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POLYPEPTIDES A ACTIVITE ~MIDASE, OUTILS GENETIQUES ET MICRO-ORGANISMES
HOTES PERMETTANT LEUR OBTENTION.
SDO M AI ~ TECHnNIOlnE:
Le domaine de l'invention est celui de la production enzymatique de
dérivés carboxyliques (carboxylates) à partir de composés contenant des groupements
amides.
10La présente invention concerne de nouveaux polypeptides présentant une
activité amidase, le matériel génétique impliqué dans leur production, ainsi que les
micro-org~nicmçs contenallt ce matériel génétique et présentant cette activité.
L'invention a ég~lement pour objet un procédé d'hydrolyse enzymatique
d'amides en carboxylates dans lequel on met en oeuvre ces nouveaux polypeptides
15ou des micro-org~ni~m~s les synth~,ti~nt, dont, not~mm~-nt, les susdits micro-org~ni~mes hôtes.
Sans que cela ne soit limit~tif, les ~mities, auxquels on s'inléresse plus
particulièrement dans le cadre de l'invention, sont: le cyano-5 valéramide,
ir~mide ou l'adipamate d'un cation quelconque, de ~ Çerence choisi parmi la
20liste de composés suivants: alcalins, alcalino-terreux, amines, ammonium, ce dermer
composé étant particulièrement préféré. Le but visé est la transformation
enzymatique des fonctions amides en fonctions carboxylates, de manière à obtenirin fine l'acide 5-cyanovalérique, l'acide adipique ou des sels de ceux-ci, e. g.: 5-
cyanovalérate d'ammonium, adipate de diammonium.
25Tout l'intérêt indll~triel des ~riip~t~s, et en particulier, de l'adipate
d'ammonium, réside dans le fait qu'il constitue l'une des bases fondamentales pour
la fabrication du nylon-6,6.
S'agissant des S-cyanovalérates, ils sont susceptibles de constituer des
produits de départ de choix, pour la ~Jri;l,al~tion de caprol~e-t~me, donnant lui-même
30accès au nylon-6.
L'action de ces amidases s'intègre dans un schéma connu de synthèse
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~1~37~3 2
enzymatique d'adipate de diammonium, à partir d'un dinitrile, à savoir l'adiponitrile.
Ce schéma est le suivant:
,NC--R--CN
Ni / ~ NH \
NC--R--CONII
A ~ ~ NH~
NC--:~--COO~,+ H.NOC--R--CONH,
NH ~ ~ A
H2NOC--R--COO~I+
Ni \ ~ A / A
+4HN-OOC--R--COO~H4
NH = nitrile hydratase,
lS Ni = nitrilase,
A =~mid~ce,
R = (CH2)n, n étant un nombre entier égal à 4 dans le cas de composés
adipiques.
ART ANTERIEUR:
Un tel schéma est resté pendant longtemps uniquement d'intérêt
théorique, car on ne conn~i~s~it que l'~mi~l~ce à activité générale de Brevibacterium
R 312, décrite not~mmt?nt dans les articles suivants:
25 - ARNAUD et al., "Etude de l'activité amidasique de quelques bactéries", FOLIA
MICROBIOLOGICA, 1976, 21, pages 178-185,
- MAESTRACCI et al., "Utilisation d'une ~mi~ce à activité générale pour la
bioconversion des amides en acides organiques", Microbiologie - aliments -
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nutrition, 1986, vol. 4, pages 19-24.
Selon ces auteurs, une telle ~mitl~e est apte à hydrolyser l'~dip~mide en
acide adipique (ou adipate d'ammonium).
En fait, il a été démontré, par la suite, notamment par la Demanderesse,
que l'activité, vis-à-vis de l'~-iir~mide, de cette amidase à activité générale est
extrêmemetlt faible, voire nulle et ce, que l'on utilise l'enzyme issue de
Brevibacterium R 312 ou celle issue d'un micro-organisme recombinant comprenant
le gène d'expression de cette enzyme.
Cette absence d'activité enzymatique de l'amidase à activité générale se
vérifie, également, pour les substrats amides se présentant sous forme de sels
solubles dans l'eau.
La faisabilité industrielle de la synthèse enzymatique d'~lip~tes, en
particulier de diammonium, ou d'acide adipique à l'aide d'~mifl~es n'a pu être
envisagée qu'à partir du moment où la Dem~nde-resse a pu mettre en évidence des
polypeptides exprimés par Brevibacterium R 312 et Rhodococcus et caractérisés,
not~mmer~t, par une activité ~mi~ e, dite énantiosélective, c'est-à-dire qu'ils sont
capables d'hydrolyser énantiosélectivement des racémiques d'amides en un acide, soit
de forme S, soit de forme R. Cela concerne particulièrement les aryl-2
propionamides et les aryloxy-2 propionamides racémiques.
En isolant, purifiant et caractérisant ces amidases "énantiosélectives", il
a été possible de proposer un procédé de synthèse enzymatique d'adipate
d'ammonium présentant des rendements améliorés.
C'est ce que décrit la demande de brevet FR 90-14 8S3.
Outre ces nouvelles amidases, cette demande de brevet décrit également
les outils de génie génétique pour les produire: séquences d'ADN, recombinées ounon, c~ettes d'~ cssion portant cette séquence et micro-organismes naturels ou
recombinés contenant ces ç~ettes d'exples~ion.
Bien que con~tit~l~nt un progrès technique notable, ces amidases
"énantiosélectives" souffrent, néanmoins, d'un handicap, déjà signalé pour les
~mi~ es à activité générale, qui est d'avoir une capacité d'hydrolyse des amides se
~,i;sent~t sous forme de sels solubles dans l'eau, e. g. adipamate d'ammonium
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inférieure à celle qu'elles ont vis-à-vis des amides peu ou pas solubles dans l'eau,
tels que l'adipamide.
Or, il est bien connu qu'une telle propriété de solubilité des substrats est
tout à fait souhaitable, au regard de l'amélioration de la faisabilité et de la rentabilité
5 d'une synthèse enzymatique industrielle.
Ainsi, l'un des objectifs es~çntielc de la présente invention est de
proposer de nouvelles enzymes à activité amidasique, un matériel génétique
permettant leur production et des micro-organismes contenant ce matériel génétique
et permettant cette production, lesdits enzymes et micro-organismes se caractérisant,
10 à la fois, par des rendements s~ti.cf~i.c~ntc de production de carboxylates à partir de
substrats de type amide de natures diverses (mono ou ~ mi(lçs) et par une activité
~mitl~ique, vis-à-vis des sels solubles d'amides, importante et industriellementintéressante.
Après de nombreux essais et recherches, la Demanderesse est parvenue
15 à atteindre, entre autres, cet objectif en isolant, purifiant et caractérisant de nouvelles
enzymes aptes à hydrolyser les amides en carboxylates avec de fortes activités et en
transformant, préférentiellement, des sels solubles d'amides, lesdites enzymes étant
utili~es, soit telles quelles, soit, et de préférence, sous la forme de micro-
organismes recombinés les générant.
EXPOSE DE L'INVENTION:
La présente invention a donc pour objet de nouveaux polypeptides ayant
une activité amidase, capables d'hydrolyser les amides en carboxylates et possédant
25 une activité enzymatique vis-à-vis de l'~lip~m~te d'ammonium supérieure à celle
qu'ils ont vis-à-vis de l'~ip~mide.
L'un de ces nouveaux polypeptides a été isolé à partir d'une souche de
Comamonas testosteroni NI 1. Plus précisément, ce polypeptide est préparé par
extraction et purification à partir de cultures de micro-organismes naturels ou
30 recombinants, la purification étant réalisée par une succession d'étapes consistant à
préparer un extrait enzymatique à partir de la culture cellulaire, à précipiter cet
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s
extrait avec du sulfate d'ammonium et à le purifier par différentes étapes de
chromatographie et filtration sur gel. Ces étapes, qui font appel à des techniques bien
connues de l'homme du métier, sont décrites en détail dans les exemples illustratifs
ci-après.
Par activité ~mi~e, on désigne, dans le présent exposé, l'hydrolyse
enzymatique d'un amide, tel que le cyano-S valéramide, l'~-lip~mide et l'~-lip~m~te
d'un cation Z, en un carboxyle, à savoir, respectivement, le cyano-S valérate de Z,
l'adipamate de Z et l'adipate de Z. Le cation Z peut être quelconque, mais on lechoisit, de l~lcfe~ ce, parmi les composés suivants: alcalins, alcalino-terreux,amines, ammonium, ce dernier composé étant particulièrement préféré.
Il est du mérite de la Demanderesse d'avoir pu isoler ces nouveaux
polypeptides et d'avoir pu mettre en évidence leur utilisation p~ri;lc~lltielle de
substrats sous forme de sels solubles dans l'eau, tels que l'~lip~m~te, par exemple
d'ammonium, plutôt que de substrats non ioniques, insolubles ou faiblement solubles
dans l'eau, tels que l'~lir~micle.
