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WO 96106186 1 ~ ~ '~ ~ '~ ~~ p~~pjZgyOII I4
F~aaments n, iPotidir.,~p-.b~ c d s'h5tb
liftent à 1 'AnNr ou ARnir riA n ~ ~ ++c ,r
uti~icai-ion rommP cnnd c o, mo roc
La présente invention relève du domaine des techniques
de détection et/ou identification des bactéries du genre
Rickettsia et plus particulièrement de celles-utilisant un
marqueur génétique.
Les rickettsies sont des bactéries gram négatif qui
appartiennent à l'ordre des Rickettsiales et à la famille
des Rickettsiaceae comprenant notamment la sous-famille des
Rickettsieae sous divisée en trois genres : les Coxiella,
dont la seule espèce~connue est Coxiella burnetti ; les
Rickettsia, groupant l'ensemble des autres espèces
pathogènes pour l'homme et les animaux ; et les Rochalimea.
Le genre Rickettsia comprend trois sous groupes : le groupe
du typhus auquel appartient R. typbi responsable- du typhus
endémique, R. prowazekü, responsable du typhus épidémique
et R. canada ; le groupe du typhus de brousse auquel
appartient R. tsutsugamushi ; et 1e groupe des fièvres
éruptives auquel appartiennent notamment R. rickettsi.i, R.
siberica, R. conorü, R. australis, R. akari, R. montana et
R. rhipicephali.
Les rickettsies sont des bactéries parasites
intracellulaires qui se multiplient dans le noyau et le
cytoplasme des cellules hôtes pour les souches du groupe
des fièvres éruptives et dans le cytoplasme de ces cellules
pour les souches des autres groupes. La transmission à
l'homme de la bactérie se fait par l'intermédiaire
d'insectes hématophages tels que la tique pour R.
tsutsugamushi (rickettsie du groupe des fièvres éruptives),
le pou pour R. prowazekit ou la puce pour R. typbi, lors
d'un repas sanguin suivi de dëjections à l'endroit de la
piqùre. . _
Le typhus épidémique dù à R. prowazek.ü caractérisé
par une fièvre élevés, des céphalées importantes, une
éruption généralisée est aujourd'hui devenu une maladie
W O 96106186 ~ ~ ~ 2 PCTIFR95101114
rare. Néanmoins, le risque existe toujours de la survenue
d'une épidémie, dès lors que les conditions requises sont
réunies, en particulier lorsque 1a population est dense et
que les conditions d'hygiène font défaut. ,
Le typhus murin, ou typhus endémique, dû à R. typbi
est répandu dans le. monde entier. Le rat est le réservoir
et sa présence conditionne l'apparition de la maladie chez
l'homme. L'infection se caraçtérise par des céphalées, des
myalgies et de la fièvre mais, le plus souvent, 1a maladie
est bénigne.
Certaines des infections associées aux rickettsies du -
groupe des fièvres éruptives, et notamment la fièvre
pourprée des Montagnes Rocheuses due à R.--rickettsü,
peuvent avoir une issue fatale pour 1e malade ou tout.au
moins s'accompagner de sévères çomplications telles que
myocardite, phlébites, syndrome méningé, encéphalite,
myélite et coma. -
Le typhus de brousse est une maladie aiguë fébrile
dont l'agent causal est R. tsutsugamushi. La maladie se
caractérise par une élévation de la température et des
céphalées importantes, auxquelles peut être-associée une
pneumopathie au cours de lapremière semaine de la maladie.
Par ailleurs, la maladie peut porter atteinte au système
nerveux central, avec-des manifestations cliniques telles
que délire,-stupeur et fibrillation musculaire. Le taux de
mortalité varie de 1 à 60 ~ selon les rëgions
géographiques. Il est particulièrement élevé en Asie du
Sud-Est,-Corée, Australie, Japon et Inde.
Aujourd'hui, aucune technique de détection n'est à la
fois assez spécifique, sensible et rapide pour
diagnostiquer une infection due aux bactéries du genre
Ri-ckettsia dans un échantillon biologique. Le contrôle de
l'infection se fait essentiellement soit par diagnostic
direct, très lourd à mettre en oeuvre car il suppose
l'inoculation à partir d'échantillons biologiques d'animaux
ou d'oeufs embryonnnés : soit par diagnostic sérologique,
souvent difficile en raison du manque de spécificité des
W0 96106986 3 PC1YFR95/01114
techniques utilisées ou en raison de l'apparition retardée
des anticorps dans les séra des patients.
La présente invention concerne une technique de
diagnostic des infections dues aux bactéries du genre
Rickettsia, et plus particulièrement celles dues à R.
tsutsugamushi, utilisant un marqueur génétique dans un
procédé de détection par hybridation d'acides nucléiques,
alliant spécificité, sensibilité et rapidité.
Plus particulièrement, l'ARN ribosomique des bactéries
est utilisé comme cible. En effet, cette molécule est
retrouvée en abondance dans toutes cellules de tous les
organismes vivants. Par ailleurs, elle présente une
séquence nucléotidiqüe particulière faite d'une succession
de régions caractérisées par une vitesse d'évolution
variable.
Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois
molécules d'ARN distinctes réfërencées ARNr(s) 5S, 16S et
235. Historiquement, ces dénominations ont été choisies par
référënce à leur vitesse de sédimentation qui reflète la
taille de ces molécules d'ARN. Cependant, la taille réelle
de ces constituants ribosomiques varie sensiblement, pour
un type donné, d'un organisme cellulaire à un autre.
Néanmoins, la terminologie ARNr 5S, 16S et 235 est
consacrée pour désigner les molécules d'ARN constitutives
des ribosomes chez toutes les bactéries.
La valeur taxonomique des sous-unités 16S et 23S
ribosomiques de diverses espèces bactériennes a été mise en
évidence dans des procédés d'hybridation pour quantifier
des niveaux d'homologies entre ces espèces_ Ainsi, Woese et
coll., Microbiological Reviews 47 : 62I-669 (1983), et
Grayet et coll., Nûcleic Acids Research 12 : 5837-5852
(1984) montrent, par des comparaisons de séquences d'ARN
165, que des régions hautement conservées sont intercalées
avec des régions de moyenne et basse homologies, même dans
le cas d'espèces proches.
A ce jour, seulement six séquences d'ADN correspondant
aux ARN ribosomiques 16S (ADNr) de bactéries appartenant à
W096106186 ,, 4 PCf/FR95/01114
- .~ r
t
la famille_des Rickettsiaceae sont décrites dans la
littérature : R. rickettsü, R. prowezekü, R. typhi, ,
Coxiella burnetti, Ehrlichia ristierü et Wolbachia
persicae. ,
On a maintenant découvert sur 1!ADN codant pour l'ARN
ribosomique de la sous-unité 16S certaines zones qui sont
conservées pour diverses espèces appartenant au genre des
Rickettsia. Par ailleurs, on a maintenant découvert sur
l'ADN codant pour l'ARN ribosomique 16S des zones variables -
au sein du genre Rickettsia. Ces résultats ont permis
d'établir des sondes de genre permettant de discriminer le
genre Rickettsia des genres taxonomiquement proçhes, ainsi
que des sondes spécifiques d'espèces appartenant au genre
Rickettsia. Ges résultats ont-été vérifiés notamment sur
les espèces suivantes : R.tsutsugamushi, R. canada, R.
conorü, R. akari, R. mooseri*R. australis, R.
rhipicephali, R. montana, R. bellü, R. japonica, R.
parkeri, R. helvetica; R. sibirica, R. massiliae, R.
slovaca et R. africae.
Avant d'exposer l'invention, différents termes
utilisés dans la description et les revendications sont
définis ci-après
- un fragment nucléotidique ou un oligonucléotide
est un enchainement de motifs-nucléotidiques assemblés
entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé
par la séquence informationnelle des acides nuçléiques
naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment
nucléotidique dans des_-conditions prédéterminées,
l'enchaïnement pouvant contenir des monomères de structures
différentes et être obtenu à partir dune molécule d'acide
nucléiquenaturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou
par synthèse chimique,
- un motif est dérivé d'un monomère qui peut être
un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments
constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une
base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose,
dans l'ARN le sucre est le ribose ~ selon qu'il s'agisse de
WO 96106186 5 ~, ~ ~ C~ ~~ PCTIFR95/OI114
l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine,
la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le
monomere est un nucléotide modifié dans l'un au moins des
trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la
modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec
des bases modifiées telles qûe l'inosine, la méthyl-5-
désoxycytidine, 1a désoxyuridine, la diméthylamino-5-
désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-
désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable
d'hybridation, soit aû niveau du sucre, pas exemple le
remplacement d'au moins un désoxyriboseparun polyamide
(P. E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), soit
encore au niveau du groupemént phosphate, par exemple son
remplacement par des esters notamment choisis parmi les
diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et
phosphorothioates,
- par "séquence informationnelle", on entend
toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont
la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence
constituent une information de même qualité que celle des
acides nucléiques naturels,
- par hybridation, on entend le processus au
cours duquel, dans des conditions appropriées, deux
fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment
complémentaires sont susceptibles de former un double brin
avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques. Un
fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un
polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec
ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui
peuvent étre déterminées dans chaque cas de façon connue.
Les conditions d'hybridation sont déterminées par la
stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions
opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique
qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La
stringence est définie notamment en fonction de la
composition en bases d'un duplex sondeJcible, ainsi que par
le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La
WO 96106186 ~ ~ ~ °~ ~ â ~ ~ 6 PCT/FR95101114
stringence peut également étre fonction des paramètres de -
la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces
ioniques présentes dans la solution d'hybridation,- la
nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la
température d'hybridation. La stringence des conditions
dans lesquelles une rëaction-d'hybridation doit étre
réalisée dépendra principalement des sondes utilisées.
Toutes ces données sont bien connues et les conditions
appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.
En général, selon la longueur dès sondes utilisées, la
température pour la réaction d'hybridation est comprise
entre environ 20 et 65°C, en particulièr entre f5 et 65°C
dans une solution saline à une çoncëntration d'environ 0,8
à 1M.
