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213~6~
PCT~94/~S89
)W094/~879
CLON~GE ET EXPRESSION DU GENE DE L'~NZYME MALOLACTIQUE DE
LACTOCOCCUS LAC~IS.
La présente Invention est relative au clonage
du gène de structure de l'enzyme malolactique de
Lactococcus lactis, à sa séquence nucléotidique complète
et à la séquence protéique déduite, ainsi qu'à des
fragments d'ADN portant la séquence codant pour ce gène.
Elle est relative également à l'expression de ce gène
dans différents h8tes procaryotes ou eucaryotes, et en
~ 10 particulier dans Saccharomyces et Schizosaccharomyces.
¦ La fermentation malolactique, fermentation
! secondaire gui est observée au cours du processus de
vinification en addition de la fermentation alcoolique
réalisée par des levures, consiste en la dégradation par
certaines bactéries lactiques de l'acide malique présent
dans les vins, en acide lactique et CO2. Les espèces
: bactériennes naturellement présentes dans la flore
fermentaire et responsables de la fermentation
: malolactique appartiennent aux genres Lactobacillus,
Leuconostoc et Pediococcus.
. Cette réaction présente deux avantages
~; principaux :
- Elle conduit à une désacidification du vin
par transformation d'un diacide (L-malate) en un
monoacide (L-lactate), dont les conséquences sont
¦ avantageuses au niveau organoleptique, pour la majorité
I des vins rouges et certains vins blancs,
- Elle permet la stabilisation microbiologique
du vin, et donc une meilleure conservation, par
utilisation d'un substrat fermentescible, ce qui empêche
1 des fermentations ultérieures par d'autres souches de
microorganismes indésirables. Enfin la fermentation
- malolactique peut avoir une; influence sur la ~ualité du
vin au niveau aromatique.
wo94n~879 213 9 ~ ~ ~ PCTn~g4/00589
Cette réaction pose toutefois un certain
nombre de problèmes, du fait de sa lenteur et de son
caractère incontrôlable.
La fermentation malolactique ne se produit
spontanément qu'à la fin du processus naturel de vini-
fication ; en effet, le pH, la teneur en éthanol et la
présence de S02 dans le vin ralentissent considérablement
la croissance des bactéries lactiques naturellement
présentes dans la masse fermentaire et responsables de la
fermentation malolactique. Pour tenter d'accélérer cette
fermentation, la techni~ue la plus couramment employée
réside en l'adjonction au milieu fermentaire, d'un
inoculat de bactéries lactiques.
Toutefois, cette technique ne résout pas
toujours les problèmes d'implantation des bactéries
lactigues, en raison de leur difficulté à s~adapter au
milieu vin. D~autre part, l'introduction de bactéries
lactiques revient à introduire, outre 1'enzyme
malolacti~ue dont llactivite est recherchée, de
nombreuses autres enzymes, dont l'action sur les-nombreux
substrats présents dans le vin, peut aboutir à une
évolution très difficilement contrôlable des qualités
organoleptiques du produit.
Il serait donc souhaitable d'avoir la possibi-
lité de mettre en oeuvre la fermentation malolactique defaçon à aboutir rapidement, et en éliminant des variables
incontrôlables, à une amélioration du produit obtenu.
Dans le but de mieux contrôler la fermentation
malolactique, `il a été proposé de cloner les gènes des
enzymes malolactiques des bactéries lactiques, de les
-i introduire et exprimer dans un microorganisme normalement
impligué dans la fabrication du vin, tel que
S. Cere~isiae.
WILLIAMS et al. ~App. Environ. Microbiol. 47 :
288-293 (1984)], ainsi que la Demande Européenne 103300
décrivent le clona~e d'un fragment d'ADN de 5 kb portant
~l Wog4~6879 21 3 9 S ~ ~ PCT~R~l/~589
le gène de 1'enzyme malolactique de L. delbruec~ii chez
S. Cerevisiae et chez E. coli.
Le gène de l'enzyme malolactique de L. oenos a
également été cloné chez E. Coli ~LAUTEN~CH et al.,
Microbiol., 39 : 29-39 (1984)].
Toutefois, les souches de microorganismes
transformés n'expriment le gène qu'à un taux très faible,
insuffisant pour permettre son utilisation dans la fabri-
cation du vin.
En outre dans les 2 cas, une instabilité de
1'ADN cloné chez E. Coli a été observée, allant même
jusqu'à entralner une perte complète du gène.
D'autre part une enzyme malolactique,
présentant une a~tivité d'un niveau comparable à celle de
l~enzyme malolactique des bactéries des genres
Leuconostoc, Pediococcus et Lact~acillus mentionnés plus
_ haut a récemment été purifiée à partir de
Lactococcus lactis. C'est une protéine d'environ 230 kDa,
i constituée de sous-unités d'environ 56 kDa. Son pHi est
d'environ 4,3, et son Km pour l'acide malique est
d'environ 10 à 12 mM. Sa séquence N-terminale a également
été déterminée ~RENAULT, Malolactic fermentation
Genetics and Genetic Engineering, GrM90, 6th
International Symposium on Genetics of Industrial
Microorganisms, Strasbourg (1990)].
A partir d'une préparation purifiée de cette
enzyme mal~lactique, les Inventeurs ont obtenu des
préparations d'anticorps polyclonaux spécifiquement
dirigés contre cette enzyme. Une banque d'ADN de
Lactococcus lactis a ensuite été réalisée dans le ~ecteur
~gtll, dans E. coli. Le criblage de cette banque avec les
anticorps obtenus a permis de cloner des fragments d'AD~,
qui représentent à eux tous 4.5 kb d'une même région
d'ADN génomique de Lactococcus lactis, contenant le gène
malolactique, et un fragment du gène de la malate
perméase, ces gènes étant organisés en opéron. Les
W094/26879 PCT~V4/~589 .-~
213966S
Inventeurs ont identifié un fragment d'ADN de 26~4 p~
incluant la totalité du gène de l'enzyme malolacti~ue, et
ont déterminé la séguence de ce fragment, ~ui est
représentée dans la liste des séquences en annexe sous le
numéro SEQ.ID.NO.1. En outre, 1'expression du gène
malolactique a été obtenue dans différents hôtes,
procaryotes et eucaryotes. Ainsi, 1'introduction du gène
malolactique de Lactococcus lactis dans E. coli, sous
contrôle de ses propres éléments de régulation ainsi que
- 10 1'expression dudit gène dans la le w re sous contrôle
d'éléments de régulation de levure font été réalisées.
La présente Invention a pour objet un fragment
d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend la
séquence du gene de 1'enzyme malolactique de Lactococcus
15 lactis.
¦ Par "séquence du gène de 1'enzy~e malolactique
de Lactococcus lactis" on entend en particulier la
~ séquence codante siétendant des nucléotides 466 à 2085
I (inclus) de la séquence SEQ. ID. NO 1 représentée dans la
liste des séquences en annexe, ainsi gue toute séquence
gui, compte tenu de la dégénérescence du code genétique,
code pour le même po~ypeptide ; cette définition comprend
I également les séguences portant des modifications
¦ mineures destinées à permettre une meilleure expression
du gène dans un hôte déterminé.
L~Invention englobe également des fragments
d'acide nucléique comprenant une séquence homologue ou
complémentaire de la séquence du gène de l'enzyme
malolactique de Lactococcus lactis, telle que définie ci-
30 dessus, ou d'un fragment d'au moins 10-mères,
~, préférentiellement au moins 20-mères, de ladite séquence,
et utilisables en particulier comme sondes pour la
localisation dudit gène et/ou comme amorces pour son
: amplification.
L'Invention a également pour objet des
cassettes d'expression, comprenant la sé~uence du gène de
~ W094/26879 21~ 9 6 ~ 5 PCTn~V4/~89
1~enzyme malolactique de Lactococcus lactis, sous
contrôle de séquences propres à réguler l'expression
dudit gène.
Par "sé~uences régulant 1'expression d'un
- 5 gène" on entend des séguences de typ,e promoteur et termi-
nateur actives chez l'hôte dans le~uel on souhaite
obtenir l'expression dudit gêne. Les promoteurs et
terminateurs de différents gènes peuvent être utilisés,
associés dans des comk,inaisons différentes.
Parmi les sé~uences utilisables pour obtenir
l'expression dans la levure du gène de l'enzyme
malolactique de Lactococcus lac~is, on citera, à titre
d'exemple non limitatif, les promoteurs et terminateurs,
connus en eux-mêmes, des gènes de 1'alcool-
deshydrogénase I (ArHI)~ de la phosphoglycérate kinase
(PGK), et de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
- (GAPDH).
Les cassettes d'expression conformes à
1'invention peuvent 8tre portées par des plasmides, ou
intégrées dans l'ADN chromosomi~ue de la levure'hôte.
L'Invention a égal~ment pour objet des vec-
teurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent
au moins un fragment d'ADN comportant la sé~uence du gène
de 1'enzyme malolactique de Lactccoccus lactis, tel que
défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la
présente Invention, lesdits vecteurs sont des vecteurs
d'expression, comprenant une cassette d'expression telle
que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la
présente Invention, lesdits vecteurs comprennent des
séquences de régulation actives dans la levure.
