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21~12~
WO95/~W~g PCTtFR94/00768
F~M~NT D'ADN DE CLOSTRIDIUM BIFERMENTANS PORTANT ~E8
GENES CODANT POUR DE8 PRO,~:l~S ASSOCIEES A UNE
A~-.lvl.~ INSECTICIDE.
L'invention est relative à de nouvelles toxines
isolees à partir d'une souche de bactérie anaérobie de
l'espèce Clostridium bifermentans. La souche CH18 de
Clostridium bifermentans serovar malaysia (Cbm), a été
décrite par H. de Barjac et M. Sebald, dans C.R. Acad.
Sci. Paris t. 310, Série III, p. 383-387, 1990.
Elle présente une activité toxique pendant la
phase de sporulation par l'intermédiaire de toxines
ayant un pouvoir larvicide vis-à-vis de larves
d'arthropodes, en particulier d'insectes et notamment
vis-à-vis de larves de Diptères, par exemple de larves
de Moustiques ou de Simulies. Ces Diptères particuliers
sont vecteurs de maladies ou provoquent des nlliCAnc~s.
Jusqu'à présent, on connaissait les toxines
spécifiques de bactéries de l'espèce Bacillus
thurinqiensis ou de l'espece Bacillus sphaericus pour
leur activité entomopathogene et notamment leur
activité toxique, vis-à-vis de larves de moustiques
(Nicolas (1992). Pes. agropec. bras., Brasilia, abr.
1992, 27, 37-46). En dépit de l'intérêt manifeste de
ces toxines de Bacillus pour lutter contre les insectes
et notamment les larves d'insectes, la recherche de
nouvelles toxines actives vis-à-vis de certains
insectes, s'avérait importante notamment dans le but
d'offrir des moyens pour lutter contre le risque de
développement d'une résistance vis-à-vis de ces
produits a activité larvicide. Dans ce contexte, les
inventeurs ont mis en évidence chez une bactérie de
l'espèce Clostridium bifermentans, l'existence d'une
activité larvicide. A cet egard, l'invention propose
pour la première fois des toxines presentes chez des
bactéries anaérobies, susceptibles d'avoir une activité
WO95/~h~9 PCT~94/00768
216612'1
toxique et en particulier larvicide vis-à-vis
d'arthropodes, et en particulier d'insectes de type
Diptère. La souche de Clostridium bifermentans
serovariété malaysia utilisée présente une inocuité
vis-à-vis des mammifères et des poissons testés ainsi
que vis-à-vis de tous les organismes aquatiques en
dehors de la cible naturelle de l'activité larvicide de
Cbm (Thiery et al. (1992) J.econ.Entomol. 85(5),
1618-1623). L'existence de l'activité larvicide de Cbm
a déjà été observée et associée dans l'art antérieur
avec les cellules sporulantes (Charles et al. (199O)
Res. Microbiol. 141, 721d-733). Il a également été noté
que cette activité diminue très fortement après la lyse
cellulaire en raison de l'inactivation par des
protéases cellulaires (Nicolas et al (1990). Appl.
Microbiol. Biotechnol. 34, 36-41).
L'invention a donc pour objet des séquences
nucléotidiques codant pour des polypeptides
susceptibles de participer à l'activité toxique vis-à-
vis de larves d'arthropodes et en particulier
d'insectes, notamment de Diptères tels que les
Moustiques ou les Simulies.
L'invention vise également ces polypeptides ainsi
que des cellules recombinantes contenant les séquences
nucléotidiques et les fragments de nucléotides de
l'invention, dans des conditions permettant leur
expression.
Entrent également dans le cadre de la présente
demande, des anticorps reconnaissant les polypeptides
de l'invention, ainsi que des compositions à activité
larvicide.
Une sequence nucléotidique de l'invention est
caracterisée par les propriétés suivantes :
- elle comprend tout ou partie du fragment d'ADN
XbaI de 7 kb représente à la figure 4A, tel qu'obtenu à
FEUILLE DE REMPL~CEMENT (REGLE 26~
wo gs/oo~g ~ 12 ~ PCT~R94/00768
partir du plasmide pCBMl déposé à la CNCM le 15 Juin
1993 sous le n I-1317 ;
- elle hybride avec la sonde oligonucléotidique
18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde
oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA
GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT
ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA
IAT CCA TTC ATC) dans- des conditions stringentes
décrites dans la partie expérimentale :
- elle code pour une protéine, un polypeptide ou
un peptide ayant la capacité de participer à l'activité
toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7
kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de
larves de Moustiques ou de Simulies.
On définit l'activité toxique dans le cadre de
l'invention, par rapport à la "cible" sur laquelle on
veut obtenir cette activité. Cette "cible" est de façon
générale un arthropode et plus particulièrement un
insecte, notamment de la famille des Diptères et par
exemple, une larve de Moustique ou Simulie.
On considèrera dans le cadre de l'invention qu'une
séquence de nucléotides code pour une protéine ou un
polypeptide ayant la capacité de participer à
l'activité toxique des produits d'expression du
fragment XbaI de 7 kb contenu dans le plasmide pCBMl
déposé à la CNCM sous le n I-1317, des lors que la
délétion ou l'altération de cette séquence au sein
dudit plasmide entraine une diminution ou une
suppression de l'activité toxique vis-à-vis de larves
de Diptères et en particulier de larves de Moustiques
ou de Simulies, constatée lorsque ce plasmide est
introduit dans une cellule recombinante n'ayant pas
naturellement d'activité larvicide, par exemple une
cellule de Clostridium bifermentans.
WO95/00~9 PCTIFR94/00768
216612~
D'autres cellules recombinantes, telles que celles
décrites par Delécluse A. et al (1988) Mol. Gen. Genet.
214:42-47) peuvent être mises en oeuvre.
L'indication relative à l'activité toxique vis-à-
vis des larves de Diptères ne doit en aucune façon être
considérée comme restrictive s'agissant du spectre
d'action, des moyens de l'invention. Elle constitue
uniquement une référence pour l'évaluation de
l'activité des produits de l'invention.
L'activité toxique peut être évaluée en mesurant
la LC50 (dose léthale pour 50% des insectes ou plus
généralement de la "cible" sur laquelle on veut évaluer
l'activité toxique).
Différents tests ont déjà été proposés dans l'art
antérieur pour détecter l'activité larvicide de souches
de bactéries susceptibles de produire des toxines. A
cet égard, on pourra se reporter à la publication de
Thiery, I. et al. (1992) Journal of American Mosquito
Control Association, vol. 8, n 3, 272-276.
