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PROCEDE DE 8YNT~E~E ENZYMATIO~E D'E8TER~ AL~Y~IQ~E~ DE
PEPTIDE8, PROD~ITS AINgI OBTENUS ET ~TI~S~TION
DE8DITS PROD~IT8
.
La presente invention concerne un procede de
synthese enzymatique, dit procede d'alcoolyse
enzymatique de proteines, permettant d'obtenir des
esters de peptides. L'invention concerne egalement les
produits o~tenus par le procede, ainsi que
l'utilisation de ces produits en tant qu'addi~ifs et
ingredients dans des produits agroalimentaires,
cosmetologiques et pharmaceutiques et chi~iques.
En raison de leur a~ondance et de leur propriet s
interessantes, les proteines d'origine ani~ale
(collagene, caseine, gelatine, etc...) et vegetale, et
leurs dérivés peptidiques constituent d'excellentes
matieres premieres pour les industries chimiques,
agroalimentaires, pharmaceutiaues e~ cosme'iques.
Par exemple, la demande de ~revet inte~nat ona1
wo-~-so/o3l23 décrit la fabrication de mic.opa-ticules
de proteines, destinees a être utilisee- co,-.~e
su~stituts de graisses dans des produits alimentaires.
Les microparticules sont fabriquees par l'addi~ion
d'une solution de proteines hydrophobes, par exe~ple
une prolamine, en milieu alcoolique, a un mi1ieu
aqueux. La protéine est precipitee sous forme de
mi~roparticules. Avant d'etre mise en con~ac~ avec le
milieu aqueux, la proteine peut etre sou~ise a une
hydrolyse enzymatique. Dans ce cas, ies
microparticules sont constituees de polypeptiàes ayan
une masse molaire d'environ l 000 daltons.
En cosmetique, des preparations de pep~ des sont
recherchées pour leur pouvoir emulsifiant, leu~
pouvoir de rétention d'e,au, leur efCe~ cond~~ionneu
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pour les shampooings et leur pouvoir adoucissant. Les
peptides utilises ont une masse molaire le plus
souvent inferieure ~ lO 000 et plut~t inferieure à
5 000. Ils sont obtenus generalement par voie
enzymatique.
L'emploi de protéines d'origine végetale en
cosmetique est particulierement recherche.
Par exemple, l'utilisation de peptides de gluten
de masse molaire inferieure a lO 000,
preférentiellement comprise entre 3 000 et 5 000, a
eté proposée en raison de leur pouvoir de retention
d'eau et leur effet conditionneur (JP-63253012). De
tels peptides sont obtenus par hydrolyse enzymatique a
l'aide d'Alcalase, de pepsine ou de la protease acide
d'AsDerqillus niaer.
Des esters de peptides ont été ~galement proposes
pour des applications cosmétiques tJP-60057043,
JP-60097042, JP-60084209). Ces esters de peptides sont
obtenus par la condensation d'un peptide avec un ester
gras ou polyhydroxylé d'un acide aminé, catalysée par
une protéase a cysteine ( C 3.4.22).
Bien que les procedes décrits jusqu'a ce jour
pour la fabrication de dérivés de protéines soi~nt
relativement efficaces, ils présentent neanmoins
certains inconvénients. Par exemple, l~ contamination
microbienne du milieu reactionnel po~e souvent un
probleme, les conditions opératoires favorisant la
croissance de micro-organismes. En outre, lors diune
hydrolyse en milieu aqueux, la masse molaire du
produit est difficile a contrôler et la reaction
aboutit souvent a des produits de masse molaire
inférieure a celle désirée.
Le procédé de l'invention a donc eté elaboré dans
le but de mettre au point un procédé économique
permettant de valoriser des proteines d'origine
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vegetale et animale, même dans un etat brut, pour la
fabrication de peptides et d'esters de peptides, ~out
en minimisant le risque de contamination microbienne
du milieu.
Les inventeurs ont mis au point un procede de
traitement de su~strats proteiques qui se deroule dans
un milieu alcoolique et qui est catalyse par une
enzyme a la fois protéolytique et esterolytique.
L'activite estérase de certaines enzymes connues
pour leur capacite a hydrolyser des liens peptidioues
(peptides hydrolases, EC 3.4.) se caracterise par la
possibilite de catalyser l'hydrolyse de liens es.e-s
alkyliques d'acides amines ou de peptides de synthese
presents à faible concentration dans une solu__on
aqueuse tamponnée.
Les inventeurs ont constate que certaines en~y~es
qui présentent a la fois une activite de protease et
d'esterase, conduisent a la synthese d'este-s de
peptides lorsque le substrat est un melange de
proteines ou de peptides présent en milieu alcool~oue
et dans certaines conditions de pH. L'enzyme uti'~se
l'alcool a la place de l'eau pour couper le liPn
peptidique entre 2 acides amines d'une proté~ne ou
d'un peptide, ou est capable de cat31yse~ la
condensation d' un peptide par 1'intermediaire de scn
groupe carboxyle terminal avec 1'alcool se!on une
réac~ion inverse a celle observee lors de 1'hydrol~se
d'esters alkyliques de peptides ou d'acides amines.