Avantageusement, les vecteurs conformes à
l'Invention sont des vecteurs navette, possédant égale-
ment une origine de réplication bactérienne et un mar-
W094/26879 PCT~41~589 ~~
.~13~6~
queur de sélection dans une bactérie (par exemple, gène
de résistance à un antibiotique).
Ces vecteurs pourxont être sélectionnés sur la
base de la nature et de la force des éléments régulateurs
qui entrent dans la cassette d'expression. On peut choi-
sir les promoteurs et terminateurs décrits plus haut, ou
toute autre séquence permettant de contrôler et de
réguler 1'expression d'un gène dans la lew re.
Un autre critère du choix des vecteurs réside
dans le nombre de copies de ceux-ci, qui est conditionné
par le choix de l'origine de réplication.
A titre d'exemple, un choix peut être fait
entre les vecteurs suivants :
. Vecteur réplicatif ~Y~p) à haut nombre de
copies, possédant comme origine de réplication dans la
levure une partie du plasmide 2~ endogène.
- - . Vecteur réplicatif tYRp) à haut nombre de
copies, possédant comme ori~ine de réplication une sé-
quence ARS chromosomique.
: 20 . Vecteur réplicatif (YLp) linéaire à haut
nombre de copies possédant des séguences télomérigues
comme origine de réplication.
. Vecteur réplicatif (YCp) à bas nombre de
copies, possédant une séguence ARS chromosomique et une
séquence centromérique.
Préférentiellement, les vecteurs conformes à
l'Invention comportent également des marqueurs de sélec-
tion dans la levure, tels gue des marqueurs
d'auxotrophie : URA3, LEU2, HIS3, TRPl, ADE, etc ...et/ou
des marqueurs de résistance à des antibiotigues (G418,
hygromycine B, chloramphénicol, phléomycine), à des
herbicides (sulfométuron methyl), au cuivre, etc...
Des vecteurs conformes à l'Invention, portant
le gène codant pour l'enzy~.e malolactique de Lactococcus
35 lactis peuvent atre introduits dans toutes souches de
le w re, par différentes techniques de transformation.
-~ wOg4/26879 213 9 ~ 6 5 PCT~4/~589
,
Parmi les techni~ues de transformation les
plus courantes utilisables on citera la techni~ue des
protoplastes, la technique de perméabilisation aux sels
de lithium et l~éle~troporation.
5Dans tous les cas, le procédé de cette
construction comprend les étapes suivantes :
- construct~.on d'une cassette d'expression
comprenant le gène de l'enzyme malolacti~ue et des
élements régulateurs de force variable i
10- introduction de cette cassette soit en mono-
copie, soit en multicopie dans la levure.
On peut également choisir d'intégrer le gène
de l'enzyme malolactigue de Lactococcus lactis, muni de
ses séquences de contrBle, dans le génome de la levure,
auquel cas on choisira par exemple un vecteur intégratif
(YIp) ne possédant pas d'origine de rép~ication dans la
- levure ; il est également possible d'intégrer ce gène en
utilisant d'autres te~hni~ues, par exemple la co-
transformation.
20Il est possible de moduler le taux d'expres-
sion du gène codant pour l'enzyme malolactique de
Lactococcus lactis, en jouant notamment sur le nombre de
copies du gene introduites dans la levure, et/ou sur la
force des éleme~ts de régulation qui y sont associés.
2~La présente Invention a é~alement pour objet
des souches de cellules eucaryotes ou procaryotes
transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au
moins un fragment d'ADN hétérologue portant au moins une
copie d'un gène codant pour l'enzyme malolactique de
30 Lactococcus lactis, sous contrôle de séquences régulant
1'expression dudit gène dans ladite cellule.
Selon un mode de réalisaSion préféré de la
présente Invention, lesdites cellules sont des cellules
de levure.
35Les souches de lew re conformes à l'invention
~rouvent de nombreuses applications dans l'agro-alimen-
W094/26879 2 1~ 9 6 6 5 pcTn~94l~s89
taire et en particulier dans le domaine de l'oenologie
pour accomplir la fermentation malolactique.
Selon une disposition préférée de ce mode de
réalisation, lesdites levures appartiennent au genre
Saccharomyces.
Selon une autre disposition préférée de ce
mode de réalisation, lesdites levures appartiennent au
genre Schizosaccharomyces.
Schizosaccharomyces est parfois utilisée en
oenologie pour sa capacité à dégrader le malate.
Cependant, son utilisation est limitée, car cette
dégradation qui est effectuée par la voie de l'enzyme
malique ne produit pas de lactate, mais de l'éthanol et
du CO2, ce qui entraîne une désacidification importante,
pouvant avoir des influences négatives sur les
caractéristiqùes du vin.
Des souches de Schizosacch~romyces obtenues
conf~onme'm#nt ~à l'Invention et~ exprimant le gène de
enzyme malolactique, réalisent la fermentation
20 ~malolactique~ avec dégradation du L-malate en L-lactate,
S~ et~ présentent ainsi l~avantage de permettre une
dés~cidificat~ion beaucoup moins importante que celle qui
résulte de la conversion malate/~thanol.
?~ Ces souches de Schizosacch~romyces peuvent
2~ avoir~ de~ nombreuses~ utilisations en oenologie ; elles
peûvent~être par exemple utilisées .
en co-culture avec une souche oenologique de
Saccharomyces cerevisiae ;
- en cellules fixées.
~- 30 ~a présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se
réfère à des exemples décrivant le clonage du gène de
1'enzyme malolactigue de Lactococcus lactis et son
expression dans des bactéries et des levures.
, ~ .
,~
, W094t26879 21 ~ 9 5 6 5 PCT~34/~89
. - M~tho~e~_
; L'enzyme malolactique a été puri~iée comme
décrit par RENAULT (1990, communication précitee) ; cf.
aussi C. ROULLAND, (DEA d'oenologie-ampélologie,
5 Septembre 1988, Université de Bordeaux II)
Les techniques générales de manipulation des
acides nucléiques et de clonage moléculaire auquelles il
est fait référence dans les exemples ~ui sui~ent sont
celles décrites par SAMBROOK et al.[ Molécular Cloning :
A Laboratory Nanual (second edition), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)~
EXEMPLE 1 - P~RIFICATION DE ~N~YX~LMA~U~ IO~E
Le protocole d~extraction est brièvement rappele ci-
après :
Sou~e - ~ond~tiona de ~ ur~
Lactococcus lac~is ~ IL 1441) est cultivé dans
-- le milieu suivant :
Extrait de levure 6 g
Tryptone 2 g
20 Glucose 15 g
Acide DL Maligue 15 g
K2HPO4 0~5 g
KH2P04 0,5 g
MgSO4 0,4 g
25 NaCl 0,02 g
FeSO4 0'004 g
MnSO4 0,02 g
H2O qsp 1 1
Le pH est ajusté à 5%. Le milieu stérile est
inoculé avec 10% (v/v) d'une pr~culture.
- Pr~arat~on ~'u~nK~ra~t brut ot do~a~es
Les cellules sont cultivées dans 3 litxes du
milieu ci-dessus à 28 C, pendant 24 heures, récoltées par
centrifugation à 1000 g pena~nt 10 mn à 4'C, et lavées 2
fois avec NaCl 0,9~.
-
WOg4/26879 ; PCTn~94l~589 ~'
2139S~
Le culot est repris dans 30 ml de tamponphosphate (0,1 M, pH 6,0). Les cellules sont broyées aux
ultrasons pendant 6 mn à 0C. Après centrifugation
(30 000g, 15 mn, à 4 C) le surnageant constitue l'extrait
brut.
Les protéines sont dosées par le BCA Protein
Assay Reagent (PIERCE).
L~acti~ité malolactique est mesurée par la
décarboxylation de l'acide malique suivie avec une
électrode à C02 (EISCHWEILER).
- Purif$cation de l'enz~me
Après traitement par la DNAse I (1 mg/ml et 15
mn d'incubation à température ambiantej, l'extrait brut
est soumis à une précipitation fractionnée au sulfate
d~ammonium (35% de saturation, puis 70%).
- Le surnageant de la précipitation à 70% n'a
pas~ d'activité. Le culot, repris dans 2 ml de tampon
phosphate 0,1 M pH 6,0, et ~ui contient toute l'activité
malolactique est déposé sur une colonne de filtration sur
gel ACA 34 ~ULTROGEL ; domaine de fractionnement de
20 000 à 350 000) de 40 cm de longueur et 2,6 cm de
diamètre, préalablement équilibrée par le tampon
d'élution : tampon phosphate O,01 N, pH 6,0, KCl 0,1 M.
L~élution est effectuée avec un débit de 18 ml/h. Le
volume des fractions collectées est de 2,4 ml.
Dans ces conditions les fractions les plus
actives correspondent aux fractions 50 à 54. Elles sont
rassemblées en vue dlune purification complémentaire par
électrofocalisation.
L'électrofocalisation est réalisée sur colonne LKB de
110 ml. Le gradient de pH est formé grâce aux ampholines
utilisées à 2% et stabilisé par un gradient de densité de
glycérol établi lors du remplissage de la colonne. La
fraction la plus active qui focalise au pH de 4,3, pHi de
la protéine, est récupérée, puis subit une étape
supplémentaire de purification par chromatographie
:~ W094126879 ~13 9 6 ~ 5 PCTn~941~589
d'échange d'ions (colonne échangeuse d'anions
SEPHAROSE Q, PHARNACIA).