Cette caractéristique se vérifie aussi bien pour les enzymes sous forme
pure que pour les germes naturels ou recombinés exprimant ces enzymes.
Parmi les polypeptides à activité ~mi~ e conformes à l'invention figure
un polypeptide se caractérisant par la séquence peptidique, telle que repl~selltée à la
fig. 1 (SEQ ID: 1 de la liste de séquences annexée).
Un autre objet de l'invention est relatif à une séquence d'ADN codant
pour un polypeptide ayant une activité amidase, capable d'hydrolyser les amides en
carboxylates, et choisie parmi la liste de séquences suivante:
- la séquence d'ADN, telle que représentée à la ~lg. 2 (SEQ ~D: 2 de la liste deséquences annexée), et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase,
- un analogue de cette séquence résult~nt de la dégénérescence du code génétique7
- - une séquence d'ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou un fragment de
celles-ci et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase,
Les polypeptides résultant de l'expression de l'une des séquences d'ADN
ci-dessus sont compris dans le champ de l'invention .
Le micro-organisme sauvage Com~nonas testosteroni NI 1, isolé par la
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Demanderesse, contient l'une des séquences ci-dessus dans son génome.
Conformément à l'invention, il a été possible d'accéder à l'i~lentific~tion
de ces séquences d'ADN par la méthode bien connue du clonage du fragment d'ADN
génomique codant pour le polypeptide dont la séquence peptidique est représentée5 à la fig. 1, à l'aide de sondes nucléotidiques élaborées à partir du polypeptide
puriflé.
L'invention concerne, également, les cassettes d'expression qui portent,
avec les signaux assurant son expression, l'une des séquences d'ADN définie
précédemment. Ces c~sett~s d'expression peuvent être, soit naturellement présentes,
10 soit intégrées dans le génome de l'hôte ou loc~ ées sur un vecteur d'expression, tel
qu'un pl~mide contenant, de plerelt;llce, un moyen de sélection.
Ces c~ettes d'expression comportent, notamment, des régions
d'initiation de la transcription et de la traduction, qui conti~nnçnt une séquence
promotrice et un site de fixation des ribosomes. Ces régions peuvent être
15 homologues ou hétérologues du micro-org~ni~me produisant naturellement le
polypeptide.
Le choix de ces régions dépend, not~mmçnt de l'hôte utilisé. En
particulier, lorsqu'il s'agit de micro-org~ni~m~s hôtes procaryotes, le promoteur
hétérologue peut être choisi parmi les promoteurs bactériens forts, tels que le
20 promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp de Escherichia coli, le promoteur de
l'opéron lactose Plac de E. coli, le promoteur droit du phage lambda PR. le
promoteur gauche du phage lambda PL. les promoteurs forts de Pseudomonas et
Comamonas, les promoteurs forts de Corynébactéries. Plus particulièrement, dans
le cas du promoteur droit du phage lambda, la forme thermosensible PRClts est
25 préférée.
Dans le cas des micro-org~ni~mes eucaryotes, tels les levures, les
promoteurs peuvent être ceux des gènes glycolytiques de levure, tels les gènes codant
pour la phospho-glycérate kinase (PGK), la glycéraldéhyde-3-phosphate
déshydrogénase (GPD), ou bien encore des gènes codant pour la lactase (LAC4),
30 l'énolase (ENO).
Concernant les sites de fixation des ribosomes, celui dérivé du gène CII
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de lambda, ainsi que ceux dérivés de gènes de Comamonas ou Pseudomonas ou ceux
dérivés de gènes de Corynébactéries sont utilisés pl~re,elltiellement lorsque le micro-
org~ni~me hôte est procaryote.
Une région, permettant une termin~i~on de la traduction et de la
5 transcription fonctionnelle de l'hôte envisagé, peut être positionnée en 3' de la
séquence codante.
Avantageusement, la cassette d'expression peut co""~re;ndre, également,
un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte recombinant. Les
marqueurs préférés sont des marqueurs domin~nt~, c'est-à-dire conférant une
10 résistance à des antibiotiques comme l'ampicilline, la tétracycline ou la
streptomycine ou à d'autres produits toxiques pour les bactéries.
Il est à noter que l'amidase selon l'invention constitue déjà, en elle-
même, un marqueur de sélection pour l'hôte qui les contient.
L'invention a ég~lement pour objet les micro-or~nicmes contenant la
15 séquence d'ADN selon l'invention, ainsi que ceux aptes à produire au moins unpolypeptide selon l'invention. Ces micro-org~ni~mes co",po,leilt ou non au moinsune c~ette d'expression, du type de celle décrite ci-dessus.
Parmi ces micro-org~ni.~mes, on trouve les hôtes utilisables pour l'accueil
d'un vecteur d'e~L~,es~ion conforme à l'invention, on peut citer, not~mmçnt, les20 entérobactéries telles que E. coli, les bactéries appartenant aux genres Comamonas
ou Pseudomonas, les bactéries corynéformes, telles que celles appartenant aux genres
Corynebacterium, Brevibacterium, Rhodococcus, Streptomyces ou Bacillus.
Un micro-org~ni~me recombiné, contenant ladite séquence d'ADN sur
une structure pl~midique, a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de
25 Micro-org~ni~mes (C. N. C. M.) (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, PARIS)
sous le n I 1279 le 11 janvier 1993. Ce micro-org~ni~me est la souche E. Coli qui
contient le plasmide pXL2216 (décrit ci-après). Ce micro-org~ni~me est égalementidentifié par la Dem~nderesse par la référence G 4315.
Il va de soi que les polypeptides produits par les micro-org~nicmes ci-
30 dessus sont, également, compris dans l'invention.
Cette dernière concerne aussi le procéde de transformation des amides en
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carboxylates à l'aide d'un polypeptide selon l'invention ou d'un micro-organismerecombiné le générant. Ce procédé consiste à mettre en présence l'amide à
transformer avec un polypeptide ou un micro-organisme recombiné, tel que défini
précédemment. On opère, génér~leme~lt, à la te"lpi~-dture ambiante. Selon un mode
S particulier de ré~ ti(3n de l'invention, le polypeptide ou le micro-organisme
recombiné sont immobilisés sur ou dans un support solide, selon une technique
classique, comme celle décrite, par exemple, dans le brevet américain
US N 4 732 851.
Le procédé de l'invention convient pour la transformation des amides, en
10 carboxylates et, plus particulièrement, pour la transformation en carboxylates des
mono et diamides de formules:
NC--R--CONH2, H2NOC--R--CONH2 et H2NOC--R--COO~Z~
dans lesquelles R est un groupe alkylène ou alcénylène linéaire ou ramifié, contenant
1 à 18 atomes de carbone, R étant, de préférence, égal à--(CH2)4--et Z est choisi
15 parmi la liste de composés suivants ~ lin~, alcalino-terreux, amines, ammonium,
ce dernier composé étant particulièrement préféré.
Le procédé de l'invention est particulièrement ~p,op.ié pour la synthèse
enzymatique, d'une part, d'un adipate, tel que l'adipate d'ammonium à partir
d'~ir~mide et surtout à partir d'un ~dir~m~t~, tel que l'adipamate d'ammonium et,
20 d'autre part, de cyano-5 valérate à partir de cyano-5 valéramide.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer les caractéristiques et les
avantages de la présente invention sans, toutefois, en limiter la portée.
DESCRIPIION DES FIGURES
La fig. 1 .~p.i;st;nte la séquence peptidique d'un polypeptide conforme
à l'invention (SEQ ~
La ~lg. 2 représente une séquence d'ADN selon l'invention (SEQ ID: 2).
La f~lg. 3 représente l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS des
30 fractions obtenues aux différentes étapes de purification de l'exemple 2.
La fig. 4 représente une courbe de l'activité spécifique de l'~mici~ce selon
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I'invention (micromoles d'adipate x h-' x mg~l de protéine) en fonction de la
te",p~,dtllre en C.
La fig. 5 ,~sente une courbe de l'activité spécifique de l'amidase selon
l'invention (micromoles d'adipate x h-' x mg~l de protéine) en fonction du pH.
S La fig. 6 représente une variation de l'activité spécifique (micromoles
d'adipate x h-' x mg-' de protéine) de l'amidase selon l'invention vis-à-vis de
l'~tlir~m~t~, en fonction de la concentration en ~ p~m~te (millimoles x 1-').
La fig. 7 représente une courbe donnant le rapport de la concentration en
adipamate sur l'activité spécifique (litres d'adipate x h-' x g~' de protéine) en fonction
de la concentration en ~ip~m~te (millimoles x 1~').
La fig. 8 ,~reseilte la carte de restriction du plasmide pXL2104
contenant le gène de l'amidase selon l'invention.
La fig. 9 ,~résellte la séquence d'un fragment de 1491 pb contenant le
gène codant pour l'~mi~l~ce de Comamonas testosteroni NI 1.
