ ~ .' ~
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3 0 ~ c ~ I _ ~ C v c
_ c 5
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EXEMPLE 5: PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR
DES FRACTIONS DE L'HEMOGLOBINE
a) Extraction chimique de l'hème de l'hémo~lobine H 1
On uti lise la méthode de F. Ascoli et col. (Methods in
enzvmology vol 76.5.1981 ) qui consiste à extraire la globine des
hémoprotéines en enlevant l'hème. Le principe consiste, dans les conditions
décrites, à mélanger 2,5 ml d'hémoglobine à 100 ml d'une solution d'acide
chlorhydrique et d'acétone. Le précipité ou culot de centrifugation contienl
la globine que l'on peut solubiliser en PBS. Le surnageant contient l'hème.
Pour tester l'activité de ce surnageant et parce que le mélange alcool
acétone est inhibiteur de la croissance des cellules cibles BFR, il est
15 évaporé par Speed Vac. Le concentrat est insoluble en PBS mals peut être
partiellement solubilisé en acétonitrile, 60 % dans 40 % d'acide Irifluoro-
acétique à 0,1 % inactif sur les cellules BFR.
b~ Effet bactéricide des fractions de l'hémoglobine humaine
purifiée, traitée par un mélange HCl
Les résultats, présentés dans le tableau 3, montrent que le
prlncipe actif de l'inhibition est localisé dans la fraction du sang forlement
colorée: la fraction héminique. La fraction~ globinique est inactl~e alors
que la fraction héminique conduit à un produit bactéricide insoluble en PBS
donc different dans sa structuré chimique des hydrolysats actlfs dejà
.
utlllses.
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2123a8~
0
2 ~ 7
WO 93/10153 P{~/FR92/01063
EXEMPLE 6: EFFET BACTERICIDE DE DIFFERENTS TYPES DE
PORPHYRINES DU COMMERCE EXTRAITES DE
L'HEMOGLOBINE Oy DE CHLOROPLASTES
Tableau 4
Concenlration Minirnale Inhibl~rlce
Types de porphyrlne
.
à 2 m~/m I dans
leur solvant ~acillus subtilis Clostridium
l 5 __ _ _ ~FR perfringens
Hématoporphyrine l /256 l /8
2b ~ 60% 1 ~
~1 0,016N ~ I/28 ~ 1/32
l 60 96 ~ 11256 ~ 1116
. . _ _ ._ .
Chlorophylline en PBS l /8 ~ l /64
lemoins solvant 0 ~ 0
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16 ~.
2123~
L'effet inhibiteur obtenu soit avec une porphine (l'hémato-
porphyrine~ soit avec des dérivés de substitution combinés au fer (hémine,
hématine) ou bien au magnésium (chlorophylline) confirme que les noyaux
porphyres sont impliqués dans l'activité bactéricide. Dans cet essai, la
nature du complexe métallique seul (Fe ou Mg) ou chimiquement combiné
(FeCl, FeOH) n'est pas. déterminante. Les noyaux sont insolubles en eau
mais ils peuvent être chimiquement solubilisés (cas de la chlorophylline) ou
obtenus plus ou moins solubles (cas des hydrolysats) suivant le degré de
dénaturation de la globine associee, en fonction de l'efficacité de la
l protéase utilisée (suc pancréatique et protéinase K par exemple).
Toutes les chromoprotéides porphyriques peuvent générer une
substance inhibitrice à partir de leur groupement proslhétique. Dans le cas
de l'hémoglobine, mieux que l'extraction chimique, l'hydrolyse enzymatique
moins coûteuse et plus spécifique conduit suivant le type de protéase, à la
l 5 production de molécules héminiques actives qui diffèrent entre elles par
leur niveau d'efficacité et leur solubilité en eau (exemple hydrolysat E5 et
HK).
EXEMPLE 7: MISE EN EyIDENCE DE L'ACTIVITE ANTIBIOTIQUE SUR
DES CELLULES CIBl ES BACTERIENNES
1. Principe et realisation du test d'antibiose
108 cellules végétatives et viables d'une souche bactérlenne
utilisée comme cible sont ensemencées en masse ou à la surface de 15 ml
du m ilieu de culture suivant
- milieu coeur-cervelle (Difco 0037) 37 g/l
- extrait de levure (Difco 0127) 5 g/l
gelose Biteck agar (Difco 0138) 14 g/l
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Des puits, ouverts dans l'épaisseur de la ~élose coulée en boîte
de Pétri, sont remplis avec 30 1ll de l'antibiotlque à tesler. Ap~ès
Incuba~lon, I'actlvité antlbiotique esl mesurée par le rayon e n mm de la
plage de Iyse totale développée autour des pUitS.