L~élution est ef~ectuee par un gradient de 0 à
0,5 M NaCl, dans un tampon Tris-Hcl 50 mM, pH 7,6, EDTA
0,l mM, ~-mercaptoéthanol 1 mM .
La fraction renfermant l'acti~ité malolacti~ue
est éluée à une concentration en NaCl de 0,33 M. C'est
cette fraction qui est utilisée pour l'obtention
d'anticorps.
10 EXE~lPI.E 2 : OBTE~I.QN D ' *~TICOR~ POI~O~C DIRIGE:S
CONTR~S Il ' E:NZY~ ~AI.OI~C~TIQl~E D~S ~A~OCOCC~S l ACq~IS
Les anticorps ont été obtenus par injection à
deux lapins d~une partie de la préparation purifiée de
protéine malolactigue selon le protocole suivant :
- Injection sous-cutanée de 2 ml de solution
de protéine malolactique (l00 ~g dans tampon NaCl 0,3 M)
additionnés de 2 ml d'adjuvant de Freund complet.
- Deuxième injection 40 jours après, avec la
même quantité de protéine malolactique et 2 ml d'adjuvant
de Freund incomplet.
Le sang des deux lapins est récupé~é 12 jours
après la 2ème injection, laissé 24 h à 4-C pour permettre
la coagulation, centrifugé à l0 000 g pendant 10 mn à 4 ,
et le sérum récupéré est aliquoté et stocké à -20'C.
Les anticorps anti-enzyme malolactique ont
ensuite été testés par test ELISA réalisé sur les deux
sérums (appelés 120 et ll9) obtenus à partir du sérum des
lapins selon le protocole décrit par SANBROOK et
al.[(1989)]. Cette analyse a permis de déterminer gue la
dilution optimale pour 1'utilisation des anticorps était
de l/lOOOème.
La spécificité des anticorps a alors été
déterminée par transfert immunoélectrophorétique ~Western
blot).
Les protéines d'un extrait brut de r actococcus
lactis (préparé comme décrit à l'Exemple l) d'une part,
, -- = ,,,, ., . , ... . . .. . , ~ .
W094t2687~ 213 9 ~ ~ ~ pcTn~s4l~89 ~
et de la préparation purifiée d'enzyme malolactique
d'autre part, ont été séparées par électrophorèse SDS-
P~GE et transférées sur membrane de nitrocellulose.
Les anticorps polyclonaux obtenus sont alors
fixés sur la membrane et revélés par des anticorps anti-
lapin couplés à la phosphatase alcaline.
Le sérum 120 reconnait sur l'extrait brut et
sur la fraction purifiée, une bande ma~oritaire de poids
moléculaire environ 60kD correspondant à l'enzyme
malolactique, et plusieurs bandes contaminantes de poids
moléculaire inférieur.
En revanche, le sérum 119 reconnait sur la
fraction purifiée, comme sur l'extrait brut, une seule
bande, correspondant à l'enzyme malolactique ; ce sérum
très spécifique a donc été utilisé pour les expériences
ultérieures.
E$EMPLæ 3 : CONS~R~rION D~ na~ggE ~'E~ S~IO~ D'ADN
GENO~IO~E DE ~TQ ÇO~C~S ~aC~IS Da~ ~. COI I
a) Extra~tion ~ l'ADN ~o ~actococcus ~CtiB
La banque d'ADN génomique de Lactococcus
lactis a été réalisée dans le vecteur Agtll.
L'ADN gé~omique de Lactococcus lactis IL 1441
¦ a, dans un premier temps, été extrait et purifié. Pour
¦ cela, 500 ml d'une culture en phase exponentielle sont
¦ 25 centrifugés à 5000g pendant 10 mn. Le culot est repris
dans 5 ml de TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM pH 8) contenant
150 mM de NaCl et 1 mg/ml de lysozyme, et incubé lQ ~in à
37 C. 1 ml de SDS, 25% dans de l'EDTA, 0,1 M pH 8 sont
ajoutés et le mélange est incubé 15 min à 60'C. L'ADN est
purifié par deux extractions au ph~nol-chloroforme,
suivies de deux autres au chloroforme-alcool isoamylique
(24:1). Une purification finale est réalisée sur gradient
de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium.
Le bromure d~éthidium est extrait à l'alcool isoamylique.
Après dilution par 2 volumes d'eau, l'ADN est précipité
par 6 volumes d'éthanol. Le précipité est récupéré à la
w094l26879 213 9 6 3 5 PCT~4l00589
13
baguette et dissous dans 1 ml de TE. ~a concentration de
l~ADN en solution a été déterminee (1 ~g/~l) par mesure
de la DO à 260 nm.
~) Di~Q~ion ~ 1 ~ çtococ~u~ t~
125 ~g d'ADN de Lactococcus lactis sont
digérés partiellement par deux unités d'enzyme AluI et
deux unités de aeIII pendt~nt 35 min. à 37-C de maniere à
générer des extrémités à bouts francs. La digestion est
arrêtée par addition d'EDT~ à 0,1 M final.
L~ADN digéré est précipité par 1/20 vol
d'acétate de sodium 3 M et 2 volumes d'éthanol. Après
centrifugation, l'ADN est repris dans 300 ~l de TE et les
fragments séparés sur gradient de sucrose pendant 15
heures à 25000 rpm.
i5 Des fractions de 0,S ml sont récoltées et
analysées sur gel d'agarose 0,8%. La fraction contenant
- des fragments de 1,5 et 4 Kb est dialysée contre du TE
pendant 4 heures.
c) ti~atio~ ~ l'AD~ a~q~r~ au_v~eur ~g1
~0 Le vecteur ~gtll ~dérivé du bactériophage ~) a
été choisi pour réaliser la ban~ue d'expression. Le
principe de réalisation de la banque consiste à insérer
des fragments d'ADN dtans la région 3' de la phase codante
du gène de la ~-galactosidase, de façon à exprimer des
protéines hybrides sous contr81e du promoteur de la ~-
galactosidase.
Un kit de clonage dans ~gtII ~AMERSHAN), a été
utilisé selon le protocole preconisé par le fournisseur.
1 ~g d'ADN digéré (à bouts francs) et dialysé
comme décrit ci-dessus a été inséré dans le vecteur ~gtll
selon le principe suivant :
L'ADN est ligué à des adaptateurs
déphosphorylés possédant une extrémité à bout franc et
une autre extremité cohésive EÇQRI. Après élimination des
ad~ptateurs libres par purification sur colonne
d'exclusion, les fragments d'ADN ''adaptésll sont
W094l26879 213 9 6 S 3 PcTn~g4t~s89
phosphorylés et ligués aux bras du vecteur également
digérés par EcoR1 et déphosphorylés.
L'empaquetage in vitro des particules
phagiques est ensuite réalisé. La banque ainsi obtenue a
été titrée par infection de la souche bactérienne E. coli
1090 ~hSd (r~km+k~ lac U169, ProA+, lon~, araD139, StrA,
SupF, trpC22 : TnlO(pMC9)] par une fraction aliquote de
~ la suspension phagique, et les transformants sélectionnés
j sur milieu LB (bactotryptone 10 g/l, extrait de levure
¦ 10 5 g/l, NaCl 10 g/l) + ampicilline (5~ ~g/ml) à 43 C (pour
! induire la lyse bactérienne). Les plages de lyse sont
obtenues après 4h d~incubation.
La ban~ue ainsi obtenue représente environ 3
fois le génome de Lactococcus lactis .
EXEMP1E 4 : CR~BL~GE DE LA BANO~E D'ADN GENOMI~Y~
a) Etaleme~t~ LL ~ L Dr~ ation de~
filtres
75000 plages de lyse ont été obtenues par
étalement de la banque sur milieu LB+ ampicilline + MgC12
et incubation 3h30 à 43-C ~conditions de non-expression).
- Les boîtes sont recouvertes de filtres de nitrocellulose
(C extra, AMERSHAMt, imprégnés d'IPTG 10 mM et incubées
pendant 4 h à 37 C, de manière à induire l'expression.
Les filtres sont rincés dans du TNT ~Tris-HCl
10 mM pH 8, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05~), puis incubés
avec légère agitation 30 min à température ambiante dans
le même tampon.
Afin de limiter la détection de clones "faux
positifs" pouvant hybrider de manière non spécifique lors
~30 du criblage de la banque, une deuxième serie de filtres,
-iconstituant des doubles de la première serie, ont été
:déposés sur les boîtes, incubés et traités de la même
fa~on.
b? ~ ~ment ~u B~Um 112
Le criblage immunologique de la bangue est
réalisé à l'aide du sérum 119 préalablement épuisé contre
WO 94126B79 2 i 3 ~ 6 ~ 5 PCT/FRg4l0058g
j;,
les protéines de E. coli . L~épuisement du sérum est
effectué comme suit :
Une culture de E. coli Y1090 est réalisée dans
100 ml de LB + ampicilline pendant 24h à 37-C. La culture
est centrifugée à 5000 g pendant 10 min à 4 C. Le culot
est repris dans 3 ml de tampon (Tris 50 mM EDTA 10 ~M pH
8), et la suspension congelée à -20 C et décongelée
(plusieurs fois). Les cellules sont lysées complètement
par sonication à O C (six fois 20 secondes), puis
centrifugées à 12000 g pendant 10 min à 4 C. Le lysat est
récupéré et incubé 4h à température ambiante en présence
de 1 ml d~anticorps 119 dilué au 1/10 dans du tampon TNT
+ 1~ gélatine + 3% BSA + 5~ lait écrémé en poudre.