La reaction enzymatique ou le substrat est un
melange de proteines ou de peptides et le co-subs..at
est l'alcsol est appelee reaction d'alcoolyse.
En milieu alcoolique et dans certaines conditions
de pH, les inventeurs ont observe l'accumulat-on
d'esters de peptides : 1'équilibre entre la reac__on
de syn~hese d'esters (réaction d'alcoolyse) e, la
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reaction d'hydrolyse desdits esters se trouve pousse
vers la reaction de synthese.
Dans ces conditions, l'alcool joue le role du
substrat et du solvant. En d'autres termes, l'alcool
est responsable de la formation d'esters et, en même
temps, empêche leur degradation.
Un phénomene similaire a deja éte décrit par
Vidaluc et al (Tetrahedron, vol. 39 n- 2, pp 269-~74,
1983). Cet article rapporte la synthese d'esters
d'acides aminés a partir d'acides amines en milieu
alcoolique catalysee par l'~-chymotrypsine. Ceci
etant, la synthese d'esters de peptides a partir de
substrats protéiques complexes n'a pas ete decrite. En
ef~et, il est tnut a fait surprenant que la réaction
de synthese, cat~lysee par 1'enzyme esterolytique et
dont les substrats sont normalement des acides amines
ou des peptides de petite taille, peut etre effectuee
sur un substrat proteique compose de proteines et de
polypeptides complexes.
Le produit obtenu par la reaction de l'invention
es. un melange de peptides et dlesters de peptides
provenant des reactions simultanées d'hydrolyse et
d'alcoolyse. Le melange présente des proprietes
semblables a cell~s des peptides issus d'une hydrolyse
classique, mais ont un caractere hydrophobe plus
marqué, ce qui presente un avantage important pour
beaucoup d'applications industrielles.
Le milieu alcoolique permet de diminuer les
risgues de contamination microbienne et, de plus, de
contrôler la masse molaire du produit. Le milieu
alcoolique assure aussi une bonne stabilite chimique
des substrats comme la glutamine, acide amine
majoritaire des protéines vegetales. La réaction est
catalysée par des enzymes peu coûteuses et facilement
disponibles.
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Plus particulièrement, la presente invention
concerne un procede de synt~ese enzy~atique d'esters
alkyliques de peptides comprenant la mise en contac_
simultanee d'un substrat proteique d'origine animale
ou ve~etale avec, d'une part, au moins une enzyme
ayant a la fois une activite proteolytique et une
activite esterolytique sur des proteines ou sur des
peptides et, d'autre part, avec au moins un alcool,
ledit alcool etant soit entie_ement misclble a l'eau,
soit au moins partiellement solu~le dans l'eau,
caracterise en ce que la mise en con~ac~ si~ultanee du
substrat protéique, de 1'enzy~e et de 1'alc~ol
s'effectue a un pH permet.ant la for~at~on d'es~e_s
alkyligues de peptides.
La réaction d'alcoolyse se de-oule se7On le
schema suivant :
O O
Il 11 .
~-~-NH-~2 + X-OH ~ 2~ R.~
<--
Substrat Alcool rs.e~ de ~ep._de
protéique
Dans le contexte de la presen~e invent_on,
1'expression "un substrat proteique d'origine ani~.ale
ou vegétale" signifie toute source de proteines ou de
polypeptides capable de joue- le role de subs.,at pour
1'enzyme proteolytique/estérolytisue. Comme subst-at
protéique dlorigine animale, la gelatine ou toute
matiere contenant la gelatine est prefe~ee.
Comme substrat protéioue d'or~gine vegetale, on
peut citer des proteines provenant de ce-eales telles
que le blé, le maïs, l'orge, l'avoine, le ri , le
seigle, le sarrasin, le sorgho et le ;-itic~le,
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~63~l
eventuellement sous forme de grain entier, ou de
fractions de grains ou de tout produit issu du broyage
du grain, tel que la farine ou la semoule. Les
produits issus du broyage du grain sont
particulierement preferés.
Le substrat proteique n'est pas necessairement
pur et peut etre utilise sous forme de melange
~omplexe associé a des matieres non-proteiques. Ceci
est le cas lorsque le substrat proteique est constitue
de fractions ou de farine de grains. Il est egalement
possible d'utiliser la fraction proteique de la
cé-éale, séparee de la fraction non prote.ique. Le
gluten de blé est un exemple de ce type de substrat.
Il est particulierement préféré, selon 1'invention,
d'utiliser comme substrat les protéines hydrophobes
connues sous le nom de "prolamines", par exemple la
gliadine, la zeine, l'hordéine et la kafirine. Ces
proteines sont insolubles dans l'eau, mais solu~les
dans l'alcool, e~ sont un constituant majoritaire des
graines de céreales. Le gluten de blé contient par
exemple environ 45 ~ de gliadine, et la frac~ion
protéique du mais contient environ 60 S de zeine.