Dans le cadre de la définition donnée ci-dessus,
une séquence nucléotidique selon l'invention peut coder
pour une protéine, un polypeptide ou un peptide
nécessaire à l'induction de l'activité larvicide ou/et
peut coder pour une protéine, un polypeptide ou un
peptide influençant le niveau de l'expression de la
toxicité vis-à-vis d'une cible donnée. Comme on l'a dit
précédemment, des tests effectués avec des cellules
recombinantes naturellement dépourvues d'activité
larvicide, transformées par le plasmide pCBM1 dans des
conditions permettant l'expression des gènes contenus
dans le fragment d'ADN inséré, peuvent être utilisés
comme base de comparaison pour tester l'activité
larvicide de proteines ou parties de protéines
exprimées par une séquence nucléotidique selon
l'invention.
wo gs/ow~g 216 S 12 '1 PCT/FR94/00768
Les termes "protéine", "polypeptide" et "peptide"
désignent dans le cadre de la demande, toute séquence
d'acides aminés, cette séquence pouvant en outre être
modifiée par des groupements de nature non protéique.
Pour faciliter la rédaction, ces protéines,
polypeptides et peptides pourront être ~e~-oupés dans
l'expression "polypeptides".
Selon un mode de réalisation avantageux de
1'invention, une séquence nucléotidique particulière
est caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre
sondes 16A, 18A, 66A et 66B, dans des conditions
stringentes. Les conditions stringentes dont il est
question ici, sont décrites dans le détail dans la
partie expérimentale de la présente demande.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention,
une séquence particulière est caractérisée en ce
qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et
66B, dans des conditions non stringentes (moins
stringentes par rapport aux conditions données plus
loin au titre des conditions stringentes).
L'invention concerne en particulier la séquence
nucléotidique caractérisée en ce qu'il s'agit du
fragment XbaI de 7 kb du plasmide pCMBl déposé à la
CNCM sous le n I-1317.
Selon un mode de réalisation particulier,
l'invention a pour objet une sequence de nucléotides
choisie parmi les enchaînements désignés par les
expressions Seql, Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3, représentés à
la figure 6.
L'invention vise également une séquence
nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride avec
l'une des séquences précedemment décrites, en ce
qu'elle est présente dans l'ADN d'une bactérie de
l'espèce Clostridium bifermentans, et en ce qu'elle
code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide
ayant la capacité de participer à une activité toxique
WO95/Oh~9 PCT~94100768
2~661~ ~
vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier vis-
à-vis de larves de Moustiques ou de Simulies.
Les séquences nucléotidiques de l'invention
peuvent être isolées par exemple à partir de bactéries
anaérobies de l'espèce Clostridium bifermentans et en
particulier à partir de la souche Clostridium
bifermentans malaysia. Elles peuvent également être
synthétisées par voie chimique selon les techniques
classiques.
Par ailleurs, ces séquences nucléotidiques peuvent
être constituées par de l'ADN simple ou double brin,
par de l'ADNc ou encore par de l'ARN.
L'invention a également pour objet selon un mode
de réalisation particulier, une séquence nucléotidique
caractérisée en ce qu'elle contient des fragments
codant pour les séquences d'acides aminés suivantes :
M N T N I F S T N L et/ou pour
N N D E W I Y G E P D S S N I et/ou pour
M N N (X) C E V N C E (X) T et/ou pour
N A S L T W G K et/ou pour
F E L et/ou pour
Q W V K et/ou pour
E N T A S G T E et/ou pour
I E Y H N N L R et/ou pour
A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I et/ou pour
D I P I S P E D I S K.
L'identification des sequences d'acides aminés est
effectuée en ayant recours au code à une lettre pour la
désignation des acides aminés.
L'invention se rapporte aussi à un fragment de
nucléotides contenu dans l'une des séquences ci-dessus
définies, caractérisé par les propriétes suivantes :
- il comprend le fragment XbaI-EcoRV du fragment
XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans
le plasmide pCMB1 dépose à la CNCM sous le n I-1317,
FEUILLE DE REMPLACEMENT ~REGLE 26)
WO 95/OK~g ~16 612 ~1 PCT~94/00768
- il a une taille d'environ 1,8 kb et il code pour
une protéine ayant un poids moléculaire de 66 kDa.
Un fragment de nucléotides préféré codant pour une
protéine de 66 kDa est caractérisé en ce qu'il contient
une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés
M N T N I F S T N L à son extrémité NH2-terminale, et
une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés
N N D E W I Y G E P D S S N I comme fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon
l'invention, contenu dans l'une des séquences
précédemment définies, est caractérisé par les
propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec
la sonde 16A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb
représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide
pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,5 kb ;
- il code pour une protéine P16 ayant un poids
moléculaire d'environ 16 kDa.
Un fragment préféré codant pour une protéine ayant
un poids moléculaire d'environ 16 kDa (protéine P16)
est en outre caractérisé en ce qu'il contient une
séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés A Y
(R) Q W V K F H I E A V N E G L K I à son extrémité
NH2-terminale et une séquence codant pour
l'enchainement d'acides aminés D I P I S P E D I S K en
tant que fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon l'invention
contenu dans l'une des séquences precédentes, est
caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P20
ayant un poids moléculaire d'environ 20 kDa, précurseur
de la protéine P16, P20 etant synthétisée pendant la
phase de sporulation de bactéries de l'espece C.
bifermentans, en particulier de Cbm.
FE'~'ILLE DE REMPLACEMENT (~EG!E 26)
W095/OK~9 PCT/FR94/00768
21 6~1~4
-
L'invention a également pour objet un fragment de
nucléotides contenu dans l'une des séquences
precédentes, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec
la sonde 18A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb
représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide
pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,55 kb ;
- il code pour une protéine P18 ayant un poids
moléculaire d'environ 18 kDa.
Un tel fragment peut de façon préférée être
caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant un
poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il
contient une séquence codant pour l'enchainement
d'acides aminés M N N (X) C E V N C E (X) T à son
extrémité NH2-terminale et des séquences codant pour
les enchaînements d'acides aminés N A S L T~W G K, F E
L, Q W V K, E N T A S G T E, et I E Y H N N L R en tant
que fragments internes.
Font également partie de l'invention des vecteurs
recombinants caractérisés en ce qu'ils contiennent une
séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides
répondant aux définitions précédentes, cette séquence
ou ce fragment étant inséré en un site non essentiel
pour la réplication du vecteur. Avantageusement ces
vecteurs sont des plasmides.
Un vecteur particulier est caractérisé en ce qu'il
s'agit du plasmide pCBMl déposé a la CNCM sous le n
I-1317.