Le sérum épuisé est stocké à 4 C en présence
d~azide de sodium (0,05%).
,c) Criblaao immunQ}Q~ig~e ~e 1~ banQue
-Les filtres de nitrocellulose sont alors
inc-~bés en présence du sérum 119 épuisé comme décrit ci-
¦dessus, et la r~vélation des anticorps fixés est réalisée
¦~20 à l'aide d~anticorps anti-lapin couplés à la phosphatase
alcaline, comme d~crit precédemment.
Seuls les clones montrant un signal positif
¦sur les deux filtres ont été pris en considération. 24
clones positifs ont ainsi ~té sélectionnés.
25Afin de ~érifier la spécificité du signal
: obtenu, les clones positifs ont été sous-clonés et une
deuxième détection à l'aide des anticorps a été réalisée.
Autour de chaque plage de lyse positi~e, une carotte
d~agarose est prélevée et incubée dans 500 ~1 de tampon
30SM ~NaCl 6 g/l, MgS04 7H20 2 g/l, Tris base 6 g/l,
gélatine 0,01 ~ pH 7,5), pendant 2 heures à 4-C afin de
permettre la diffusion des particules phagiques. Cette
suspension est de nouveau utilisée pour infecter E. coli
1090 et le mélange étalé sur boîte LB + ampicilline +
MgCl2 comme précédemment, de façon à obtenir des plages
de lyses très isolées. Un deuxième criblage par le sérum
W094/26879 - ' - ' PCTn~94/~589 -!
2139~
16
119 réalisé comme pré~édemment a permis d'éliminer 14
clones sur les 24 testés, qui ne présentaient plus de
signaux significatifs. Les 10 autres clones, très
nettement positifs ont été sélectionnés.
d) Caractérisation d~ clone~ recombinant~
L'ADN phagique des 10 clones positifs a été
extrait et analysé. Une plage de lyse positive bien
isolée (sous-clone) a été systématiquement utilisée comme
matériel de départ.
L'ADN est extrait à partir des plages de lyse
confluantes sur boîtes LB + ampicilline. Les boîtes sont
recouvertes de 5 ml de tampon SM et agitées à 4-C pendant
2 heures. La suspension est récupérée, additionnée de
quelques gouttes de chloroforme, et centrifugée à 4000 g
¦ 15 pendant 10 min à 4 C pour éliminer les débris bactériens.
I L'ADN est extrait à partir de la suspension phagique
ainsi purifiée.
-;La première analyse a consisté à amplifier par
PCR les inserts portés par les phages recombinants pour
en déterminer la taille.
Deux oligonucléotides ~lambda gtll Primer
(forward) 24-NER et lambda gtll Primer (reverse) 24-MER,
j Société BIOLABS] correspondant à des séquences de la
¦ ~-galactosidase entourant le site de clonage E~RI ont
¦ 25 été utilisés comme amorces dlamplification des inserts.
¦ L~analyse des produits d~amplification sur gel
d'agarose (1,6%) a permis de déterminer gue les 10 clones
~gtll sélectionnés avaient des inserts de taille comprise
entre 2 et 3,5 kb.
Afin d'établir la carte de restriction des
fragments d'ADN clonés, les inserts des vecteurs ~gtll
ont été sous-clonés dans le plasmide pUC18 [YANISH-PERRON
et al. Gene n- 33, p. 103-119, (1985)]. Le sous-clonage
de 6 inserts a ainsi pu être obtenu.
La carte de restriction des 6 inserts a été
réalisée ; 5 des 6 inserts présentent une région commune,
` W094/26879 213 9 6 ~ 5 PCT~94/~589
suggérant que ces 5 inserts proviennent d'un même
fragment génomique. Ceci a été vérifié par hybridation de
- Southern de fragments de restriction d'ADN génomique de
Lactococcus lactis séparés sur gel d'agarose et
- 5 ~ransférés sur membrane de Nylon, avec les inserts
marqués radioactivement au 32p
Les cartes de restriction de 4 de ces 5
inserts sont représentées à la figure 1.
Les tailles des inserts représentés sont de 3
kb, 2,7 kb, 2 kb, et 3 kb. Ces inserts se chevauchant, la
taille totale de la région clonée est de 4,5 kb.
- Le 6ème clone, qui présente un insert ayant
une carte de restriction sans aucune similitude avec
celle des 5 autres clones, provient d'un fragment d'ADN
génomique différent.
Afin de déterminer si l'un des deux types de
- fragments d'ADN clonés contenait la région 5' du gène
codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis,
une hybridation de Southern des inserts séparés sur gel
d'agarose et transférés sur membrane de nylon, avec une
sonde d'oligonucléotides dérivés de la séquence protéique
de 1'extrémité NH2 terminale de l'enzyme malolactique (P.
RENAULT, communication précitée) a été réalisée. La sonde
choisie est un mélange d'oligonucléotides déduits de la
séquence incluant les 6 premiers acides aminés :
ATG~A,C)G(G,A,T,C)GC(G,A,T,C)CA(T,C)GA(G,A)AT
Les 5 inserts provenant d'un même fragment
d'ADN hybrident avec la sonde ; ce qui prouve que
1'extrémité 5' du gène codant pour l'enzyme malolactique
de Lactococcus lactis est contenue dans les 5 inserts
clonés. Par contre, aucune hybridation n'a été détectée
sur le 6ème clone.
e) ~ouence du clone P153A
La sé~uence nuciléotidique d'un des 5 clones
P153A présentant un insert de 2,7 kb a été déterminée par
la méthode de didéoxiterminaison sur un séquenceur
.
W094/26879 PCT~4/~589 -l
213~S5
18
Applied Biosystem. La séquence totale de l~insert est
représentée en annexe, sous le numéro d'identification
SEQ ID NO 1, ainsi que la séquence en acides aminés qui
en est déduite. La région codante du gène malolactique
est de 1620 nucléotides. Les 20 premiers acides aminés
déduits de la séquence nucléotidique obtenue sont
identiques à la séquence protéique déterminée à partir de
l'enzyme purifiée, à l'exception du 14ème acide aminé
(lysine au lieu de cystéine déterminée à partir de
l'enzyme purifiée). Cette phase ouverte de lecture est
susceptible de coder pour une protéine de 53 kD, ce qui
est tout à fait compatible avec la taille de l'enzyme
malolactique de Lactococcus lactis estimée par gel
filtration et par électrophorèse SDS-PAGE (environ 60kD).
15La séquence SEQ ID NO 1 comprend en outre 465
nucléotides en amont du codon d'initiation de la
traduction. Cette séquence comprend llintégralité du
promoteur du gène de l'enzyme malolactique. Les
! promoteurs de Lactococcus lac~is ont une taille de
¦ 20 l~ordre de 150 nucléotides en amont du codon
d'initiation. De plus, les signaux caractéristiques
, d~initiation de transcription des gènes de Lactococcus
¦ lactis sont présents.
En aval de la phase ouverte de lecture, 596
nucléotides ont éte séquencés, et une autre phase ouverte
de lecture de 581 nucléotides a été mise en évidence en
3 ' du gène malolactique dans un autre cadre de lecture.
La recherche d'homologies avec les gènes ou
- protéines connues a été réalisée par comparaison de la
3 0 séquence nucleotidique SEQ ID NO 1, et des séquences
- protéiques déduites avec des bases de données.
- En ce qui concerne la phase ouverte de
lecture de 1620 nucléotides, des conservations très
importantes en acides aminés et en nucléotides ont été
35 mises en évidence avec différentes enzymes maliques,
responsables de la décarboxylation du malate en pyruvate.
) W094/26879 213 ~ ~ 6 5 PCT~94/~89
19
D~autre part, une séguence consensus de
liaison du NAD a été retrouvée.
Ces homologies sont parfaitement en accord
avec la fonction de 1'enzyme malolactique, qui utilise,
comme l'enzyme malique, le malate comme substrat, et
exige du NAD pour la transformation du substrat en
lactate.
- En ce qui concerne le début de phase de
lecture identifiée en aval du gène malolactique, des
homologies en acides amines, également importantes (de
l'ordre de 40%) ont été identifiées avec des citrate
perméases. Il para~t extr^emement probable que cette phase
ouverte de lecture puisse correspondre à la région 5
d~une malate perméase.
- 15 Il apparaît donc gue sont presents sur le
fragment d~ADN séquencé le gène de structure codant pour
-- 1'enzyme malolactique, et une partie du gène de la ma}ate
perméase, et que ces gènes sont organisés en opéron.