- une sonde est un fragment nucléotidique
comprenant de 5 à 100 monomères, notamment de 6 à 35
monomères, possédant une spécifïcité d'hybridation dans des
conditions déterminées pour former un complexe
d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant, dans le
cas présent, une séquence nucléotidique comprise dans un
ARN ribosomiqu2, l'ADN obtenu par transcription inverse
dudit ARN ribosomique et l'ADN (appelé ici ADN ribosomique
ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de
transcrip-tion ; une sonde peut étre utilisée à des fins de -
diagnostic (notamment sondes de-capture ou de détection) ou
à des fins de thérapie,
- une sonde de capture est immobilisée ou
immobilisable sur un support solide par tout moyen
approprié, c'est-à-dire-directement ou indirectement, par
exemple-par covalence ou adsorption,
- une sonde de détection peut étre marquée au
moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs,
des enzymes (notamment une peroxydase, une phosphatase
alcaline, ou une enzyme suscèptible d'hydrolyser un
substrat chromogène, fluorigène ou luminescent), des
composés chimiques chromophores; des composés chromogènes,
W 0 96106186
7 PCT/FR95/OI I I4
s
fluorigénes ou luminescents, des analogues de bases
nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine,
- une amorce est une sondé comprenant de 5 à 100
motifs nucléotidiques et possédant une spécificité
d'hybridation dans des conditions déterminées pour
l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple
dans une technique- d'amplification telle que la PCR
(POlymerase Chain Reaction), dans un procédé de séquençage,
dans une méthode de transcription inverse, etc.,
-l'homologie caractérise le degré de similitude
de deux fragments nucléotidiques comparés,
- les sondes et amorces selon l'invention sont
celles. dont les séquénces sont identifiées c-i-après, ainsi
que les analogues de ces sondes ou amorces qui sont celles
dont les séquences présentent au moins 70 ~ d'homologie,
et au moins 5 motifs nucléotidiques consécutifs de séquence
informationnelle ïdentique avec ces dernières. De telles
séquences sont appelées ici-"séquences homologues".
Les sondes selon l'invention utilisées à des fins de
diagnostic peuvent étre mises en oeuvre dans toutes les
techniques d'hybridation connues et notamment les
techniques de dépSt ponctuel sur filtre dites "DOT-BLOT"
(MANIATIS et al, Molecular Cloning, Col.d Spring Harbor,
1982), les te-chniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN
BLOT" (SOUTHERN. E.M., J. Mol. Biol., ,gg, 503 (1975), les
techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les
techniques SANDWICH (DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, ~, 23
(1977)) ; on utilise en particulier la technique SANDWICH,
avec une sonde de capture spécifique et/ou une sonde de
détection spécifique, étant entendu que la sonde de capture
et la sonde de détection doivent avoir des séquences
nucléotidiques au moins partiellement différentes.
Une autre application de l'invention est une sonde de
thérapie pour traiter les infections dues aux bactéries du
genre Rickettsia, ladite sonde étant susceptible de
s'hybrider-in vivo sur l'ARN ribosomique 16S desdites
bactéries et/ou sur l'ADN génomique pour bloquer les
CA 02174753 2001-12-11
t
Ö
phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou la
réplication.
La F i g u r e 1 représente les séquences d'ADNr
correspondant à l'ARNr 16S de diverses bactéries du genre
Rickettsia, dont~la liste figure à ~la suite de la partie
expérimentale ci-après. La numérotation de la séquence
nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique
16S de R. rickettsii, complètement identifiée par~Weisburg
et al. (1989, Genbank (M21293)), a été utilisée à titre de
référence afin de définir les fragments et pour les
aligner.
La présente invention a notamment pour objet un
fragment nucléotidiqüe monocaténaire capable de s'hybrider
avec l'ADNr ou l'ARNr des Rickettsia et non à l'ADNr ou à
l'ARNr des non-Rickettsia.
En particulier, le fragment nucléotidique
monocaténaire n'est pas susceptible de s'hybrider
spécifiquement à l'ADNr ou l'ARNr de Cowdria ruminantium,
Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma marginale, Wolbachia
pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana et
Coxiella burnatti.
Le fragment nucléotidique monocaténaire de l'invention
présente une séquence nucléotidique d'au moins 5
nucléotides consécutifs choisie dans les séquences
suivantes .
commençant au nucléotide N° 130 et finissant au nucléotide N°
170
commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N°
201
commençant au nucléotide N° 241 et finissant au nucléotide N°
272
commençant au nucléotide N° 289 et finissant au nucléotide N°
298
3 0 commençant au nucléotide N° 299 et finissant au nucléotide
N° 315
commençant au nucléotide N° 334 et finissant au nucléotide N°
357
commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N°
481
commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N°
536
commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N°
570
commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N°
585
commençant au nucléotide N° 661 et finissant au nucléotide N°
684
commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N°
739
commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N°
929
commençant au nucléot~'ide N° 940 et finissant au nucléotide N°
960
WO 96106186 9 PCT/FR95/01114
commençant au nucléotide N°1035 et finissant au nucléotide
N°1055
commençant au nucléotide N°1078 et finissant au nucléotide
N°1107
commençant au nucléotide N°1199 et finissant au nucléotide
N°1213
commençant au nucléotide N°1330 et finissant au nucléotide
N°1350
commençant au nucléotide N°1361 et finissant au nucléotide
N°1387
commençant au nucléotide N°1429 et finissant au nucléotide
N°1463
commençant au nucléotide N°1501 et finissant au nucléotide
N°1520
commençant au nucléotide N°1555 et finissant au nucléotide
N°1576
et leurs séquences complémentaires.
