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I WO 94/19490 ~ 1 3 4113 PCT/FR94100201
., ~ 1
océdç de d~abilisation d~n~struct~re~econdai~e intracaténairç
d'un polvnucléotide simple brin. et de ca~ture ~ nu~léotide
I~'inven~ion a pour objet un procédé de déstabilisation d'une structure
secondaire intracaténaire présente dans un polynucléo~ide simple brin, ce procédé
5 étant utilisable dans une technique d'hybndation en phase solide lorsqu'un locus
d'intérêl de l'acide nucléique est présent au niveau d'une structure secondaire.L'invention concerne également un dispositif des~né à la mise en
oeuvre de ce procédé. L'un des avantages de ce proGédé est quiil est facilement
automatisable.
' 10 L'hybridation des acides nucléiques par ~ormation de liaisons
hydrogène entre deux séquences complémentaires selon les lois d'appariement A-T,G-C pour l'ADN, et A-U, G-C pour l'ARN, est un phénomène bien connu.
Sur la base des propriétés d'hybridation des acides nucléiques, des
tests ont été développés pennettant de mettre en évidence et de quantifier, dans un
échantillon à analyser, un acide nucléique. Dans cette technologie dite "par sondes
nucléiques", la présence d'un acide nucléique dans un échantillon est confirmée en
utilisant un oligonucléotide de séquence connue (la sonde) qui est complémentaire
d'une séquence nucléotidique de l'acide nucléigue recherché (la cible).
Une technique d'hyblidation particulièremen~ intéressante est la
2 0 technique dite d'hybridation sandwich qui utilise une première sonde fixée en excès
sur un support solide, pemlettant de capturer l'acide nucléique recherché, et une
seconde sonde, marquée, appelée sonde de détection, qui permet de révéler la
présence de l'acide nucléique ainsi capturé. Cette technique, décrite notamment par
Dunn et Hassel, Cell 12:23-36 (1977), comporte donc l'utilisation de deux sondes,
une sonde de capture, fixée sur un support solide, capable de s'hybrider avec une
partie (ou zone de capture) d'un acide nucléique à détecter dans un échantillon, et
une sonde de détection marquée, qui est complémentaire d'une autre zone de la cible,
et qui permet la détection grâce à un marqueur qui peut être radioactif, enzymatique
ou chimique.
3 0 La forrnation ou l'absence de formation d'un hybride en~e la sonde de
détection et l'acide nucléique cible est une source de renseignements importante pour
le diagnostic. Par exemple, si la séquence nucléique d'intérêt est spécifique d'un
genre ou d'une espèce de bactéries, la présence du genre ou de l'espèce dans un
échantillon est confirrnée quand la form?tion d'un hybride est détectée.
Les essais fondés sur les techniques d'hybridation peuvent donc être
utilisés dans le diagnostic de maladies associées ~ la présence de microorganismes
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO94/190~ 341~3 PcTl}~s
pathogènes tels que bacténes, champignons ou virus. Ils trouvent également une
utilisation dans l'industrie agro-alimentaire, notamment pour contrôler l'absence de
contamination bactérienne.
Par ailleurs, la technique d'hybridation peut être utilisée dans le
diagnostic des maladies génétiques.
Dans le cas de la détection d'organismes, en particulier d'organismes
infectieux, dans un échantillon, l'acide nucléique-cible (ADN ou ARN) doit bien
entendu comprendre au moins une séquence nucléique suf~lsamment spécifique de
l'espèce, du genre ou de la famille de l'organisme à détecter et la sonde,
complémentaire de ladite séquence nucléique, doit éventuellement pouvoIr
reconnaître sa cible même au sein d'un milieu contenant des milliers d'autres acides
nucléiques qui, dans certains cas, ne différeront de la cible que par une paire de
bases. Ainsi, si ia séquence nucléique recherchée est présente dans l'échantillon
examiné, elle formera avec la sonde, un hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou
ARNtARN, selon le cas.
La cible peut être une molécule d'ADN simple brin (obtenue par
exemple par dénaturation thermique préalable d'un ADN double brin ou par
transcription inverse d'un ARN) comprenant une séquence nucléique spécifique de
l'organisme à détecter.
2 0 l,a cible peut être ~également un ARN (ARN ribosomigue, ARN de
transfert, ou ARN messager).
. I)ans le cas de la détection de virus, la cible peut également être une
molécule d'ADN ou d'ARN. Dans le cas des organismes procaryotes ou eucaryotes,
on préfere souvent utiliser comme cible l'ARN ribosomique (ARNr) qui, avec les
protéines ribosomiques, cons~itue le ribosome. Celui-ci assure une fonction
essentielle de la cellule, à savoir la traduction de l'ARN messager en protéines.
L'ARN ribosomique, qui est retrouvé dans toutes les cellules, est un marqueur
universel des êtres vivants qui possède des variations discriminantes au niveau de
chaque espèce. Il a été l'objet de nombreuses recherches dont une compilation
3 0 récente peut être trouvée dans "The Ribosome: Structure, Function and Evolution",
American Society for Microbiology, Washington D.C. (1990).
La petite sous-unité du ribosome (16-18 S) et la grande sous-unité
(23-28 S) sont des molécules de choix pour étudier les relations phylogénétiquesentre les différents organismes vivants, et pour procéder à leur identification.Notamment Takahashi et al., Biochim. Biophys. Acta 134.124-133 (1967) ont
montré la valeur taxonomique des sous-unités de l'ARN ribosomique en procédant à
FEUILLE DE REMPLACEMENt (REGLE 26)
_ WO 94/19490 ~13 4113 PCT/I;R94/00201
des experiences d'hybndation d'ARNr de référence avec des ADN d'espèces proches.Ces expériences font ressortir un pourcentage d'homologie quantifiable,
reproductible et représentatif de l'éloignement taxonomique par rapport à l'espèce de
reférence. De même, Fox et al., International Journal of Systematic Bacteriology,
27~ 57 (1977), ont montré l'intérêt des ARNr 16 S pour la taxonomie des
procaryotes.