~EMP~E 5 : E~R~SION D~ G~EE NAL~ 9: L 9l~ E. ~O~I
~'expression du gène malolactique a été
étudiée chez E. coli, chez diff~rents tranfoxmants de la
souche bactérienne ~H5a: pl53A (clone séquencé), p5A,
pl91A (voir cartes de restriction, Figure 1).~
Les transformants ainsi que la souche témoin
~5a transfolLl-ée par pUC18, ont été ensemencés dans une
gamme de milieux de culture à concentration croissante en
malate : 3 ml de milieu M9 (Na2HP04,7H20 6g/1, KH2PO4
3g/1, NaCl 0,5g/l, NH4Cl lg/l, glucose 4g/l), additionné
de thiamine lmg/l, acide aspartique 20mg/1 et
d'ampicilline 20mg/1, et contenant 0 ; 0,3 ; 0,5 ou 1% de
malate (p/v). Le milieu est tamponné à pH 6,5 par
addition d'acide citrique.
Les cultures ont ëté incubées à 37 C, avec
agitation, pendant 48h.
A titre de témoin, Lactococcus lactis a été
cultivé dans 8 ml de milieu M9 contenant 5g/l de UYEAST
.. . . . - -. . - . .. .
wO94n687g PCT~94/~589
2139S~S
EXTRACT" et la même gamme de malate. Les cultures ont été
incubées à 28 C, pendant 48 h, en anaérobiose.
Les cultures ont alors été centrifugées 10 min
à 4000g. Les surnageants ont été récupérés et testés pour
la présence de ~-lactate. Le dosage du L-lactate a été
réalisé à l'aide d'un kit (BOEHRINGER), selon le
protocole décrit par le fournisseur.
Les résultats, présentés dans le tableau I ci-
- dessous ~exprimés en g/l), montrent une production très
nette de lactate dans le surnageant de culture des
transformants pl53A et pl91A, alors qu'aucune trace de
lactate n~est détectée dans le surnageant de la souche
témoin (E. coli DH5 transformée par pUC18). Un autre
transformant, p5A, qui a été testé dans les mêmes
conditions, ne produit par contre pas de lactate. Ceci
s'explique par le fait que le gène malolactique porté par
- le vecteur recombinant p5A présente une extrémité 3'
i tronquée de 200 nucléotides. Cette région semble donc
essentielle à l'activité malolactique.
¦~ 20En absence de malate, il n'y a pas de
~-i- production significative de lactate dans le surnageant de
~, culture des transformants pl53A et pl91A, ni de la souche
i témoin transformée par pU~18. Ceci s'explique par le fait
¦ que E. coli ne produit pas de L-lactate dans ces
conditions de culture.
En présence de malate, aucune production de
lactate n'est observée pour la souche témoin. Par contre,
en ce qui concerne les transformants pl53A et pl91A, une
production significative de lactate est observée, en
présence de 0,1, 0,3, et 1~ de malate.
Le taux de lactate produit est assez faible si
on le compare à celui produit par la souche témoin de
L. lactis testée dans les mêmes conditions et à partir
des mêmes concentrations en malate. Cependant, il
3S convient de noter que la production de L-lactate dans L.
lactis correspond au L-lactate produit par fermentation
, W094/26879 213 9 6 S S PCTn$941~589
malolactique, et également a une proportion importante de
L-lactate prvduit par dégradation des sucres, via la
- L-LDH gui convertit le pyruvate en lactate.
D~autre part, il est difficile de déterminer
la part de malate qui est réellement disponible pour la
fermen~ation malolactique. En effe~, dans les conditions
de culture utilisées pour E. coli, une partie non
négligeable du malate peut être utilisé via le cycle
tricarboxyli~ue.
TABLEAU I
Souche bactérienne % malate dans le milieu de culture
0 0,3 0,5
. .
E. coli DH5a(pUC18) 0,001 0,017 0,008 0,015
. E. coli (pl53A) G,015 0,12 0,23 0,31
E. coli (pl91A) 0,017 0,17 0,15 0,2
Lactococcus lactis 2, 6 5, 09 8, 5
i EXEME~E 6 : EXPR~SSION D~ _G~E_ ~PLOL~ÇTIO~E DANS ~A
I Afin de réaliser l~expression du gène
malolactique cloné dans la le~ure, la région codante a
I été placée sous contrôle dléléments régulateurs
j (promoteurs et terminateurs) de lew re, dans des vecteurs
- navette levure/E. coli.
a) Introduction ~u ~ malolacti ~ ~ur le
Dl~smide multicoDie ~VT100-U
Le plasmide d'expression pVT100-U a été
utilisé. Ce plasmide contient l'origine de réplication de
levure 2~, le marqueur de sélection URA3 et les éléments
régulateurs forts ADH ~promoteur et terminateur de
l'alcool déshyrogénase I), ainsi que les éléments
bactériens (origine de réplication et gène de résistance
- à l'ampicilline).
Ce plasmide a eté décrit par VERNET et al
[Gene 52 ; 225-233, (1987)]
W094/26879 213 3 6 ~ S pcTn~s4l~589
22
La région codante du gène malolaetique a été
amplifiée par PCR à partir du plasmide plS3A, à l'aide
d'amorces constituées d'oligonucléotides d~rivés de la
séquence du gène malolactique. Afin de faciliter le
S clonage, l'introduetion de sites de restrietion 8hQI en
amont et ~aI en aval de la région codante a été réalisée
au cours des amplifications.
Les oligonucIéotides utilisés eomme amorees
sont :
- un oligonucléotide permettant d'isoler la
région eodante au niveau du eodon d'initiation de la
traduetion ATG (amoree 1) et eomportant un site ~hoI
- Du eôté 3l, l'oligonucléotide choisi ~amorce
3l) est localisé à quelques nucléotides en aval du codon
de terminaison de la traduction.
,
Les séquenees ainsi que les positions exactes
des amorees utilisées sont indiquées sur la figure 2.
- L~amplifieation a été réalisée de la manière
suivante :
amoree 1 4 ~l (30pmoles)
amoree 3 4 ~1(30pmoles)
Taq buffer lOX 10 ~l
~ Taq poly,mérase (S~/~l) 0,S ~l
-,~ ~ dNTP2~ 10 ~l
, ~ 25 MgCl2~25mM 6 ~1
plS3A 4 ~l (40ng)
H20 62 ~1
-i Conditions d'amplifieation : 30 secondes à
.,,, . I .
94 C, 30 seeondes à 40 C, 1 min à 72 C pendant 30 cycles.
30~ ~a taille des fragments amplifiés a ét~
vérifiée par analyse d'un aliquot sur gel d'agarose.
lOOng des fragments amplifiés ont été digérés
-- par ~hQI et 8kaI et ligués à 50ng de veeteur pVTlO0-U
préalablement digéré par ~hQI et ~aI et déphosphorylé.
Le veeteur pVT100-U obtenu, dénommé pMl, est
représenté à la figure 3.
:
2139~65
W094/26879 PCT~4/~589
23
La souche de levure Saccharomyces cerevisiae
- SCV5M a été transformée par le vecteur pM1.
La souche SCV5M a été déposée le 18 juin 1992
- 5 auprès de la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, sous le
numéro I-1222. Il s'agit d'une souche de laboratoire
haploïde, ura~, MATa, dérivée d'une souche oenologique.
La méthode de transformation utilisée est
celle de l'acétate de lithium décrite par ITO et al. [J.
Bacteriol. n- 153, pp. 163-168, tl983)1.
c) Obtention ~ la ferme~Sation malolac~iuue
dans la levure
Deux des transformants obtenus, dénommés
ScV5M/pMIa et ScV5M/pMIb ont été testés pour ~eur
capacité à réaliser la fermentation malolactique
- (con~ersion du malate en lactate) ; ces transformants ont
été cultivés dans les conditions suivantes :
- d'une part, sur milieu synthétique minimum
YNB (6,7 g/1 UYeast nitrogen base without aminoacid"
(DIFCO~, 20 g/l glucose) contenant 0, 0,6 ou 1% de
- malate, tamponné soit à pH 3, soit à pH 6 avec de l'acide
citrique (6,3 g/l).
- d'autre part, sur milieu synthétique mimant
la composition d'un moût de raisin, [SABLAYROLLES et
BARRE, Sciences des Aliments, n- 6, p. 373-383 (1986)],
tamponné à p~ 3,3.
Les deux milieux utilisés ne contiennent pas
d'uracile, ce qui assure une pression de sélectlon pour
les plasmides.
t Un transformant de ScVSM par le plasmide
pVT100-U ne contenant pas d'insert a été utilisé comme
témoin négatif.
CO~ CTIONS DE C~Tl~E ~$ D~: ~20SAGE:
8 ml de milieu sont ensemencés par les souches
de levures (transformants et témoin). La croissance est
W094l26879 PCT~R~4/00589
~13366~
24
réalisée dans des tubes stéxiles de 10 ml, à 28 C,
pendant 60 h, sans agitation.
Les cultures sont centri~ugées 5 min à 4000 g
et le surnageant testé pour la production de L-lactate en
utilisant un kit Boehringer, comme indiqué à 1'Exemple 5.
RES~ TS
Les résultats obtenus sont présentés dans le
Tableau II.