Un autre vecteur recombinant selon l'invention,
est le plasmide pHT316 résultant de l'introduction dans
le plasmide pHT315 (Arantes et Lereclus, 1991, Gene,
108: 115-119), d'un fragment BamHI-EcoRI de 0,5 kb
(Nicolas et al (1993) FEMS Microbiol. Letter 106,
275-280) contenant le promoteur de la cytolysine de B.
FEIJ'' LE DE RE~ilPLACEMENT (RE~LE 26)
WO95/OK~9 ~ PCT~94/00768
thuringiensis (Ward et Ellar, 1986, J. Mol. Biol.,
l91:1-11). Ce vecteur peut être modifié par la séquence
Cbm.
Le plasmide pHT316 permet avantageusement la
surproduction chez Bt, des protéines de Cbm, toxiques
vis-à-vis des insectes.
L'invention a également pour objet des cellules
hôtes recombinantes procaryotes ou eucaryotes,
caractérisées en ce qu'elles contiennent une séquence
ou un fragment répondant à l'une des définitions
données ci-dessus, ou encore un vecteur de l'invention
dans des conditions permettant le clonage et/ou
l'expression de ladite séquence ou dudit fragment.
Un hôte particulier peut être une cellule
bactérienne, par exemple une souche de Clostridium
bifermentans, une souche de Bacillus thurinqiensis ou
une souche de Bacillus sphaericus.
S'agissant de B. thuringiensis, on fera référence
à la publication de Lereclus D. et al (1989), FEMS
Microbiology Letters 60, 211-218, dans laquelle la
technique de transformation (par introduction des gènes
de toxines dans Bt) de B. thuringiensis est décrite.
S'agissant de B. sphaericus, on se reportera par
exemple à la publication de Taylor L.D. et al (1990)
FEMS Microbiology Letters 66, 125-128.
Une autre cellule selon l'invention peut être une
cellule eucaryote par exemple une cellule végétale.
L'invention a également pour objet un polypeptide
ou une composition de polypeptides, caractérisé en ce
qu'il est code par une séquence nucléotidique ou un
fragment de nucléotides défini(e) précédemment.
Un polypeptide particulier selon l'invention est
impliqué dans une activité larvicide vis-à-vis de
- larves de Dipteres, notamment de Moustiques ou de
Simulies, et est caractérisé par les proprietés
suivantes :
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO95/~h~9 PCT/FR94/00768
2~6124
- il est caractéristique d'une bactérie anaérobie
de l'espèce Clostridium bifermentans ;
- il ne produit pas de réaction immunologique avec
des sérums dirigés contre les protéines du cristal de
B. thuringiensis israelensis ou de B. sphaericus.
Les polypeptides de l'invention comprennent
notamment une première protéine caractérisée en ce
qu'elle a un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en
ce qu'elle est le produit de l'expression dans une
cellule recombinante d'un fragment de nucléotides
hybridant avec l'oligonucléotide 16A dans des
conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans
la séquence NsiI-XbaI du fragment XbaI contenu dans le
plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numero I-1317.
Une autre protéine de l'invention est caractérisée
en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 18 kDa
et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans
une cellule recombinante d'un fragment de .nucléotides
hybridant avec l'oligonucléotide 18A dans des
conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans
la séquence EcoRI-XbaI du fragment XbaI contenu dans le
plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numéro I-1317
et décrit à la figure 4A.
Une troisième protéine selon l'invention est
caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire
d'environ 66 kDa et en ce qu'elle est le produit de
l'expression dans une cellule recombinante d'un
fragment de nucléotides hybridant avec
l'oligonucleotide 66A et/ou 66B dans des conditions
stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence
XbaI-EcoRI du fragment XbaI contenu dans le plasmide
pCMB1 déposé à la CNCM sous le numéro I-1317.
L'invention concerne aussi des fragments
polypeptidiques des proteines P16, P18 ou P66, ou tout
fragment tel qu'obtenu à partir des protéines
précédemment définies dès lors qu'il est impliqué dans
FE.JI' ~ E DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
W095/0063g ~ 12 ~ PCT~R94/00768
une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères
notamment de Moustiques ou de Simulies.
Entrent notamment dans le cadre de l'invention,
les séquences polypeptidiques codées par les séquences
de nucléotides Seql, Seq2.1, Seq2.2, Seq3 ou Seq4.
Une autre séquence d'intérêt est la séquence
d'acides aminés correspondant au gène cbmll telle que
représentée à la figure 6_
Selon un autre mode de réalisation de l'invention,
un polypeptide de l'invention est caractérisé en ce
qu'il est reconnu par des anticorps dirigés contre la
protéine P16 et/ou par des anticorps dirigés contre la
protéine P18 et/ou par des anticorps dirigés contre la
protéine P66.
Des polypeptides particuliers de l'invention sont
par exemple des polypeptides comprenant une séquence
d'acides aminés codée par l'un des enchaînements Seql,
Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3 et reconnus respectivement par
des anticorps anti-protéine P66 pour le polypeptide
comprenant au moins l'une des séquences Seql, Seq2.1 ou
seq2.2 et par des anticorps anti-protéine P16 ou anti-
protéine P18 pour le polypeptide comprenant la séquence
Seq3.
La demande concerne également un polypeptide
caractérisé en ce qu'il est modifié par addition,
délétion, substitution d'acides aminés des lors qu'il
conserve la capacité du polypeptide correspondant non
modifié à intervenir dans l'activité toxique vis-a-vis
de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de
Simulies.
La présente demande vise aussi des compositions de
polypeptides caractérisées en ce qu'elles comprennent
par exemple la protéine P16 et la protéine P18 ou en ce
qu'elles comprennent les protéines P16, P18 et P66.
Ces protéines sont de préférence sous forme
purifiée, le cas échéant co-purifiee, soit après
W095/O~g - PCT/FR94/00768
l ?~ 'i
12
isolement à partir d'une souche, soit après expression
dans un hôte cellulaire recombinant.
L'invention concerne aussi un extrait protéique
ayant une activité larvicide vis-à-vis de larves de
Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies tel
qu'obtenu par :
- culture de Clostridium bifermentans à 34-C en
anaérobiose en milieu TYG dans un courant gazeux
contenant 5% H2, 5 CO2 et 90% N2,
- récupération de la culture en fin de
sporulation, environ après 16 h,
- lavage de la culture avec NaCllM,
- rinçage 2 fois avec un tampon TE,
- récuperation du culot qui constitue l'extrait.
Une composition particulière de polypeptides selon
l'invention peut aussi être caractérisée en ce qu'elle
a l'activité larvicide d'un extrait brut tel que défini
ci-dessus.
La présente demande a également pour objet des
anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine selon
les définitions ci-dessus données.