La valeur taxonomi~que des séquences nucléotidiques des sous-unités
de l'ARNr a été soulignée notamment par: Pace et Campbell, J. of Bacteriology 107
: 543-547 (1971), qui discutent des ARN ribosomiques de diverses espèces
1 0 bactériennes et d'une méthode d'hybridation pour quantifier des niveaux d'homologie
entre ces espèces; et Woese et coll., Microbiological Reviews 47: 621-669 (1983),
ainsi que Grayet et coll., Nucleic Acids Research 12: 5837-5852 (1984), qui
montrent par des comparaisons de séquences d'ARN 16S que des régions hautement
conservées sont intercalées avec des regions de moyenne et basse homologie, memedans le cas d'espèces proches.
En fait, les ARN ribosomiques sont présents dans tous les organismes
vivants, de la bactérie à l'homme. Ils présentent une séquence nucléotidique
particulière faite d'une succession de domaines caracténsés par une vitesse
d'évolution variable. Dans ce dernier cas, certains domaines sont conservés chez tous
2 0 les organismes, ou dans des groupes d'organismes, et sont donc utilisables comme
sites de complémentarité pour l'hybridation à des amorces oligonucléotidiques
universelles de séquençage ou d'amplification. Lorsqu'au contraire, la vitesse
d'évolution d'un certain domaine est élevée, celui-ci peut e~e utilisé pour élaborer
des sondes spécifiques, selon les cas, de l'espèce, du genre, de la famille ou du règne.
2 5 Les ARNr constituent une molécule très abondante dans toutes les cellules,
représentant plus de 90 % des ARN totaux. Leur organisation en famille
multigénique a pour résultat que leur séquence est représentative d'une espèce, ou
éventuellement d'une population, plutôt que d'un individu.
L'utilisation d'ARN ribosomique, en tant que cible, pour des réactions
d'hybridation, peut être effectuée sur culture, par exemple sur culture bactérienne, ou
sur un échantillon clinique, après transcription inverse suivie éventuellement d'une
amplificadon enzymatique in vitro, en utilisant les méthodes connues, la PCR
(Polymerase Chain Reaction): Saiki et al., Science, 230:1350-1355 (1985), la TAS(Transcription Amplification System): Kwoh et al., P.N.A~S. USA, 86:1173-1177
(1989), la 3SR (Self Sustained Sequence Replication): Guatelli et al., P.N.A.S. USA,
87:1874-1878 (1990) ou toute autre méthode d'amplification appropriée.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE ~
WO 94l194~0 ~ 13 ~1 13 PCT/F~94/00201
On peut également u~iliser directement comme cible l'ADN dont
l'ARN ribosomique est le produit de transcription.
Le développement de tests visant à mettre en evidence la présence
d'ARNr dans un échantillon se heurte toutefois à certaines difficultés, liées
5 notamment à la conformation des molécules dans l'échantillon. En effet, la molécule
d'ARNr, bien que monocaténaire, présente des s~ructures dites secondaires. Elle
contient en effet des séquences auto-complémentaires qui, dans des conditions
physico-chimiques déterrninées, sont capables de s'apparier localement~ par
hybridation intramoléculaire, en se repliant sur elles-mêmes et en formant ainsi des
10 structures dites "en épingle à cheveux" ou en "tiges-boucles" (les "boucles"
correspondant à des p;lrties de séquences non auto-complémentaires situées entredeux séquences impliquées chacune dans une hybridation in~arnoléculaire); voir par
exemple la Figure 1. L'existence de structures de type "tige-boucle" a été prouvée
expérimentalement; voir par exemple Noller et al., in the Ribosome: Structure,
15 Function and Evolution, op.cit. Le résultat est une structure secondaire organisée
comparable à celle de la figure 1 qui représente la s~ructure secondaire de l'ARNr 16
S d'E. Coli (Gutell et al., Comparative Anatomy of the 16 S-like ribosomal RNA,
Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 32:1~-216 (198~)). Des structures secondaires
analogues sont bien entendu présentes dans la forme simple brin de l'ADN dont
2 0 l'ARNr est le produit de transcription.
Les structures secondaires présentes dans les acides nucléiques sont à
l'origine de diffieultés d'hybridation des sondes oligonucléotidiques, car elles sont
difficilement accessibles auxdites sondes; voir notamment Shimomaye et Salvato,
Gene Anal. Techn.. 6: 25-28 (1989~. Pour cette raison, la demande de brevet PCr
2 5 WO 91/00926 décrit un procédé dans lequel on choisit une région-cible de l'ARNr
qui contienne le moins possible de structures secondaires. Mais un tel choix soulève
des difficultés car les régions d'intérêt diagnostic, ayant varié dans le processus
d'évolution, sont le plus souvent situées à l'intérieur desdites s~uctures secondaires.
On peut envisager d'éliminer les structures secondaires par dénaturation thermique
3 0 ou à l'aide d'agents alcalins comme l'hydroxyde de sodium. Toutefois, il a été montré
qu'une partie des structures secondaires et/ou tertiaires n'~tait pas dénaturée dans les
conditions de dénaturation utilisées habituellement; voir notamment EP-0318245,
dont les auteurs ont montré en outre que les structures secondaires résiduelles
peuvent inhiber, voire bloquer la formation d'un hybride entre une sonde et une
séquence nucléique cible intégrée dans une structure secondaire. En outre, la
dénaturation thermique n'est pas propice à la réalisation de l'hybridation dans un
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 2~
WO 94tV490 PCT/FR94/00201
-, ~.t3~113
appareil automatique, car elle nécessite d'opércr à des temperatures variées. Enfin,
l'utilisation d'hydroxyde de sodium pose des problèmes de corrosion et de précision
des doses introduites.