L'invention concerne notamment les fragments
nucléotidiques monocaténaires ayant üne séquence d'au moins
8. et en particulier d'au moins 10, nucléotides consécutifs
choisie dans les séquences mentionnées ci-dessus (ou dans
des séquences complémentaires). Bien entendu, l'invention
s'étend à tout fragment nucléotidique suffisamment
homologue d'un fragment tel que défini ci-dessus pour être
capable de s'hybrider spécifiquement avec l'ADNr ou l'ARNr
des Rickettsia.
Plus particulièrement, les séquences nucléotidiques
des fragments de l'invention sont choisies dans les
séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 22, décrites en fin de
description, ou leurs séquences complëmentaires.
La numérotation de la séquence de l'ARNr 165 de R.
rickettsü, appliquée aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO
22 ci-dessus, ne reflète pas toujours le nombre de
nucléotides ou monomères constituant ces séquences en
raison des variations de taille existant entre les
séquences et la séquence de l'ARNr 16S de R. rickettsü .
Les variations sont dues à des insertions ou délétions
naturelles dans le matëriel génétique.
Conformément à la définition ci-dessus les fragments
de l'invention sont des fragments d'ADN, mais ils peuvent
aussi âtre dés fragménts monocaténaires d'ARN, ou leurs
fragments complémentaires, ainsi que des fragments
monocatënaires d'ADN génomique dont les produits de
transcription sont les fragments d'ARN précités, ou leurs
fragments complémentaires.
W0 96/06186 10 PCTIFR95101114
r
s , .,
2.~.~~ l~~
Les fragments nucléotidiques monocaténaires de
l'invention sont utilisables enparticulier comme.sondes
notamment comme sondes de capture ou de détection, selon
les techniques d'hybridation connues-.
Les sondes spécifiques du genre Rickettsia sont
notamment celles présentant une séquence choisie parmi les
séquences:
commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N°
201
commençant au nucléotide N° 284 et finissant au nuclëotide N°
298
commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N°
585
commençant au nucléotide N° 940 et finissant au nucléotide N°
960
commençant au nuclÉotide N°1199.et finissant au nucléotide
N°1213
commençant au nucléotide N°1429 et finissant au nucléotide
N°1463
et leurs séquences complémentaires, ou leurs analogués.
Les sondes d'espèce ~. tsutsugamushi sont notamment
celles- présentant une séquence choisie parmi les séquences:
commençant au nucléotide N°130et finissant au nucléotide N°170
commençant au nucléotide N°291 et finissant au nucléotide N°272
commençant au nucléotide N°299 et finissant au nucléotide N°315
2Q commençant au nuclëotide N°334 et finissant au nucléotide
N°357
commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N°
481
commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N°
536
commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N°
570
commençant au nucléotide N° 661 et finissant au. nucléotide N°
684
commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N°
739
commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N°
929
commençant au nucléotide N°1035 et finissant au nucléotide
N°1055
commençant au nucléotide N°1078 et finissant au nucléotide
N°1107
commençant au nucléotide N°1330 et finissant au nucléotide
N°1350
commençant au nucléotide N°1361 et finissant au nucléotide
N°1387
commençant au nucléotide N°1501 et finissant au nucléotidé
N°1520
commençant au nucléotide N°1555 et finissant au nucléotïde
N°1576
et leurs séquences complément-aires, ou leuxs analogues.
Un autre objet de l'invention est-une sonde de -
thérapie pour le traitement des infections dues aux
bactéries du genre Rickettsia et notamment une sonde de
thérapie pour le traitement des infections dues une-espèce
déterminée dè Rickettsia, l'une et l'autre comprenant au
moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que -
défini précédemment.
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Un autre objet de 1'inventinn est une amorce pour la
transcription inverse spécifique en une séquence d'ADN
complémentaire d'une séquence d'ARN ribosomique 16S de
Rickettsia appartenant soit à une région conservée
' S seulement parmi les Rickettsia, soit à une région
spécifique de 1!espèce R. tsutsugamushi ; ou une amorce,
notamment pour l'amplification spécifique d'une séquence
d'ADN ou d'ARN complémentaire ou homologue de 1a séquence
de l'ARN ribosomique 16S des Rickettsia, appartenant soit à
une région région conservée seulement parmi les Rickettsia,
soit à une région spécifique de l'espèce R. Tsutsugamushi.
Une telle amorce comprend ou est constituée par un fragment
nucléotidique monocaténaire tel que défini précédemment.
L'invention concerne aussi un réactif pour détecter
et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un
échantillon biologique comprenant au moins une sonde de
l'invention, et en particulier une sonde de capture et/ou
une sonde de détection répondant à la définition d'une
sonde donnée ci-dessus. Le réactif peut comprendre un
mélange de sondes.
