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.__ _1_
L'invention a pour objet un procédé de sélection et/ou d'obtention de sondes
nucléiques
capables"rle détecter des nouvelles régions à nombre variable de répétitions
en tandem présentes
dans le génome des eucaryotes supériews, les sondes pouvant être ainsi
obtenues. et lews
utilisations.
Avec le développement de la biologie moléculaire et son application dans la
vie cowante,
les circonstances requérant une identification génétique sont de plus en plus
fréquentes. Parmi
celles-ci, on peut notamment citer l'identification d'un individu, en
particulier, lors d'enquêtes de
police ou de recherches de paternité, l'identification d'une lignée
cellulaire. ou bien encore le
contr8le de l'origine d'une semence, qu'elle soit humaine, animale ou
végétale.
Toutefois, étant donné la complexité du génome des eucaryotes supérieurs, une
analyse
complète de celui-ci, pow un individu donné, est inenvisageable à l'hewe
actuelle.
Il est par conséquent nécessaire de recourir à l'utilisation de marquews de
cette identité
génétique. ,
Il a récemment été mis en évidence l'existence, dans le génome d'eucaryotes
sup$riews, de
marqueurs intéressants désignés sous le terme de régions à nombre variable de
répétitions en
tandem (régions VNTR ou de façon abrégée Wi TR), ces régions étant également
encore
appelées "régions hyper<~ariables" ou "régions minisatellites".
Chaque locus correspondant à une VNTR est constitué d'une séquence de
nucléotides
répétée en tandem et dont le~nombre de répétitions varie d'un individu à
fautre.Toutefois, toutes
les séquences répétées ne sont pas toujows parfaitement identiques. Néanmoins,
pour une espèce
donnée, la séquence répétée d'un locus déterminé est fortement conservée.
Les différentes VNTR d'un même individu sont dispersées dans le génome et se
distinguent
les unes des autres non seulement par la séquence du motif répété mais
également par le nombre
de répétitions de lew propre motif.
Parmi les procédés de détection de ces régions utilisés jusqu'à présent, on
peut citer le
criblage d'une banque à l'aide de sondes nucléotidiques à répétitions en
tandem naturelles (Wong
et al, Annu, Hum Genet, 51,269-288, 1987) ou de sondes synthétiques (Zischler
et al,.~enomics,
13, 983-990, 1992). On peut également citer le procédé décrit dans la demande
de brevet FR
91.10516 consistant en un criblage d'une banque enrichie en VNTR à (aide de
sondes
nucléotidiques à répétitions en tandem artificielles ainsi quë le procédé.
consistant en une
recherche systématique dans une banque génomique (Armow et al, Génomics, 8,
501-512).
Toutefois, ces procédés se sont avérés insuftïsants dans la mesure où ils
n'ont permis de
mettre en évidence jusqu'à présent que :l0% environ du nombre de VNTR estimé
pour l'espèce
humaine, '
On a maintenant découvert que de façon surprenante, en utilisant des fragments
d'ADN
génornique obtenus après hydrolyse d'ADN à l'aide de certaines enzymes de
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_2_
restriction et sélectionnés d'après leur taille, il devenait possible
d'obtenir aisément de nouvelles
sondes càpables de nouvelles VNTR.
Par sonde, on entend, dans la présente demande, toute séquence nucléotidique
simple brin
pouvant s'apparier à une VNTR, selon les propriétés bien connues d'appariement
purine
s pyrimidine des brins commentaires d'acides nucléiques dans les duplex ADN-
ADN, ADN
ARN et AIRN-ARN .Ce processus d'appariement s'effectue par (établissement de
liaisons
hydrogène entre les bases adénosine-thymine (A-T) et guanosine-cytosine (G-C)
de l'ADN
double brin; des paires de bases adénosine -uracile (A-U) peuvent également se
former par
liaison hydrogène dans les duplex ADN -ARN ou ARN-ARN. L'appariement des brins
d'acides
nucléiques pour la mise en évidence d'une molécule d'acide nucléique est
communément appelé
"hybridation d'acides nucléiques" ou simplement "hybridation".
Par nouvelle VNTR on entend une région du génome non encore identifiée comme
telle, et
pour laquelle on ne dispose pas de sonde spécifique connue dans la
littérature.