, L'invention a pour objet un dispositif permettant la déstabilisation des
structures secondaires intracaténaires d'un polynucléotide simple brin, et permettant
simultanément la capture dudit polynucléotide, ce qui facilite en outre des opérations
ultérieures telles que la détection par hybridation, l'arnplification ou le séquençage.
En outre, le dispositif de l'invention peut être utilisé sans dénaturation
préalable du polynucléotide cible simple brin. Le dispositif peut donc être utilisé
dans un appareil automatique, fonctionnant à ~empérature fixe, par exemple à 37-C.
L'invention a donc pour objet un dispositif pour la déstabilisation
d'une structure secondaire intracaténaire présente dans un polynucléotide simplebrin, caractérisé par le fait qu!il contient un oligonucléotide fixé sur un support, ledit
oligonucléotide contenant une séquence dite déstabilisante capable de s'hybrideravec une séquence non auto-complémentaire participant à ladite structure secondaire
dudit polynucléotide, et par le fait qu'il est utilisable comme sonde de capture pour
ledit polynucléotide.
Autrement dit, I'oligonucléotide fixé sur un support joue à la fois le
rôle de déstabilisant et le rôle de sonde de capture. Comme cela a été indiqué ci-
2 0 dessus, on appelle sonde de capture un oligonucléotide fixé sur un support, et
perrnettant l'isolement de la cible.
; L'oligonucléotide peut être un fragment d'ADN ou d'ARN naturel, ou
~r~ ~ un oligonucléotide naturel ou de synthèse~ ou un fragment d'ADN ou d'ARN- de
¦ synthèse soit non modifié, soit comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles
~ ' 25 que l'inosine, la méthyl-5-désoxycyddine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-
- 3 désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre autre
base modifée perrnettant l'hybridadon. Des modificatdons chimiques appropriées
peuvent permettre par exemple d'améliorer la résistance vis-à-vis d'une dégradon, j I enzymadque, en particulier due aux nucléases, et d'accroître en outre le rendement
3 0 d'hybridation, bien entendu sans affecter l'enchainement des bases. Des exemples en
sont l'introducdon entre au-moins deux nucléoddes d'un groupement choisi parmi les
esters de diphosphate, d'alkyl- et aryl-phosphonate et de phosphorothioate, ou le
remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide; voir à ce sujet P.E.
Nielsen et al. Science, 254, 1497-1500 ~1991).
Le support peut être un support macromoléculaire, et en particulier un
support solide. Les supports udlisables sont connus en soi. Il peut s'agir par exemple
- FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO 94/19490 PC'r/~94tO0201
~ 3 ~ 3 6
de la paroi d'un tube à essais, d'une plaque de polystyrène ou de nylon, d'un cône (par
exemple en copolymère butadiène-stylène), de billes oll de microsphères de latex,
etc. L'oligonucléotide déstabilisant doit être capable d'entrer en concurrence avec la
séquence complémentaire de la séquence qu'il reconnâît dans la structure secondaire
5 de la cible. Pour cette raison, la séquence reconnue par l'oligonucléotide ne doit pas
consister uniquement en une partie elle-même auto-complémentaire de la cible, car
la sonde oligonucléotidique comporterait alors elle aussi une séquence auto-
complémentaire et se replierait sur elle-même, de sorte qu'elle ne pourrait pas jouer
son rôle de sonde déstabilisante sans dénaturation préalable.
l O Il convient de noter qu'il n'était pas évident qu'une sonde fixée sur un
support, et donc soumise à des contraintes stériques, puisse être utilisée commemoyen de déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire dont l'accessibilité
est bien entendu fortement réduite, comme un simple examen de la figure 1 permetde le comprendre, et cela d'autant plus qu'en réalité, les polynucléotides tels que les
15 ARNr ont une structure tertiaire qui, en général, complique encore davantage les
problèmes d'accessibilité des sondes oligonucléotidiques fixées. Ce résultat estd'autant plus remarquable qu'en fait, comme cela est montre dans la partie
expérimentale, il n'est même pas nécessaire d'effectuer une dénaturation préalable du
polynucléotide-cible pour que le dispositi~ de l'invention fonctionne de manière2 0 satisfaisante.
Dans la demande de brevet EP-0318245, on a décrit des essais
d'hybridation en phase liqu~de dans lesquels on utilise un ou plusieurs
oligonucléotides auxiliaires dont la capacité d'hybrida~ion avec une séquence
impliquée dans une structure secondaire de la cible perrnet de favoriser l'hybridation
25 d'une autre sonde spécifique reconnaiss~nt une autre séquence également présente
dans ladite structure secondaire. Il est indiqué dans cette demande de brevet
européen que le fait de travailler en milieu hétérogène, c'est-à-dire avec ~lxation d'un
réactif sur une phase solide, ne favorise pas l'hybridation, pour des raisons qui
tiennent à l'encombrement et à l'orientation des molécules. C'est manifestement pour
3 0 cette raison que les auteurs de la demande de brevet européen citée ont opté pour la
réalisation d'essais en phase liquide. Il existait donc, chez les spécialistes, un préjugé
contre la possibilité d'utiliser un oligonucléotide fixé sur un support solide et, malgré
cela, capable de déstabiliser une structure secondaire, sans l'aide d'un oligonucléotide
. . .
aux~llalre.
3 5 Pour fixer l'oligonucléotide sur le support, on peut utiliser toutes les
mét'nodes connues telles que par exemple la fixation par établissement d'une liaison
FEUILLE DE REMPLACEMENT ~REGLE 26)
WO 94/19490 ~ 1 3 4113 PCT/FR94100201
covalente, soit directement, soit par l'interrnédiaire d'un ligand lui-meme fixé au
support par au moins une liaison covalente ou par adsorption. On peut citer à cepropos les documents WO 8~/01302 ainsi que FR-9109057 (2.679.255).