2. Souche cible de référence
On utilise une souche de Bacillus subtilis, la souche BFR isolée
d'une conserve alimentaire qui a la parlicularité d'êlre facile à manlpuler:
10 souche mésophile, aérobie stricte, capable d'inilier une populallon
abondanle en 6 heures de cullure à température du Laboratolre. Cetle
souche ne sporule pas dans le mllieu de cullure précité. Celte souche esl
'~ Irès sensible aux différents Iypes d'antlblotlques el sera ulilisée pour tester
les divers hydrolysals, les témoins d'une part, el, d'aulre part rechercher et
contrôler le ~evenlr des fracllons actives dans les trallements de
purif ication.
, -
WO 93/101~3PCI/FR92/01063
1~ ,
2123~i8~
3. Effet de divers traitements physiques et chimiques sur
l'activité de l'hydrolysat ES
Tableau 5
Traitements Rayon de la zone d'inhibition de
croissance de la souche E~FR ~mn)
I O _
Congélation -20C, - 80C 5~5
24h à 20C 5,5
8 jours à +4C 4,5
Ebullition 10-30 minutes 5,5
Pasteurisation 1 5h 2,5
Filtration stérilisante 5,5
Evaporation et
concentration lO fois 7,0
Lyophilisation et
concentration 10 fois ~,0
+ protéa~e K ( 1 mg/ml)
l heure 50C 5,5
+ protéase K ( 10 mg/ml)
:4 beur-s J0-C
4. Mise en évidence de l'effet ba~téricide des substances
inhibitrices produites par l'hydrolysat ES
Des tubes de 9 ml de milieu de culture sans gélose contenant
des dilutions croissantes de l'hydrolysat brut ES sont ensemencées avec Iml
d'une population de 3.107 cellules végétatives de BFR. Après ~ heures de
contact à 37 C, on mesure dans chaque tube le nombre de cellules
vivantes et le rayon de la zone d'antibiose.
PCI /FR92/01 063
WO 93/10153 2 l ~ 5 8 7
Les résulta~s sont présenlés à la figure l.
L'hydrolysat ES utilisé pur et dilué jusqu'au lt32, empêche la
multiplication bactérienne et tue les bactéries de l'inoculum. La dilution au
5 1/32 représente la concentration minimale inhibitrice à partir de laquelle
apparaît l'effet bactéricide.
EXEMPLE 8: SPECTRE D'ACTIVITE DE L'HYDROLYSAT ES SUR
-
DIFFERENTES SOUCHES BACTERIENNES
OriRine des souches
-
A l'exception des souches de collection ou en provenance de
Belgique, tou~es les souches ont été isolées au Laboratoire de la microflore
dominante de l'intestin d'enfants et d'adultes. Les prélèvements d'enfants
viennent du service de néonatologle d l'hôpital A. Béclère: les enfants
prématurés étaient agés de I à 2 mois et n'avaient pas de trouble
pathologique intestinal. Les prélèvements d'adultes concernent des
individus sains non hospitalisés ou malades (pouchite ou colite).
Caractérisation des souches isolées au Laboratoire
Elles sont classées par leur morphotype. Un certaln nombre
ont été caractérisées sur 20 réactlons biochimiques différentes (API 20A) e~
2S sur les produits finaux de leur métabolisme fermentalre (acides fixes et
acides gras volatils).
Techniques du test de bactéricidie sur les souches bactériennes
t
Les souches anaérobles facultatives sont testées comrne la
souche lémoin Bacillus FR.
Pour les souches anaerobles strlctes, deux techniques ont ete
utilisees:
WO 93~101~3 PCI`/FR92/01063
~_ ~.~ 20
2123587
- les souches très senslbles à l'oxygène (EO5) sont cultlvées dans une
chambre anaéroble (Freler). Elles sont ensemencées à la surface de la
gelose et incubées 48 heures à 37 C dans la chambre anaérobie.
- les souches anaérobies moins sensibles à l'oxygène sont ensemencées à
I'extérieur dans la masse de la gélose. Elles sont ~ncubées 4~ heures a
37 C en jarré anaérobie (Gaspack system).
21~3;~7
WO 93/10153 21 P~/FR92/01063
.