Le substrat proteique de la reaction d'alcoolyse
peut aussi être une matiere peptidique ou
polypeptidique.
Selon cette variante de l'invention, la matiere
peptidique peut provenir d`une prehydrolyse partielle
d'une matiere protéique. Dans ce cas, la reaction
d'alcoolyse est précédée par une étape d'hydrolyse
partielle. Les esters de peptides sont alors obtenus
par condensation des peptides sur l'alcool. La
préhydrolyse partielle peut être effectuee par voie
enzymatique, chimique ou thermique~ La voie
enzymatique est préférée. Pour le pro~ede d'hydrolyse
partielle, il est avantageux de mettre en oeuvre la
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même enzyme proteolytique/esterolytique que celle
utilisee ultérieurement dans la reaction d'alcoolyse.
La reaction d'alcoolyse peut ainsi être initiee par la
simple addition de l'alcool et l'ajustement du pH aux
valeurs permettant la formation stable d'esters. Ceci
permet un controle facile du degre d'hydrolyse et
evite une hydrolyse totale du substrat proteique. Le
substrat peptidique a normalement une masse molaire
moyenne de 4 000 à 6 000 Daltons environ. Il s'agit
donc de polypeptides de taille moyenne.
Dans tous les cas, le substrat du procéde a une
masse molaire moyenne supérieure a l 000 Daltons.
Le substrat proteique peut etre soluble dans
l'eau ou soluble dans l'alcool. La reac~_on
d'alcoolyse eta~t effectuée dans un milieu alcoolioue,
l'utilisation d'une proteine non soluble dans
1'alcool, telle que la gelatine, donne lieu a un
milieu reactionnel heterogene. Lorsque le subs~rat est
un substrat complexe tel que le gluten, qui est
compose de différentes protéines d~nt environ 50 ~
sont solu~les dans l'alcool et ~0 % solubles dans
l'eau, le milieu reactionnel est multiphasique.
Selon le procedé de l'invention, le subs~-at
proteique d'origine animale ou vegetale est mis en
contact avec au moins une enzyme ayant une ac~ivite
proteolytique et esterol~tique sur des pr~teines ou
sur des peptides. L'enzyme est de préference soit une
protéase, soit une carboxypeptidase. Les proteases a
serine ou a cystéine respectivement exemplifiees par
la -su~tilisine ~provenant de Baclllus SD., de
préférence Bacillus licheniformis~, ou la papalne
. .
(provenant de latex de papayer) sont particulierement
préféxées. L'activité double de protease et d'esterase
n'est pas une propriété possédée par toutes les
protéases. Ceci étant, en appliquant le tes' déc~~t
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ci-dessous pour détecter la formation d~esters,
l'homme de 1'art peut facilement identifier celles qui
conviennent au procede de l'invention. L'enzyme peut
etre sous forme de preparation enzymatique, par
exemple sous forme de melange grossier d'enzyme, tel
qu'~n surnageant de culture microbien, ou peut en
revanche être sous forme purifiee depourvue de tout
autre type d'activité enzymatique et de tout autre
contaminant. La preparation enzymati~ue peut aussi
être un melange de proteases d'origines différentes, a
condition que ces differentes enzymes puissent
fonc'ionner ensemble.
Normalement, l'enzyme est utilisée sous forme
li~re, mais elle peut aussi etre immobilisée sur un
support solide tel que la silice, ou sur des billes ou
sur des mem~ranes connues dans l'art. L'immobilisation
de 1'enzyme permet d'effectuer le procede de
l'invention de maniere continue.
Les conditions operatoires et notamment l~ pH
sont critiques, selon le procede de l'invention, pour
l~efCicacite de la réaction d'alcoolyse. Les réactions
d'hydrolyse e~ d'alcoolyse se déroulent en parallele,
mais dans certaines conditions de pH, les esters ne
s'accumulent pas dans le milieu reactionnel. Il existe
cependant une gamme de pH a laquelle la formation
d'esters est effec~ive. Les inventeurs ont constaté
que, pour une meme enzyme, le pH optimum pour la
réaction d'al~oolyse est sensiblement plus bas que le
pH optimum pour la réac_ion d'hydrolyse telle ~u'elle
est pratiquée conventionnellement en milieu
exclusivement aoueux. Par exemple, le pH optimum pour
la réaction d'hydrolyse par la subtilisine est autour
de pH 8 tandis que le pH optimum pour la réaction
d'alcooiyse est autour de pH 5- La papaïne ~ui
presente un pH optimum pour la réaction d'hydrolyse
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d'environ 7 catalyse la reaction d'alcoolyse entre pH
5 et 7, particulierement autour de pH 6. De maniere
generale, le pH doit être acide pour permettre la
formation stable d'esters. La mise en contact du
substrat proteique avec la subtilisine et l'alcool
s'effectue à pH 3 a 8, de preference a pH 4 ~ 6, par
exemple pH 5 environ.