La séquence déstabilisante de l'oligonucléotide utilisé dans le
dispositif de l'invention doit avoir une longueur suffisante (c'est-à-dire un nombre de
motifs nucléotidiques suffisant) pour provoquer la déstabilisation de la structure
secondaire de la cible à une température prédéterminée.
Il est connu que la stabilité d'un duplex nucléique augmente avec le
nombre de bases appariées, ce qui se traduit par le fait que la température Tm
(température de dissociation de 50 % des duplex) augmente, pour un oligonucléotide
donné, Iorsqu'on le soumet à unc élongation par augmentation du nombre de motifsnucléotidiques.
La séquence oligbnucléotidique déstabilisante devra donc avoir une
longueur suffisante pour pouvoir à la fois rompre le duplex formé par les séquences
capables d'hybridation intracaténaire, par d6placement d'un des brins, et inhiber
effilcacement~ la reformalion de la structure secondaire par hybndation intracaténaire,
à la température à laquelle on opère. On a découvert de façon surprenante que malgré
les contraintes prévisibles nées de l'utilisation d'un oligonucléodde déstabilisant fixé
sur un support, il est possible d'obtenir une déstabilisation satisfaisante de la structure
second ~ire à des~températures inférieures à 50 C, et cela sans dénaturation préalable
du polynudéotide-cible, tout en utilisant des oligonucléotides relativement courts,
ayant par exemple~ de~ 20 à 40 nucléotides. En pratique, on peut opérer généralement
entre 0 et 45 C~environ, et èn particulier à 37 C, ce qui Feprésente un avantageM ~ évident
~M~ ~ 2 5 ~ L'invention a donc également pour objet un procédé de déstabilisation
d'une~ structure socondaire intracaténaire d'un polynucléotide simple-brin et decapture dudit polynucléotide, caractérisé par le fait que l'on met en contact undispositif tel que défini ci~essus avec une phase liquide contenant, ou susceptible de
contenir, ledit po!ynucléotide, à une température inférieure à 50-C. La phase liquide
3 0 est par exemple un échantillon biologique ou un isolat de culture dans lequel on
souhaite rechercher, pour la doser ou la carac~ériser, une séquence polynucléotidique
d'intérêt, comme cela a été rappelé dans la partie introductive ci-dessus. Par exemple,
~ ~ .
si l'on ajoute à la phase liquide un second oligonucléotide capable de s'hybrider avec
une séquence autre que ~la séquence rec~onnue par la séquence déstabilisante, ce3 5 second oligonucléotide pourra être utilisé, en quantité suffisante, soit comme sonde
de détection (le second oligonucléotide est alors un oligonucléotide marqué), soit
- FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO 94/19490 ~J 13 ~11 3 pcTlFRs4loo2ol
comme amorce pour l'amplification ou le séquençage de la cible par élongation dusecond oligonucléotide.
Bien entendu, le second oligonucléotide devra avoir une longueur
appropriée, et en particulier suffisamment courte pour assurer une spécificité à la
5 température à laquelle on opère. Le second oligonucléotide a généralement une
longueur inférieure à 25 nucléotides, en particulier de 8 à 20 nucléotides.
La séquence reconnue par le second oligonucléotide, lorsqu'il est
présent, est généralement située dans la partie déstabilisée de la structure secondaire.
Pour effectuer l'élongation du second oligonucléotide, il convient
1~ d'ajouter à la phase liquide en quantité suf~lsante les nucléstides élémentaires et une
polymérase telle qu'une ADN polymérase ou, lorsque la cible est un ARN ou une
transcriptase inverse (ADN polymérase ARN dépendante).
Par utilisation de nucléotides contenant en outre des nucléotides
modifiés, par exemple des nucléotides terminateurs de chaîne ou des nucléotides
15 marqués, il est possible de synthétiser et caractériser des produits d'élongation du
second oligonucléotide. L'une des applications peut ê~e le séquençage, effectué par
la méthode de Sanger ou selon toute autre méthode appropriée.
On peut mettre également à profit la déstabilisation de la structure
secondaire pour synthétiser une séquence complémentaire de la cible par élongation
2 0 de la sonde de capture, par addition à la phase liquide des nucléotides élémentaires et
d'une polymérase et, dans ce cas, la sonde de capture sera bien entendu fixée par son
extrémité 5'. Ici encore, il est possible de procéder à un séquençage par utilisation de
nucléotides mélangés à des nucléotides modi~lés.
On sait par ailleurs qu'il existe des polymérases capables de déplacer
2 5 les brins d'un duplex pour copier l'un des deux brins: c'est le cas par exemple de la
E. Coli DNA polymérase I; voir notamment J. Sambroo}c et al. Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), chap.5 page 34.Lorsque l'oligonucléotide de capture est fixé au support par son
, extrémité 3', et que le second oligonucléotide est capable de s'hybrider avec une
3 0 séquence de la cible située en aval par rapport à la séquence reconnue par la sonde de
capture (c'est-à-dire avec une séquence située entre l'extrémité 3' de la cible et la
séquence reconnue par l'oligonucléotide de capture), il est possible de proceder à une
élongation du second oligonucléotide de façon à synthétiser une séquence
complémentaire de la région de la cible située entre le second oligonucléotide et la
35 sonde de capture, et dans le cas où l'on utilise une polymérase capable de déplacer
les brins d'un duplex, l'élongation du second oligonucléotide peut se poursuivre
FEUlLLE DE RE~JIPLACEM~NT (REGLE 26)
_~ wo 94/19490 f~ t 3 ~1 1 3 PCTIF~94/00201
jusqu'au-delà de la séquence reconnue par la sonde de capture, et le produit
d'élongation du second oligonucléotide se trouvera relargué en solution.