La fig. 10 représente la carte de restriction du plasmide pXL2216
conlellallt le gène de l'~mi~ e selon l'invention.
La fig. 11 r~,esellte la carte de restriction du plasmide pXL2144
contenant le fragment SpeI-ClaI dérivé du pl~cmi~e pXL2104 entre les sites XbaI et
ClaI du vecteur pMTL22.
La fig. 12 ,~r~sente l'électrophorèse sur Gel SDS-PAGE montrant
l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention dans la souche E-Coli TG 1.
La fig. 13 ,~p,i;se,lle la carte de restriction du plasmide pXL2238
contenant le gène de l'~mi~e selon l'invention.
La signification des abréviations llti~ é~s dans la suite de la description
25 est donnée ci-après.
- SSC: tampon couramment utilisé pour les hybridations, il contient du
citrate de sodium et du NaCl (20XSSC = NaCl 3M-citrate de
sodium pH 7, 0,3 M),
- SDS: dodécylsulfate de sodium,
- FPLC: chromatographie liquide dénommée en langue ~ngl~ e "fast
protein liquid chromatography",
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- SDS-PAGE: gel d'électrophorèse à base de dodécylsulfate de sodium et de
polyacrylamide,
- IPTG: isopropyl ,B-D thio galactopyranoside,
- CLHP: chromatographie liquide haute pt;l rOl l,lance,
- PS: poids sec,
- X-gal.: 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - ~ D galactopyranoside.
EXEMPLE~.
EXEMPLE 1: HYDROLYSE DE L'ADIPAMATE ET DE L'ADIPAMIDE PAR
Comamonas testosteroni NI 1.
La souche Comamonas testosteroni NI 1 est une souche isolée à partir d'un
éch~ntillon de terre par criblage microbiologique. Ses pelrollllances sont évaluées sur
ir~m~te et ~dir~mide.
1.1. Préparation des cellules:
La souche Comamonas testosteroni NI 1 est cultivée, en fiole agitée, à 28 C,
pendant 19 h, dans le milieu A dont la composition est la suivante:
- Glycérol ........................... 10,0 x 103 mgxl~
- Cyano-5-valérate de sodium .........1,5 x 103 mgxl~
- K2HPO4 ............................. o~sx1o3 mgxl~'
- MgSO4, 7H2O ........................ o,Sx103 mgxl~'
- MnSO4, H20 ......................... 20,0 mgxl~'
- FeSO4, 7H2O ........................ 20,0 mgxl~'
- NaCl ............................... 10,0 mgxl~'
- Extrait de levure .................. o,Sx103 mgxl~'
- Extrait de boeuf ................... 0,5x103 mgxl-
- HCl 3N QSP pH 5
Cette préculture sert à ensemencer une fiole de 2 litres remplie au dixième par
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le milieu A. Après 22 h, 3,5 gxl~' de cellules humides sont récoltés. Cela
correspond à une DO66,~,~ de 1,4 et un poids sec de 0,9 gxl-'.
1.2. Détermination de l'activité enzymatique sur ~-lir~mi~e et ~lir~m~te
S Un culot cellulaire contenant 31 mg de cellules sèches est mis en suspension
dans 5,5 ml d'une solution 20 mM en ~-lip~m~te ou ~lip~mi~e dans le tampon
phosphate de potassium pH 7,50 mM. La réaction est conduite à 25 C sous
agitation et la cinétique est suivie par prélèvement. Sur chaque prélèvement,
sont dosés par CLHP l'~tlip~mide, l'adipamate et l'adipate. Les vitesses de
formation de l'adipate, à partir de l'adipamide et de l'adipamate, sont,
respectivement, de 8,3 et 33 Uxg~' de cellules sèches (1 U est égale à
1 micromole de produit formé par minute) (cellules entières). Par comparaison,
on obtient les activités données dans le TABLEAU I ci-dessous et mesurées dans
les mêmes conditions, avec Brevibacterium R 312 et Rhodococcus sp.
TABLEAU I:
~CTIVITÉS EN t ~ - '01 FC DE
SOUC~IES ~iUBSTRATSPRODUIT l:ORMÉ PAR MINUTE ET
P~ GRAMME DE CELLUI FS SECHES
Comamonas testosteroni A~iip~t~ 33,0
N~ k 8,3
Brevibacterium R 312 A-lip~qt,. o,o
A-1ip~mi~ 2,3
Rhodococcus sp A~iipqmq.~t~ 0,0
A-lip~m~
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E~ 2: P~u~CA~ONDEL'~DASEDE Comamon~ testosteroni NIl.
2.1. Culture des cellules:
La souche Comamonas NI 1 est cultivée en fermenteur de 15 1 sur le milieu
B dont la composition est:
- Glucose .............................. 5,0 x 103 mgxl~'
- Cyano-5-valérate de sodium ............ 5,7 x 103 mgxl~
- Adiponitrile .......................... 1,Ox103 mgxl~'
- Na2HPO4, 2H2O ........................ 3,4 x 103 mgxl~'
- KH2PO4 ................................ 2,7 x103 mgxl~'
- MgSO4 ................................ 0,5 x 103 mgxl~'
- MnSO4, H2O .............................. 20,0 mgxl~'
- FeSO4, 7H2O ............................. 20,0 mgxl~'
- NaCl .................................... 10,0 mgxl~'
- vit~minPS
. Biotine ............................. 8 x 10-5 mgxl~'
. Acide nicotinique ................... 8x 10-3 mgxl~'
. Thi~mine, HCl ....................... 4 x 10-3 mgxl~'
Le pH, la te"lp~ldture, le débit d'air et la vitesse d'agitation sont régulés,
respectivement, à 6,6, 28 C, 300 l/h et 350 tpm. Après 4 h de fermentation,
15 g d'adiponitrile sont ajoutés. Après 19 h 30 de culture, 188 g de cellules
humides, soit 40 g de cellules sèches sont récoltées. Cela correspond, en fin
de culture, à 2,5 g/l de cellules poids sec et à une DO660m,, de 7.
25 2.2 Purifi~tion:
Toutes les étapes de la purification sont réalisées dans le tampon B (Tris-HCl
100 mM pH 7,5, glycérol 10 %). A ch~rllne des étapes, l'activité amidase des
fractions est déterminée à pH 7,5 et à 25 C dans le tampon B dilué 10 fois en
présence d'~-lip~m~tP 10 mM. La concentration en protéine des pools est
déterminée par la méthode au bleu de Coomassie (kit PIERCE Protein assay).
L'unité d'activité U correspond à 1 ~mole d'adipate produite par minute dans
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les conditions du test. Le pannel de protéines est analysé par gel de
polyacrylamide-SDS (Phastsystem PHARMACIA).
Les données de chacune des étapes de la purification sont regroupées dans le
tableau II ci-après et la fig. 3 annexée. Les procédures de chacune des étapes
sont commentées ci-après.
- Etape 0: extrait brut:
66 g de cellules humides sont reprises dans 100 ml de tampon B et
soniquées pendant 28 min en temps effectif (sonicateur VIBRACELL de
BIOBLOCK: sonde 13 mm, p~ nce 7, 30 % du cycle actif. La DO660"",
passe ainsi de 220 à 63. Après centrifugation à 30 000 gmax pendant
60 min, les 125 ml du surnageant sont récupérés.
- Etape 1: fractionnPm~nt au sulfate d'ammonium:
Les 125 ml sont additionnés de 26 g de sulfate d'ammonium pour atteindre
35 % de la saturation. Après une heure, la suspension est centrifugée
30 min à 30 000 gmax. Le surnageant est récupéré et additionné de 18 g de
sulfate d'ammonium pour atteindre 60 % de la saturation. Après 1 h, la
suspension est centrifugée à 48 000 gmax. Le précipité est récupéré puis
dialysé contre le tampon B pendant 66 heures environ. Après dialyse, 43 ml
sont récupérés puis analysés (protéine totale l 200 mg, [prot] = 28 gxl-',
activité totale = 1 200 U, act. spéc. = 1 Uxmg~', rdt prot. = 46 %, rdt
act. = 60 %).
- Etape 2: colcnn~ érh~n~e~lce d'ions (Q sepharose fast flow):
La fraction dialysée (43 ml) est cha,~ée à un débit de 130 mlxh-' sur une
colonne (26 x 380 mm) de "Q sepharose flast flow" équilibrée avec le
tampon B à un débit de 200 mlxh~l. La colonne est percolée à un débit de
200 mlxh~' successivement par les solutions suivantes:
tampon B, QSP pour retour à la ligne de base,
500 ml d'un gradient de KCI 0 à 0,4 M dans le tampon B,
200 ml de tampon B contenant 0,4 M de KCI,
~ 250 ml de tampon B additionné de 1 M de KCI.
L'activité amidase est éluée dans un volume de 170 ml, à une force ionique
WO 94/17190 % ~ 5 ,~ 7 ~ ~ 14 PCT/FR94/00080
comprise entre 0,05 et 250 mM en KCl. Cette solution est analysée (prot.