La présente invention a pour objet un procédé de sélection et/ou d'obtention
de sondes
nucléiques capables de détecter de nouvelles VNTR dans le génome d'une espèce
donnée,
caractérisé par le fait
a) que l'on prépare un ensemble de fragments de restriction provenant de l'ADN
d'un
individu de ladite espèce, ledit ensemble étant obtenu, de façon connue en
soi, par hydrolyse d'un
échantillon contenant au moins une partie de l'ADN génomique dudit individu, à
l'aide d'au
moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante
du site qu'elle
reconnaît, puis séparation des fragments de restriction en fonction de leur
taille,
b) que l'on répète les opérations du paragraphe a) ci-dessus sur des
échantillons semblables
d'ADN génomique du même individu de façon à obtenir une pluralité de tels
ensembles de
fragments de restriction, .
c) que, par ailleurs, on prépare des sondes par hydrolyse enzymatique d'ADN
d'uné banque
génomique de ladite espèce à l'aide d'au moins une enzyme de restriction
coupant à une distance
sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation des
fragments de.restriction
obtenus en fonction de leur taille, sélection des fragments ayant une longueur
supérieure à 1.5 kb,
et marquage desdits fragments selon les méthodes connues, les fragments de
même taille
marqués ainsi obtenus constituant une sonde,
d) que l'on met en contact, dans des conditions d'hybridation, chacune des
sondes ainsi
obtenues avec l'un des ensembles de fragments de restriction obtenus au
paragraphe a) ou b) ci-
dessus,
e) que l'on sélectionne les sondes qui dans ces conditions sont capables
d'hybridation avec
des fragments de restriction, d'au moins une longueur déterminée, de
l'ensemble de fragments
avec lequel la sonde considérée a été mise en contact,
f), que l'on sélectionne en outre les sondes qui, avec un ensemble de
fragments de
restriction, obtenu comme au paragraphe a), d'ADN d'un individu de la même
espèce, ne donnent
pas des profils d'hybridation identiques à ceux obtenus, avec les sondes
connues
-3- 2334539
reconnaissant des VNTR, sur des ensembles de fragments de restriction obtenus
de façon
analogue et provenant du même individu,
g) et que, si désiré, on séquence et/ou synthétise etlou marque avec un
traceur, selon
les méthodes connues une sonde nucléique comprenant au moins une partie de la
séquence des
sondes ainsi sélectionnées.
Bien entendu, il est possible par utilisation de méthodes connues, y compris
celles
du paragraphe g) ci-dessus, de confirmer que la sonde nucléique obtenue par le
procédé de
l'invention reconnaît bien une VNTR. On trouvera plus loin dans la
description, l'indication
d'autres méthodes permettant d'obtenir une telle confirmation.
Selon un mode de réalisation du procédé selon l'invention, celui-ci comprend
après
l'étape e) deux étapes supplémentaires d') et e') consistant à répéter les
étapes d) puis e), mais
avec des ensembles de fragments de restriction obtenus à partir d'ADN d'un
individu autre que
celui dont provient l'ADN utilisé aux étapes a) et b). Parmi les sondes
capables d'hybridation
avec un ensemble de fragments de restriction provenant dudit autre individu,
on sélectionne,
après l'étape e'), celles qui donnent un profil d'hybridation différent de
celui obtenu avec les
fragments préparés à l'étapf: a) ou b).
L'enzyme de restriction utilisée dans le procédé selon l'invention est de
préférence
une enzyme qui reconnaît une séquence courte et donc fréquente dans le génome,
et possède
un site de restriction à distance constante ou quasi-constante du site
reconnu. PatTni les
enzymes possédant les propriétés requises, on peut citer notamment les enzymes
de classe IT,
c'est-à-dire coupant en un site spécifique à proximité du site reconnu ou
inclus dans le site
reconnu, et les enzymes de classe III, coupant en un site non spécifique mais
à une distance
constante ou quasi-constante, de l'ordre de 20 bases, du site reconnu. Parmi
les enzymes
utilisables, on peut citer par exemple Alu I, Hae III et Hinf I.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, les
hydrolyses
enzymatiques sont réalisées à l'aide de deux enzymes choisies parmi les
enzymes
précédemment citées.
La séparation des fragments de restriction en fonction de leur taille peut
être réalisée
par tout procédé connu, par exemple par électrophorèse.