Enfin, l'invention apporte un procédé pour détecter
et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un
échantillon biologique selon lequel on met en contact soit
l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 165, extrait des
rickettsies et éventuellement dénaturé, soit l'ADN
génomique, extrait et dénaturé, des bactéries, soit encore
l'ADN obtenu â partir de la transcription inverse de l'ARN
ribosomique 16S, avec au moins une sonde de l'invention,
puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde,
de façon connue en soi.
. Bien entendu, il convient d'effectuer l'hybridation
dans des conditions suffisamment discriminantes
(stringence) pour qûe l'hybridation d'au moins une des
sondes soit spécifique.
Si désirë, avant d'exposer l'acide nucléique à la
sonde de l'invention, on réalise une amplification de cet
R'U 96/06186 12 PCT/FTt95/01114
acide nucléique en Pré6ence d'un système enzymatique adapté
et d'au moins une ,amorce d'amplification de l'invention.
L'invention concerne en particulier un procédé de
détection et/ou d'identification de Rickettsia dans un
échantillon biologique, caractéris'è-en ce qu'il comprend:
a- la mise en contact dudit échantillon avec au moins
un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini ci-
dessus, dans des conditions prédéterminées qui permettent
audit fragment de s'hybri-der à-l'ADNr ou à l'ARNr d'une
bactérie du genre Richettsia, s'il est présent ; et
b- la détection dudit hybride comme indicateur de la
présence de.Rickettsia dans l'échantillon.
Bien entendu, lés conditions prédéterminées
d'hybridation sont celles qui permettent une hybridation
spécifique.
Les Exemples suivants illustrent l'invention.
EXEMPLE 1
Détermination de la séquence nucléotidique de l'ADN
correspondant à l'ARN ribosomique 16S de rickettsies.
La séquence. nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN
ribosomique 16S des 16 souches suivantes a été déterminée:
R.tsutsugamushi ATCC Gilliam -
R. canada Gamaleya Research Institute Collection 2678
R. conor ATCC VR-141
R. akari ATCC VR-148
R. mooseri ATCC VR-144
R. australis -
R. -shiplcephali-
R. montana
R. bell --
R. japonica
R. parkeri
R. helvetica
R. sibirica ATCC VR-151 ..
R. massiliae '
R. slovaca
R. africae Gamaleya Research.Institute Collection
CA 02174753 2001-12-11
13
L'ADN total des souches a été isolé selon la technique
décrite par Maniatis et al.(Molecular cloning, Cold Spring
Harbor, 1982). Des produits d'amplification PCR ont été
générés à partir de l'ADN génomique~isolé de ces souches à
l'aide d'amorces d'amplification choisies dans des régions
conservées dans les séquences connues de R. rickettsii, R.
typbi et R. prowazekii.
Les produits d'amplification obtenus ont été purifiés sur
billes magnétiques marquées à la streptavidine (Dynabead M-
280 ; Dynal Inc., N.Y.) et séquencés en utilisant la
technique préconisée dans le kit commercial "Autoread
sequencing kit".
EXF~ LE 2
Utilisation d'une sonde spécifique dirigée contre l'ARN
ribosomique 16S pour l'identification de R. tsutsugamushi.
La sonde commençant au nucléotide N°903 et finissant au
nucléotide N°929 de la SEQ ID NO 13, est spécifique pour
les souches de R. tsutsugamushi. Une collection de souches
de rickettsies a été testée par hybridation sur l'ARN
ribosomique 16S et a permis de constater la spécificité de
cette sonde.
L'hybridation des ARN ribosomiques d'une bactérie-cible a
été conduite selon le procédé de détection non-radioactif
et semi-automatisé décrit dans le brevet français
n° 90 07249 et modifié pour la détection de l'ARN
ribosomique par l'addition d'un déstabilisant. Ce
déstabilisant (qui est une sonde de capture, commençant au
nucléotide N°940 et finissant au nucléotide N°970 de la
séquence de R. Tsutsugamuchi (référencée 23 dans la figure
annexée)) et un conjugué de détection oligonucléotide-
enzyme (l'oligonucléotide correspondant à la~sonde définie
au début du présent exemple) sont utilises. La manipulation
a été conduite dans une plaque de microtitration selon le
protocole suivant.
* (marque de commerce)
CA 02174753 2001-12-11
T
r
14
L'ARN ribosomique des souches a été extrait selon le
protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries
à Gram positif décrit dans "Current Protocole in Molecular
Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New
York. Dans une plaque de microtitration (Nunc 439959) est
déposée une solution de 1 ng/ul de l'oligonucléotide de
capture dont l'extrémité 5' a réagi avec le réactif
Aminolink 2*(Applied Biosystems, Foster city , Californie)
dans du PBS 3X (0.45 M NaCl 0.15 M phosphate de sodium pH
7.0). La plaque est incubée 2 h à 37° C puis lavée 3 fois
avec 300 u1 de PBST (PBS 1x, Tween 20* . 0, 5 % (Merck
822184)). Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à
l'extrémité 5' de la~sonde un bras comportant un groupement
6-aminohexyle. La sonde ainsi couplée à un ligand possédant
un groupement polaire (amine primaire), et fixée de façon
passive sur le support, procure un signal amélioré ; voir
la demande FR 91 09057.