Elle vise également un antisérum polyclonal
caractérisé en ce qu'il est dirige contre une protéine
de l'invention ou contre une composition de ces
protéines ou encore contre un extrait tel que décrit
ci-dessus.
Les séquences nucléotidiques ou fragments selon
l'invention permettent également la préparation de
sondes nucléotidiques, obtenues par marquage selon les
techniques classiques des fragments ou sequences ci-
dessus décrits.
Entrent également dans le cadre de l'invention,
des compositions à activité larvicide comprenant à
titre de principe actif, un ou plusieurs polypeptides
selon l'une quelconque des définitions données
précédemment.
WO gS/OK~9 ~ 2 l1 PCTn~94/00768
D'autres compositions à activité larvicide selon
l'invention peuvent également être caractérisées en ce
qu'elles comprennent à titre de principe actif, des
cellules recombinantes répondant aux définitions
précédemment données.
De telles compositions peuvent en outre comporter
des cellules recombinantes modifiées par des séquences
codant pour un ou plusieurs polypeptides à activité
larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
On peut également envisager selon l'invention de
préparer des cellules recombinantes contenant à la fois
des gènes ou séquences nucléotidiques ou fragments
codant pour une protéine répondant aux définitions ci-
dessus et contenant en outre une séquence à activité
larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
D'autres caractéristiques et avantages de
l'invention apparaissent dans les exemples et les
figures qui suivent.
Fiqures 1 à 3: Relations immunoloqiques, distribution
et cinétique de synthèse de P66, P18 et P16.
Fiqure 1 : SDS-PAGE de l'extrait toxique de Cbm. Les
poids moléculaires de protéines standard sont indiqués
dans la marge droite (en kDa).
Fiqure 2 : Détection des protéines P66, P18 et P16 dans
C et dans des souches de C. bifermentans non
toxiques. Des échantillons de 100 ~1 de cultures
sporulées, ont été soumis à une électrophorèse sur gel
de polyacrylamide (SDS-PAGE), transférées sur une
membrane de nitrocellulose et soumis à immunodétection
avec des IgG purifiées par affinité dirigées contre P66
(A66), P18 (A18) ou P16 (A16). Puits a, Cbm; puits b,
souche ATCC 638; puits c, souche 744-83; puits d,
souche VPI 4407; puits e, souche VPI 4413A.
W095/0h~9 PCT~94/00768
2166:L2ll
14
Fiqure 3 : Cinétique de synthèse de P66, P18 et P16 au
cours de la sporulation de Cbm, à 34C (haut) ou à 42C
(bas), en conditions anaérobies. Des aliquots de 100 ~1
de culture ont été soumis à une électrophorèse sur gel
de polyacrylamide (SDS-PAGE), transférés sur une
membrane de nitrocellulose et soumis à immunodétection
avec des IgG purifiées par affinité, dirigées contre
P66 (A66), P18 (A18) ou P16 (A16). Temps de culture en
heures : a, 4.5; b, 6 (correspondant au to de
sporulation); c, 7.5; d, 9; e, 10.5; f, 13; g, 30. Les
poids moleculaires de protéines standard sont indiqués
dans la marge (en kDa).
Fiqures 4A et 4B : Structure du plasmide pCBMl et carte
de restriction du fragment XbaI.
Fragment XbaI : Bg : BqlII; N : NsiI; P : PvuII; R :
EcoRI; Rv : EcoRV; X : XbaI
Site de clonage :
H : HindIII; S : SphI; Ps : PstI; Sal :~SalI; Bm :
BamHI; Sm : SmaI; K : KpnI; Sst : SstI; R : EcoRI.
Les parties hachurées à droite et à gauche du fragment
XbaI sont des fragments du plasmide vecteur pHT304
(Arantès 0. et al (1991), Gene, 108, p. 115-119).
Les fragments sur lesquels hybrident les sondes
oligonucléotidiques sont représentés en traits
hachurés, sous le fragment XbaI.
La flèche correspond à l'extrémité 5' du gène de P16
hybridant avec la sonde 16A.
Enzymes n'ayant pas de sites de restriction dans le
fraqment XbaI :
BamHI, HindIII, PstI, SstI, SalI, SmaI.
Fiqure 5 : Localisation des oligonucléotides utilisés
pour le séquençage des séquences lues.
Séquences des oligonucléotides utilisés :
16A': complémentaire 16 A: : acc cat tgt cta tat gc
16B : oligon 16 B non dégénéré: ggagat atc gga atg tc
16B': complémentaire 16 B' : ccg ata tct cct gaa ga
FEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
W095/~h~9 2 16 6 12 ~ PCT~94/00768
18 B : oligo 18 B non dégénéré : tct gta ccg gaa gca gt
18 B': complémentaire 18 b : gct tcc ggt aca gaa gg
66 C-R: aac cct aca tct gtt aa
66 D-A: tac tac cat agt ttc ca
66 E-A: tgc aaa gcc aag ttg at
Légende
fragment Xba inséré, issu de l'ADN de Cbm
Amorce "reverse" R-48
Amorce "universelle" - 40
Polylinker du pUC 19
Amorces nucléotidiques de synthèse ()
Vecteur navette pHT 304
Fiqure 6 : Séquences de nucléotides lues.
6A: Seq.l, lue à l'aide de l'amorce réverse R-48.
6B: Seq.2.1, lue à l'aide de l'amorce 66C-R.
6C et 6D: Seq.2.2, lue avec les amorces 66B, 66D-A et
66E-A.
6E à 6G: Gène Cbm, lu avec les diverses amorces "16 et
18".
6H et 6J:-SEq4, lue avec l'amorce universelle R-40.
Fiqure 7: Séquence d'acides aminés correspondant au
gène Cbmll et localisation des séquences NH2-terminales
et internes des protéines P18 et P16.
Figure 8 : Localisation des copies de cbm 11 sur le
fragment XbaI.
Figure 9A et 9B : Localisation du fragment XbaI sur le
plasmide résident.
Ligne 1: Marqueur de taille CCC de 16 a 2,06 Kb
Ligne 2: Préparation des plasmides de Cbm CH 18, natifs
Ligne 3: Préparation des plasmides de Cbm CH 18,
hydrolysés par Xba
Sonde utilisée : pCBMl
Fiqure 10 : Expression des gènes introduits dans pCBMl,
chez E.coli
Ligne 1 : E.coli + pHT 304 (vecteur navette utilisé)
Ligne 2 : E.coli + pCBM 1
FEUlLLE DE REMPLA~EMENT (REGLE 26)
W095/OW~g PCT~94/00768
~16~2 l ~
16
Sonde utilisée : anticorps anti Cbm total.