Bien entendu, on entend par taille des fragments la longueur de ceux-ci,
exprimée en
nombre de nucléotides. Les fragments seront considérés comme de même taille si
par la mise
en oeuvre du procédé de séparation utilisé, lesdits fragments ne sont pas
séparés. Ainsi, par
exemple, lorsqu'on utilise comme procédé de séparation l'électrophorèse sur
gel d'agarose à
1%, des fragments seront~considérés de .même taille, si leurs longueurs ne
diffèrent pas de plus
3S de 50 à 100 bases environ.
Par banque génomique, on désigne tout mode de stoc(<age du génome d'un
individu,
ladite banque pouvant être partielle ou totale, c'est-à-dire contenant une
partie ou la totalité
dudit génome. Les banques génomiques utilisées se présentent notamment sous
forme de
microorganismes dans lesquels sont insérés selon les méthodes connues des
fragments du
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-4-
génome ou de la partie du génome à stocker. Parmi les
microorganismes coux-amment utilisés, on peut citer
notamment des bactéries, des virus et des levures. Les
fragments du génome à stocker sont insérés directement dans
le génome du microorganisme récepteur ou sous une forme
indépendante telle qu'un plasmide. L'utilisation de ces
banques permet, par culture préalable desdits
microorganismes, d'augmenter facilement le nombre de copies
du génome ou de la partie du génome à étudier. On extrait
L0 ensuite le matériel génétique recherché, selon les méthodes
connues.
Dans un mode de réalisation particulier, la
banque utilisée pour préparer des sondes selon le procédé
de l'invention Eest une banque génomique humaine, notamment
cosmidique. Parmi les banques génomiques humaines sous
forme de cosmides, on peut citer notamment les banques
commercialisées sous 1.a référence "HL 1145y" par la Société
Clontech, sous la référence "951202" par la Société
Stratagene Clonung System ou celle réalisée à partir du
20 vecteur Superco;~ I* de référence "961200" avec la lysat
d'encapsidation de référence "Gigpack II*" commercialisés
par la Société Stratagene Cloning System.
Selon un autre mode de réalisation, la banque
utilisée est uni=_ banque génomique de rat telle que celle
commercialisée sous la référence "RL1032m" par la Société
Clontech.
La banque utilisée peut être également une banque
génomique de poulet telle que celle commercialisée sous la
référence "951401" par la Société Stratagene Cloning
30 System.
* marques de commerce
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-4a-
Les abondes utilisées dans le procédé selon
l'invention peuvent être marquées par tout marqueur
classiquement utilisé.
Elles peuvent notamment marquées à l'aide d'un
traceur radioactif comme 32p~ 33g~ 125g~ 14C. Le marquage
radioactif peut être z-éalisé selon les méthodes connues.
Les ;séquences de nucléotides peuvent être
notamment marquées en (3') par addition soit d'un ou
plusieurs désox.yribonucléotides, soit d'un analogue de
1.0 nucléotide tel g:u'un didésoxynucléotide, marqué en position
alpha par le =s2p, en présence de la Desoxynucleotidyl
Terminal Transfe:rase; les séquences de nucléotides peuvent
également être r~larquées en (5') à l'aide d'une kinase, par
exemple la T4 Polynuc:Leotide Kinase; il s' agit dans ce cas
du transfert sur les polynucléotides du phosphate
radioactif d'un nucléotide marqué en position gamma. Les
séquences de nucléotides peuvent encore être marquées à
chaque extrémité par adjonction, en présence d'une ligase,
d'une séquence quelconque radiomarquée.
20 Les sondes peuvent aussi être marquées par
amorçage aléatoire ou encore lors de leur synthèse chimique
par incorporation d'un ou plusieurs ribonucléotides ou
désoxyribonucléotides radioactifs.
La méthode de détection de l'hybridation dépendra
du marqueur ra3ioactif utilisé et pourra reposer sur
l'autoradiograph:ie, la scintillation liquide, le comptage
de rayonnement gamma ou toute technique connue permettant
de détecter le rayonnement émis par le marqueur radioactif.
Un marquage non radioactif peut également être
30 utilisé, de façon connue en soi, par exemple en associant
aux séquences de nucléotides des substances présentant des
propriétés
_; _ 2134539
immunologiques, comme un antigène ou un haptène, ou présentant une affinité
spécifique pour
certains réactifs, comme un ligand, ou encore présentant des propriétés
permettant la
complétion de réactions enzymatiques, comme une enzyme ou un substrat
d'enzyme. Les
séquences de nucléotides peuvent être marquées par amorçage aléatoire, ou lors
de la synthèse
chimique, en incorporant un ou plusieurs ribonucléotides ou
désoxyribonucléotides marqués
non radioactivement. Le marquage non radioactif peut encore être réalisé par
incorporation à
l'extrémité (3') d'un ou plusieurs désoxyribonucléotides ou ribonucléotides,
ou d'un analogue
de nucléotide tel qu'un didésoxynucléotide comportant l'un de ces groupements.