Sur milieu synthétique minimum YNB
(Tableau II~, en absence comme en présence de malate (0,3
et 1~), aucune trace de L-lactate n'est détectée avec la
levure témoin (ScV5M/pVTU). Ceci est tout à fait en
accord avec le fait que S. cerevisiae est incapable de
réaliser la transformation du malate en lactate, et gue,
d~autre part, en anaérobiose, elle ne produit que des
traces de l~ctate à partir du glucose, principalement
- sous forme de D-lactate.
Les souches transformées pMla et pMlb, en
l'absence de malate, produisent des traces de L-lactate,
de l'ordre d'une cinquantaine à une centaine de
milligr~mmes. Il est probable que cette légère production
provient de la conversion par 1'enzyme malolactique d~une
; partie du malate endogène de la levure, m~tabolisé à
partir du glucose. En présence de malate dans le milieu
de culture (O,6 et 1~ de malate), et dans les milieux YNB
tamponnés à pH 3, ou sur moût synthétique (pH 3,3, 3g~1
de malate), une production très significati~e de L-
lactate (de 0,5 à 0,7 g/l pour le clone pMla dans ces
conditions expérimentales) est observée.
La production la plus importante est o~ser~ée
sur moût synthétique dont la composition est très proche
de celle des moûts de raisin (0,7 g/l de L-lactate soit
7,7 ~moles/ml).
Dans les mêmes conditions de culture (YNB)
mais à pH 6, la production de L-lactate est très faible,
du même ordre de grandeur qu'en llabsence de malate. La
j wog4n6879 21~ 9 S 6 5 PCT~V4/~589
différence de production de L-lactate selon le pH du
milieu de culture pourrait s'expliquer par un problème de
perméation du malate chez S. cerevisiae à pH 6. ~ pH 3 ou
3,3, une grande partie du malate (pK 3,5) se trouvant
sous forme non-dissociée peut entrer à l'intérieur de la
cell~lle par simple diffusion. Par contre à pH 6 le
~ malate, principalement sous forme dissociée entrerait
I moins facilement à l'intérieur de la cellule.
Les souches recombinantes dégradent donc le
malate en lactate par fermentation malolactique, et avec
une efficacité plus grande à pH acide, donc en conditions
proches de celles de l'oenologie.
~1 ~
W094l26879 213 3 6 S 5 PCT~94/~S89
TABLEAU II : DOSA~E DU LACTATE CHEZ S. CEREVISIAE
. _ . .
Souches de levure L-lactate produi L-lactate produit
(g/1) (~mole/ml)
_ _
ScVRM/~VT100-~
- dans (pH = 3) :
0% malate 2,4.10-3 0,02
0,6% malate l 7.10-3 0,07
1% malate 9.10-3 0,1
- dans (pH = 6) :
0% malate 3.10-3 0,03
0,6% malate 6.10-3 0,06
1% malate 10.10-3 0,11
- Moût synthétigu
(pH = 3,3) 9.10-3 0,1
,
ScV5M/~Mla .
~ - dans (pH = 3) :
:~ 0% malate 0,15 1,66
::! o 6% malate 0,4 4,4
1% malate 0,52 5,7
~: - dans (pH ~ 6) :
!:~ o% malate 0,1 ~ 1,1
0,6% malate 0,07 0,77
1% malate 0,05 0,55
-~ 25 - Moût synthétiqu
. (pH = 3,3) 0,7 7,7
., , .
'.,
--
--`! WOg4~6~79 2 1 3 9 6 ~ ~ PCT~4/~589
TABLEAU II (suite~
_ _ _ . .
Souches de lew re L-lactate produit L-lactate produit
(g/l) (~mole/ml)
_ _ ~
Sc~5M/pMlb
- dans (pH = 3) :
0% malate 0,15 1,66
0,6% malate 0,40 4,4
1~ malate 0,48 5,3
- dans (pH = 6) :
0% malate 0,11 1,22
0,6% malate 0,08 0,88
1% malate 0,056 0,62
- Moût synthétique
(pH = 3,3) 0,51 5,66
_ ~
La même expérimentation a été effectuée sur moût
synthétique, et la production de lactate mesurée au bout
dè 10 jours de culture ; 1,5g/1 (soit 17 ~moles/ml) de
lactate ont été produits dans ces conditions.
EXEMPLE 7 : EXPRESSION D~ QE~ _ NALOLACTIO~E C~EZ
SC~I~OSA~C=~=~E
L'expression du gène malolactique a été
également étudiée chez Schizosaccharomyces pombe. Dans ce
but, la région codante du gene malolactique a été placée
sous contrôle d'un promoteur de S. pombe, dans un vecteur
navette S. pombe/E, coli.
a) Intro~uction ~u a~e malolacti~uq sur_le
Dlasmide mNlt$co~ie ~ARTl
Le plasmide d'expression pART1 a été utilis~.
Ce plasmide contient llorigine de réplication de levure
ARS1, le marqueur de sélection LEU2 et le promoteur de
1'alcool déshydrogénase de S. pombe, ainsi que des
éléments bactériens (origin~ de réplication et gène de
résistance à llampicilline).
W094/26879PCT~R941~589 ~-~
2139~65
28
Ce plasmide a été décrit par McLeod et al.,
(EMBO ~. 6; 729-736, 1987).
La région codante du gène malolactique a été
Iamplifiée par PCR à partir du plasmide pl53A, à l'aide
;5 d'amorces constituées d'oligonucléotides dérivés de la
séquence du gène malolactigue. Afin de faciliter le
clonage, l'introduction de sites de restriction ~EHI en
amont et SacI en aval de la région codante a été réalisée
au cours des amplifications.
Les oligonucléotides utilisés comme armorces
sont :
- un oli~onucléotide permettant d'isoler la
région codante au niveau du codon d' initiation de la
traduction ATG (amorce 12) et comportant un site ~HI
i 15 - du c8té 3~ oligonucléotide choisi (amorce
1 13) est localisé à quelques nucléotides en aval du codon
de terminaison de la traduction et comporte un site Sa~I.
Les séquences ainsi que les positions exactes
~ des amorces utilisées sont indiquées sur la figure 2
-~ ~ 20 L'amplification a été réalisée de la manière
;~ suivante :
~ . amorce 12 4~1 (2Opmoles)
:~ . amorce 13 4~1 (20pmoles)
. Taq buffer lOX 10~1
. Taq polymérase ~5UJ~1) 0,5~1
. dNTP 2~M 10~1
. mgC12 25mM 6~1
. pl53A 10~1 (lOOng)
. H20 65,5~1
Conditions d'amplication : 30 secondes à 94 C,
30 secondes à 37 C, 1 minute à 72 C pendant 30 cycles.
La taille des fragments amplifiés a été
vérifiée par analyse d'un aliquot sur gel d'agarose.
100 ng de fragments amælifiés ont été digérés
par ~mHI et ~acI et ligués à 50 ng de vecteur pAARTl
préalablement digéré par ~mHI et SacI et dephosphorylé.
'\ W094/~6879 213 9 ~ 6 5 PCT~94/~589
:, , . . ;
29
Le vecteur obtenu, dénommé pD4, est représenté
à la figure 4.
b) Tran~formatio~_9~L~ hv
Une souche S. pombe auxotrope pour la leucine
- 5 a été transformée par le vecteur pD4 et par le vecteur
pART1. I1 s'agi~ de la souche de laboratoire leul-32 h+,
gui a été fournie par J. KOHLI, Institute of General
Microbiology, Raltzerstrasse 4, C~-3012, Bern,
Switzerland.
La méthode de transformation utilisée est
celle de transformation à l'acétate de lithium adaptée de
ITO et al. [Journal of Bacteriology 153, 163-168,
(1983)].
c) Obte~tio~ ~ la ferment4~æn ~al~lactioue
aan~ s. T~O~
Un des transformants obtenus, dénommé Sp/D42 a
été testé pour sa capacité à réaliser la fermentation
malolactique (conversion du malate en lactate). Le
transformant a été cultivé dans les conditions
suivantes :
- sur milieu synthétique min~mum YNB contenant
50 g/l de glucose et 5,5 g/l de L-malate, tamponné soit à
à pH 3,~, soit à pH 6. Ce milieu ne contient pas de
leucine, ce qui assure une pression de sélection pour les
plasmides introduits.
Un transformant de la même souche par le
plasmide pART1 ne contenant pas d'insert a été utilisé
comme témoin négatif.
8ml de milieu sont ensemencés par les souches
de levure (transformant et temoin). La croissance est
réalisée dans des tubes stériles de 10 ml, à 40'C,
pendant une semaine, sans agitation.
~ es cultures sont centrifugées 5min à 4000g et
le surnageant testé pour la production de L-lactate en
utilisant un kit BOEHRINGER, comme indiqué précédemment.
La dégradation du L-malate a ét~ étudiée par dosage du L-
~ .
WO ~/2~79 213 3 5 ~ S ~CT~4/~589
malate residuel dans le milieu de culture à 1'aide d'un
kit BOEHRINGER.
Les résultats obtenus sont présentés dans le
tableau III ci-dessous.
Dans les différentes conditions de culture
testées, la levure témoin Sp/pART1 ne produit que des
I traces de L-lactate (de l'ordre de 20 à 40 mg/l). En
¦ effet, de même que S. cerevisiae, S. pombe est incapable
de transformer du malate en lactate, et, d'autre part ne
j10 produit que des traces de lactate en anaérobiose à partir
¦ du glucose.