TEST DE ~ E DE D~FER~N1ES SOUCHES ~ACDE~E~NES
A L'HYD~OLYSAT ES BRUT OU CONCE~TRE 3 FO~
G ~ ou ~o ~PI TO.~E O~G~ RAYON DE LAZO~E
TYPE ou D' ~ BIOSE(n~n~
~OM DE LA SOUCHE
~RUT ~3
. _ _
C~SrR~ UM,
Cperfr~n~ens
~1.C10 ~0005002 _ enfan~l9 j) 3.0 3.0
Poul5.3(Cp?) 46326002 pouc~tead~te 3.0 3~5
CpFR type A _ ad~te 3,5
Pou4 2.11 type A ~6125022 pou~tead~te 1.0Cp ~.6 e~t+ + co~ PasL 3,0
DG2.H8 t~pe A ~612~22 _ eDfant~58 j) 2. 5
UK2.F4 t~pe A 46124002 _ enfant(46 j) 2. 0
DG3.C3 47 / 773~2 _ enfant(65 j) ~. 0
Cp ~1 adulte(~ele) 2. 0
C~ifficil~ .
_
IS3.1 ~10~103 + ~nfant(~0 j) 0. 0 0. 0
I~;El,B8 _ enfant(39 j) 0. 0 0. 0
DG3.A6 ~12~6103 _ e~ t(65 j) 0, 0 0. 0
SBCl.D6 41666123 _ enfant(l8 j) 0, 0 0. 0
ISl .Z 41444123 + enfa~t(19 j) 0, 0 0. 0
b~1.2 ~10~4103 _ enfant(19 j) 0, 0 0. 0
VPL10463 ~ collection 0. 0 0. 0
M~ra + adulte(colite) 0. 0 û. 0
DGl.A10 416~6123 _ enfant(51 j) 0.0
Cpara~utrificum
l~K2.E6 ~63~6023 e~fant(46 j) 1.5 6.0
~l.A3 423~600l enfant(l9 j) 2.0 ~.0
~C3.E5(Cpa?~ 4644600l enfan~30 j) 0,0 0.0
67 pa~b~EeO 0.0
97 ads~(Eb~) O.û
FE UILLE D E R E~P U ~C t M E~rr
wo 93/10153 22 PCr/FR92/nl063
212~S87
C butvricum
DR2.B6 467~7223 enfan~(49 j) 0. 5 ~ j
~lU~.C10 46756202 enfant(33 j) 0, 0 ~
Cb 1002.5 enterocolite ~ + 1. 0
DG3.Hll 47757733 enfant(65 j) 1. j 4,
SBCl.H9 467472"3 e~fant(l8 j) 1, 5 3. 5
I~;EU.F4 467472''3enfant(39 j) 3. 5
NCI~ 7423 collection 2. 0
105 hémocult.(Belg.) 3. 0
Autres Clcstridium
Csor~ellii
VPI 9048 collection ~ ~ 5
(Belg.) 0. 0
Cbif/sor~ellii
NCI~ 87-80 colllBelg)
NCI~ 6g27 coll~Belg) 0. 0
NCI~ ?914 colllBel~g) 0. 0
Cbi~ermentans .
N~I~ 506 colllBelg) 0. 0
ga pus ~ elg.) ~. 0
C~mosum .
I~ 7 473462Z''enfant(53 j) Z~ 5 4. 0
lS3.D5 47346232 enfant(40 j~ 4. 0
Chistol~ticum
NC~ 503 colllBelg~ ~ 0
66 (Belg~) 3. 0
CseDticum
(Bel~ ) 4~ 0
~1 11l I F nE REMPLACEMENT
2123~87
,~ WO g3/10153 PCr/FR92/01063
23
C.tertium
NCIC 541 co~eO 0.0
114 cop~.(~e~.) 0.0
~3.2 47346122 enfant(40 j) 1.0 3,0
Gsub~n~ e
92 h~m~c(Be~) 5.0 .