Le marquage
peut aussi êae fait directement par modification chimique de
l'oligonucléotide, comme la
photobiotinylation ou la sulfonation, ou encore par fixation de colorants
spécifiques de l'ADN
qui sont fluorescents quand ils sont fixés, tels que les dimères d'oxazole ou
de thiazole orange.
11 peut également être réalisé par addition en (3') ou (S') de molécules
traceuses par réaction
chimique aprés synthèse ; les séquences de nucléotides peuvent encore être
marquées à chaque
extrémité par adjonction, en présence d'une ligase, d'une séquence quelconque
portant des
molécules traceuses. La méthode de détection et de révélation de
l'hybridation, réalisée de
façon connue en soi, dépendra évidemment du marqueur non radioactif utilisé.
Les conditions d'hybridation du procédé selon l'invention sont de préférence
des
conditions discriminantes, permettant ainsi d'augmenter la spécificité de
ladite hybridation.
Parmi ces conditions, on peut citer notamment une température comprise entre
60 et
75°C et en particulier comprise encre 6~°C et 70°C, une
concentration ionique comprise entre
0,3 et 1,2M et de préférence égale à 0,9 M en ions Na+. L'étape d'hybridation
proprement dite
est suivie de plusieurs lavages à 6~°C à l'aide d'un milieu à
concentration ionique plus faible
et en particulier comprise entre 0,015 et 0,15 M en Na+.
Par le procédé selon l'invention, on obtient pour chaque ensemble de fragment
un
2~ profil d'hybridation. Lorsqu'on obtient des profils d'hybridation
différents à partir des
ensembles de fragments de restriction d'un~même individu mis en contact d'une
part avec la
sonde obtenue par le procédé et d'autre pan avec les sondes déjà connues, on
peut conclure
que la sonde obtenue est nouvelle, c'est-à-dire qu'il s'agit d'une sonde
susceptible d'identifier
une VNTR non encore connue.
Lorsqu'on obtient des profils d'hybridation différents à partir d'ensembles de
fragments de restriction d'individus différents, mis en contact avec une même
sonde, cela
constitue une confirmation de la variabilité de la VNTR détectée. Pour cette
raison, les deux
individus testés sont de préférence non apparentés afin de diminuer la
probabilité de mettre en
évidence des allèles identiques.
Lorsque les profils d'hybridation obtenus sont identiques, c'est-à-dire
lorsqu'on
observe une hybridation sur des fragments de même taille, on ne peut conclure
à l'absence de
variabilité de la région détectée, car deux hypothèses sont alors à envisager
: soit la sonde
utilisée détecte effectivement une région ne répondant pas à la définition
d'une VNTR, soit la
sonde utilisée détecte bien une VNTR mais les deux individus testés présentent
des allèles
CA 02134539 2000-OS-08
-6-
identiques pour ladite région. Pour conclure, on peut alors
analyser un ensemble de fragments de restriction, provenant
de l'ADN d'un troisième individu, obtenu de façon identique
à celle utilisée pour les ensembles de fragments de deux
premiers individus, et, ainsi déterminer si la région testée
est variable ou non.
La présente invention a également pour objet les
sondes détectants de nouvelles VNTR pouvant être obtenues
par le procédé selon L'invention.
Parmi les sc>ndes selon l'invention, on peut citer
notamment:
- le;s nouvelles sondes obtenues selon le
procédé de l'in.vention au départ des banques génomiques
humaines commercialisées sous la référence "HL 1145y" par
la Société Clor..tech, sous la référence "951202" par la
Société Stratag~~ne Cloning System ou celle réalisée à
partir du vecteur Supercos I de référence "961200" avec le
lysat d'encapsidation de référence "Gigapack II*"
commercialisés par la Société Statagene Cloning Système et
notamment les sondes décrites dans la partie expérimentale
ci-après;
- le~~ nouvelles sondes obtenues selon le
procédé de 1 ' invent iorA au départ d' une banque génomique de
rat commerciali~:ée sous la référence "RL 1032m" par la
Société Clontech.