Fiqures llA, llB et llC : Homologies de séquence
trouvées entre la protéine Cbm 11 et les protéines
décrites dans la banque de données Swissprot.
MATERIELS ET METHODES
Préparation de l'extrait
Un extrait a été préparé à partir d'une culture de
Cbm réalisée à 34C en anaérobiose en milieu TYG (à
base de Biotrypcase 3%, extrait de levure 2%, glucose
0,5 a 1%, chlorydrate de cystéine 0,05%) dans un
fermenteur ayant une capacité de 6 litres, en présence
d'un courant gazeux contenant 5% H2, 5% CO2 et 90% N2.
La culture bactérienne sporulante a été récoltée après
16 h, en fin de phase de sporulation. La culture a
ensuite été lavée avec lM NaCl, rincée 2 fois avec 20
mM Tris HCl, 5mM EDTA, pH8 (tampon TE) et {conservée à
-70C jusqu'à l'utilisation. Les culots congelés ont
été décongelés resuspendus dans un tampon TE traité
dans un sonicateur pendant une durée totale de 1 minute
comprenant un temps réel de sonication de 15 secondes
sur la glace (Sonicateur Branson, grande sonde, échelle
de sortie 40%, durée du cycle de sonication ("duty
cycle": 25%) et centrifugés à 5000 g pendant 15 min. Le
surnageant résultant (correspondant à l'extrait brut de
protéines) a été recueilli.
Analyse des protéines
La concentration en protéines de l'extrait a été
déterminée en utilisant le test Biorad de protéine avec
l'albumine sérique bovine comme standard. Une
électrophorèse sur gel de polyacrylamide a été realisee
selon la technique de Laemmli, U.K. (1970) (Nature 227,
680-685) sur des gels de polyacrylamide a 13%. Les
marqueurs de poids moleculaires utilisés dans cette
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
W095/Oh39 PCT~V4/00768
21~12~
17
analyse des protéines par SDS-PAGE en conditions
dénaturantes sont ceux du kit Pharmacia
d'électrophorèse de protéines (LMW Ref. 17-0446-01),
contenant les protéines suivantes : phosphorylase B (de
masse moléculaire 94000 daltons), albumine (67000),
ovalbumine (43000), anhydrase (30000) inhibiteur
trypsique (20100) et alpha lactalbumine (14000).
Préparation des antisera contre les protéines de
Cbm
Des antisera polyclonaux contre l'extrait brut de
protéine de Cbm ont été obtenus chez des lapins après
deux séries de 10 à 15 microinjections intradermiques
de 500 ~g de protéines émulsifiées dans l'adjuvant
complet de Freund, à 3 semaines d'intervalle. Les
lapins ont reçu des injections sous-cutanées d'une dose
de rappel sans adjuvant de Freund, 3 semaines après.
Les IgG ont été purifiées à partir des sérums par
précipitation au sulfate d'ammonium et chromatographie
sur une colonne DEAE-52 (Whatmann) puis conservés à
4C.
Des antisera polyclonaux contre les polypeptides
individualisés dénaturés P66, P18 et P16 ont été
produits chez les lapins selon la manière suivante :
les trois protéines ont été séparées par électrophorèse
préparative SDS-PAGE et détectées avec du KCl lM. Les
bandes ont été découpées sur les gels et les bandes
d'acrylamide découpées ont été rincées avec de l'eau
déionisée, puis plongées dans l'eau, émulsifiées avec
de l'adjuvant complet de Freund et injectées aux lapins
selon la technique décrite précédemment. Apr~es
récupération des antisera, les IgG ont été purifiées
par affinité sur des bandes de nitrocellulose contenant
le polypeptide utilisé pour l'injection aux lapins,
selon la technique de Burke et al (1982). EMB0 J. 1,
1621-1628.
FEUI! LE ~E R'-MPLACEM,-NT (REGLE 26)
WO95/OW~9 PCT~94/00768
~ . .
~6612il
18
Hydrolyse enzymatique de l'extrait de Cbm
Pour rechercher la toxicité de l'extrait, 500 ~1
d'aliquots de l'extrait (400 ~g) ont été chacun traités
pendant deux heures à 37-C avec l'une des enzymes
suivantes : protéinase K (EC 3.4.21.14, Boehringer,
40~g/ml), ribonucléase type I-A (EC 3.1.27.5, Sigma,
100 ~g/ml) et déoxyribonucléase I (EC 3.1.21.1,
Boehringer, 100 ~g/ml).
L'activité larvicide a été testée sur des larves
de Anopheles stephensi au troisième stade larvaire.
Fractionnement de l'extrait protéique
Les extraits bruts de protéines ont éte filtrés
sur un filtre HA-Millex contenant des pores de 0.45 ~m
(Millipore) et soumis à une chromatographie liquide à
haute résolution (FPLC2, Pharmacia). Une
chromatographie par échange d'ions a été réalisée sur
une colonne Mono Q HR 10/10 équilibrée avec un tampon
TE. Les protéines ont été éluées avec un gradient
multi-étapes contenant de 0 à lM NaCl. Une filtration
sur gel a été réalisée sur une colonne Superdex 200
HiLoad 16/60 dans un tampon TE contenant 150 mM NaCl
(tampon TES). Les fractions ont été analysées par
électrophorèse (SDS-PAGE) après précipitation des
protéines avec 10% d'acide trichloracétique.
Test de neutralisation et immunoprécipitation
La capacité des différents antisera d'inhiber
l'activité larvicide de l'extrait a été testée selon la
méthode suivante : des dilutions en série de l'extrait
ont été incubées avec un volume fixe d'IgG anti-extrait
dans un tampon TE à 20C pendant 1 heure. La toxicité
des échantillons et des échantillons de contrôle non-
traités a été testée en utilisant des larves de A.
stephensi. Des tests de neutralisation ont été
W095/OW~9 21~ l PCT~94/00768
également réalisés dans les mêmes conditions avec les
antisera ou les anticorps purifiés par affinité,
dirigés contre les protéines dénaturées P66, P18 ou
Pl6. Les protéines ont été immunoprécipitées à partir
de l'extrait avec les antisera dirigés contre l'extrait
ou contre les protéines individuelles P66, P18 ou P16
dénaturées par la technique de Howe et al, ((1982).
Mol. Gen. Genet. 186, 525-~30), en utilisant des billes
de Protéine A Sepharose (Sigma) comme porteurs.
Cinétique de la synthèse de P66, P18 et P16
Cbm a poussé dans des flacons scellés de 1 litre,
contenant 800 ml de milieu liquide TYG, avec une
agitation magnétique douce, soit à 34C soit à 42C.