La cible constituée par 10 u1 d'extrait d'ARN totaux est
mélangée.avec 40 u1 de tampon PBS saumon (PBS-3X + ADN de
sperme de saumon 10 ug/ml (Sigma D 9156)). L'ensemble est
ajouté dans le puits à 50 u1 d'une solution du conjugué
oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de
détection, à la concentration de 0.1 ng/ul en
oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10
sérum de cheval (BioMérieux 55842)). La plaque est incubée
1 h à 37° C puis lavée par 3 fois avec 300 u1 de tampon
PBST. Dans chaque puits, on rajoute 100 u1 de substrat OPD
(ortho-phénylènediamine Cambridge Medical Biotechnology
ref/456) dans un tampon 0,055 M acide citrique, 0,1 M
monohydrogénophosphate de sodium, pH 9,93) à la
concentration de 4 mg/ml, auquel on ajoute extemporanément
du peroxyde d'hydrogéne à 30 $ dilué au 1/1000. Après 20
min de réaction l'activité enzymatique est bloquée par 100
u1 d'acide sulfurique 1N et la lecture est effectuée sur un
appareil Axia Microreader (ARIA . marque enregistrée)
(bioMérieux) à 492 nm.
Les bactéries-cibles é,~aient notamment les suivantes .
* (marques de commerce)
CA 02174753 2001-12-11
r
30 souches appartenant à l'ordre des Rickettsiale
- 20 souches appartenant au genre des Rickettsia
- 7 souches appartenant à l'espèce de R tsutsugamushi
L'adaptation de la combinaison spécifique sur l'automate
5 VIDAS (marque déposée - commercialisé par la société
bioMérieux-VITEK) a été effectuée. La paroi du puits de
microplaque est ici remplacée par le SPR (marque de
commerce) ("Solid Phase Receptacle") qui est un support
conique réalisé à partir d'un matériau vendu sous la
10 dénomination K résine (copolymère butadiène-styrène) et
commercialisé par la société bioMérieux-VITEK (USA). Les
divers réactifs sont disposés dans une barrette à plusieurs
cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR
qui est capable d'aspirer et de refouler les réactifs et
15 qui fait donc office de pipette. La réaction d'hybridation
sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit
sur la paroi interne du cône.
Sur la surface interne du SPR, est fixé passivement
l'oligonucléotide de capture comportant à son extrémité 5'
le ligand Aminolink 2*(Applied Biosystems-réf.400808) à une
concentration de 1 ng/ul dans un volume de 315 u1 d'une
solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl
600 mM). Après une nuit à température ambiante ou deux
heures à 37°C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution
PBS Tween* puis séchés sous vide. La barrette contient dans
des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est
à dire . 200 u1 d'une solution à 0,1 ng/ul du conjugué de
détection oligonucléotide-phosphatase alcaline, 2 fois 600
u1 de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de
substrat.
Dans le premier puits de la barrette, sont déposés 10 u1 de
l'ARN extrait dans le même tampon que pour le protocole
microplaque ci-dessus.
Après incubation 30 minutes du cône par le mélange cible
plus sonde de détection, le cône est lavé 2 fois par une
solution de PBS Tween* 250 u1 de substrat MUP (méthyl-4
umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon
* (marques de commerce)
W096/06156 16 PC1'/FR95/01114
diéthanolàmine sont aspirés dans le cbne, puis relâchés
dans une cuvette de-lecture. L'appareil mesure le signal
fluorescent exprimé en URF (unités relatives de
fluorescence) de la cuvette.
Les résultats obtenus avec ce système sont les mêmes que
ceux obtenus en microplaque.
De façon analogue; on peut vérifier le caractère spécifique
de genre ou d'espèces des autres fragments nucléotidiques
qui font l'objet de l'invention.
Liste et origine des bactéries dont la séquence d'ADNr
correspondant à l'ARNr 16S est représentée en anneze.
1 R.ricketts Genbank
14 thai (tick typhus rickettsia)
10 R.slovaca (M-91 isolat diffrent de R siberica)
11 R.japonica
3 R.conor
18 astrakan fever rickettsia
13 israeli tick typhus rickettsia
7 R.sibirica
R.parkeri
16 R.africae
8 R.massiliae
17 Bar29 (GS isolat diffrent de massiliae)
R
6 R.rhipicephali
9 R.montana
12 R.helvetica
4 R.australis
5 R.akari
3I RSDNAX (EBL bacterium) Genbank
2 R.bell
Z1 Coccinelle (AB j~acterium) Genbank
22 R.canada . '
19 R.prowazek Genbank
R.typhi Genbank
23 R. tsutsugamushi
26 Cowdria ruminantium (CRDNA) Genbank
Ehrlichia chaffeensis (EHRRRNAF)Genbank
27 Anaplasma marginale (APMRR16SA) Genbank
28 Wolbachia pipientis (WP'16SCP) Genbank
24 Ehrlichia ristic (EHRRGBSA) Genbank
Rochalimea (Bartonella)quintana ROCRR16SA Genbank
29 Coxiella burnatti COXRRSA Genbank
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
CA 02174753 2001-12-11
17
LISTE DES SEOUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
( i ) DÉPOSANT
(A) NOM . Société Anonyme dite BIO MERIEUX
(B) RUE: Chemin de l'Orme
(C) VILLE: Marcy l'Étoile
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 69280
(G) TÉLÉPHONE: (33) 78 87 20 00
(H) TÉLÉCOPIE: (33) 78 87 20 90
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Fragments
nucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement à
l'ADNr ou ARNr des Rickettsia et leur utilisation comme
sondes ou amorces.