- Les nouvelles sondes obtenues selon le
procédé de l'invention. au départ de la banque génomique de
poulet commercialisée sous la référence "951401" par la
Société Stratagene Cloning System;
En particulier, la présente invention a pour
objet les nouvE~lles sondes caractérisées par le fait
*marque de commerce
CA 02134539 2002-03-12
-6a-
qu'elles contiennent une séquence d'au moins 40 nucléotides
choisie dans la séquence du génome humain contenue dans
l'une des cultures suivantes, dëposées à la Collection
Nationale des C.'ultures de Microorganismes (CNCM) à
l'Institut Pasteur le 30 juillet: 1993 sous les numéros:
- I-1343 pour le cosmide 15E5 contenant le
locus D1S339,
- I-344 pour le cosmide 32A8 contenant le
locus D11S1000,
- I-1345 pour le cosmide 33F4 contenant le
locus D8S358,
- I-1346 pour le cosmide 51A11 contenant le
locus D17S885, et
- I-1347 pour le cosmide 151A7 contenant pour
le locus D13S324,
lesdites sondes étant respectivement désignêes
sous les références "CEB88", "CEB41", "CEB42", "CEB49" et
"CEB69".
La présente invention a également pour objet les
sondes polynucléot.idiques synthétiques ou hémi-synthétiques
équivalentes aux nouvelles sondes obtenues par le procédé
selon l'invention, (c'est-à-dire des sondes présentant les
mêmes propriétés d'hybridation). On peut aussi préparer des
sondes modifiée:;, notamment des sondes d'acides
ribonucléiques, ou d'acides désoxyribonucléiques dont l'une
des quatre bases est modifiée, et en particulier remplacée
par une base telle que par exemple l'inosine.
L'invention s'étend donc. à toute sonde
polynucléotique nc~ se distinguant d'un sonde directement
obtenue par le procédé selon l'invention que par l'addition
et/ou la délétion
X134539
et/ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides, tout en conservant ,les
mêmes popriétés
d'hybridhtion avec la VNTR reconnue par ladite sonde directement obtenue par
ledit procédé.
On peut citer en particulier les polynucléotides dont la séquence est
identique à celle d'une partie
de la sonde initialement obtenue, mais est exempte de la ou des régions
bordant la VNTR.
Par région bordant, on entend les 200 nucléotides situés de part et d'autre de
la VNTR
proprement dite.
On peut bien entendu multiplier par amplification, selon les méthodes connues,
les sondes
capables de détecter des VNTR obtenues par le procédé de l'invention ou les
sondes équivalentes
telles que définies ci-dessus. La méthode d'amplification consiste par exemple
à utiliser une
première amorce complémentaire d'au moins une partie d'une séquence bordante
de la région
hypervariable, telle qu'elle peut être obtenue à partir des cosmides, et une
seconde amorce
contenant au moins une partie de la séquence de l'autre région bordante, puis
à mettre en oeuvre
un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérise, suivi d'un
processus de
dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extension-dénaturation, cette
méthode étant connue
sous le nom de PCR (brevets US n° 4 683 195, 4 683 202 et 4 800 159,et
EP n° 0 201 184), pour
obtenir un nombre suffisant de copies des sondes selon l'invention.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des sondes décrites
précédemment.
La présente invention concerne en particulier l'utilisation telles que
définies précédemment
dans des procédés de recherche de parenté, de dépistage de maladies tumorales
ou héréditaires,
ou d'identification d'un échantillon biologique.
Selon un mode de réalisation particulier, on utilise les sondes telles que
définies
précédemment, notamment chez les humains, dans un procédé de recherche de
parenté,
comprenant
- une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions
d'hybridation,
ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de
fragments de
restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un
individu testé, à l'aide
d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement
constante du site
qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur
taille.
- une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions
d'hybridation,
ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de
fragments de
restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un
second individu, dont
on veut déterminer s'il est parent dudit individu testé, à l'aide de l'enzyme
ou des enzymes de
restriction utilisées) à la première étape, lesdits fragments étant également
séparés en fonction
de leur taille, et
- une troisi8me dtape dans laquelle on compare la taille des fragments
s'hybridant
2134539
_g_
avec la ou lesdites sondes) chez les deux individus, étant entendu qu'il, y a
présomption de
parenté quand la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sondes)
est identique.