Selon la methode de la presente invention,
l'homme du metier peut sans difficulté deter~iner le
pH auquel la formation d'esters alkyliques de peptide
est obtenue. Il suffit d'effectuer le test de
déterminatisn de la quantite d'alcool liee au produit
par hydrolyse basique du groupe ester decrit dans
1'exemple l ci-dessous. Cette determination est
effectuee pour une serie de valeurs de pH differentes
et les valeurs qui permettent la formation d'esters
alkyliques sont ainsi déterminees. Dans le contexte de
la presente invention, le taux d'esterification du
produit considere comme significatif est d'au moins lO
% environ. De preference le taux d'esterification est
d'au moins 25 % et avantageusement d'au moins ~0 %.
Selon le procede de l'invention, l'alcoolyse est
effectuee en mettant en contact simultane le subs.rat
proteique, 1'enzyme et un alcool qui est soit
entiërement miscible a l'eau, soit au moins
partiellement soluble dans l'eau. Comme exemples de ce
type d'alcools, on peut citer des alcanols
aliphatiques possédant entre l et 5 atomes de carbone,
par exemple le méthanol, l'ethanol, le propanol, le
butanol et le pentanol. Le n-propanol, le n-butanol et
le n-pentanol sont preféres. Les alcools qui sont
totalement miscibles, en toutes proportions, a l'eau
tels que le methanol, l'ethanol et le n-propanol sont
particulierement avantageux. Neanmoins, lorsque
l'alcool est partiellement miscible ou non miscible a
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?,~3~63rl
l'eau, l'efficacite de la reaction d'alcoolyse peut
être augmentee par la présence d'un autre compose a la
fois miscible a l'eau et miscible a l'alcool, par
exemple le 2-propanol.
LR produit obtenu par le procedé de 1'invention
est un melange de peptides et d'esters de peptides
issus des reactions simultanées d'hydrolyse et
d'alcoolyse. Le melange est constitue d'une population
hetérogene de peptides et d'esters de peptides de
longueurs de chaînes variables, ~e groupement
alkylique des esters provenant directement de
l'alcool, et ayant donc- entre 1 et 5 atomes de
carbone. La nature precise du produit est influencee,
d'une part, par la nature du substrat et, d'autre
part, par la pureté ~e 1'enzyme. Par exemple, un
substrat protéique compose d'un mélange de protéines
différentes donnera lieu a un mélange très complexe
d'esters et de peptides. De même, une protéase ou une
carboxypepsidase contaminee par d'autres enzymes
présentant d'autres activités enzymatiques pourrait
conduire a la présence d'autres substances chi~iques
dans le produit, surtout si le substrat est également
impur. Les mélanges de peptides et d'esters de
peptides peuvent être soumis a une étape - de
purification pour obtenir un mélange enrichi en
esters.
La solubilite du produit dans l'eau ou dans
l'alcool varie selon les réactifs et n'est pas
toujours la même que celle du substrat. Par exemple,
l'utilisation de la gliadine de ble comme substrat
donne lieu a des esters qui sont solubles dans 1'eau,
tandis que l'utilisation de la zéine de maïs conduit à
la formation d'esters solubles dans 1'alcool.
Pourtant, la gliadine et la zeine sont toutes deux
solubles dans 1'alcool. Lorsque le substrat protéi~ue
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est un melange complexe de pr~teiines présentant des
solubilites differentes, il est probable que le
produit de la reaction d'alcoolyse sera constitue
d'esters et de peptides posseidant des solubilites
differentes. Dans ce cas, la fraction soluble dans
l'eau ou soluble dans l'alcool peut être récuperee
selon l'utilisation ulterieure du produit. Par
exemple, en cosmetique, des produits solubles dans
l'eau sont préferes.
La duree de la reaction d'alcoolyse varie entre 2
a 30 heures selon la nature du substrat proteique et
de l'alcool. Par exempl~, l'alcoolyse d'un substrat
proteique complexe tel que le gluten se deroule de
preference pendant environ 24 heures. En revanche, un
substrat protéique pur tel que les gliadines de ble
do~ne lieu, dans un milieu alcoolique miscible a
l'eau, a des taux d'esterification important apres
seulement 2 a 6 heures. La reaction est arretée par
dénaturation de 1'enzyme par ajustement du pH a une
valeur fortement acide, éventuellement accompagne par
un chauffage a 50 environ pendant 30 a 50 minutes.
La réaction d'alcoolyse se déroule normalement a
une temperature comprise entre 20 et 45 C, par exemple
autour de 25.
La concentration de l'alcool est d'au moins 30 %
v/v et de préférence, d'au moins 70 % v/v. Lorsque
l'alcool est l'éthanol, la concentration peut etre de
go % v/v. Si la concentration de l'alcool est trop
basse, la reiaction d'alcoolyse ne peut avoir lieu et
la réaction-d'hydrolyse domine.