Des échantillons de 30 ml ont été récupérés à 9o
minutes d'intervalles sans renouveler la teneur en gaz
par ponction à travers un bouchon en caoutchouc. Les
échantillons ont été centrifugés, rincés comme décrit
précédemment et les culots de centrifugation ont été
gardés a -70C jusqu'à l'analyse de l'activité
larvicide et de la teneur en protéines par
électrophorèse SDS-PAGE. Les expériences
d'immunodétection ont été réalisées après
électrotransfert sur une membrane Hybond-C Super~
(Amersham). P66, P18 et P16 ont été détectées avec les
IgG purifiées par affinité dirigées contre chaque
protéine (A66, A18 et A16) et visualisées avec un
système de détection en Western blot ECL~ (Amersham).
Pour la comparaison, les cultures ont été réalisées à
34C et 42C dans des flacons dans lesquels un échange
de gaz était possible.
Criblaqe de P66, P18 et P16 dans des souches C.
bifermentans non larvicides
WO95/OK~9 ` PCTn~94/00768
1 2 '~ `
Les souches non larvicides de C. bifermentans
(souche type ATCC 638, 744-83, VPI 4407 et VPI 4413A
ont été criblées par immunodétection pour rechercher la
présence de P66, P18 et P16. Ces souches ainsi que la
souche Cbm ont été cultivées dans des flacons scellés
contenant 50 ml de milieu TYG, à 34C et récupérées
après 15h lorsque la sporulation était complètement
terminée mais avant la lyse cellulaire.
Bioessais sur des larves de moustiques
Des échantillons de culture bactérienne ou des
extraits de protéine ont été testés sur 20 larves de
Culex pipiens au quatrième stade larvaire et/ou de A.
stephensi au troisieme stade larvaire dans des boites
en plastique de Petri d'une capacité de 6 ml. Les
mortalités ont été enregistrées après 24 h et 48 h
d'exposition.
Relations immunologiques avec les toxines de
Bacillus
Un extrait brut de Cbm a été testé avec des
antisera dirigés contre les cristaux de B.
thurinqiensis serovar israelensis 1884, B.
thurinqiensis serovar aizawai 7.29, B. thuringiensis
serovar thurinqiensis 1715 et B. thurinqiensis serovar
entomocidus HD9, ainsi que des antisera contre les
protéines de cristaux de 42 et 51 kDa de B. sphaericus
2362.
RES~LTATS ET DISC~SSION
L'extrait de Cbm contenait trois protéines
majeures de poids moléculaires apparents 66, 18 et 16
kDa, désignées par les abréviations P66, P18 et P16,
ainsi que différents composants mineurs de nature
protéique (Figs. 1 a 3).
W095/~W~9 ~ 6 ~1 2 ~ PCT~94/00768
1. Caractérisation des protéines P66, P18 et P16
L'extrait obtenu est toxique envers les larves des
moustiques Culex pipiens, Anopheles stephensi et Aedes
aegypti.
Sa LC50 après 48h contre A. stephensi au troisième
stade larvaire était de 5 ~g/ml. L'activité larvicide
de l'extrait a été perdue après incubation pendant 2h à
37C avec de la protéinase K. Au contraire, aucune
inactivation n'a été obtenue avec la DNase ou la RNase.
De plus, l'activité larvicide était totalement inhibée
par les IgG dirigées contre l'extrait total. Ainsi
l'activité larvicide est bien due à des toxines de
nature protéique au moins en partie.
Des antisera dirigés contre les protéines du
cristal entomopathogène de B. thurinqiensis ou B.
sphaericus n'ont pas donné lieu à une réaction croisée
avec les protéines de l'extrait de Cbm, indiquant que
les toxines de Cbm appartiennent à une nouvelle classe
de toxines insecticides.
P66, P18 et P16 sont les composants majoritaires
des extraits toxiques de Cbm.
P66, P18 ou P16 ne sont pas immunologiquement
apparentées (Figure 2, lignes a). P18 et P16 étaient
seulement présentes dans Cbm alors qu'une protéine de
66 kDa immunologiquement apparentée à P66 de Cbm a été
détectée dans 4 souches de C. bifermentans non-
entomopathogènes testées (Figure 2, lignes b à e).
La synthèse de P18 et de P16 dans une culture
effectuée à 34C, était concommitante avec la
sporulation de Cbm (figure 3) et l'apparition de
l'activité larvicide. P16 etait synthétisée sous forme
d'un precurseur de 20 kDa (P20), progressivement
converti en un polypeptide de 16 kDa lors de la lyse
cellulaire (Fig. 3).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO95/OK~9 PCTA~94/00768
216612ll
P18 et P20/P16 ne sont pas détectées
immunologiquement dans les souches de C. bifermentans
dépourvues d'activité larvicide (Fig 2).
P18 et P20/P16 sont très faiblement détectées dans
Cbm cultivée à 42C, dans les conditions où la bactérie
n'est pas toxique (Fig 3).
P66 était détectée dans des cellules de Cbm
pendant le stade végétatif et durant la sporulation.
Dans les cellules sporulantes, d'autres polypeptides
immunologiquement apparentés à P66 étaient détectés,
allant de 25 à 66 kDa (figure 3); ces polypeptides
pourraient être des produits de dégradation de P66.
La culture de Cbm a poussé à 42C sans échange
gazeux ; elle n'était pas toxique et contenait
seulement des traces de P18 et P16. Dans cette culture,
P66 était également synthétisée pendant la phase
végétative mais aucune protéine de poids moléculaire
inférieur n'a été détectée (Figure 3). Dans les
cultures avec échange gazeux, on ne relevait pas de
différence dans l'activité larvicide, la synthèse de
P66, P18 et P16 et la lyse du sporange, entre les
cultures effectuées à 34C ou à 42C.
Des essais de purification de chaque protéine ont
permis les constatations suivantes : la plus grande
partie de la toxicité était perdue après filtration,
avant la réalisation d'une chromatographie FPLC~, bien
que les extraits filtrés et non filtrés aient eu les
mêmes profils protéiques. Ceci suggère que l'activité
larvicide pourrait être liée à la présence d'aggrégats
proteiques ou de particules. Ceci a également été
observé pour les toxines de Bti ou de B. sphaericus qui
sont beaucoup plus actives sous forme d'aggrégats qu'en
solution (Schnell et al (1984). Science 223, 1191-1193
et Nicolas et al (1993). FEMS Lett. 106, 275-280). En
outre, avec la chromatographie FPLC~, soit sur colonne
d'echange d'ions, soit par filtration sur gel, les
FEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
wo gsto~g ~16 612 I PCTtFR94/00768
trois polypeptides P66, P18 et P16 coéluaient en
différents points. Des tests d'immunoprécipitation ont
montre que chacun des antisera individuels dirigés
contre P66, P18 ou P16 étaient capables de précipiter
les trois produits ensemble comme le faisaient des
anticorps préparés contre l'extrait brut. Des tests de
chromatographie et d'immunoprécipitation ont suggéré
que P66, P18 et P16 sont a-ssemblés en un complexe.