580 mg, [prot.] = 3,4 gxl-', act. tot. = 1 200 U, act. spéc. = 2,1 Uxmg~
de prot., rdt en prot = 47 %, rdt en act. -- 100 %).
- Etape 3: colonne d'interactions hydrophobes (Phenyl Sepharose):
Les 168 ml sont concentrés par précipitation au sulfate d'ammonium à 65 %
de la saturation. Pour cela, 72 g de sulfate d'ammonium sont additionnés.
Après une heure d'agitation à 4 C, la suspension est centrifugée à
30 000 gmax pendant une heure. Le culot est remis en suspension dans le
tampon B et dialysé contre 2 l de tampon B pendant une nuit. 25 ml sont
recueillis, additionnés de 4,4 g de sulfate d'ammonium pour atteindre 30 %
de la saturation puis chargés à 50 mlxh~l pendant 35 min sur une colonne
de "Phenyl Sepharose" (26 x 300 mm), équilibrée avec du tampon B
contellallt le sulfate d'ammonium à 30 % de la saturation. La colonne est
lavée avec le même tampon à un débit de 100 mlxh~' pendant l h. Le débit
est réduit à 40 mlxh~' et la colonne est percolée avec du tampon B seul.
L'activité est éluée après 2,8 h dans un volume de 30 ml (prot. + 110 mg,
[prot.] = 1,4 gxl-', act. tot. = 910 U, act. spéc. 8,1 Uxmg~' de prot., rdt
en prot. = 20 %, rdt en act. = 74 %).
Les étapes suivantes sont réalisées sur le système FPLC Pharmacia.
- Etape 4: gel filtration (liPLC Superdex 200):
Les 80 ml sont concentrés par ultrafiltration sur membrane Amicon PM10
puis sur centriprep 10. Ces 2,8 ml sont chargés sur la colonne de gel
filtration (16 x 600 mm) équilibrée avec le tampon B additionné de 0,1 M
de KCl à un débit de 0,8 mlxmin~'. L'activité est éluée avec le tampon ci-
dessus à un débit de 1 mlxmin~' et dans un volume de 9 ml (26 mg de
protéine, 470 U, act. spéc. = 18 Uxmg~' de prot., rdt en act. = 51 %, rdt
en prot. = 26 %).
- Etape 5: gel filtration (FPLC Superdex ~00):
Cette deuxième gel filtration est effectuée dans des conditions identiques à
la pré~dente, mais en deux fois. Les dosages ne sont effectués que sur le
premier passage, réalisé à partir d'une fraction de 3 ml des 9 ml de la
Wo 94117190 ;~ 1 ~i 3 7 g 3 PCT~94/00080
15 '`'
précédente étape.
- Etape 6: colonne échangeuse d'anions (mono Q HR 5/5 Pharmacia):
Sur cette colonne, équilibrée avec le tampon B, les protéines ne sont pas
retenues et sont éluées directement dans le volume mort. Les fractions
actives, 16,5 ml, sont analysées (prot. = 17,1 mg, [prot.] = 1 gxl-', act.
tot. = 262 U, act. spéc. = lS Uxmg~' de prot., rdts cumulés pour les
étapes S et 6 = 65 % pour les prot. et SS % pour l'activité).
- Etape 7: colonne échangeuse d'anions (mono Q HR 5/5 Pharmacia):
Cette étape est réalisée en deux fois, en utilisant la moitié de la fraction
précédente à chaque fois et avec le tampon B/5. Le tampon est modifié par
dialyse sur membrane Amicon PM10 et substitution par du tampon B/S. Les
6 ml de rétentat sont chargés sur la colonne équilibrée avec le tampon B/S,
à un débit de 1 mlxmin~'. Après lavage de la colonne pendant 14 min, un
gradient de 0 à 0,lS M en KCl est appliqué en 25 min. La colonne est
lS ensuite alimentée avec une solution de KCl 1 M dans le tampon B/S. Endeux fois, 3,75 ml sont recueillis et analysés (prot. = l,S mg,
[prot.] = 0,4 gxl-', act. tot. = 121 U, act. spéc. = 81 Uxmg~' de prot., rdt
en prot. = 11 %, rdt en act. = 46 %.
- Etape 8: colonne échangeuse d'anions (mono Q HR 5/5 Pharmacia):
Les 3,7 ml de l'étape précéclente sont dilués à 6 ml avec le tampon B/S,
déposés sur la colonne. Les protéines sont éluées dans les conditions de
l'étape 7. Les fractions actives sont réunies et analysées
(vol. = 3 ml, protéines = 1 mg, [prot.] 0,34 gxl-', act. tot. = 93 U, act.
spéc. = 92 Uxmg~' de prot., rdt en prot. = 67 %, rdt en act. = 77 %).
- Etape 9: colonne d'interactions hydrophobes (octyl ~u~e. ose ~IR 5/5):
Les 3 ml du pool de l'étape précédente sont amenés à 38 % de la saturation
par addition d'une solution concentrée en sulfate d'ammonium. Les 6 ml
résultants sont chargés sur la colonne, équilibrée avec le tampon B
additionné de 1,7 M de sulfate d'ammonium. Les protéines sont éluées par
un gradient décroissant de sulfate d'ammonium de 1,7 M à 0 M dans le
tampon B en 1 h à un débit de 0,S mlxmin~'. Les fractions actives sont
-
WO 94/17190 PCT/FR94/00080
~ 3 7 9 3 16
réunies pour analyse (vol. = 1,5 ml, prot. = 0,75 mg, [prot.] = 0,S g/l,
act. tot. = 53 U, act. spec. = 70 Uxmg~l de prot., rdt en prot. = 75 %,
rdt en act. = 56 % .
- Etape 10 ~ cc~ e (colonne de Fast ~p-~qltinf~ HR 10/lO Pharmacia):
S Les 1?5 ml sont tout d'abord concentrés à l'aide du centricon PM10 jusqu'~
un volume de 0,5 ml. Cette fraction est dépos~e sur la colonne, ~quilibrée
avec le tampon phosphate 10 mM pH 6,8. La protéine est élu~e à un débit
de 4 mlxmin~l. La protéine sort dans un volume de 2 ml environ (prot.
tot. = 360 ~Lg, [prot.] = 180 mgxl~l, act. tot. = 19 U, act.
sp~c. = 53 Uxmg~l de prot., rdt en prot. = 48 %, rdt en act. 36 %).
TABLEAU II: PUR~CATION DE L'AMIDASE DE Comamonas NI 1
VOL. PROT. ACTIVITE RENDEMENT
ETAPE PF
DE
PURIFICATION MG TOTALE SP~CIF.PROT.ACTIV.
U U/MG % %
O - Extrait brut 125 '' 7002 100 0,78 100 100
I - (NH4)2SO4 35-60 % 43 1 200 1 200 2,1 22 59 1,3
2 - Q ~ I.alu,c 170 580 1 200 2,1 æ 59 Z,7
3 - Phenyl s~ .. v,c 80 110 910 8,1 4,2 44 10
4 - Gel filtration 1~ 26 470 18 0,9 '73 Z3
5 - Gel filtration
6 - Mono Q HR 5/5 16 17 26Z lS 0,6 13 19
7 - Mono Q HR 5/5 3,7 1,5 121 81 0,05 5,8 100
8 - Mono Q HR 5/5 3 1 93 9" 0.03 4,5 IZ0
9 - Octyl superose HR 5/5 1,5 0,75 53 70 0,03 ",5 90
10 - Dessalage " 0,419 53 0,01 0,9 67
WO 94/17190 2 l ~ 3 7 9 3 PCT/FR94/00080
17
ABR~VL~TIONS:
- PF = coefficient de purification,
- U = 1 mole/min.
La fig. 3 annexée montre les résultats d'une analyse en gel de polyacrylamide
SDS des fractions obtenues aux différentes étapes de la purification.
kes puits sont numérotés de 1 à 12, de gauche à droite, les poids moléculaires
du marqueur ont été portés sur la droite de la figure (kilo Daltons). Les puits
1 et 12 contiennent des protéines standard de poids moléculaire connus, le puits2 l'extrait brut et les puits 3 à 10 correspondent aux extraits purifiés des étapes
1 à 8 et le puits 11 à l'extrait purifié de l'étape 10. La bande correspondant àl'~mid~e selon l'invention est celle d'environ 40 kDa.
2.3 Caractérisations:
Cette amidase analysée par gel SDS-PAGE présente une bande principale de
43 000 Da dont la séquence N-terminale est: (acides aminés 1-18 de la
SEQ ID: 3 dans la liste de séquences annexée).
Met-Ile-Glu-Asn-Ile-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-Asn-Ile-Leu-Glu-Ser-Asn-Thr-Asn- . . .
Par gel filtration, le poids moléculaire est de 80 000 +/- 2 000 Da. L'amidase
est donc une enzyme homodimérique.