( i i i ) NOMBRE 'DE SÉQUENCES : 22
(iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disc
(B) ORDINATEUR: PC* Compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: DOS*#6.2
wINDOws*#3.o
(D) LOGICIEL: Microsoft Word*#6.0
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO . 1
1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR . 33 nuclotides
liB TYPE . acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS . simple
liD CONFIGURATION . linaire
Iii TYPE DE MOLCULE . ADN
liii HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS . non
* (marques de commerce)
W 0 96106186 18 FCT'/FR95/01114
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE . bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 130-170
lviC UNI TES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 130-170
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
SEQ ID NO : 1
CGAATTAATG
CTGAGTTTGC
TTAGTATTAA
TTA 33
R'O 96/06186 19 PCT/FR951011I4
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 21 nuclotides
liB TYPE : acide nclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
1vi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GNOME:
lv iA CHROMOSOMEJSEGMENT:
lv iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 181-201
lviC UNITS:
lix CARACTRISTIQUE:-
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 181-201
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
3S lxi DESCRIPTION
DE LA
SQUENCE:
SEQ ID NO : 2
GTGAGTAACA
CGTGGGAATC
T 21
WO 96/06186 2 0 PCT/FR95101114
?1'~~i5~
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQU1VCE:
liA LONGUEUR : 27 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
1i HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi - POSITION DANS LE GENOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 241-272
lviC UNITES:
lix CAgpCTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 241-272-
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude -
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
SEQ ID NO : 3
TCACGTATGC
CCTCTATAAG
GAGGAAA
--27
W0 96106186 21 PCT/FTt95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 15 nuclotides
1iB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE: -
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMENT:
1v iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 284-298
lviC UNI TES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 284-298
lixC METHODE D~IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
SEQ - ID NO : 9
TATCGCTGAT
GGATG
15
WO 96106186 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 2 PC1'1FR95101114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 17 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:-
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
lv iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.rickettsfi : 299-315
lviC UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 299-315
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
SEQ ID NO : 5
AGCCCGCGGC
AGATTAG
17
W O 96106186 2 3 ; ' - PCT/FR95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA-SEQ ID NO :
6
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 24 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
1i HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lv i POSITION DANS LE GENOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMENT:
1v iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts ü : 334-357
lvüiC UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 339-357
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 6
GCTCACCAAG CCGACGATCT GTAG 24
WO 96106186 ~ ~'2 4 PCT/FR95101114
;:.
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 7
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 22 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE bEVELOPPBMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
lv iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 460-481
lviC UNI TES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 460-481
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
SEQ ID NO : 7
CCAGCAATGC
CGCGTGAGTG
AT 22
WO 96106186 2 5 PCTIFR95/01114
~.~ ~4'~~$
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 21 nuclotides
IiB TYPE :-acide nuclique -
TiC NOMBRE DE BRINS : Simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYP:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvilA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE
lvi POSITION DANS LE GNOME:
lv iA CHROMOSOMEJSEGMENT:
lv iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 504-536
lviC UNI TES:
lix CARACTRISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 504-536
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 8
TCTTTTAGTA GGGATGATAA T 21
WO 96106186 2 6 PCTIFR95101114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGEUR : 21 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRSNS : simple
liD CONFIGURATION : linaire -
l TYPE DE MOLECULE : ADN
1i HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE r
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lviB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 550-570
lviC UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 550-570
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par Similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUNCE:
SEQ ID NO : 9
GACAGTACCT
ACAGAAAAAG
C 21
WO 96/06186 2 7 PCTIFR95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 10
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 25 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique -
liC NOMBRE DE BRINS : simple -
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE :-ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lv i POSITION DANS LE GENOME:
lvi.A CHROMOSOME/SEGMENT:
lv iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 561-585
lviC UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 561-585
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 10
CAGAAAAAGC CCGGGCTAAC TCCGT _-25
W O 96106186
2 8 PCTIFR95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 11
1i - CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 24 nuclotides
1iB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE -: ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE -.'
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE;
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE: -
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IP~IEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE
lv i POSITION DANS LE GENOME:
lvlA CHROMOSOME/SEGMENT:
lv iB POSITION PAR RAPPORT -
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 661-684
lviC UNITES:
1ix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE ; ADN
lixB EMPLACEMENT : 661=684
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 11
TAATAAGTTA GGAGTGAAAT CCCA 2q
WO 96106186 2 g PCTIFR95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA-SEQ ID NO : 12
1i CARACTERISTIQUES DE. LA SEQUENCE:
1iA LONGUEUR : 30 nuclotides
1iB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE-CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
1vi11B POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 710-739
lviC -UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE .-ADN
lixB EMPLACEMENT : 710-739
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
Ixi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 12
AAAACTGTTA GGCTAGAGTA TGGTAGAGGG 30
WO 96106186 3 0 PCTIFR95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ZD NO : 13
1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR : 23 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLCULE : ADN
li HYPOTHTIQUE
1iv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:-
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GNOME:
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviliB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 903-929
lviC UNITS:
lix CARACTRISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 903-929
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SQUENCE:
SEQ ID NO : 13
GATATTGGGG
GATTTTTCT-T
TCA 23
WO 96106186 31 PCTIFR95/01114
1
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 14
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 21 nuclotides
liB TYPE : acide nclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple .
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE :-ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE i3APLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lviiB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATTON DE R.ricketts : 940-960
lviC UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 940-960
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par-smilitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
-
SEQ ID NO : 14
TAACGCATTA
AGCACTCCGC
C 21
WO 96106186 3 2 PCTIFR95101114
N
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ-ID NO : 15
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 21 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPEDE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE -; bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE
lv i POSITION DANS LE GENOME:
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviliB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 1035-1055
lviiiC UNITES:
lix CARACTERISTIQUE: -
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 1035-1055
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
SEQ ID NO : 15
AATTCGATGA
TCCGCGAAAA
A 21
W0 96/06186 33 PCT/FR95/OlII4
.,
t,.; ~;
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 16
1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR : 30 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique '
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLCULE-: ADN
li HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE :/
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE: -
lviH LIGNE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE: -
lvi POSITION DANS LE GNOME:
lvlA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 1078-1107
lviC UNITS:
lix CARACTRISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 107$-1107
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
1xi DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 16
AGTCGCGAAA AATGGAGACA TTTTTCTTCA 30
WO 96106186 3 q PCT/FIt95101114
~~.:'~:~75~
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 17
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
1iA LONGUEUR : 15 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNE CELLULAIRE: -
lviI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lv i POSITION DANS LE GNOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMENT:
lv 1B POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 1199-1213
lviC UNITS:
lix CARACTRISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 1199-1213
lixC MTHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: .
lxi DESCRIPTION
DE LA
SQUENCE:
SEQ ID NO : 17
ATTCTTATTT
GCCAG
15
W0 96106186 35 PCT/FR95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 18
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 20 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire =
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
1i HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE :~
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
2 1vi I ORGANELI~E
0
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvilA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GENOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMBNT:
1v iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 1330-1350
lviC- UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 1330-1350
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA'SEQUENCE:
SEQ ID NO : 18
CTACAGAGTG ATGCGATACG 20
WO 96106186 3 g PCTIFR95/01114
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 19
1i -- CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR : 26 nuclotides
1iB TYPE . acidenuclique
1iC NOMBRE DE BRINS.: simple
liD CONFIGURATION :linaire
1 TYPE DE MOLCULE : ADN
1i HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tSUtsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:
1v SOURCE IMMDIATE : hioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GNOME:
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
lv iB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMROTATION DE-R.ricketts : 1361-1387
lviC UNITS:
lix CARACTRISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 1361-13$7
lixC MTHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 19
AGCTAATCAT TAAAAGGTAT CTCAGT 26
W096106186 3~ - - - - PCT/FR95/01114
~i'~4~~~~ u
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 20
1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR : 35 nuclotides -
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire -
l TYPE DE MOLCULE : ADN
li HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
1vi ORIGINE:
lviA-- ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STADE DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU.
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNE CELLULAIRE:
lvI ORGANELLE:
lv SOURCE IMMDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GNOME:
lv 1A CHROMOSOME/SEGMENT:
lviB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 1429-1463
lviC UNITS:
lix CARACTRISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 1429-1463
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 20
CGCTAGTAAT CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAAT 35
PCTIFR95101114
W096/06186 ,~ ''r~~~ 38
1 INFORMATIQNS POUR LA SEQ-ID NO : 21
1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR : 20 nuclotides
liB TYPE : acide. nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLCULE- _ ADN
1i HYPOTHTIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
lviD STAD$ DE DVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE: -
lv -- SOURCE TMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lvi POSITION DANS LE GNOME:
lviA CHROMOSOME/SEGMENT:
lvi.B POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMROTATION DE-R.ricketts _ : 1501-1520
lviC -UNITS:
lix CARACTRISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 1501-1520
lixC MTHODE D'IDENTIFICATION : par-similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA-SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 21
TGGGAGTCAG TGGTACCTGA 20
W096106186 3~~~~ (~~
rcT~xvsiolua
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 22
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR : 22 nuclotides
liB TYPE : acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS : simple
liD CONFIGURATION : linaire
1 TYPE DE MOLECULE : ADN
li HYPOTHETIQUE
liv ANTI-SENS : non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE:
lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi
lviB SOUCHE
lviC INDIVIDU/ISOLE:
15, lviD STADE DE DEVELOPPEMENT
lviE HAPLOTYPE:
lviF TYPE DE TISSU:
lviG TYPE DE CELLULE:
lviH LIGNEE CELLULAIRE:
lviI ORGANELLE:-
lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.
lvA BIBLIOTHEQUE:
lvB CLONE:
lv i POSITZON DANS LE GENOME:
lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:
lviB POSITION PAR RAPPORT
A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 1555-1576
lviC UNI TES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 1555-1576
lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude
lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxi DESCRIPTION DÉ LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 22
CACGGTAGAA CTGGTGACTG GG 22