Lorsque l'oligonucléotide de capture est fixé au support par son
, extrémité 5', I'addition d'une polymérase dans des conditions permettant l'élongation
5 conduit alors à une élongation de l'oligonucléotide de capture. Lorsqu'un second
- oligonucléotide, capable de s'hybrider avec une séquence de la cible situé en aval par
rapport à la séquence reconnue par l'oligonucléotide de capture, est également
présent, I'addition d'une polymérase dans des conditions permettant l'élongationconduit à l'élongation des deux oligonucléotides, et dans le cas où l'on utilise une
polymérase capable de déplacer les brins d'un duplex, la progression de l'élongation
du second oligonucléotide provoquera la déshybridation de la cible d'avec la sonde
de capture (et son produit d'élongation). Le produit d'élongation de la sonde decapture sera alors sous forrne monobrin et fixé au support solide, tandis que leproduit d'élongation du second oligonucléotide sera relargué en solution sous laforme d'un duplex formé avec la cible.
Ainsi, le procédé de la présente demande perrnet de réaliser
facDement, tout en mettant à profit les avantages propres aux procédés en phase
solide, la détection, éventuellement quantitative, la caractérisation et l'amplification
¦ ~ de séquences nucléotidiques présentes dans des structures secondaires, toutes
2 0 opérations qui, jusqu'à présent, soulevaient des difficultés techniques importantes.
L'invention concerne également les dispositifs particuliers et procédés
dédts ci-après dans la partie expérimentale, et notamment l'utilisation des sondes de
; capture particulières décrites,- y compris lorsqu'elles sont utilisées avec les seconds
oligonucléotides dénommés "sondes de détection" dans la partie expérimentale, c'est-
- à-dire:
utilisation des sondes de capture SEQ ID No. 2, 6, 8, 10, ou 12;
- utilisation, respectivement comme sonde de capture et comme
second oligonucléotide, des couples de sondes suivants: 2 et 1; 6 et 5; 8 et 7; 10 e~
9; 12 et 13; 12 et, en mélange, 14, 15 et 16.
3 0 Les exemples suivants illustrent l'invention. Dans ces exemples, on
fait référence aux dessins annexés dans lesquelles:
- la Fig. l représente la structure secondaire de l'~RN ribosomique 16S
d'E.Coli d'après Gutell R.R., B.Weiser, C.R. Woese, and H.F. Noller, 1985.
Comparative anatomy of the 16S-like ribosomal RNA. Prog. Nucleic Acid Res. Mol.
Biol. 32:155-216, et
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
wo 94119490 ~ 1 3 4 1 13 PCTfFR94/00201
- la Fig.2 représente un détail de la Fig. 1, avec des précisions sur la
séquence des sondes utilisées à l'exemple 1.
Exemple 1:
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37C sans
} dénaturation préalable et permettant d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au
niveau d'un locus présent dans une structure secondaire pemlettane de distinguer les
espèces Escherichia coli et Shigella des autres espèces bactériennes.
La séquence des sondes utilisées est donnée dans le Tableau 1 ci-après.
, Dans un premier temps, on a constaté expérimentalement que la présence de
la structure secondaire empêche l'hybridation d'une sonde de détection spécifique et
donc l'obtention d'un signal. La cible est la région tige-boucle de l'ARNr en position
435-500 de la figure 1. La numérotation est celle de Gutell R.R., B. Weiser, C.R.
Woese, and H.F. Noller, 1985. Comparative anatomy of the 16S-like ribosomal
RNA. Prog. Nucleic Acid. Res. Mol., Biol. 32:155-216. La sonde de détection G1 du
tableau 1 est complémentaire d'une partie de cette structure et est, d'après lesconnaissances actuelles, spécifique de l'entité taxonomique E. coli-Shigella.
L'hybridation des ARNr d'une bactérie-cible a été conduite selon le procédé de
0 détection non-radioactif et semi-automatisé décrit dans le brevet français n 90
Q7249 en ulilisant une sonde de capture S8L de spécificité eubactérienne et une
sonde de détection G1 conjuguée à la peroxydase. La manipulation a été conduite
dans une plaque de microtitration selon le protocole suivant.
Dans une plaque de microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution
2 5 de 1 ng/~Ll de l'oligonucléotide de capture dont l'extrémité 5' a réagi avec le réactif
J Aminolink 2 (Applied Biosystems, Foster city, Californie) dans du PBS 3X (0.45
M NaCl 0.15 M phosphate de sodium pH 7.0). La plaque est incubée 2 h à 37- C
puis lavée 3 fois avec 300 111 de PBST (PBS lx, Tween 20:0,5 / (Merck 822184)).
L'ARNr cible est extrait de chaque bactérie selon la technique suivante. 1,5
3 0 ml de culture bactérienne est centrifugé et le culot repris dans 75 ,ul de tampon Tris
(Tris 25 mM, EDTA 10 mM, saccharose 50 mM pH 8) et 25 ~I de solution de
Iysozyme (1 mg/ml en tampon Tris). Aprés incubation 30 min à 37 C, 50 111 de
phénol sont ajoutés et le tube est agité fortement pendant 30 secondes. On rajoute 50
~LI de chloroforrne et on agite à nouveau 2 secondes. Après centrifugation pendant 5
min, on récupère la phase aqueuse.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO 94/19490 ~ 4113 PCT/FR94/00201
11
La cible constituée par 10 ~11 d'extrai2 d'ARN totaux est mélangée avec 40 ~Ll
de tampon PBS saumon (PBS-3X +ADN de sperrne de saumon 10 ~lg/ml (Sigma D
9156)). L'ensemble est ajouté dans le puits à 50111 d'une solution du conjugué
oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de détection, à la concentration de
5 0.1 ng/~ll en oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10 % sérum de
cheval (BioMérieux 55842)). La pla~ue est incubée 1 h à 37' C puis lavée par 3 fois
300 ~11 de PBST. Dans chaque puits, on rajoute 100,ul de substrat OPD (ortho-
phénylènediamine Cambridge Medical Biotechnology ref/456) dans un tampon 0,055
M acide citrique, 0,1 M monohydrogénophosphate de sodium, pH 4,93) à la
1 0 concentration de 4 mg/ml, auquel on ajoute extemporanément du peroxyde
d'hydrogène à 30% dilué au 1/1000. Après 20 min de réaction l'activité enzymatique
est bloquée par 100 ~I d'acide sulfurique lN et la lecture est effectuée sur Axia
Microreader (BioMérieux) à 492 nm.