On peut conclure à l'existence d'un lien de parenté entre les deux individus,
lorsqu'un
nombre suffisamment représentatif de fragments s'hybridant avec des sondes
obtenues selon
l'invention ont la même taille.
On peut en particulier utiliser le procédé décrit ci-dessus pour une recherche
de paternité
selon la méthode décite par Alec Jeffreys (Highly variable minisatellites
and.DNA ftngerprints,
Biochemical Society Transactions, Vol 15, pp 309-317, 1987) ou par Wong et al,
(Characterisation of a panel of highly variable mirusatellites cloned from
Human DNA, Ann
Hum Génet 51, pp 269-288, 1987).
Ce procédé peut bien entendu être également appliqué à la vérification de
l'origine de toute
semence animale ou végétale.
On peut également utiliser les sondes selon l'invention d'un procédé de
dépistage d'un
dérèglement génétique associé à certains cancers ou maladies héréditaires.
Le processus de cancérisation s'accompagne parfois d'une instabilité génétique
générale
entraînant des mutations etlou des pertes de fragments chromosomiques,
notamment de
fragments porteurs de gènes antitumoraux. Cette instabilité générale peut se
traduire par une
modification du nombre de répétitions des motifs d'une VNTR, ou même par la
délétion d'une
VNTR.
La présente invention a donc en particulier pour objet (utilisation des sondes
telles que
définies précédemment dans un procédé de dépistage de maladies tumorales,
caractérisé par le
fait qu'il comprend
- une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions
d'hybridation,
ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de
fragments de
restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de, (ADN génomique des
cellules testées d'un
individu, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance
sensiblement
constante du site qu'elle reconnaît , puis séparation desdits fragments en
fonction de leur taille,
- une deuxième étape dans laquelle on met en contact dans des conditions
d'hybridation,
ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un second ensemble
de fragments de
restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de (ADN génomique de
cellules normales d'un
même individu, à l'aide de de (enzyme ou des enzymes de restriction utilisées
à la première
étape, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille,
et
-une troisième étape dans laquelle on compare, chez les deux catégories de
cellules le
nombre et Ia taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sonde(s),
étant entendu qu'il y a
présomption d'une maladie tumorale quand le nombre ou la taille des fragments
s'hybridant avec
la ou lesdites sondes) diffère.
Les sondes telles que définies selon (invention peuvent également être
utilisées
-~. 2134539
dans un procédé de dépistage de maladies héréditaires dans lesquelles on
observe des pertes de
fragments chromosomiques porteurs de VNTR, par exemple des microdélétions
télomériques
associées à un retard mental.
L'invention concerne ainsi l'utilisation de sondes telles que définies
précédemment,
dans un procédé de dépistage de maladies héréditaires, caractérisé par le fait
qu'il comprend
une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions
d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un
ensemble de
fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN
génomique de .
l'individu testé, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une
distance
sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits
fragments en fonction
de leur taille,
- une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions
d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un
second ensemble
de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN
génomique d'un
individu sain, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisées)
précédemment,
lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et
- une troisième étape dans laquelle on compare le nombre de fragments
s'hybridant
avec la ou lesdites sondes chez les deux individus, étant entendu qu'il y a
présomption de
l'existence d'une maladie héréditaire quand le nombre des fragments
s'hybridant avec la ou
lesdites sondes) diffère.
On entend ici par "individu sain" un individu ne présentant pas la maladie
héréditaire soupçonnée.
Les sondes selon l'invention peuvent être également utilisées pour déterminer
si un
échantillon biologique provient d'un individu donné. Cette utilisation est
particulièrement
intéressante lors d'enquëtes de police afin de déterminer si un échantillon
biologique provient
bien d'un individu soupçonné.
Selon ce mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc
l'utilisation des sondes telles que définies précédemment dans un procédé
d'identification d'un
échantillon biologique, par comparaison avec l'ADN d'un individu testé,
caractérisé par le fait
qu'il comprend :
- une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions
d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un
ensemble de
fragments de restriction, obtenu par hydrolyse de l'ADN dudit échantillon
biologique, à l'aide
d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement
constante du site
qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur
taille,
- une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions
d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un
second ensemble
de fragments de restriction, obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN
génomique de
l'individu testé, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restrictions
utilisées) à la première
CA 02134539 2000-OS-08
-10-
étape, lesdits fragments étant également séparés en
fonction de leur taille, et
- une troisième étape dans laquelle on compare
la taille des fragments s'hybridant avec lesdites sondes)
dans l'échantillon biologique et chez l'individu testé,
étant entendu qu'il y a présomption que l'échantillon
biologique provient de l'individu testé quand la taille des
fragments s'hyb:ridant avec la ou lesdites sondes) est
identique.