La masse molaire moyenne du produit peut etre
déterminee par chromatoqraphie par permeation de gel
(FPLC) et reflete la taille des peptides et des es~ers
de peptides obtenus. La masse molaire moyenne du
produit varie selon la nature du substrat proteique,
W093~18180 PCT/FR93/00213
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c'est-a-dire proteique ou peptidique, et selon la
durée de la reaction et la concentration de l'enzyme.
En général, la masse molaire moyenne du produit issu
de l'alcoolyse de protéines est inferieure a 10 000,
par exemple entre 6 000 et 10 000, et celle du produit
issu de l'alcoolyse de peptides est inférieure à
5 000, par exemple entre 3 000 et 5 000. Dans tous les
cas, la masse molaire moyenne du produit est
supérieure a 1 000 Daltons. La réaction de l'invention
aboutit donc a des produits ayant une masse molaire
moyenne plus elevée que la masse moilaire moyenne
obtenue apres une réaction d'hydrolyse en milieu
aqueux. En effet, en milieu alcoolique (n-propanol,
70 % v/~), la masse molaire moyenne du produit de la
réaction d'alcoolyse de gluten, soluble dans l'eau
est de 6 200 (exemple 1), alors que le produit de la
reaction d'hydrolyse de gluten, soluble dans l'eau est
de 4 200 (exemple 2). La condensation de peptides de
~als sur le n-propanol conduit a la formation d'une
population de peptides estérifiés de masse molaire
moyenne 4 200.
Selon une variante de l'invention, le procédé
peut comporter une étape supplémentaire permettant de
récupérer le produit de 1'invention, sous forme de
microparticules. Selon cette variante, le produit doit
être soluble en milieu alcoolique. Normalement, cette
étape comprend la precipitation du produit (soluble en
milieu alcoolique) d~ns une phase aqueuse. La phase
aqueuse contient avantageusement au moins un agent
antiagrégant facilitant la formation de particules de
petite taille. Comme agents antiagrégants, on peut
citer des agents tensio-actifs et des gommes telles
que la gomme arabique et la carboxymethylcellulose.
L'agent antiagrégant est présent dans la phase agueuse
a une concentration comprise entre 0,2 % et 1,0 %
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(p/v). Par microparticules, il faut comprendre dans le
co~texte de la presente invention, des particules
ayant une taille de 0,2 a lO ~, de preference autour
de l ~, par exemple 0,8 a 1,2 ~. L'introduction de la
solution alcoolique dans la solution aqueuse est
accompagnee d'une agitation vigoureuse. Bien entendu,
il est important de veiller a ce que le produit ne
soit pas denature.
Le produit obtenu par ce mode de realisation de
1'invention, est une dispersion aqueuse stable de
microparticules de peptides et d'esters de peptides.
Ils peu~ent être utilises pour des applications
agroalimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques.
L'utilisation des microparticules de l'invention dans
1'industrie agroalimentaire comme substituts de
graisse s'est averee particulierement avantageuse.
Les propriétés du produit sont en partie
dependantes de la masse molaire moyenne. Les
conditions operatoires et les matieres de diepart
peu~ent donc etre choisies en fonction de
l'utilisation ulterieure du produit.
Par exemple, pour un produit destiné a etre
utilise comme substitut de graisse, il est avantageux
d'effectuer la reaction d'alcoolyse directement sur le
substrat protéique sans effectuer de prehydrolyse
partielle préala~le.
Les produits de l'invention ont des proprietes
émulsifiantes, adoucissantes et un pouvoir de
retention d'eau. Ces proprietes physiques et chimiques
sont avantageusement exploitees dans des produits
cosmetiques comme agents emulsifiants, comme agents
filmogenes par exemple comme conditionneurs dans les
shampooin~s, comme adoucissants, comme agents
épaississants, comme agents hydratants, comme base
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2l3~63~
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lavante et moussante, ou comme tout autre additif ou
ingrédient.
Les produits de l'invention peuvent également
etre utilises dans l'industrie agroalimentaire ou
pharmaceutigue comme additifs ou ingrédients
texturants, comme substituts de matière grasse, comme
agents moussants ou comme agents émulsifiants. Il est
en outre possible d'utiliser les produit~ de
1'invention dans des produits chimiques, comme agents
mouillants par exemple pour des produits de lessive,
comme agents emulsifiants, comme a~ents adouc~ssants,
comme agents filmogenes et comme agents de filage.
Différents modes de realisation de l'invention
seront illustres par les exemples suivants.
EXEMP~E8
E~EMPLE ~ : ALCOOLY8E DE~ PROTEINE~ D~ GL~E~ DE BLE :_
Le ~luten de blé vital utilisé est commercialisé
par la société Roquette (Lestrem, France~.