2.4 Activité de l'~mi~l~se en fonction de la te~ .ture:
Un pool de fractions conte"ant l'~mi(l~e a été utilisé pour cette étude. Dans
les conditions de la purification, ce pool contient 0,3 gxl-' de protéine et
possède une activité spécifique de 26 Uxmg~l de protéine. L'activité de ce pool
a été déterminée entre 10 et 60 C.
Les conditions de cette étude sont les suivantes: [adipamate] = 10 mM,
tampon tris-HCl 10 mM, pH 7,5. Volume réactionnel 2 ml, temps de réaction
15 min, [protéine] = 7,5 mgxl~'.
Les résultats sont regroupés dans la fig. 4. L'activité augmente en fonction de
la température jusqu'à 50 C environ. Au-delà; une dénaturation est observée.
Wo 94/17190 PCT/FR94/00080~
~ ~ ~ 3 7 93 18
Entre 10 et 40 C, la loi d'Arrhénius est observée et permet de calculer un ~`G
de réaction de 83 kJxmole~'.
2.~ Activité en fonction du pH:
A partir de la meme préparation enzymatique que celle utilisée précédemment,
l'activité est mesurée à différents pH. Les conditions de cette étude sont les
suivantes: [~r~ip~m~te] = 10 mM, tampon carbonate 10 mM, pH 10, tris-HCl
10 mM, pH 9, 8.5, 7.5, phosphate 10 mM, pH 6.5, acétate 10 mM, pH 3.5,
4.5, 5.5, T = 25 C, volume réactionnel 2 ml, temps de réaction 15 min,
[protéine] = 7,5 mgxl~l.
Les résultats sont regroupés dans la ~Ig. ~. Le pH optimum se situe entre 8,5
et 10, ce qui correspond bien au comportement généralement rencontré pour
les amidases.
2.6 Détermination du Km de l'~mitlqce:
Le substrat utilisé est l'~-lir~m~te. Sa vitesse d'hydrolyse en adipate est
déterminée à différentes concentrations en ~ip~m~tt~ (0,2, 1, 2, 5 et 10 mM).
Les conditions de cette étude sont les suivantes: T = 25 C, tampon Tris-HCI
10 mM, pH 7,5, extrait enzymatique 100 ~1 (cf. paragraphe 2.5), volume
réactionnel 4 ml, sauf 10 ml pour 0,2 et 1 mM en ~rlir~m~t~., temps de
réaction cinétique sur 2 h.
Comme montré à la fig. 6, la courbe obtenue en traçant la vitesse en fonction
de la concentration en substrat est conforme à une cinétique de Michaelis-
Menten. En conséquence, la transformation de Hanes S/V = f(S), représentée
à la ~Ig. 7 donne une constante de Michaelis de 0,25 mM.
EXEMPLE 3: CLONAGE DU G1~NE CODANT POUR L'AMIDASE DE Comamonas
testosteroni NI 1.
30 A partir de la séquence N-terminale ~I~;sentée dans l'exemple 2.3, une sonde
nucléotidique a été synthétisée. Il s'agit d'un 20 mer 256 fois dégénéré:
Wo 94/17190 PCT/FR94/00080
7 ~ 3
19 , ~, .
M I E N I I A (SEQ ~: 5)
S ' ATG ATT GAA AAT ATT ATT GC 3' (SEQ ID: 4)
C G C C C
A A A
Dans la liste de séquences ~nnexee, la séquence de 20 bases est ~ignee par
SEQ ID: 4 tandis que la séquence d'aminoacides y associée est quant à elle référencée
SEQ ID: 5.
La stratégie suivie a consisté, tout d'abord, à vérifier la spécificité de cette sonde
10 nucléotidique et à déterminer la nature des fragments d'ADN génomique à cloner.
Brièvement, I'ADN génomique de Comamonas testosteroni NI 1 a été digéré par
plusieurs enzymes de restriction co~ ondant à des sites utilisables pour le clonage.
Après électrophorèse sur gel d'agarose et transfert sur membrane de nylon, les
diverses digestions ont été hybridées à la sonde. La sonde a une spécificité suffisante
15 dans les conditions d'hybridation utili~s (5x SSC, 5x Denhardt, 0,1 % SDS,
50 mM NaPO4 pH 6,5, 250 ,ugxml~~ ssDNA, température d'hybridation 50C.
Conditions de lavage: 1 h, 6x SSC, température ambiante et 5 min en 2 x SSC,
0,1 % SDS à 50C).
Dans ces conditions, la sonde nous a permis d'obtenir des signaux importants et sans
20 ambiguité. En particulier, dans le cas des digestions par SstI, PstI et BglII. Les
empreintes d'hybridation montrent, en particulier, l'existence d'un fragment unique
SstI d'environ 5,5 kb. Afin de cloner ce fragment, les fragments de 5 à 6 kb d'une
digestion SstI de l'ADN génomique ont été purifiés par électrophorèse préparative
sur agarose et électroélution, puis ligaturés au plasmide pUC 19, lui-même digéré
25 par SstI. Après transformation dans la souche DH5a~, 500 clones blancs sur LBampicilline X-gal ont été repiqués individuellement, transférés sur membrane de
nylon, puis analysés par hybridation avec la sonde ayant servi pour hybrider le
Southern blot et ce dans les mêmes conditions de stringence. Deux clones ont ainsi
été repérés comme hybridant très fortement avec la sonde. Ces deux clones se sont
30 avérés contenir un plasmide ayant inséré le même fragment d'environ 5,5 kb dans
la même orientation. L'un de ces deux pl~mides (pXL2104) a été analysé plus en
Wo 94/17190 PCT/FR94/00080
~37~3
détail (cal~ogldyhie de restriction, séquençage partiel en utilisant la sonde comme
amorce et Southern blot). Il a ainsi pu être montré que la partie 5' du gène, qui
hybride avec la sonde, est localisée sur un fragment de PstI/SpeI de 420 pb environ
et que le gène est orienté dans le sens SpeI vers PstI. La fig. 8 présente une carte
de restriction de ce pl~mide.
EXEMPLE 4: Sl~:QUENOE D'UN FRAGMENr DE 1491 pb CONTENANT LE G~NE
CODANT POUR L'AMIDASE DE Comamonas testosteroni NI 1.
La localisation du fragment de 1491 pb séquencé, contenant le gène codant pour
l'amidase de Comamonas testosteroni NI 1, est indiquée sous l'insert cloné sur la
fig. 9. La stratégie de séquencage de ce fragment, réalisé selon des méthodes
classiques connues par l'homme de métier, est r~,i;se~ e sur la même figure. Lesdiverses séquences ont toutes été obtenues par la méthode de termin~i~on de chaînes
(kit sequenase en présence de 7-déaza dGTP; ~5S)dATP) soit sur des matrices
simple brin de M13 (mpl8 ou mpl9 cf YANIS~ et al., Gene 33 (1985) 103)
recombinant portant des sous fragments, soit dir~;~",ent sur le plasmide pXL2104.
Plusieurs amorces spécifiques ont ég~lt m-ont été synthéti~ées dans ce but.
La séquence est présentée sur la fig. 2. et sur SEQ ID: 2 de la liste de séquences
~nne~ée. Le GC % moyen de la séquence obtenue est de 33,6 %, ce qui est inférieur
au GC % de 61,5 % décrit chez d'autres souches de Comamonas (TAMAOKA et al.,
Int. J. Syst. Bacteriol, 1987, 37, 52-59). Une analyse de la séquence obtenue a
permis de caractériser une phase ouverte de 1254 pb codant pour un polypeptide de
418 résidus colle~yol-dant à un poids moléculaire de 46 148 Da. Ce polypeptide
co---ylend la séquence NEI2 terminale utilisée pour synthétiser la sonde.
Ainsi cette phase ouverte ~cyresellte le gène structural de l'amidase recherchée. Ce
gène sera dénommé amdA dans la suite du présent exposé.
A partir du pl~mi~le pXL2104, le pl~micle pXL2216 a été préparé par insertion dufragment SpeI-ClaI contenant le gène amdA entre les sites XbaI et ClaI du vecteur
pMTL 23 (CHAMBERS et Al., Gene, 68 (1988) 139-149). Ce plasmide, dont la carte
de restriction est présentée sur la figure 10, a été utilisé pour transformer la souche
WO 94/17190 2 1 ~ 3 7 ~ 3 PCT/~94/00080
21
de E. coli TG 1. La souche résult~nte appelée G 4315 a été déposée à la Collection
Nationale de Culture de Micro-org~nismçs à Paris (Institut Pasteur, 25 rue du
Docteur Roux) sous le n I 1279.
5 EXEMPLE 5: EXPRESSION DE L'AMIDASE DE Comamonas Testosteroni NI 1
DANS E. coli.