Les bactéries-cibles étaient notamment ies suivantes:
- 50 isolats ou souches E. coli (dont ATCC 25290, 25922, 27165, 10536,
4157, 11775T);
- - Divers autres Escherichia (18 isolats): E. fergusonii, E. hennanii, E.
vulneris:
- 30 Shigella: S. boydii, S. dysenteriae (dont ATCC 29027), S. flexneri, S.
: 2 0 sonnei;
: - Divers Salmonella (27 isolats ou souches): S. arizonae (dont ATCC
i
13314, 13323, 12325), S. choleraesuis (ATCC 13312), S. gallinarum, S. give, S.
paratyphi A, S. shomron, S. sophia, S. typhimurium (dont ATCC 14028 et 13311), S.
spp(ATCC 9712, 1202, 11997, 8388, 6962, 29628);
2 5 - Diverses entérobactéries: Citrobacter amalonàticus dont ATCC 25405,
Citrobacter freundii dont ATCC 11102, Enterobacter cloacae dont ATCC 13047,
EnEerobacter sakazaki dont CUETM 79104 et ATCC 29544, Enterobacter taylorae
(CUETM 452384), Hafnia alvei, Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae dont ATCC
13886 et divers autres Klebsiella, Kluyvera ascorbata ATCC 33433, Moellerella
wisconsensis (dont CDC 182679 et 306575), Morganella morganii, Proteus mirabilis,
Proteus morganii (dont ATCC 25830), Proteus penneri, Proteus rettgeri, Proteus
vulgaris (dont ATCC 6380), Providencia rettgeri, Pseudomonas aeruginosa ATCC
35422, Serratia grimesii ATCC 14460, Serratia marcescens dont ATCC 8195 et
8100, divers autres Serratia, Yersinia enterolitica dont ATCC 23715, Yersinia
interrnedia dont ATCC 29909, Yersinia kristensenii dont ATCC 35669, Yersinia
pseudotuberculosis dont ATCC 23207 et NCTC 8487;
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
-
WO 94tl9490 ~ 3 PCT/F~94100201
12
- Enterococcus faecalis.
Résultats
Les résultats de spécificité montrent que ce système de détection ne donne
aucun signal dans les conditions indiquées. La sonde de capnlre S8L n'est pas encause: en effet, si l'on remplace la sonde de détection spécifique G1 par la sonde de
détection eubacténenne E220, (capture: S8L) toutes les souches d'E. coli-Shigella,
ainsi que les autres espèces bactériennes sélectionnées donnent un résultat positif.
Les résultats négatifs obtenus avec la sonde de détection G1 pour les souches E. coli-
Shigella indiquent donc que celle-ci ne peul pas accéder à sa cible à cause de la
présence, dans les conditions expérimentales utilisées, de la structure secondaire
décrite dans la figure 1.
Lorsque la sonde de capture eubactérienne S8L est remplacée dans les
mêmes conditions par l'oligonucléotide G3 (Tableau 1 et Figure 2) situé dans la tige-
boucle de coordonnées 435-500, un signal est obtenu avec toutes les souches E. coli
et Shigella. La spécifîcité est alors celle désirée: cette combinaison de sondes ne
présente pas de réactions croisées avec les acides nucléiques, en particulier l'ARNr,
de toute autre espèce bactérienne, y compris les espèces proches d'Escherichia, à
l'exception toutefois d'Escherichia fergusonii qui donne un résultat positif. Ainsi,
I'oligonucléotide G3 fixé sur un support solide remplit la fonction de capture et de
~ - 2 0 déstabilisation. En outre, ces expériences montrent clairement que la dénatura~ion
- ¦ préalable de l'ARN n'est pas nécessaire.
L'adaptadon du même système capture G3 - détection G1 sur l'automate
VIDAS (marque déposée - commercialisé par la société BioMérieux SA - VlTEK) a
' été effectuée. La paroi du puits de microplaque est ici remplacée par le SPR ("Solid
2 5 Phase Receptacle") qui est un support conique réalisé à partir d'un matériau vendu
sous la dénomination K résine (copolymère butadiène-styrène~ et commercialisé par
la société VITEK (USA). Les divers réactifs sont disposés dans une barrette à
plusieurs cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR qui est capable
d'aspirer et de refouler les réactifs et qui fait donc office cle pipette. La réaction
3 0 d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi
interne du cône.
Sur la surface interne du SPR, est fixé passivement l'oligonucléotide de
capture déstabilisant comportant à son extrémité S' le ligand Aminolink 2 (Applied
Biosystems-réf.400808) à une concentration de 1 ng/~ll dans un volume de 315 ,~Ll
d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 rnM).
Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37C, les cônes sont lavés 2
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
W094/i9490 13 rcT/~s~loo~ol
fois par une solution PBS Tween, puis séchés sous vide. La barret~e contient dans
des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est à dire: 200 111 d'une solution
à 0,1 ng/~ll àu conjugué de détection oligonucléotide^phosphatase alcaline, 2 fois
600 ~1 de solution de lav.age PBS Tween et une cuvette de substrat.
Dans le premier puits de la barrette, sont déposés 10111 de l`ARN extrait
dans le même tampon que pour le protocole microplaque ci-dessus.