300 g de gluten sont disperses dans 1,2 1 de n-
propanol a 70 % v/v. Le pH de la suspension est ajusté
a 5,2 a 1'aide de 17 mmoles de HCl. La subtilisine de
qualité alimentaire (AlcalaseR 2,4 L : subtilisine
Carlsberg) est commercialisee par NOVO NORDIS~
(Fontenay sous bois, France). 24 ml de préparation de
subtilisine sont ajoutés a la suspension . Le mélange
est incubé 24 heures sous agitation douce a 2S-C.
La subtilisine est ensuite dénaturee par
ajustement du pH du melange a 3,5 avec 115 mmoles de
HCl et chauffage a ~0C pendant 40 minutes.
Le n-propanol est éliminé par évaporation à 55~C,
et le produit mis en suspension dans de l'eau (~olume
de la suspension aqueuse : 3,3 1, pH = 3,1~.
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2 1 ~ 7
Le pH de la suspension aqueuse est ajuste a 6,0 a
1'aide de 113 mmoles de NaOH. LRS produits solubles
sont collectes par centrifuqation (5000 g, 15 min),
microfiltres sur filtre 0,2 micron et lyophilises. Les
insolubles sont éliminés.
Apres lyophilisation, la quantité collectee de
produit soluble est de 110 g.
Determination de la masse molai-e movenne du Produit :
La masse molaire moyenne du produit est
determinée par chromatographie par permeation de gel a
l'aide d'une colonne Superose 12 R HR 10/30 PharmaciaR
(F.P.L.C.). L'éluant est du tampon phosphate de sodium
50 mM, pH 7,0 contenant 150 mM de NaCl. Le debit
d'élution est 0,5 ml/min. Les produits d'elution sont
detectes a l'aide d'un spectrophotometre dont la
longue~r d'onde d'absorbtion est fixee a 280 nm~ La
calibration de la colonne (correspondance masse
molaire/temps d'élution) et la determination du volume
total sont effec~ues comme indique dans la
documentation technique Pharmacia.
La droite de calibration du systeme
a~alytique est o~tenue en exprimant le logarithme
decimal de la masse molaire de proteines de
calibration en fonction du temps ou du volume
d'élution. La masse molaire moyenne du produit de
glu~en soluble dans l'eau apres reaction d'alcoolyse
est calculée d'apres le chromatogramme d'elution a
1'aide de la formule :
~hiMi
~ hi
avec, pour un temps ou un volume d'elution i
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~ .
~.3~63~ 16
- Mi, la masse molaire du produit ~ilue au temps
ou au volume d'~ilution i gur la droite de
calibration,
- hi, la hauteur sous le pic pour un temps ou un
volume d'élution i.
L'echantillon est préparé a une concentration de
5 g/l dans le tampon d'élution et centrifugé si
nécessaire.
Détermination de la quantite d'alcool liée au produit
Par hYdrol~se basique du qroupe ester :
L'alcool total c~ntenu d~ns l'échantillon
correspond a l'alcool lié au produit et eventuellement
a l'alcool li~re résiduel, non éliminé par évaporati~n
et lyophilisation.
L'al~ool lié au produit correspond donc a
1'alcool total par gramme de produit moins 1'alcool
li~re par gramme de produit.
Alcool total :
67 mg de produit sont introduits dans un tube
Eppendorf. 0,3 ml d'eau, puis 0,3 ml de NaOH 2N sont
ajoutés et le tube est bouché. Le mélange est agité et
incubé a température a~biante pendant 2 heures.- LR
mélange est ensuite acidifié à l'aide de 0,3 ml de
H2SO4 2,lN. LRj mélange est centrifugé et la quantité
d'alcool total par gramme de produit est déterminée
par analyse HPLC du surnageant de centrifugation.
Alcool libre : -
-
67 mg de produit sont introduits dans un tubeEppendorf. 0,3 ml d'eau, puis 0,~ ml de H2SO4 lOmN sont
aj outés et le tube est bouché. Le mélange est agite,
incubé à température ambiante pendant 2 heures,
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centrifuge et la quantite d'alcool libre par gramme de
produit est determinée comme precedemment.
L'alcool est analyse par ~PLC a l'aide d'une
colonne Polypore H (Brownlee Labs, 250 x 7,O mm, 10
microns). L'eluant est une solution aqueuse de H2S0~,
lOmN a un debit compris entre 0,35 et 0,70 ml/min. Le
volume injecte est de 20 ~1. Le detecteur est un
refractometre.
Taux d'esterification :
Le taux d'esterification correspond au no~bre de
micromoles d'alcool lie par gramme de produit divisé
par le nombre de micromoles de peptides et d'esters de
peptides par gramme de produit.