Afin de confirmer l'identité entre le gène am~4 et le gène codant pour l'amidase de
Comamonas testosteroni NI 1, un pl~mide a été construit dans lequel le gène amdA,
10 précédé de son propre site de fixation des ribosomes, est placé sous le controle du
promoteur de l'opéron lactose de E. coli. Ainsi, le pl~mide pXL2144, décrit sur la
fig. 11, a été obtenu par insertion du fragment SpeI-ClaI dérivé du plasmide
pXL2104 entre les sites XbaI et ClaI du vecteur pMTL 22 (CHAMR~R~ et al., Gene,
68 (1988) 139-149).
15 Ce plasmide contient donc le promoteur de l'opéron lactose Plac, suivi du site de
fixation des ribosomes et du gène structural de l'~mi~e, ainsi qu'un gène conférant
la rési~t~nce à l'ampicilline.
Le plasmide pXL2144 a été utilisé pour transformer la souche de E. coli TG 1. Lasélection des micro-org~ni~me~ se fait sur ampicilline.
20 L'e~p,ession de l'~mid~e de Comamonas testosteroni NI 1 a été vicu~ ée, aprèssonication des cellules, par gel SDS-PAGE, dans la fraction brute ou, après
centrifugation, dans le culot et dans le surnageant.
Chaque piste correspond à une quantité de protéine équivalente à 60 ~l de culture à
uneDOde3à610nm.
25 La f~lg. 12 présente les résultats obtenus. Les poids moléculaires des marqueurs sont
indiqués en kilodaltons par les flèches à droite du gel sur cette figure.
Le contenu des di~érentes pistes est indiqué sur le tableau suivant.
WO 94tl7190 PCT/FRg4/00080~
~537g3 22
TG1 + TGl + TGl + TGl +
p~l44 pXL2144 pMTL22pMTL22
+ lrrG + IPrC
Sul.la~ A D G J
Culot B E H K
Fraction brute C F I L
Il ressort de la fig. 12 que les extraits de cellules comprenant le plasmide pXL2144
expriment l'~mi~e selon l'invention, essentiellement sous forme soluble une bande
à environ 45 kDa est visible pour les pistes A.C.D.F, alors que celle-ci n'apparait
pas pour les extraits G à L.
10 De plus, la co",p~udison de la bande à 45 kDa environ des extraits A.C et desextraits D.F montre que les cellules cultivées en présence d'ITPG ont un niveau
d't;~,cssion plus élevé.
15 EXEMPLE 6: AC11VrF~ DE L'AMIDASE C~EZ Escherichia coli.
L'activité de la souche E. coli (pXL2144), induite ou non, est mesurée sur adipamide
et adipamate et co",par~e à celle de la souche témoin E. coli (pMTL 22).
20 6.1 Préparation des cellules:
Les cultures sont réalisées dans les conditions décrites dans le TABLEAU III ci-dessous. Au cours de la phase exponPntielle de croissance, une des deux
cultures de la souche recombinante est induite par l'IPTG 1 mM, après encore
2 h à 37 C cette culture est traitée.5
WO 94/17190 215 3 7 9 3 PCT~94/00080
TABLEAU m CULTURE DES SOUCHES
P. S.
MICRO-ORG~NI$~ES MILIEUDO 660 nm g/I
E. coli (PMTL22) B 2,2 0,84
E. coli (pXL2144) B 1,8 0,75
E. coli (pXL2144) C 2,3 1,10
ABR~VL~TIONS:
- B = milieu LB + Amp 100 ~gxml~',
- C = milieu B + ajout de IPTG 1 mM à 0,8 de DO
CONDITIONS COMMUNES:
Ensemencement au 1/lOOème à partir d'une préculture âgée de 17 h, temps de
culture 5,5 h, T = 37 C.
15 6.2 Mesures des activités spécifiques:
Les conditions de mesure des activités spécifiques et les résultats sont
Lo,iés dans le TABLEAU IV ci dessous.
Les conditions communes de ces mesures sont les suivantes: T = 25 C,
tampon phosphate 50 mM pH 7, cinétique sur 90 min.
WO 94/17190 S 3 7 ~ 3 PCT/FR94/00080
24
TABLEAU IV: MESURES DES ACr/VrrÉS AMIDASIQUES DES SOUCHES
RECOMBINANTES QUI EX~RIMENT L'AMIDASE DE Comamonas
NI 1.
SUBSTRAT ACTIVIT~
SOUCHhS SP~CIFIQUE
Nature [cel.]Induit Et. t Nature [S]~mole/min/g
g/l +I mMde PS
E. coli (pXL2144) 6,2 + E A-1ipnm~ 15 14
6,1 + ST A~iipnm: ip12 15
6,1 + SC Ariipnm: ~f. 12 0
6,1 + SS A-iipnmi~3 12 14
6,2 - E A~lip mi~ 11 0
0,3 + E ~ . 50700
0,25 + ST A-iipnmA~,, 502 000
2, 5 0 + S C A ~ 5 09 7
0,25 + SS A~iip-mn~R 501 900
0,69 - E Arlirqmntt~50130
1,4 - ST A~ ^ 50500
2,8 - SC Aflipnmnt~.50 46
1,4 - SS A~'. ~ 50433
E. coli (pMTL22) 10 E ~ jpnmA~ 25 0
14 E J~fiipnrr: ilo.13 0
ABRÉVIATIONS:
- ~ = cellules entières,
- ST = broyat cellulaire,
- SC = fraction insoluble du broyat cellulaire,
- SS = fraction soluble du broyat cellulaire.
WO 94/17190 3 PCT/FRg4/00080
EXEMPLE 8: EXPRESSION ET A~:11V11~; DE L'AMIDASE DANS Pseudomonas
putida
L'~mid~e a été exprimée chez Pseudomonas putida à l'aide de la construction
S suivante: A partir de pXL2216 décrit sur la figure 10, le fragment Sa~/BglII de
1.75kb contenant le gène amdA a été introduit entre les sites SalI et BamHI de
pDSK519 (Keen et al., 1988, Gene. 70: 191). Ce pl~cmide, pXL2238, décrit sur
la figure 13 a été introduit dans la souche de Pseudomonas putida G 2081. G 2081est une dérivée de Pseu~lomonas p~tida 2440 (Bagdasarian and Timmis, 1981. In
10 Hofschneid and Goebel. Topics in Microbiology and Immunology. 47. Springer
Verlag. Berlin.) rendue ré~i~t~nt~ à l'acide nalidixique et à la rifampicine. Levecteur pDSK519 a été utilisé comme pl~mide témoin.
L'activité de la souche G 2081 (pXL2238) est mesurée sur ~(lip~m~t~ et comparée
à celle de la souche témoin G2081 (pDSK519).
Les souches Pseudomonas G 2081 (pDSK519) et Pseudomonas G 2081 (pXL2238)
ont été cultivées en milieu LBk (Tryptone 10 g/l, NaCl 5g/l, extrait de levure 5g/l,
glucose lOg/l, sulfate d'ammonium 1 g/l et kanamycine 100 mg/l). Les résultats des
cultures sont regroupés dans le tableau V.
0 TABLEAU V: CULTURE DES SOUCHES ESTIMEES POUR LEUR ACTIVITE
AMIDASE
Micro-org~ni~me DO660~ Poids sec
(g/l)
Pseudomonas (pDSK519) 2,3 0,9
25Pseudomonas (pXL2238) 1,8 0,5
Les activités de ces souches ont été déterminées sur ~tlip~m~te et adipamide. Les
conditions et résultats sont répertoriés dans le tableau VI.
WO 94/17190 PCT/FR94/00080 ~
~3~3 26
TABLEAU VI: COND1TIONS REACTIONN~LES ET RESULTATS DES MESURES DE
L~A~; 11V11~ AMIDASE DES SOUCHES RECoMslNAN rES
PSEUDOMONAS (PDSK519) ET PSEUDOMONAS (PXI2238)
Con~ ion~ r~ictinnnPll~oc
Souches dur~e volume Substrat Activité
((U/kg de CS)
nature (g/l) état (h) (ml) na~re (mM)
Comamonas 5,6 E 4 5,sæ~lir~m ~.o 20 0,5
testosteroni Nll ~ I;p-,.. t~ 20 2,0
P. putida 2 E 3 4 r', ~ 20 o
(pDSK519)
P. Putida 2 E 1,5 2 r ' .~ 18 0
(pXL223 8) E r ~ t' 45 3, 8
S ~ip~ 50 5, 1
Conditions communes: tampon phosphate SO mM pll 7; ~ C 25-28;
20 Abréviations: E cellules entières, S broyat cellulaire; U mole d'amide
hydrolysée/h; CS cellules sèches;
La souche Pseudomonas (pXL2238) exprime le gène de l'~mi~ e de Comamonas
NI. 1 et cela d'autant mieux que la prép~r~tinn cell~ ire est soniquée.
Ces expériences montrent que l'~mi~ e est exprimée et active chez Pseudomonas
putida.