C.SDo~neS
NCTC 532 co~8e~) 3.0
107 (Be~ ) ~ 0
Csnn~iosurn
~.U 41010001 en~n~28 ii 1.5 6,0
Atll~ES S~O~JIE~
T~l.S(o~s) 46756220 ~n~16 j) 0,0 4.5
UK3.E4(P~) 45342003 eDfan~53 j) 4.0
~Gl.B2(C~st) 47756222 en~n~51 j) 3.5
SPR ch H~(P~pl) _ ad~te ~n ~.0 6,0
~PR ch C7(end~) 47757731 adulte ~n 1. 0 2. 5
SPR ch A9(endcsp,~ 44514733 adulte sain 1, 0 +
SPR ch FlO(pepto) 45404002 adulte sa~n 3. 5` 3. 0
SPR ch D3(pepto~ 44414401 a~ulte sa~n 5, 0
PR ch Al(plec~ a~ulte sa~n 1. 0
PP~ ch A2(plec~ a~ulte sain O, O
PR ch BlO(plec) ~dulte sain 2. 5
PR ch C5~pl~c) adulte sain O, O
PR ch DlZ(inflab) adulte sain O. O
P~ ch E6(inflab) adulte sa~n O. O
PR ch Bl(endoEOS) adulte sai~ 4. 0
PR ch B3(endoEOS) adulte sain 5. 0
PR ch Dl~i~fEOS) a~ulte cs~in 2, 0
PR ch D4(i~fEOS~ adulte ~in 2, 5
P~ ch D5(infEOS) adulte sai~ 2. 5
PR ch D6(ir~EOS) adulte ~in 3. 0
PR ch D3tCll~6Eos) adulte sain 3~ 5
PR ch E~(plecEOS) ad~te sain 3. 5
~ l I F n~ REMpLAcEMENT
wo 93~10153 P~/FR92/Q~063
24
2123~7
L~3 ~ I ~
~oralis ARG11 46146Z00 adulte sain 1. 5 0. 0
~caecae ~1 patho(Belg) 0. 0 0, 0
a~uminLPoul3E~ 47104600 pouchite adulte 0. 0 0. 0
~fragilis ARD2 46144240 adulte ~in 1. 0 O, O
~melanARF2 46104200 adulte sain 0. 0 0. 0
~splanch 41 patho(Belg) 0. 0 1. 0
~uniL Poul2D8 ~6556210 pouchite adulte 0. 0 0, 0
Elmerdae Pou42A10 46544200 pouchite adulte 4. 5 4~ 0
ap~acutus 5~ 46716210 pathdBelg) 1. 5 t
adista~ FRF3 46746370 adulte sain 0. 0 0. 0
B.n~GCE7 46514210 ad~te sain i), 0 0, 0
~o~atus FRF4 565~6330 adulte sain 0. 0 0 0
GCD5(~ser+~ adulte sain + 0 0
PS3C~ 467~6330 enfant 0. 0
8.~.Poul3B~ ~B5~4220 pouchite adulte 0. 0
~bi~ 8(colo1 pa~ho(Belg) 0. 0
abinus ~8(colD2) pathdBelg~ 3, 5
BlFlDOBAC~M
abifidum ~536 enfant 4. 0
,.,. . ,-~. ~ . ~ ~
DRl.C9 ¦ - enfant +
~:1111 LE ~E REMPLACEMENT
WO 93/10153 212 3 ~ ~ 7 PCI`/FR92/01063
~U~SOUCH3 1 .
4NA~D~
t~ PeDt~t~Dto.
PRC8 46750216 ~te 5~ +
MCU G7tEOS) 47510606 ad~te ~n 3.0 4.0
FREl 46710216 ad~te ~n 1.0 2.5
LGK3 D12 47104626 en~nt 0,0 2,0
D8(E~ 4~656216 ~nt 1,0 5,0
~CU D8(E~ 46516616 ad~te 5~ 4,0 6,5
PS3A12~EQ~ 4B710216 en~t 2,0 3.0
MCM D12(EOS) 47510606 a~te s~n B.0
MoU F7~E~ 47756616 a~ s~n 6.5
GC C9 ad~ n 3" 0
FR F6 a~ulte sa~n S, 0
~ U adulte sain 4. 5
F~ E~i adulte sain 4. 5
FR D9 adulte sain S, 0
FR F9 adulte 51~1 4, 5
FR D10 adulte sain D, 0
t~e Euba~ter~um
Ml:U C6 46346002 adulte ~ + 4, 5
A5 47710402 adulte sain + 2. 0
~lJl C4 46142222 adulte ~ 8. 0
GC ~10 adulte 51in 5, 0
GC FB adulte sain 4, 5
FR E10 adulte 5~1n 6. 0
~?e bif~e
GC G6 a~ulte ~ +
G~ A3 adulte ~ ~. 0 3. 5
Gt: D10 adulte sain + 3, 5
GC D9 adul~e sain 0, 0 4. 0
GC H~O a~ult~ s~in O. 0 3. 0
GC G6 adulte s~in 2, 5
GC H8 adulte sam 3. 0
GC E8 adulte sain O. 0 2. 0
GC D6 a~te s~n 0~ O +
t~l LF I~E REMPLACEMEN~
w o 93/10153 PC~r/F~92!Q1063
26
212358 1
t~pe bacter/fuso
Pou 13B6 poucbite adulte 3. 0 +
~ E2 adulte saLn 0. 0
GC E7 adulte s2in 0, 0
GC A2(ba~ cocc) adulte saLn + 7, 0
GiC C6~dipLD) adulte sai~ 0. 0GC C10(bat pal! adulte saLl 0. 0 0. 0
GC C3(bat ef~ adulte saLl 3, 0
GXC D2(ba~ poly~ adulte saLl 0, 0