Après incubation 30 minutes du cône par le mélange cible plus sonde de
détection, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween. 250 ~11 de subs¢at
MUP (méthyl-4 umbelliféIyl phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine
1 0 sont aspirés dans le cône, puis relachés dans une cuvette ds lecture. L'appareil
mesure le signal fluorescent expnmé en URF (unités relatives de fluorescence) de la
cuvette.
On a obtenu avec ce système les mêmes résultats qu'avec les microplaques.
Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à l'extrémité 5' de la sonde un bras
comportant un groupement 6-aminohexyle. La sonde ainsi couplée à un ligand
possédant un groupement polaire (amine primaire), et fixée de façon passive sur le
' support, procure un signal amélioré; voir la demande FR 91 09057.
..
Exemple 2:
~, 20
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37C et permettant
d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant les
genres Salmonella et Vibrio, ce locus étant présent dans une structure secondaire
différente de celle de l'exemple 1.
La cible comprend ies deux structures secondaires de l'ARNr 16S,
analogues à celles présentes aux positions 770 à 880 de la figure 1. La séquence des
sondes est donnée au Tableau 1.
L'hybridation des ARNr de souches bactériennes a été conduite selon le
protocole décrit dans l'exemple 1. Il utilise la sonde déstabilisante dSAL9-2 pour la
capture et l'oligonucléotide SAL9 comme sonde de détection (conjuguée à la
peroxydase). La sonde de détection SAL9 du tableau 1 est complémentaire d'une
partie de la structure secondaire et doit, selon les connaissances actuelles, être
spécifique de l'entité taxonomique genre Salmonella.
Les bactéries-cibles étaient notamment les suivantes:
- 20 isolats ou souches de Salmonella arizonae dont ATCC 13314,13323 et
12325;
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Wo 94/194~0 ;~134113 PCT/FR94/00201
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- les autres Salmonella déjà ulilisés à l'exemple 1;
- divers autres Salmonella, et notarnmen~: S. bakou, S. derby, S. enteritidis,
S. gallinarum, S. paratyphii A, B et C, S. panama, S. pullorum, S. thomson;
- diverses enterobacténes ~34) des genres Citrobacter, Enterobacter,
Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Serratia; dont ATCC 11102, 13047, 29544,
13886, 6380, 35422, 8195, déjà cités et 25830 (Proteus morganii~;
- divers E. coli dont ATCC 27165 et 41~7
- divers Shigella dont ATCC 11060
- divers autres Escherichia (blattae ATCC 29907T, fergusonii, herrnanii,
l 0 vulgaris);
- divers Vibrio (anguillarum, harveyi), Aeromonas et Pleisiomonas.
Les résultats obtenus indiquenl que la combinaison de sondes utilisée est
spécifique des genres Salmonella et d'au moins une espèce du genre Vibrio (Il s'agit
de Vibrio anguillarum). Elle ne présente pas de réactions croisées avec les acides
nucléiques, en particulier l'ARNr, des autres espèces bactériennes, y compris les
especes proches de ces deux genres. Ceci est contrôlé par le fait qu'une hybridation
avec la sonde de capture S8L de spécificité eubactérienne, et la sonde de détection
E220 de spécificité eubactérienne est positive avec les souches non-Salmonella et
non-Vibrio.
2 0 Il convient de remarquer que` la sonde SAL9 ne diffère de la séquence
correspondante chez Escherichia coli (Fig. 1 ) que par un seul nucléotide. La sonde
SAL9 est cependant suffisamment spécifique et donne un résultat négatif pour E.
coli.
L'adaptation de la même combinaison de sondes sur l'automate VIDAS
2~ ~bioMérieux S.A., France) a perrnis l'obtention des mêmes résultats qu'en microplaques.
Exemple 3:
, On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37 C et permettant
d'hybrider en phase solide l'ARN r 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant
I'espèce Listeria monocytogenes, ce locus étant présent dans une structure secondaire
de l'ARNr 16S, analogue à celle présente entre les positions 123~ et 1300 de la
figure 1.
L'hybridation des ARNr de couches bactériennes a été conduite selon le
protocole décrit dans l'exemple 1, à l'exception de l'extraction de l'ARN r cible qui
FEUILLE-DE REMPLACEMENT ~REGLE 26)
WO g4119490 ~ 1 3 ~ 1 1 3 PC~ 94/002~1
1 5
est effectuée de la manière suivante: I,5 ml de culture bactérienne est centrifugé et
, le culot repris dans 75 111 de tampon Tris (Tris 50 mM, EDTA I0 mM, saccharose 25
% pH 8) et 25 ~1 de solution de mutanolysine ~Sigma) (1 mg/ml en tampon Tris) etde Iysozyme (1 mg/ml en tampon Tris). Après incubation 30 min à 37~C, 50 ,ul de
5 phénol sont ajoutés et le tube est agité fortement pendant 30 secondes. On rajoute 50
',11 de chlorofoIme et on agite à nouveau pendant 2 secondes. Aprés centrifugation
pendant 5 min, on récupère la phase aqueuse.
Ce protocole utilise la sonde déstabilisante ~L1 pour la capture et
l'oligonucléotide RL2 comme sonde de détection (conjuguée à la peroxydase). La
10 sonde de détection RL2 du tableau 1 est complémentaire d'une partie de cette
structure et devrait, selon les connaissances actuelles, être spéci~lques de Listeria
monocytogenes.
Les bactéries-cibles é~aient les suivantes:
- onze isolats de Listeria monocytogenes;
- trois Listeria grayi dont ATCC lgl20, quatre Listeria innocua, trois
Listeria mu~Tayi dont CCM ~990 (CCUG 4984), trois Listeria ivanovii, quatre
Listeria seeligeri dont CIP 100100 (CCUG 15530), trois Listeria spp, trois Listeria
- welschineri dont CIP 8149 (CCUG 15529).