Caracterisation du produit obtenu par alcoolvse du
qluten Par la subtilisine en présence de n-proPanol 70
% v/v:
- teneur en peptides : 71 %
(methode de Kjeldahl)
- masse molaire moyenne : 6200
- n-propanol lié : 2,7 mg/g pep~ides
- taux d'esterification 28 %
EXE:~SPLE 2: ALCOOLY8E DE PEPT:rDE8 DE GL~JTEN DE ~LE:
,
Les peptides de gluten de ~lé ont ete prepares
par hydrolyse du gluten par la subtilisine (Alcalase)
a pH = 8 : la masse molaire moyenne des peptides
solu~les dans l'eau déterminée selon les conditions
décrites dans l'Exemple 1 est de 4 200.
75 g d'hydrolysat de gluten sont disperses dans
o,75 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH du milieu
réactionnel est ajusté a 5,1 a 1'aide de 120 mmoles de
HCl. 15 ml de subtilisine (Alcase Q 2,4L) sont ajou~es
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2~3l63~
18
la suspension. Le melange est incubé 20 heures sous
agitation douce ~ 25-C.
La subtilisine est ensuite dénaturée par
ajustement du pH du melange a 3,5 avec 80 mmc,les de
HCl et chauffage à 50-C pendant 40 minutes. Le n-
propanol est elimine par~ ëvaporation a 55-C et le
produit mis en suspension dans de l'eau (volume de la
suspension aqueuse : O,75 1, pH -~ 2,9).
Le pH de la suspension aqueuse est ajuste à 6,0 a
1'aide de 85 mmoles de NaOH. Les produits solubles
sont collectés par centrifugation, microfiltrés sur
filtre 0,2 micron et lyophilisés. Les insolubles sont
éliminés . Après lyophilisation, la quantité collectée
de produit soluble est de 61 g.
Caracterisation du Produit obtenu Par alcool~se de
pePtides de qluten Par la subtilisine en Présence de
n-~ropanol 70 % v/v :
- teneur en peptides : 62 %
(methode de Xjeldahl)
- masse molaire moyenne : 3900
- n-propanol lié : 8,2 mg/g
- taux d'estérification : 53 %
LSE:~PIE 3: ALCOs~lY8E: DE8 GLIADINE~ PRE8E~CE
D'J~COOL~; MIBCIBLE~ ET NON MI~;CIBIæ8 A L'EAlJ
Des milieux réactionnels contenant :
- gliadines (Sigma G-3375) : 30 g/l
- su~tilisine (Alcalase 2,4L) : 2 % v/v
- alcool 70 %
ont été préparés à pH = 5 (ajusté avec HCl) et incubés
a 25 C sous agitation douce. Apres incubation, la
subtilisine est dénaturée par ajustement du pH a 2
~ X ~ '~ ' ~ S ' ;~ 's~ 'J~Y~;~ ",~"; r" ,~ ",:" ~ ,~, ,,
WO93/18180 21 3 I PCT/FR93/00213
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avec HCl, l'alcool evapore, le produit mis en
suspension dans 1'eau. Les melanges sont ensuite
lyophilises et les produits de reaction caracterlses.
Tableau 1 : Alcoolvse des qliadines en Presence
d'alcools miscibles et non miscibles 2 1' eau :
Alcool, Duree Masse mol. Taux
70 % v/v d'incuba- (produits d'esteri-
tion h solubles fication
a pH = 7,0 % (a),
Ethanol 2 9 900 7g
n-propanol 6 ~ 8 400 50
n-butanol 15 8 100 15
n-butanol:45% 15 8 200 32
2-propanol:25%
:~ n-pentanol 15 4 800 4
. ~ n-pentanol 15 ~8 300
2-propanol
(a) LR taux d'esterification est donne pour l'alcool
primaire.
L'efficacite de la réaction d'alcoolyse diminue
lorsque la longueur de la chalne aliphatique augmente
(ethanol, propanol).
Lorsque 1'alcool est partiellement miscible (n-
butanol) ou immiscible a l'eau (n-pentanol),
1'efficacité de la réaction d'alcoolyse est augmentee
par la présence d'un tiers composé a la fois miscible
a l'eau et misci~le a l'alcool (par exemple, le 2-
propanol).
EXEMPLE ~ : INFL~ENCE D~ P~ 8~R L'EFFICACIT~ D~ LA
REACTION D'ALCOOLY~E :
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~3~63~ 20
~ Des milieux reactionnels ont ~té prepareis comme
détaillé dans l 'Exemple 3 avec seulement l'ethanol
et le n-propanol comme alcools utili~és et les pH des
milieux reactionnels ajustes ~ 5,0 ou ~ 7,0 avec HCl.
LRS produits de la réaction apreis 6 heures
d'incubation ont éte obtenus comme indiqué dans
l'Exemple 3 et caractérisés (Tableau 2).
L'hydrolyse de protéines par la Subtilisine est
efficace ~ pH basique, 7 a lO. Néanmo~ns, il a eté
observé que 1'efficacité de la reiacti~n d'alcoolyse
est significativement augmentée lorsque le pH du
milieu reactionnel est acide, le pH étant ajusté à 5,0
notamment.