Des IgG dirigées contre les protéines P66, P18
et/ou P16 denaturées ne neutralisaient pas la toxicité;
en revanche des anticorps contre la fraction brute de
l'extrait neutralisaient la toxicité. Il est concevable
que des IgG dirigées contre les protéines dénaturées
étaient capables de reconnaitre le complexe P66-P18-
P16, mais ne reconnaissaient pas des épitopes ou des
domaines impliqués dans l'activité larvicide.
Ces expériences ont montré l'implication de P18 et
P16 dans l'activité larvicide. En effet, dans des
cultures de Cbm effectuées à 34-C, les deux protéines
sont synthétisées concommitamment avec l'apparition de
l'activité larvicide. Elles sont absentes des souches
non toxiques de C. bifermentans et présentes à un
niveau très bas dans des cellules non toxiques de Cbm
cultivées à 42-C. L'activité larvicide de Cbm a 42 C
est modulée par les conditions d'échange de gaz entre
la culture et le mélange de gaz anaérobique. L'absence
d'activité larvicide dans des flacons scellés, sans
échange gazeux est corrélée avec la faible synthèse
et/ou une rapide dégradation de P18 et P20/P16.
2. Clonaqe des qènes codant pour P66, P18 et P16
Des séquences partielles en acides aminés de P66,
P18 et P16 ont été déterminées par microséquençage.
Séquences en acides aminés des protéines P66, P18
et P16
WO95/Oh~9 PCT~94/00768
2~6612~ 24
Ces séquences ont été obtenues par
microsequençage, selon des techniques couramment
pratiquées par les laboratoires de microséquençage.
Pour chaque protéine ont été réalisées i) la séquences
NH2-terminale et ii) une ou plusieurs séquences de
fragments internes obtenus par hydrolyse trypsique de
la protéine. Les séquences ont été déterminées avec un
séquenceur Applied Biosystems 470, a partir des
protéines séparées sur SDS-PAGE et transférées sur
membrane de PVDF Immobilon (Millipore).
P66
- séquence NH2-terminale M N T N I F S T N L
- interne 1 N N D E W I Y G E P D S S N I
P18
- NHz-terminale M N N (X) C E V N C E (X) T
- interne 1 N A S L T W G K
- interne 2 F E L
- interne 3 Q W V K
- interne 4 E N T A S G T E
- interne 25 I E Y H N N L R
P16
- NH2-terminale A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I
- interne 1 D I P I S P E D I S K
(X) : indéterminé
Les sondes oligonucléotidiques ont été faites à partir
des séquences soulignées
Protéine Acides aminés Sonde oligonucléotidique
5'-3'
P66, NH2-term. N N T N I F S T N 66A=ATG AAT ACI AAT ATI
TTT TCI ACI AA (26mer)
P66, interne D E W I Y G E P D 66B =TC IGG TTC ICC ATA
WO95/O~g PCT~4/00768
1 2 ~
IAT CCA TTC ATC (26mer)
P18, NH2-term. C E V N C E18A=TGT GAA GTI AAT TGT
GA (17 mer)
P16, NH2-term. F H I E A V N E G 16A= TTT CAT ATI GAA GCI
GTI AAT GAA GG (26mer)
I=DMT dInosine cyan~ethyl phosphoramidite
~=séquence complémentaire
A partir de ces informations des sondes
oligonucléotidiques ont été synthétisées et utilisées
pour cribler une banque d'ADN total de Cbm hydrolysé
par l'enzyme XbaI, construite dans le plasmide navette
pHT304 (Arantès ~ Lereclus, Gene. 1991. 108 : 115-119).
Sélection du plasmide pCBMl
Une banque d'ADN a été construite dans un vecteur
navette- pHT304, construit par O. Arantès et D.
Lereclus, à parti~ d'un plasmide résident de B.
thurinqiensis pHT 1030 et de pUCl9, capable de se
répliquer dans E. coli et dans les bactéries à gram
positif. L'ADN total de Cbm a été hydrolysé par XbaI,
transféré sur membrane Hybond N+ (Amersham) après
électrophorèse sur gel d'agarose, et hybridé avec
chacune des sondes synthétisées, marquées à l'extrémité
3' par la fluorescéine ("kit ECLTM 3' oligolabeling and
detection systems", Amersham) selon le protocole
recommandé par le fournisseur dans les conditions
d'hybridation et de stringence suivantes :
Temperature d'hybri~ation : 42C, 15h, en four à
hybridation HYBAID (Cera-Labo) avec 5-10 ng de
sondes/ml.
216 6 12 1 PCT~94/00768
26
Lavages après hybridation : 2 fois 5 minutes à
température ambiante dans 5 x SSC, 0,1% SDS, puis 2
fois 15 minutes en 1 x SSC, 0,1% SDS.
La banque d'ADN génomique de Cbm construite dans
E. coli souche TGl a été criblée par hybridation sur
colonies avec l'oligonucléotide 16A marqué en extrémité
3' par la fluorescéine (système ECL 3' oligolabeling
Amersham). Le criblage a permis d'isoler un plasmide
recombinant pCBM1 hybridant avec l'oligonucléotide 16A
mais aussi avec les oligonucléotides 66A, 66B et 18A.
Une seule bande de 7 kb a été détectée sur l'ADN
hydrolysé par XbaI par la sonde correspondant à
l'extrémité NH2 terminale de P16 (sonde 16A). Une
faible réaction a été également été détectée sur ce
fragment avec les sondes 18A et 66A. La banque a donc
été construite dans E. coli TGl avec les fragments XbaI
d'ADN de taille voisine de 7,5 kb élués sur Prep-A-Gene
(Biorad). Le criblage de la banque (400 clones) par
hybridation des colonies sur filtre Hybond N+ avec
l'oligonucléotide 16A a révélé 10 clones positifs
(mêmes conditions de stringence que décrites ci-
dessus). L'analyse des 10 plasmides recombinants, par
plusieurs enzymes de restriction, a montré qu'ils
étaient tous similaires. Un des plasmides (pCBMl, 13,5
kb) a été selectionné.
Le plasmide pCBMl a une taille de 13,5kb et
résulte donc de l'insertion d'un fragment XbaI d'ADN de
Cbm de 7kb au site de clonage XbaI de pHT304 (6,5kb).