!La souche transformée par le gène malolactique
(Sp/D42), en l'absence de malate, produit des quantités
très faibles de L-lactate (de l'ordre de 170 à 300 mg/1).
Cette légère production provient très problablement de la
conversion par 1'enzyme malolactique d'une partie du
malate endogène de la levure, métabolisé à partir du
glucose. Ceci a également été observé avec les
transformants de S. cerivisiae ~ tableau II). En présence
de 5,5 g/l de L-malate dans le milieu de culture, une
production très importante de L-lactate est observée pour
~le transformant Sp/D42, de 2,4 à 3 g/l selon le pH du
`~
milieu de culture. La production la plus forte est
observée à pH acide, donc en condition de pH proches de
celles de l'oenologie. La production obtenue à pH6 est
aussi très forte, comparativement à celle obtenue pour
les transformants de S. cere~isiae au même pH.
! D'autre part, en présence de 5,5 g/l de L-
malate et à pH acide, le transformant Sp/D42 est capable
de dégrader pratiquement tout le L-malate du milieu (à
! pH 3,5, seulement 150 mg/l de L-malate n'ont pas été
dégradés) et de plus, de convertir plus de 80~ du malate
présent en L-lactate (3,05 g/l).
~, WO 94/26879 213 9 S 6 5 PCT/ERg4/00589
TABL~DOSAGE DIJ ~ACTAq!~ Z S. PO~BE
_ _ _ . ~
Souches de levure L-Lactate L-Malate
produit (g/l) résiduel (g/l) :~
~ _ . ,_ ,,
Sp~ARTl
- dans (pH = 3,5)
0% malate ` non détecté
0,55% malate 0,04 1,4
- dans (pH = 6)
0% malate 0,02
0,55% malate 0,03 4,6
. _
Sp/D42
- dans (pH = 3,5)
0% malate - 0,17
0,55% malate 3,05 0,15
.
- dans ~pH = 6)
: 0% malate 0,3
0,55% malate 2,4 1,5
\
\
\
WO 94126879 PCT~R94/00589
2139G65 32
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NON: INSTITUT NATIONA~ DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
- I.N.R.A.
1 (B) RUE: 147, RUE DE h'UNIVERSITE
i (C) VILhE: PARIS
I (E) PAYS: FRANCE
! ( F) CODE POSTAL: 7534l CEDEX 07
(A) NOM: BARRE Pierre
(B) RUE: 90, RUE DES LAVANDES
(C) VILLE: SAINT GEhY DU FESC
~E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 34980
1 (A) NOM: DEQUIN Syl~ie
I (B) RUE: 7, RUE DU GENERAL RENE
(C) VILLE: MONTPELLIER
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 34000
(A) NOM: ANSANAY Virginie
~B) RUE: 60, COURS GAMBETTA
(C) VILhE: MONTPELLIER
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 34000
(ii) TITRE DE L' INVENTION: CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE L'ENZYNE
MALOLACTIOUE DE LACTOCOCCUS LACTIS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME LISI8LE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
~B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTENE D' EXPLOITATION: PC-DOS~MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn ReleAse #l.0, Version #1.2S (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 93 06003
(B) D~TE DE DEPOT: l8-MAY-l993
:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2684 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOhECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
~A) ORGANISME: Lactococcus lactis
:
2 1 3 ~ 5 ~ 5
O 94l26879 PCT~FR94/0Q589
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONEhhE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 466..2085
(D) AUTRES RENSEIGNE~ENTS: /product= ~ENZYME MALOhACTIQUE~ :
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONE~LE:
(A~ NOM/CLE: -35_signal
(B) EMPhACEMENT: 392..397
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELhE:
(A) NOM/CLE: -10_signal
(B) EMPhACFM~NT: 416..421
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TTTTGTTGAA AAAATTTCTA ATCAAATTAT TAACCTAAAA GATACATAAA TTTAAAAAAT 60
AAAA¢TAGAG TGATTTTACT CTACTTTTTT AGAATACTTT TATATAATAG GAAATATGAA 120
TAAAGCAAAG CGCACAATTT TGGTTTTATT TAAAAAAATG GATACCTTAG ATACACAACC 180
ACCATTGACA AAAAATCTTA ATCCTAAATT GGTTGAAACC CTGATAAATT AGGGATAGTA 240
ATAGGAGGAG GACAGTTTAT CA m AATAG TTATAAGCTA ATTTTTACTA CCATTTCTTT 300
GATTAATATC ATCTAT m T ATATAGAGAC TTTTAAATAA ACATTGACAT TA m ATGCG 360
:TTATA~ATTA AATTTATCAA CACTAAGGAA TTTGACTATA ACGATAAAAG AAGTTTATAG 420
TAATAAAGTA ATAA~CATTAA TTATAATTTT AATGGAGGTT GTACG ATG CGT GCA 474
Met Arg Ala
CAT GAA ATT TTA AAC AAT CCT m TTA AAT AAA GGA ACA GCT TTT ACT 522
His Glu Ile~Leu Asn Asn Pro Phe Leu Asn Lys Gly Thr Ala Phe Thr
5 10 15
ATG AAA GAC CGT CAA GAA TT~ GGG TT~ ATT GGT CTT CTT CCA CCA ACT 570
Met Lys Asp Arg Gln Glu Leu Gly Leu Ile Gly Leu Leu Pro Pro Thr
~ 20 . 25 ~0 ~5
GTT CAA ACA ATT:GAG GAA CAA GCT GAA CAA ACT TAC GAA CAA TAT TTG 618
Val Gln Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Gln Thr Tyr Glu Gln Tyr Leu
40 ~ 45 50
ACA AAA CCA TCT GAT TTA GAA AAA CGT CAT TTC TTG ATG GAA ATT TTT 666
Thr Lys Pro Ser Asp Leu Glù Lys Arg His Phe Leu Met Glu Ile Phe
55 60 65
AAT ACA AAC CGT ACT TTG TTT TAC TAC TTA TTC AAC AAA CAT ATT GTA 714
Asn Thr Asn Arg Thr Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Asn Lys His Ile Val
70 75 80
GAA m AAT CCA GTT GTT TAT GAT CCA ACA ATT GCT GAT ACA ATT GAA 762
Glu Phe Asn Pro Val Val Tyr Asp Pro Thr Ile Ala Asp Thr Ile Glu
85 90 95
AAC TAC AGT CAT TTG TTC GTA GAT CCA CAA TAT GCT GCT TAT CTT GAT 810
Asn Tyr Ser His Leu Phe Val Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Tyr Leu Asp
100 105 110 115
WO 94/26879 213 9 G ~ S PCT~R94/00589
ATT AAC CAC CCT GAA AAC ATT ACT GAA ACA TTG AAA AGT GCA GCA GGT 858
Ile Asn His Pro Glu Asn Ile Thr Glu Thr Leu Lys Ser Ala Ala Gly
120 125 130
GAC AGA GAA ATT CGT CCT ATT GTT GTA ACT GAT GCT GAA GGA ACC CTT 906
Asp Arg Glu Ile Arg Pro Ile Val Val Thr Asp Ala Glu Gly Thr Leu
135 140 145
. GGT ATT GGA GAC TGG GGA ACT CAA GGT GTT GAT ATC TCA GTT GGT AAA 954
Gly Ile Gly Asp Trp Gly mr Gln Gly Val Asp Ile Ser Val Gly Lys
150 155 160
TTA ATG ATT TAT ACA GCC GCA GCA GGT ATT GAT CCA GCG TCT GTA CTT 1002
Leu Met Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Ile Asp Pro Ala Ser Val Leu
165 170 175
CCA GTT GTT ATT GAT GCA GGG ACA AAT AGG AAA GGA CTT TTA GAA GAT lOS0
Pro Val Val Ile Asp Ala Gly Thr Asn Arg Lys Gly Leu Leu Glu Asp
180 185 190 lg5
CAT TTG TAT CTT GGA AAT CAT CAA GAA CGT ATT TAC GGT GAT CAA TAC 1098
His Leu Tyr Leu Gly Asn His Gln Glu Arg Ile Tyr Gly Asp Gln Tyr
200 205 210
.TAC AGT TTC GTC GAT CAA TTT GTA GAA ACT GCA GAA TCA ATT TTC CCT 1146
:~Tyr Ser Phe Val Asp Gln Phe Val Glu Thr Ala Glu Ser Ile Phe Pro
~215 220 225
.~
AAA TTG TAC CTT CAC TGG GAA GAT TTC GGA CGT TCA AAT GCT GCA ACA 1194
Lys Leu Tyr Leu His Trp Glu Asp Phe Gly Arg Ser Asn Ala Ala Thr
230 235 24C
ATT TTA AAT AAC TAC AAA ACA AAA ATC CCA ACA m AAT GAT GAC ATT 1242
Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Pro Thr Phe Asn Asp Asp Ile
245 250 255