GC ~ (bat cocc) adul~e saL~ 0. 0
AlD(bat cocs) adulte saLl 0. 0
GC Gl(bat cocc~ adu~te saii 0, 0
AE3ROBDES' F.~C
Lacto ferm entPA4 enfan ~5 j)
Eco~ 5148 ent+porc adulte 0. 0
EcoiE~lO adult saLn 0. 0
strepto GX~CB adulte sain 0. 0
entenlGCAl adulte saLl 0, 0
s~r fecalb~3R10 adulte saLn 0. 0
.. __ . _ _ . , _
Ebsi~us FR ~. 5 5. S
_ . _
I:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/101~3 212 3 ~ 8 7 P(~r/FR92/01063
27
EXEMPLE 9 : DEVFNIR DE L'ANTIBIOTIQUE H2K DANS LE TUaE
DiGESTIF DE LA SOUR!S AXENIQUE (SANS G_RME)
~,5 ml de l'hydrolysat bru~ H2K lyophlllse et concentré l
5 fols, stérllisé à l '`~ C pendant 30 mlnutes est admlnlstre par sonae
gastrique à des sourls axénlques selon le protocole sulvant:
Tableau 6
50 n-ln 3h 30 1 5h
. . _ . _
l ~ Souris S l ~,5ml sacrifiée
Sourls 52 0,5ml 0,5ml sacrif iée
Sourls S3 0,5ml ~ 0~sml ~ 0,Sml sacrlflee ¦
~ 0,5ml ~ - 0,5ml ¦ - 0,5ml ~ac~ ee,
Les contenus lntestlnaux, dilues au l / l0è en PBS sont
controlés sur cellule clble BFR; les résultats sont présentés au.taDleau 7.
L'antlbiotlque contenu dans l'hydrolvsat brut n~est pas
absorbé. Il translte dans le tube digestlf de la souris axénlque et est
re~rouvé actif sur ~FR dans tous les contenus et les féces 3h 30 après la
premiere lngestlon.
Dans la sourls temoln, l'apparltlon d'une petlte zone
d'antibiose dans l'lG3 pourralt correspondre à l'effet inhlblteur ~e
substances digestlves sécretees dans l'intestln grêle et réabsorDees au
nlveau du caecum.
~:FI 111 I E ~E~ REMPLACEMEI~
WO 93/10153 28 PCI/FR92/01063
2123S8~
I O ~ O ~ O
,c ~ ~ ~ ~ '
z
2 0 N ~7 ~ 3 ~ o
~ 1 ~
25 ~ ~
3o I ~ A~
FEUILLE DE REMPLACEMENT
212~ i87
WO 93/101S3 PCI`/FR92/01063
.~ . 2g
EXEMPLE 10 PURIFICATION ET DEBUT DE CARACTERISATION DE
LA SUBSTANCE BACTERICIDE SOLUBLE PRODUITE
DANS L'HYDROLYSAT H 1 K
a) Purification par fractionnement de la partie soluble en eau
L'hydrol,vsat brut es~ élué dans une colonne Fractogel Butyl
TSK 650.S. On recherche les fractions actives par test d'antibiose sur ~FR.
Les résultats du chromatogramme monlrent qu'après la fraction non retenue
(fraction 1), la première fraction retenue, éluée en eau (fraction 11) con~ient
10 I'effet antibiotiaue. La fraction active, éluée en méthanol 20% correspond
probablement à la partie insoiuble de l'antibiolique H 1 K.
b) Purification de la fraction active soluble en eau
Les chromatogrammes comparés en HPLC.C18 de l'h,vdrol,vsat
15 brut, des fractians I et 11 du s,vstème Fractogel Butyl montrent que seule la
fraction éluée à 100% de tampon B, absorbant à la fois à 214 et 3~0 nm es
active~
Cette fraction active est obtenue purifiée à partir de l'éluat 11
Fractogel Butyl.
2~
c) Détermination du poids moléculaire
La fraction purifiée HPLC.C18 étudiée en` ~el flllra~lon
Sephadex LH20 esl éluee en une seule fraction aclive absorbanl à 214 et
380 nm à un poids moiéculaire correspondanl situé entre 6GG e~ 1 55G
5 daltons-
~ * ~ * ~
LEGENDE DE LA FIGURE I
Conditions du test:
- 9 ml LBHI [E5]
- I ml 3.107 BFR
- aucune spore
35 - 8H de contact
FEUILLE DE REMPLACEMENr