WO 94/17190 215 3 7 9 3 PCT/FRg4/00080
27 . ~
EXEMPLE 9: COMPARATIF DES ACTIV1TÉS SPÉCIFIQUES SUR
ADIPAMIDE ET ADIPAMATE DE SOUCHES EXP~MANT UNE
AMIDASE SELON L'ART A~R (FR 90-14 853) ET
SOUC~ES EXPRIMANT UNE AMIDASE SELON L'1NVENTION.
Les conditions des mesures et les résultats sont donnés dans le TABLEAU VIII ci-dessous.
TABLEAU vm:
SOUCHES SULS rRAT ACnVITÉ
SPi~ClFlQUE
NatUre [Cel.] IndUit Etat NatUre tS] ~mOle/
(mM)min/g
Brevibactcrium (R 312) 0,06 + EA~;r~m;~ 20 2,3
0,3 + ST A~;r~m;~1~ 20 10
0,3 + ST Adipamatc20 4,2
E. coli (PXL1751) 0,3 + E Adipamide 20 75
ART
0,3 + E Adipamate 20 16
~ I~UhUK
0,3 + ST Adipamate20 16
Rho~co.. ~ ~ sp 0,76 + E~1ir:~mi~ 20 35
0,76 + ST A~;r~m;~1~ 20 62
0,3'' + ST Adipamate 20 55
C. testosteroni sp 5,6 + E A~;P~ 20 8,3
5,6 + E Adipamate 20 33
INV~ON
E. coli (PXL2144) 6,2 + E A~i;r~m;~ 5 14
6,1 + ST .A~1;r~m;~Jr 12 15
0,3 + E Adipamate 50 700
0,25 + ST Adipamate 50 2 000
WO 94/17190 ~1 ~ 3 7 9 3 PCT~94/00080
28
CONDITIONS COMMUNES:
T = 25C
- Tampon phosphate 50 mM pH 7.
ABRÉVIATIONS:
- E = cellules entières,
- ST = broyat cellulaire.
Le pl~mi(le pXL1751 de la souche recombinée E. Coli est décrit en détail
dans la demande de brevet FR 90-14 853.
Le TABLEAU VII met clairement en évidence la plus grande spécificité de
l'~mi~ e suivant l'invention vis-à-vis de l'~(lip~m~te que vis-à-vis de l'adipamide,
à l'inverse de ce que l'on observe pour les amidases connues. Cette observation vaut
aussi bien pour une e~les~ion amidasique par les germes naturels que par les
germes recombinés.
WO 94/17190 PCT~FR94/00080
29
LISTE DE SEQUENCES
(l) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC CHIMIE
(B) RUE: 25, Quai Paul Doumer
(C) VILLE: Courbevoie .
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 92400
(G) TELEPHONE: 47 68 12 34
(H) TELECOPIE: 47 68 16 56
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Polypeptides à activité amidase, outils
génétiques et micro-org~ni~m~s hôtes permettant leur
obtention, procédé d'hydrolyse mettant en oeuvre lesdits
polypeptides
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUF'PORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #l.O, Version #1.25 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE DEPûT: FR 93 01062
(B) DATE DE DEPOT: 27-JAN-1993
(2) INFûRMATION POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 418 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: lin~P;re
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ Ip NO: l:
FEU~LLE DE REMPLACEMENT ~REGLE 26)
WO 94/17190 ~ ~ 5~ ~93 ` PCT~R94100080
Met Ile Glu Asn Ile Ile Ala Lys Leu Lys Asn Ile Leu Glu Ser Asn
1 5 lo 15
Thr Asn Ser Phe Ile Ser Leu Asp Leu Val Asp Val Ser Lys Gln Leu
Lys Lys Gln Asp Ser Asn Gln Pro Leu Asn Gly Val Thr Val Ala Ile
Lys Asp Leu Ile Asp Val Glu Gly Gln Lys Thr Thr Met Gly Ser Ala
Gln Tyr Gln Asn Asn Ile Ala Arg Ser Asp Ala Asp Val Val Arg Arg
Leu Arg Thr Ala Gly Ala Val Ile Phe Gly Lys Thr Asn Thr His Glu
95he Ala Tyr Gly Ser Thr Gly Asp Lys Ser Phe Phe Gly Pro Val Leu
100 105 llo
Asn Pro Asn Asn Glu Asn His Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser
115 120 125
Ala Ala Ala Val Ala Ala Asp Leu Cys Asp Val Ala Ile Gly Thr Asp
130 135 140
Thr Ala Ala Ser Val Arg Leu Pro Ala Ala Leu Cys Gly Val Ile Gly
145 150 155 160
Leu Lys Pro Thr Tyr Asn Ser Ile Lys Arg Asp Gly Val Phe Ser Leu
165 170 175
er Pro Ser Leu Asp His Val Gly Ile Ile Ser Lys Ser Leu Asp Leu
180 18~ l9o
Ile Glu Lys Thr Phe Asn Ser Thr Lys Thr Ser Ile Asp Gln Lys Pro
195 200 205
Gln Lys Asn Leu Asp Lys Lys Leu Thr Ile Gly Leu Leu Lys Gly Phe
210 215 220
Phe Glu Glu Tyr Ile Cys Ser Ser Val Lys Glu Lys Tyr Asp Glu Thr
225 230 235 240
Ile Glu Leu Leu Arg Ser Asn Gly Cys Glu Ile Lys Glu Ile Asn Ile
245 250 255
ys Glu Ala Phe Asp Ile Tyr Thr Asn Ser Gln Ile Val Leu Lys Tyr
260 265 270
Glu Ala Tyr Lys Ile His Glu Glu Ser Leu Lys Leu Asn Tyr Pro Phe
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Gly Arg Ile Leu Arg Gly Glu Asn Ile Thr Lys
290 295 300
~EUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
.3
WO 94/17190 ' PCT~FR94100080
31
Asp Glu Tyr Asp Ile Ala Lys Lys Tyr Gln Glu Asn Ala Arg Ile Ile
305 310 315 320
Phe Asp Thr Ala Leu Lys Asp Val His Val Leu Ala Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Gly Ile Leu Pro Pro Lys Ile Phe Glu Arg Gln Thr Lys Val Asn Glu
340 345 350
Asn Thr Val Glu Thr Phe Phe Leu Leu Thr Arg Leu Thr Ala Pro Ile
355 360 365
Asn Phe Thr Gly His Pro Ala Ile Ser Tyr Pro Ile Gly Lys Ile Asn
370 375 380
Asn Leu Pro Val Gly Ile Gln Phe Ile Ser Asp Phe His Asn Glu Glu
385 390 395 400
Ile Leu Phe Gln Ala Cys Asn Leu Leu Gln Lys Ser Phe Leu Ala Lys
405 410 415
Gly Asn
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1491 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ~génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 127..1380
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEa ID NO: 2:
TCCGCAATTC ATGATTGAAA GATGTGAGTT TCCATGAGAT CAGAGACCGA G M m AGAC 60
ATTCATCGAA AGTGAAAATA ATAACTAGTT TTATATATTA GTTATTGAAA TTTAGTGGAT 120
AAGAAA ATG ATT GAA AAT ATT ATT GCG AAA TTA AAA AAT ATT CTA GAG 168
Met Ile Glu Asn Ile Ile Ala Lys Leu Lys Asn Ile Leu Glu
1 5 lo
TCG AAC ACC AAT TCG TTT ATA AGT TTA GAT TTA GTT GAT GTC TCA AAA 216
Ser Asn Thr Asn Ser Phe Ile Ser Leu Asp Leu Val Asp Val Ser Lys
5 20 25 30
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
7~
WO 94/17190 PCT/FR94100080
32
CAA TTA AAA AAA CAA GAT AGC AAT CAA CCA CTA AAT GGA GTA ACA GTT 264
Gln Leu Lys Lys Gln Asp Ser Asn Gln Pro Leu Asn Gly Val Thr Val
35 40 45
GCT ATA AAA GAT TTA ATT GAT GTT GAA GGC CAG AAA ACC ACT ATG GGT 312
Ala Ile Lys Asp Leu Ile Asp Val Glu Gly Gln Lys Thr Thr Met Gly
5 55 60
TCT GCT CAA TAT CAG AAT AAT ATA GCA AGA AGT GAT GCC GAT GTT GTG 360
Ser Ala Gln Tyr Gln Asn Asn Ile Ala Arg Ser Asp Ala Asp Val Val
65 70 75
CGC AGG CTC AGA ACA GCA GGT GCT GTG ATA TTT GGA AAA ACT MT ACA 408
Arg Arg Leu Arg Thr Ala Gly Ala Val Ile Phe Gly Lys Thr Asn Thr
80 85 go
CAC GAG TTT GCT TAT GGA TCT ACT GGG GAT MA TCA TTT TTT GGA CCA 456