On peut alors conclure que l'échantillon
biologique provient de l'individu testé, lorsqu'un nombre
suffisamment représentatif de fragments s'hybridant avec
des sondes obtenues selon l'invention ont la même taille.
Le terme "échantillon biologique" désigne ici
tout échantillon dont on peut extraire l'ADN afin de
l'analyser selon le procédé précédemment décrit. Ce peut
être notamment un fragment de peau, de la salive, du
sperme, etc.
Le procédé décrit ci-dessus permet également de
vérifier, de façon analogue, si les cellules présentes dans
un échantillon biologique proviennent bien d'une lignée
cellulaire donné.°.
Les exemples suivant illustrent l'invention.
EXEMPL1~ 1: Procédé de sélection des sondes
capables de déte~~ter des yNTR
a) Préparation des sondes
On a utilisé une banque génomique cosmidique
commercialisée sous :1a dénomination "HL 1145y" par la
Société Clontech et ayant comme vecteur le cosmide pWE 15,
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dont on réali:~e une suspension à une dilution telle
qu' après étalement su:r milieu de culture solide LB-agar et
culture de 18 heures â 37°C, on puisse obtenir des colonies
isolées, constituées d'un seul clone.
Une fraction de chaque clone est ensuite inoculée
dans un puits d'une plaque à 96 puits, contenant un milieu
de culture de t~irpe "T'erific Broth" (TB) (sambrook, Fritsch,
Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harber Laboratory Press, 1989) et on laisse incuber
durant une nuit à 37°C. On réalise alors une réplique de la
microplaque sur une membrane commercialisée sous la
dénomination de "Hybond N+*" par la Société Amersham selon
le procédé décrit par le fournisseur. La membrane ainsi
obtenue est plagiée sur milieu de culture TB contenant de
l'ampicilline à environ 80 ~.1, maintenue une nuit à 37°C
puis fixée. On ajoute alors dans chaque puits de la plaque
un volume de glycérol à 50%, puis on congèle les plaques et
les stocke â une température de -80°C.
En parallèle, on réalise une miniculture de 2 ml
dans un milieu TB à partir d'une fraction de chaque
colonie. Lesdites minicultures sont mises à incuber durant
20 heures, à 37°~~ et sous agitation.
On réa:Lise alors des groupes provenant du mélange
de 24 minicultures correspondant à des clones inoculés sur
une même plaque multipuits. On extrait l'ADN cosmidique,
pour chaque groupie, selon les mêthodes conventionnelles.
Pour chaque groupe, l'ADN cosmidique extrait est
remis en suspension dans 300 ~,l de Tris 10 mM pH 7, 5 EDTA
1mM (TE). On prélève alors dans chaque groupe trois
fraction aliquotes de 50 ~.1, auxquelles on ajoute
* marque de commerce
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respectivement 7_es couples d'endonucléases de restriction
suivants (commercialisées par la Société Appligène):
- Alu I et Hae III
- Alu I et Hinf I,
- Hinf I et Hae III,
chaque enzyme étant une concentration de 20
unités environ peur un volume total complété à 10 ~.1.
Après une nuit d'incubation à 37°C, l'ADN
hydrolysé est précipité dans l'éthanol, séparé, puis remis
en suspension dans 5 ~.1 de TE .
On dépose les échantillons, ainsi que des
marqueurs de tailles, sur un gel horizontal d'agrose à 1%.
On fiat migrer :Les fragments par électrophorèse à environ
12 V/cm en tampon TAE 1X (Sambrook, Fristch, Maniatis,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Pres:~, 1989). Le gel est ensuite révélé au
bromure d'éthidi,~m.
Pour chaque groupe, et pour chaque hydrolysat,
les fragments sont découpés du gel et récupérés par
centrifugation.
Des 10 à 20 ~1 environ de suspension d'ADN ainsi
récupérés, on prélève 2 u1 que l'on marque au dCTP (32p)
selon la méthode décrite par Feinberg et Volgelstein (Anal,
Biochem, 132, 6-13, 1983) en utilisant le kit commercialisé
par la Société Boehringer.
On obt~_ent ainsi un ensemble de sondes marquées.