Les résultats obtenus montrent que cette combinaison de sondes est
2 0 spéci~lque pour Listeria monocytogenes. Elle ne présente pas de réactions croisées
avec les acides nucléiques, en paIticulier l'ARNr, de toute autre espèce bactérienne
testée, y compris les espèces proches, tel Listeria innocua.
L'adaptation de la même combinaison de sondes sur l'automate VIDAS
(bioMérieux S.A., France) a permis d'observer les mêmes résultats qu'en
microplaques.
Exemple 4:
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37C et permettant
d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant
l'espèce Chlamydia trachomatis, ce locus étant dans une structure secondaire
analogue à celle située entre les positions 585 et 655 de la ~Igure 1.
L'hybridation des ARNr de souches bactériennes a été conduite selon le
protocole décrit dans l'exemple 1.
L'hybridation utilise la sonde déstabilisante dCI`4 pour la capture et
l'oligonucléotide CI 3 comme sonde de détection (conjuguée à la peroxydase). La
FEUILEE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Wo 94/19490 - ;~13 ~113 PCT/~4t00201
16
sonde de détection CI 3 du tableau 1 est complémentaire d'une partie de cette
s~ucture et devrait, selon les connaissances actuelles, être spécifique de Chlamydia
trachomatis.
Les bactéries-cibles étaient les suivantes:
- quatre isolats de Chlamydia trachomatis répondant respectivement à la
classification Serovar Ba, D, K et L~; Wang S.P. et al., 1975, J.Clin~Microbiol.1 :250-255.
- divers autres Chlamydia dont Chlamydia Pneumoniae et Chlamydia
psittaci;
- diverses souches non-Chlamydiae des genres Acinetobacter,
Achromobacter, Aeromonas, Bacillus, Branhamella, Candida, Chromobacter,
Enterobacter, Enterococcus, Haemophilus, Klebsiella, Escherichia, Lactobacillus,Listeria, Micrococcus, Neisseria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, SeIratia,
Staphylococcus, Streptococcus.
Les résultats obtenus mon~ent que cette combinaison de sondes est
spécifique de Chlamydia trachomaris. Elle ne présente pas de réactions croisées avec
. les acides nucléiques, en particulier l'ARNr, de toute autre espèce bactérienne testée,
y compris les espèces proches, tel Chlamydia psittaci.
L'adaptation de la même combinaison de sondes sur l'automate VIDAS
2 0 (bioMérieux S.A., France) a perrnis d'observer les mêmes résultats qu'en
microplaque.
Exemple 5:
!
2 5 On décrit ici Ull procédé fonctionnant en particulier ~ 37 C et perrnettant
d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant
diverses espèces du genre Mycobacterium, ce locus étant présent dans une structure
secondaire analogue à celle située entre les positions 140-230 de la figure 1.
L'hybridation des ARNr des souches bactériennes testées a ~té conduite
3 0 selon le protocole décrit dans l'exemple 1, à l'exception de l'extraction de l'ARNr
cible effectuée selon le protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries à
Gram positif décrit dans `'Current Protocols in Molecular Biology" 1987, AusubelFM et al., Wiley interscience, New York.
Le test d'hybridation utilise la sonde déstabilisante dTB1 pour la capture et
I'oli~onucléotide bovis 310 comme sonde de détection (conjuguée à la peroxydase).
La sonde de détection bovis 310 du tableau 1 est complémentaire d'une partie de la
-
FEUILLE DE RENIPLACEMENT (REGLE 26)
WO 94/1949D ;~ 1 3 ~ 11 3 PCT/FR94/00201
structure secondaire et devrait, d'après les connaissances actuelles, être spécifique du
groupe taxonomique tuberculosis regroupant M. tuberculosis, M. bovis, M.
africanum, M. microti.
Les bacténes-cibles étaient les suivantes:
- 27 isolats ou souches de Mycobacterium tuberculosis dont ATCC 27294 et
NCrC 7417;
- 5 souches ou isolats de Mycobacterium bovis dont ATCC 1921Q et M.
bovis BCG (Copenhague 1077);
- diverses souches de Mycobacterium avium et intracellulare dont ATCC
35716, 29555, 35764, 35847, 35770;
- divers Mycobacteriurn (chelonae, diernoferi, flavescens, fortuitum, gastri,
gordonae, kansasii, lactis, marinum, non chromogenicum, phlei, scrofulaceum,
simiae, smegmatis, szulgai, terrae, triviale, xenopi, vaccae) dont ATCC 14472,
14470, 12478, 19981, 25275, 35799, 15755 et 23292;
1 5 - Non-mycobacteries: Actinomadura madurae, Nocardia asteroides ATCC3308, Nocardia brasilensis ATCC 19296, Rhodococcus aichiensis et Rhodococcus
sputi.
Les résultats obtenus montrent que cette combinaison de sondes est
spécifique de Mycobacterium tuberculosis. Elle ne présente pas de réactions croisées
2 0 avec les acides nucléiques, en particulier l'ARNr, des autres espèces bactériennes, y
compris les autres espèces du genre Mycobacterium, alors même que l'ARNr de ces
souches est bien disponible pour l'hybridation comme le confirTne l'hybridation
observée avec la sonde de capture S8M de spécificilé eubactérienne, et la sonde de
détection E220 de spécificité eubactérienne.
L'adaptation de la mêrne combinaison de sondes sur l'automate VIDAS
(bioMérieux S.A., France) permet d'obtenir les mêmes résultats qu'en microplaque.
De la même manière, il est possible de définir des sondes spécifiques du
groupe taxonomique complexe Mycobacterium avium-M. intracellulare encore
appelé "MAI". Le test d'hybridation utilise la sonde dés~abilisante dTB 1 et le
30 mélange des sondes de détection MAI 1, MAI 2, MAI 3 (tableau 1).
- FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
PCTIFR94/00201
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FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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