His Glu Phe Ala Tyr Gly Ser Thr Gly Asp Lys Ser Phe Phe Gly Pro
95 100 105 110
GTT CTA AAT CCA MC MT GAA AAC CAT ATT ACT GGT GGG TCT AGC AGT 504
Val Leu Asn Pro Asn Asn Glu Asn His Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ser
115 120 125
GGA TCA GCT GCA GCT GTC GCA GCC GAC TTG TGC GAT GTT GCA ATA GGT 552
Gly Ser Ala Ala Ala Val Ala Ala Asp Leu Cys Asp Val Ala Ile Gly
130 135 140
ACT GAT ACG GCT GCT TCT GTA AGA CTA CCT GCA GCA CTA TGT GGT GTT 600
Thr Asp Thr Ala Ala Ser Val Arg Leu Pro Ala Ala Leu Cys Gly Val
145 150 155
ATT GGA TTA AAG CCA ACT TAC AAC TCC ATT AAA AGA GAT GGA GTT TTT 648
Ile Gly Leu Lys Pro Thr Tyr Asn Ser Ile Lys Arg Asp Gly Val Phe
160 165 170
AGT CTA AGC CCG TCA TTA GAT CAT GTT GGA ATT ATC AGT AAA TCA TTA 696
Ser Leu Ser Pro Ser Leu Asp His Val Gly Ile Ile Ser Lys Ser Leu
175 180 185 190
GAT TTA ATT GAA AAA ACC TTT AAC TCC ACT AAA ACA TCA ATC GAT CAA 744
Asp Leu Ile Glu Lys Thr Phe Asn Ser Thr Lys Thr Ser Ile Asp Gln
195 200 205
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO 94/17190 ~ ` ~ ' `
PCT/E~94/00080
33
AAG CCC CAA AAA AAC TTA GAT AAG AAG TTA ACT ATT GGC CTT CTA AAA 792
Lys Pro Gln Lys Asn Leu Asp Lys Lys Leu Thr Ile Gly Leu Leu Lys
210 215 220
GGT m TTT GAG GAA TAT ATT TGC AGC TCT GTC AAA GAA AAA TAT GAT 840
Gly Phe Phe Glu Glu Tyr Ile Cys Ser Ser Val Lys Glu Lys Tyr Asp
225 230 235
GAA ACT ATA GAA TTA TTA AGA AGT AAC GGT TGT GAA ATC AAA GAA ATT 888
Glu Thr Ile Glu Leu Leu Arg Ser Asn Gly Cys Glu Ile Lys Glu Ile
240 245 250
AAT ATT AAA GAA GCA TTT GAT ATT TAC ACA AAT TCG CAA ATA GTT CTT 936
Asn Ile Lys Glu Ala Phe Asp Ile Tyr Thr Asn Ser Gln Ile Val Leu
255 260 265 270
AAA TAC GAA GCT TAT MA ATA CAT GAA GAA TCT TTG AAA TTA AAT TAT 984
Lys Tyr Glu Ala Tyr Lys Ile His Glu Glu Ser Leu Lys Leu Asn Tyr
275 280 285
CCA I~C GAC CCT GM GTT AAG GGG CGA ATA TTA AGG GGT GM AAT ATA 1032
Pro Phe Asp Pro Glu Val Lys Gly Arg Ile Leu Arg Gly Glu Asn Ile
290 295 300
ACC AAA GAC GAA TAT GAT ATC GCA AAA AAA TAT CAA GAA AAT GCA AGA 1080
Thr Lys Asp Glu Tyr Asp Ile Ala Lys Lys Tyr Gln Glu Asn Ala Arg
305 310 315
ATC ATA m GAC ACA GCT TTA AAA GAT GTT CAT GTA TTA GCA TCC TTA 1128
Ile Ile Phe Asp Thr Ala Leu Lys Asp Val His Val Leu Ala Ser Leu
320 325 330
ACA AGC GGA ATA CTA CCG CCA AAA ATC TTT GAA CGT CAA ACA AAG GTT 1176
Thr Ser Gly Ile Leu Pro Pro Lys Ile Phe Glu Arg Gln Thr Lys Val
335 340 345 350
AAT GAA AAT ACA GTG GAA ACA TTC TTT TTA TTG ACA AGA CTA ACA GCT 1224
Asn Glu Asn Thr Val Glu Thr Phe Phe Leu Leu Thr Arg Leu Thr Ala
- 355 360 365
CCA ATA AAT TTT ACT GGT CAC CCT GCT ATC TCA TAT CCG ATT GGA MA 1272
Pro Ile Asn Phe Thr Gly His Pro Ala Ile Ser Tyr Pro Ile Gly Lys
370 375 380
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
-
WO 94/17190 7 9 ~ PCT~R94/00080
ATA AAT AAC TTG CCC GTA GGC ATC CAG TTT ATT TCT GAT TTT CAC AAT 1320
Ile Asn Asn Leu Pro Val Gly Ile Gln Phe Ile Ser Asp Phe His Asn
385 39 395
GAG GAA ATT CTT TTC CAG GCG TGT AAT CTT CTA CAG AAA TCA TTT TTA 1368
Glu Glu Ile Leu Phe Gln Ala Cys Asn Leu Leu Gln Lys Ser Phe Leu
400 405 410
GCG AAA GGT AAT TAAATGAAAT TCAAGATCAA AACCACTTTG TGTGCGTCAT 1420
Ala Lys Gly Asn
415
TGTTATGCTT ATCTGGCTTG GCTCAAGCCG CATATCCCTC TAAGAATATT ACCCTTGTGG 1480
TTCCA m CC T 1491
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 418 acides amines
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: ]; né~; re
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SE W ENCE: SEQ ID NO: 3:
Met Ile Glu Asn Ile Ile Ala Lys Leu Lys Asn Ile Leu Glu Ser Asn
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Ile Ser Leu Asp Leu Val Asp Val Ser Lys Gln Leu
3
Lys Lys Gln Asp Ser Asn Gln Pro Leu Asn Gly Val Thr Val Ala Ile
Lys Asp Leu Ile Asp Val Glu Gly Gln Lys Thr Thr Met Gly Ser Ala
Gln Tyr Gln Asn Asn Ile Ala Arg Ser Asp Ala Asp Val Val Arg Arg
Leu Arg Thr Ala Gly Ala Val Ile Phe Gly Lys Thr Asn Thr His Glu
Phe Ala Tyr Gly Ser Thr Gly Asp Lys Ser Phe Phe Gly Pro Val Leu
100 105 110
Asn Pro Asn Asn Glu Asn His Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser
115 120 125
~IILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
21~37~3
WO 94117190 ~ PCT~R94/00080
Ala Ala Ala Val Ala Ala Asp Leu Cys Asp Val Ala Ile Gly Thr Asp
130 135 140
Thr Ala Ala Ser Val Arg Leu Pro Ala Ala Leu Cys Gly Val Ile Gly
145 150 155 160
Leu Lys Pro Thr Tyr Asn Ser Ile Lys Arg Asp Gly Val Phe Ser Leu
165 170 175
er Pro Ser Leu Asp His Val Gly Ile Ile Ser Lys Ser Leu Asp Leu
180 185 190
Ile Glu Lys Thr Phe Asn Ser Thr Lys Thr Ser Ile Asp Gln Lys Pro
195 200 205
Gln Lys Asn Leu Asp Lys Lys Leu Thr Ile Gly Leu Leu Lys Gly Phe
210 215 220
Phe Glu Glu Tyr Ile Cys Ser Ser Val Lys Glu Lys Tyr Asp Glu Thr
225 230 235 240
Ile Glu Leu Leu Arg Ser Asn Gly Cys Glu Ile Lys Glu Ile Asn Ile
245 250 255
ys Glu Ala Phe Asp Ile Tyr Thr Asn Ser Gln Ile Val Leu Lys Tyr
260 265 270
Glu Ala Tyr Lys Ile His Glu Glu Ser Leu Lys Leu Asn Tyr Pro Phe
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Gly Arg Ile Leu Arg Gly Glu Asn Ile Thr Lys
290 295 300
Asp Glu Tyr Asp Ile Ala Lys Lys Tyr Gln Glu Asn Ala Arg Ile Ile
305 310 315 320
Phe Asp Thr Ala Leu Lys Asp Val His Val Leu Ala Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Gly Ile Leu Pro Pro Lys Ile Phe Glu Arg Gln Thr Lys Val Asn Glu
340 345 350
Asn Thr Val Glu Thr Phe Phe Leu Leu Thr Arg Leu Thr Ala Pro Ile
355 360 365
Asn Phe Thr Gly His Pro Ala Ile Ser Tyr Pro Ile Gly Lys Ile Asn
370 375 380
Asn Leu Pro Val Gly Ile Gln Phe Ile Ser Asp Phe His Asn Glu Glu
385 390 395 400
le Leu Phe Gln Ala Cys Asn Leu Leu Gln Lys Ser Phe Leu Ala Lys
405 410 415
ly Asn
~EUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
~lS37~3
WO 94/17190 , 36 PCTn~R94/00080
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
ATGATHGARA AYATHATHGC 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 7 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: 1; néA; re
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Met Ile Glu Asn Ile Ile Ala
FEUtLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