La carte de restriction de pCBMl a été déterminée
(Fig 4A et 4B).
Les régions avec lesquelles hybrident les sondes
mentionnées ci-dessus ont été déterminees par
Southern-blot sur le plasmide pCBMl hydrolysé par
différentes enzymes de restriction pour les 4 sondes.
De plus la technique de PCR en utilisant comme amorces
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO95/~9 PCT~4/00768
~16~12~
27
l'amorce universelle et l'oligonucléotide 16A a permis
de localiser la région d'hybridation de 16A à 2kb de
l'extrémité 3' du fragment XbaI (Fig 4A). Ces résultats
permettent de conclure que les 3 gènes codant pour P66,
P20/16 et P18 sont contenus dans le fragment XbaI de
7kb.
Localisation par PCR de l'extrémité 5' du qene codant
pour P16 sur le fraqment XbaI
La PCR a éte réalisée en utilisant la Taq polymérase et
comme amorces, l'oligonucléotide 16A et l'amorce
universelle (M13 universal sequencing primer Pharmacia)
et comme matrice le plasmide pCBMl, avec le cycle
suivant :
1 cycle Dénaturation : 95C 10 min.
25 cycles Hybridation: 42C 1 min.
Elongation: 72C 2 min.
Dénaturation: 95C 1 min.
1 cycle Hybridation: 42C 3 min.
Elongation: 72C 4 min.
3. Détermination de la séquence nucléotidique
La stratégie de séquençage utilisée était celle de
"marche sur le fragment". La séquence a été réalisée
selon la technique de Sanger (Sanger, et al., 1977,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) sur le
plasmide pCBMl rendu simple brin par dénaturation a la
soude. L'extension a été effectuée à partir des amorces
universelle, réverse, ou des oligonucléotides
correspondant aux séquences déduites des séquences en
acides aminés des protéines P66, Pl8 et P16 ou des
séquences nucléotidiques lues. L'ensemble des
FEUiLLE C'E ~Rr~ P~CE~ENT (REGLE 26)
W095/00639 PCT~R94/00768
2l66l2ll
28
oligonucléotides utilisés et leur localisation sur le
fragment d'ADN sont représentés dans la figure 5.
Un total de 1800 pb a été lu et est présenté sur
la figure 6. Les séquences nucléotidiques (Seql, Seq2,
Seq3 et Seq4) déterminées, ainsi que la séquence en
acides aminés déduite de la séquence Seq3 sont données
dans la figure 6.
La détermination des sites de restriction contenus
dans la séquence du gène codant pour la protéine de 66
kDa a permis de localiser avec précision la position du
début du gène 66kDa sur le fragment XbaI ; environ 95%
du gene est présent sur le fragment clone.
L'analyse de la séquence Seq3 et la comparaison
avec les séquences amino terminales et internes des
protéines 16kDa et 18 kDa (mentionnées dans la figure
6) a montré que les gènes 16 kDa et 18 kDa ne sont pas
distincts et représentent en fait le même gène. Un seul
cadre de lecture capable de coder pour une protéine de
11 kDa (masse moléculaire calculée) a été trouvé ; le
gène correspondant a été désigné gène CBMll. La masse
moléculaire calculée de 11 kDa correspondrait à celui
de la protéine de 18 kDa. D'apres la séquence, la
protéine de 16 kDa serait en fait une protéine ayant
une masse moléculaire calculée de 8,9 kDa ; elle
pourrait résulter de la protéine 11 kDa par clivage des
17 acides aminés NH2-terminaux.
La recherche d'homologies au niveau acides aminés
entre la séquence Seq3 et d'autres protéines a été
réalisée. Seule trois protéines (dont une produite par
une autre espèce de Clostridium) présentant des
homologies très restreintes ont été trouvées dans les
banques de données.
L'existence d'un gène unique codant pour les deux
protéines est en contradiction apparente avec un
résultat précédemment trouvé concernant l'absence de
parenté immunologique entre ces protéines. On a donc
WO95/~K~9 PCT~94/00768
2 ~ 2 ~
recherché la présence de plusieurs copies du gène CBM
11 codant pour des protéines différentes.
4. Nombre de copies du qène CBM 11
Des expériences de PCR réalisées sur la plasmide
pCBM1 avec les différentes combinaisons d'amorces
décrites dans la figure 5 ont montré la présence de
deux copies du gène Cbm 11 sur le fragment XbaI de 7 kb
cloné. Ces deux copies ont des tailles similaires, sont
en orientation directe et distantes d'environ 200 pb
(Figure 8).
Des expériences similaires effectuées sur l'ADN
total de Cbm ont permis de montrer l'existence d'au
moins une copie supplémentaire sur cet ADN en
orientation inverse.
5. Localisation des gènes codant pour les protéines
de 66 kDa, 18 kDa et 16 kDa
Des expériences d'hybridation ont été réalisées en
parallèle sur l'ADN plasmidique et l'ADN total de Cbm
en utilisant comme sonde le fragment XbaI de 7 kb ; ces
expériences ont eté réalisées en utilisant la technique
"Direct nucleic acid labelling system" ECL (Amersham)
de sondes froides, selon les indications du
fournisseur. Les résultats obtenus ont permis de
localiser ce fragment sur un plasmide résident
d'environ 13 kb (Figure 9A et 9B).
6. Expression des qènes des protéines de 66 kDa, 18
kDa et 16 kDa chez E.coli
L'étude de l'expression des gènes clonés dans le
plasmide pCBM1 a été réalisee chez E.coli par
immunodétection a l'aide de sondes froides. Les
extraits de E.coli ont été préparés de la façon
suivante : les clones TG1 (pHT304) et TGl (pCBM1) ont
eté cultivés en milieu LB. Cette expérience a mis en
F~U'LEE DE REMPLACEMENT (r~EGLE 26)
W095/00639 PCT~R94/00768
216612 l
évidence la synthèse chez ce recombinant d'une protéine
unique de 20 kDa réagissant spécifiquement avec
l'anticorps anti protéine 18 kDa (Figure 10). Aucun
produit correspondant à l'expression du gène 66 kDa n'a
pu être visualisé.
Des essais biologiques menés sur Anopheles
stephensi Liston montrent que ce clone recombinant,
bien que synthétisant une protéine immunologiquement
apparentée aux protéines de Cbm, ne présente aucune
toxicité même à forte concentration. Ceci suggère que
la protéine de 20 kDa exprimée chez E.coli n'est pas le
seul élément responsable de la toxicité de Cbm et
confirme les résultats obtenus concernant un phénomène
de synergisme entre les différentes protéines produites
par Cbm.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