CAA GGA ACT GGT ATT GTT GTT TTA GGT GGT ATT TTC GGA TCA CTT GAC 1290
Gln Gly Thr Gly Ile Val Val Leu Gly Gly Ile Phe Gly Ser Leu Asp
260 265 270 275
ATT ACA GGT GAA AAA TTA ACT GAT CAA GTA TAT CTT TGC TAT GGT GGT 1338
Ile Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asp Gln Val Tyr Leu Cys Tyr Gly Gly
280 285 290
IGGT TCA GCC GGT GCA GGG ATT GCT GGT CGT GTT CAT GCT GAA ATG GTT 1386
IGly Ser Ala Gly Ala Gly Ile Ala Gly Arg Val His Ala Glu Met Val
1295 300 305
',AGT GAA GGT CTT TCT GAA GAA GAA GCT TAC AAA CAT TTC TTC ATG ATT 1434
Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Tyr Lys His Phe Phe Met Ile
310 315 320
GAT CAA CAA GGT TTA CTT TTT GAT GAT ATG GAA GAC CTT ACA CCA GCT 148
Asp Gln Gln Gly Leu Leu Phe Asp Asp Met Glu Asp Leu Thr Pro Ala
325 330 335
CAA AAA CCA TTT GCT AAA AAA CGT GCT GAT TAT AAA GAT GCT GGA GAT 1530
Gln Lys Pro Phe Ala Lys Lys Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Ala Gly Asp
340 3~5 350 355
ATG ACT GAC CTT CTT AAC GTT GTT AAG ACA GTA AAA CCA ACT ATT TTA 1578
Met Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Lys Pro Thr Ile Leu
360 365 370
2I39565
WO 94l26879 PCT~R94/0058
GTA GGA ACT TCA ACT AAT CCA GGT GCC TTT ACA AAA GAA GTT GTT GAA 1626
Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ala Phe Thr Lys Glu Val Val Glu
375 380 385
GCA ATG TGT GCT AAT ACA GAA CGC CCA GTA ATC TTC CCT ATC TCA AAT 1674
Ala Met Cys Ala Asn Thr Glu Arg Pro Val Ile Phe Pr~ Ile Ser Asn
390 395 400
CCA ACT AAA AAA ATG GAA ACT ACA GCT GAA CAA GTT ATT GAG TGG TCT 1722
Pro Thr Lys Lys Met Glu Thr Thr Ala Glu Gln Val Ile Glu Trp Ser
405 410 415
GAT GGA AAA GCT TTT GTC GCT ACT GGT GTT CCT TCA GGA ACA ATC AGC 1770
Asp Gly Lys Ala Phe Val Ala Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr Ile Ser
420 425 430 435
TAC AAA GGT GTT GAT TAT CAA ATT GGT CAA GCA AAT AAC TCA CTT ATC 1818
Tyr Lys Gly Val Asp Tyr Gln Ile Gly Gln Ala Asn Asn Ser Leu Ile
440 445 450
CAC CCA GGT TTG GGC TTA GGA ATG TTG GCA TCT GAA GCA AAA CTT TTG 1866
His Pro Gly Leu Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Glu Ala Lys Leu Leu
455 460 465
ACA GAT GAA ATG ATC GGT GCA GCT GCA CAT TCA TTG AGC GGT TTA GTA 1914
Thr Asp Glu Met Ile Gly Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Gly Leu Val
470 475 480
GAT CCA GGT AAA CCA GGT GCT CCT GTT CTT CCT CCA TTT GAA TTT GTT 1962
- Asp Pro Gly Lys Pro Gly Ala Pro Val Leu Pro Pro Phe Glu Phe Val
485 490 495
GCT GAT GTA TCA ATT AAA GTT GCA GAA GCA GTT GCT AAG AAA GCT CAA 2010
Ala Asp Val Ser Ile Lys Val Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Ala Gln
500 505 510 515
GAA CAA GGT CTT ACT GAA TCT AAA GAA ACT GAT ATG GCT AAA GCA GTT 2058
Glu Gln Gly Leu Thr Glu Ser Lys Glu Thr Asp Met Ala Lys Ala Val
520 525 530
CGT GAT CTT AAA TGG TAT CCA GAG TAC TAAGGGGAAT ATCTTAAATG 2105
Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr
535 540
AAAAAACTTA AAGAAACGAA AATATCGGGA ATTAGTCTTC CCTTATATGC CTTTTTCGTA 2165
GCTGTCATCA TAGTTGTAAC ACTATTAGGA AAACTTCCAC TTGATATGGT AGGGTTAACT 2225
CTCCTACTTG TAACATTAGG CCACCTATTA TACTTCATAG GAGAAAAATT CCCTATTATG 2285
AATTCATACT TAGGTGGGGG ATCTGTTTTC ACTTTAATTG GTGCTACTCT ATTATCTTTC 2345
TTCCACATTG TTCCTTCAAA TGTTATTGGA GCAGTTTCCA ATTTTATGGG TGGAAAA m 2405
GGATTTCTTG ATTTTTATAT AGCTGCACTT ATCTGTGGAT CTATTTTAGG AATGAACAGA 2g65
AATCTTTTGG TTAAAGCTTC CAAGAAATTT ATTCCGATTG CTTTAATCAC TATGGTTATT 2525
GGTTTCTTCT CAGTAGGTCT TGTAGGAATG CTTATTGGTA ATGGATTTGC TGATTCTGTA 2585
ATGTATGTTT CTATGCCAAT GATGTCAGGT GGTATGGGAG CCGGAATTAC TCACTCTCTC 2645
AAATCTATGC AGCCGGATTG GCTCATGGAA ACCAAGCAG 2684
WO 94/26879 PCTn~94/00589
2139~6~
36
~2) INFORMATI~N POUR LA SEQ ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 540 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Arg Ala His Glu Ile Leu Asn Asn Pro Phe Leu Asn Lys Gly Thr
1 5 10 15
Ala Phe Thr Met Lys Asp Arg Gln Glu Leu Gly Leu Ile Gly Leu Leu
Pro Pro Thr Val Gln Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Gln Thr Tyr Glu
Gln Tyr Leu Thr Lys Pro Ser Asp Leu Glu Lys Arg His Phe Leu Met
Glu Ile Phe Asn Thr Asn Arg Thr Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Asn Lys
His Ile Val Glu Phe Asn Pro Val Val Iyr Asp Pro Thr Ile Ala Asp
Thr Ile Glu Asn Tyr Ser His Leu Phe Val Asp Pro Gln Tyr Ala Ala
100 , 105 110
Tyr Leu Asp Ile Asn His Pro Glu Asn Ile Thr Glu Thr Leu Lys Ser
115 120 125
Ala Ala Gly Asp Arg Glu Ile Arg Pro Ile Val Val Thr Asp Ala Glu
130 135 140
Gly Thr Leu Gly Ile Gly Asp Trp Gly Thr Gln Gly Val Asp Ile Ser
145 150 ` 155 16
Val Gly Lys Leu Met Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Ile Asp Pro Ala
165 170 175
Ser Val Leu Pro Val Val Ile Asp Ala Gly Thr Asn Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Leu Glu Asp His Leu Tyr Leu Gly Asn His Gln Glu Arg Ile Tyr Gly
195 200 205
Asp Gln Tyr Tyr Ser Phe Val Asp Gln Phe Val Glu Thr Ala Glu Ser
210 215 220
Ile Phe Pro Lys Leu Tyr Leu His Trp Glu Asp Phe Gly Arg Ser Asn
225 230 235 240
Ala Ala Thr Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Pro Thr Phe Asn
245 250 255
Asp Asp Ile Gln Gly Thr Gly Ile Val Val Leu Gly Gly Ile Phe Gly
260 265 270
Ser Leu Asp Ile Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asp Gln Val Tyr Leu Cys
275 280 285
-
2 1 ~ 5
WO 94/26879 PCT~R94/00589
Tyr Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ile Ala Gly Arg Val His Ala
290 295 300
Glu Met Val Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Tyr Lys His Phe
305 310 3~5 320
Phe Met Ile Asp Gln Gln Gly Leu Leu Phe Asp Asp Met Glu Asp Leu
325 330 335
Thr Pro Ala Gln Lys Pro Phe Ala Lys Lys Arg Ala Asp Tyr Lys Asp
340 345 350
Ala Gly Asp Met Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Lys Pro
355 360 365
Thr Ile Leu Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ala Phe Thr Lys Glu
370 375 380
Val Val Glu Ala Met Cys Ala Asn Thr Glu Arg Pro Val Ile Phe Pro
385 390 395 400
- Ile Ser Asn Pro Thr Lys Lys Met Glu Thr Thr Ala Glu Gln Val Ile
405 410 415
Glu Trp Ser Asp Gly Lys Ala Phe Val Ala Thr Gly Val Pro Ser Gly
420 425 . 430
Thr Ile Ser Tyr L~s Gly Val Asp Tyr Gln Ile Gly Gln Ala Asn Asn
435 440 445
Ser Leu Ile His Pro Gly Leu Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Glu Ala
450 455 4bO
Lys Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Gly Ala Ala Ala His Ser Leu Ser
465 470 475 480
Gly Leu Val Asp Pro Gly Lys Pro Gly Ala Pro Val Leu Pro Pro Phe
485 490 495
Glu Phe Val Ala Asp Val Ser Ile ~ys Val Ala Glu Ala Val Ala hys
500 505 510
~ys Ala Gln Glu Gln Gly Leu Thr Glu Ser Lys ~lu Thr Asp Met Ala
515 520 525
Lys Ala Val Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr
530 535 540