Tableau 2 : Influence du PH sur llefficacité de la
reaction d'alcoolYse des qliadines ~ar la
su~tilisine :
pH Milieu Taux
Alcool de synthese Mw d'estéri-
fication
Ethanol ~ 7,o 6 700 14
. . .
Ethanol 5,0 9 400 49
. _ ,
N-prnpanol 7,0 8 300 39
_
N-propanol 5, 0 8 4 00 50
E~EMPLE 5: Al.COOI.Y8E DES PROTEINE~ DIJ GL~rE~a DE: BLE
P~ ~ PAP~
250 g de gluten de blé vital sont disperses dans
1,O 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH de la suspension
est ajusté à 6,0 a l'aide de HCl. lO0 g de papaïne
(6~00 NF Gist Brocades, Seclin, France ), et de la
cystéine (concentration finale : lO mM) sont ajoutés à
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2131G37
la suspension. Le melange est incube 24 heures sous
agitation douce a 25-C. Le produit de la reaction est
récupere comme indique dans 1'Exemple 1. La masse
molaire moyenne des peptides solubles a pH 6,0 est
5 700 et le taux d'esterification est egal à 9 %.
E~EMPLE 6 : ALCOCLY8L D~ LA GELATINE PAR LA
-
8~TILI8IN~ :
25 g de gelatine alimentaire (140-160 bloom) sont
dispersés dans 250 ml de n-propanol a 70 % v/v. Le pH
est ajuste a 5,0 avec HCl (0,3 mmole). La subtilisine
(2,5 ml d'Alcalase 2,4~) est ajoutee et le melange est
incube pendant 22 heures sous agitation douce a 25 C.
lZ,S ml de preparation de Subtilisine sont alcrs
ajoutés et le melange incubé pendant 4 heures. La
Subtilisine est enfin denaturee par ajout de 11 mmoles
de HCl (pH = 3,5) et le mélange chauffe a 50'C pendant
30 minutes. L'alcool est evaporé et le produit dilue
dans 1'eau est lyophilisé. Læ masse molaire moyenne
des produ~ts solubles dans l'eau a pH = 7 est 12 000
et le taux d'esterificati~n est égal a 29 %.
EXEHPLE 7 : PREPAR~TION DE MICROYARTIC~E8 A P~RTIR D~
PRODtJIT D ' ALCS~OLY8E DE ZEINE DE M~ PAR LA
8~BTILISINE EN P~E8ENC~ D'ET~ANOL :
.
10 g de zéine (matière azotée totale : 80, 7 %
Sigma Z-3625) sont solubilises dans 100 ml d'éthanol a
90 % v/v ou 70 % v/v. LRS melanges sont ajustes a pH 5
avec HCl. La subtilisine (2 ml d'Alcalase 2,4L) est
ajoutée et les melanges sont incubes 48 heures a 25 C.
Les solutions sont ensuite filtrées sur papier et les
microparticules sont preparées selon le protocole
suivant :
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~3 ~631 22
- la solution a~coolique (100 ml) maintenue A 40-C
est pompee ~ un d~bit de 4 ml/min dans 0,8 1 d'une
solution aqueu~e de gomme arabique a 10 g/l maintenue
à 70-C et agitee fortement. La solution alcoolique
entre en contact avec la solution aqueuse à travers
une aiguille de diamètre 0,8 mm plongeant dans la
solution aqueuse,
- la suspension de microparticules est incubée au
moins 4 heures à 4-C et filtrée sur papier,
- l'alcool contenu dans le filtrat est é~aporé,
- les microparticule~ sont obtenues en suspension
dans l'eau et séchées par.lyophilisation.
Les caractéristiques des produits obtenus sont
indiquees dans le Tableau 3.
Tableau 3 : PréParation de microParticules à martir du
roduit d'alcoolvse de la zéine de maïs ~ar la
subtilisine en Présence d'ét~anol :
Ethanol dans la réaction
d'alcoolyse, % v~v 70 90
M.A~T. dans produit sec, % 55 54
Rendement de microparticulation
de la M.A.T., % 100 94
Ethanol lié aux peptides
mg/g peptides 0,98 1,14
. _
ESEMPI~ 8 ~ COOLY8E DE: PEPTIDE~ DE~ EN PRE82NCE:
DE N--PROPA17OL:
Les peptides de maïs ont été prepares selon la
méthode de l'exemple 2 et soumis ensuite a une
réaction d'alcoolyse. Le milieu et les conditions
réactionels étaient les suivants :
WO93/18180 2 f 31 6 3 PCT/FR93/00213
- peptides de maïs : 100 g/l
(masse molaire : 5 700)
- n-propanol : 70 % v/v
- Alcalase : 2 % v/v
- pH : 5,0
- temperature : 25 C
- duree : 20 h
Le produit de la reaction de condensation avait
les caracteristiques suivantes :
- masse molaire : 4 100
- taux d'estérification : 55 %