D'autrE:s ensembles de sondes marquées ont été
obtenus de façon analogue au départ de la banque génomique
humaine commercialisée sous la référence "951202" par la
Société Stratagene Cloning System utilisant également le
vecteur cosmidi<~ue pWE 15, et au départ d'une banque
CA 02134539 2000-OS-08
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génomique humaine réalisée dans le vecteur Supercos I* de
référence "961?00" avec le lysat d'encapsidation de
référence "Gigapack II*" commercialisée par la Société
Stratagene Cloning System.
b) Préparation des ensembles de fragments d'ADN
provenant des individus testés (blots)
On utilise L'ADN provenant des deux individus non
apparentés.
On réalise de façon telle que décrite
précédemment l'hydrolyse enzymatique de chacun desdits ADN.
On sépare selon le procédé décrit précédemment
les fragments obtenus, les dénature par de l'hydroxyde de
sodium 0,4N, puas on transfère les fragments simple brin
séparés sur une membrane commercialisée sous la
dénomination "HV:bound N+*" par la Société Amersham.
* marques de commerce
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c) 1-lYbridation
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Les hybridations par ransfert Southern blot ont été effectuées à 65°C
de la manière décrite
par Vergnaud et al, Electrophoresis, 12, 134-140, (1991).
On réalise une hybridation des blots obtenus pour chaque individu, avec chaque
sonde
obtenue ci-dessus.
En parallèle,on réalise avec chaque sonde une hybridation d'une réplique de la
plaque
multipuits correspondant à l'ensemble de sondes utilisées.
Les Mots et les répliques sont ensuite lavés et on soumet alors à exposition
un film de type
Kodak XAR S*à -80°C, par (intermédiaire d'écrans amplificateurs.
Lorsque les blots et les répliques sont lavés dans des conditions de moyenne
stringence
([Na+] = 0,1 S M), la durée de l'exposition est de quelques heures jusqu'à 12
heures .
Lorsque les blots et les répliques sont lavés dans des conditions de moyenne
stringence
puis relavés dans des conditions de forte stringence ([Na+] = O,O15M), la
durée de l'exposition
peut être plus élevée, par exemple 72 heures.
On obtient ainsi des représentations photographiques des hybridations
obtenues.
d) Analyte deÇ profils d'hvbridation obtenus
On compare un des profils d'hybridation obtenus, avec ceux obtenus pour le
même
individu avec les sondes connues. Lorsque ces profils diffèrent, la sonde mise
en évidence est
réputée nouvelle.
Si de plus on obtient, à partir d'une même sonde détenue par le procédé, des
profils
d'hybridation différents pour les deux individus, on peut conclure que la
sonde utilisée détecte,
sans nécessité de conftrmation supplémentaire, une VNTR.
On repère ensuite sur la réplique de la plaque multipuits, lé puits'
présentant une forte
hybridation avec la sonde utilisée pour les deux blocs, c'est-à-diré le puits
contenant le clone dont
un des brins de (ADN est complémentaire de ladite sonde.
On dispose alors, dans le puits correspondant de la plaque multipuits, d'un
clone permettant
de préparer à nouveau ladite sonde. .
Sur environ 5 000 clones d'une banque commerciale de cosmides de génome
humain,
analysés selon le procédé décrit ci-dessus, on a isolé environ cinquante
nouvelles sondes
détectant de nouvelles VNTR humaines.
Parmi ces nouvelles sondes, cinq sont désignées sous les référence "CEB88",
"CEB41",
"CEB42", CEB49" et "CEB69". ~ '
* marque de commerce
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Les cultures correspondantes ont été congelées puis déposées à la ÇNCM
respectivement
sous les'huméros I-1343, I-1344, I-1345, I-1346 et I-1347.
La proportion de cosmides contenant au moins une VNTR pour une banque
cosmidique du
génome humain complet est estimée à 2 ou 3 %. Le procédé décrit ici a permis
l'isolement d'une
VNTR pour cent cosmides. Ce procédé permet donc la mise en évidence d'au moins
30 à 50%
des séquences VNTR présentes dans la banque.
On a isolé selon le procédé décrit ci-dessus, des VNTR dans différents
génomes. C'est ainsi
que la validité du procédé décrit a été testée non seulement chez l'homme,
mais aussi chez le rat.
Par exemple, chez le rat, 10 000 clones environ ont été analysés, et une
centaine de VNTR ont
été isolées.
