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ADEN W IRUS RECOMBINANTS POUR LA THERAPIE GENIQUE DES CANCERS
La présente invention concerne des vecteurs recornbin~nt.~ d'origine virale et
leur utili.~tion pour le traitement des can~Pr~. Plus particulièrement, elle conceme des
adénovirus recombinants co.npo~lanl une séquence d'ADN hétérologue sous le
c,ontrole de signaux d't:A~r~s~ion actifs specifiqu~ t dans les cellules tumorales.
L'invention concerne égalPmPnt la p~p~lion de ces ve~;~e~, les compositions
pl~ eu~ ues les contenant et leur utilisation en thérapie génique.
La thérapie génique collsi~e à corriger une ~lP.fi~ n-e ou une ~n(nm~lie
(mutationJ expression abellal"e, etc) par intr~llction d'une information génétique
dans la cellule ou l'organe affecté. Cette inform~tinn génétique peut être introduite soit
in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule mo(lifiée étant alors réintroduite
dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu applo~ié. Dirrére,-Les
techniques ont été décrites pour l'introdt~chQn de cette inform~tion génétique, parmi
lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et
de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines
nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al.,
PNAS 84 (1987) 7413),1'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980)
10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de
gènes est apparu comme une alternative promettel~e à ces techniques physiques detransfection. A cet égard, dirré~ virus ont été testés pour leur capacité à infecter
certaines populations cellulaires. En particulier, les le~virus (RSV, HMS, MMS,
etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
De nombreuses applications de la thérapie génique sont en cours d'étude,
telles que les maladies génétiques (ll~yopa~llie, mucovi~cj~lose, SCID, etc), les
pathologies du système nerveux central (~l7hPimPr, Parkinson, etc), les maladiescardiovasculaires (hémophilie, athérosclérose), le SIDA ou les cancers. Plus
particulièrement, concernant le traitement des cancers, dirrél~ es stratégies ont été
proposées dans l'art antérieur. Ainsi, la ~em~n~l~P EP 259 212 décrit la préparation de
30 vaccins destinés au traitement des cancers, col.lpre.lant un virus modifié capable
d'exprimer un antigène spécifique d'une tumeur, permettant de générer une réponse
immunitaire contre ces cellules. Par ailleurs, la dem~n(le W O91/15580 décrit laconstruction de rétrovirus contenant un gène codant pour un ribozyme, dont
s~ion en culture cellulaire peut permettre de détruire un ARNm d'un oncogène.
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Il est également connu de la demande WO 93/10814 d'utiliser des vecteurs exprimant
des formes immunogéniques, non tumorigénique, d'oncogène cellulaires impliqués
dans le développement des cAn~rs. La demAn-ie WO 93/02556 décrit enfin l'ntili~Atinn
de cellules prélevées dans la tumeur, m~xlifiées génétiquement ex vivo par introduction
5 d'un gène toxique, puis .æari~";~ es au patient. Toutefois, cette approche impose
des étapes de chilu~gie, et de plus, la stabilité du gène toxique dans la cellule
l.~lsr~"lnée ex vivo n'est pas l~...onl,~e.
Aussi, bien que des résultats illlé.e:~&n~s aient été obtenus, les constructionsdécrites dans l'art antérieur ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante
certaines difficultés, et nol~ .ent le ciblage précis des cellules à traiter. Ainsi, il a été
proposé d'utiliser des rel-~vi~ls recombinants cornme vecteurs pour le transfert de
gènes thérapeutiques. En effet, ces virus ne sont capables d'infecter que les cellules qui
se divisent. Cepçn~Ant, l'emploi de ce type de vecteur ne permet pas de cibler avec
sl~rri.CA-~ ent de sélectivité les cellules tumorales. De plus, ces virus ne peuvent être
obtenus avec des titres très élevés ce qui limité l'effira~ité thérapeutique. Il a par
ailleurs été proposé d'a~imini~trer directement le gène dans la tumeur. Ici encore, les
risques de diffusion aux cellules el,vi~onl~Alllp~ ne sont pas exlus. Pour cette raison, il a
été proposé de modifier la spécificité d'hote des virus utilisés, en incorporant dans leur
enveloppe des protéines reconn~i~.c~nt des récepteurs spécifiques de cellules tumorales
(WO93/00103; WO92/14829). Toutefois, ces constructions ne permettent pas
d'obtenir des ciblages s1~ffi~ntc, notamment lorsque le virus utilisé code pour une
protéine toxique destinee à la destruction des cellules.
La présente invention apporte une sollltion avantageuse à ces problèmes. Elle
fournit en effet des ve~;lelus capables de diriger l'expression d'un gène donné
2s sélectivement dans les cellules tumorales. La présente invention repose en particulier
sur la mise en évidence que certains signaux de controle de la transcription sont actifs
(ou activés) spécifiquement dans les cellules tumorales, et qu'ils peuvent être utilisés
pour l'expression sélective de gène hétérologues. Elle résulte également de la mise en
évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le
transfert et l'expression de gènes thérapeutiques dans les cellules tumorales. En
particulier, les adénovirus présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des
cellules qu'ils infectent, de s'y m~int~nir de manière très stable ce qui permet d'obtenir
un effet thérapeutique durable, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui permet
une application au traitement de cancers affectant tout type de cellules. De plus, des
3~ adénovirus recombinants peuvent être obtenus avec des titres élevés, ce qui permet de
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travailler à des multiplicités d'infection élevées, et d'introduire plusieurs copies du gène
hétérologue par cellule. L'invention repose également sur la mise en évidence que les
virus de type adénovirus sont capables d'incorporer des séquences hétérologues
co-l-prenant de tels promoteurs, de transférer ces séquences dans les cellules
s tumorales, et d't:A~imer des gènes désirés sous le controle de signaux spécifiques
dire.-le..,~nl au niveau de 11~mPl~rs.
Un p.e,llier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant
défectif co~ n~ll une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux
d'e~,~ion actifs spécifiquement dans les cellules tumorales.
L'invention a é~lP,mPnt pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus
rec~mbin~nt défectif pour la pr~pa~alion d'une co-~lpo~i~ion ph~n-n~ceutique destinée
au tr~itPmP-nt ou à la ~venlion des cancers.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se
répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des
adéno-virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu
au moins des séquences npcec.c~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-
fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré.
P~erérenliellement, le virus défectif conserve né~nmoinc les séquences de son génome
qui sont nPcPcc~ires à l'Pn-~p~ tion des particules virales.
Il existe di~-~n~ sé-ulype~ d'adénovirus, dont la structure et les propriétés
varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'homme, et
not~mm~nt les sujets non immuno--lepnm.os. Parmi ces séiu~yl)es, on préfère utiliser
dans le cadre de la présente invention les adénovirus hnm~in~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou
Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir ~lem~n~e FR 93 05954). PalTni les
adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut
citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al.,
Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV).
De p,~fe~ ce, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus
~n~rel~ iellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-
800) par exemple].
De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine
..."~;ne ou canine ou mixte.
Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'invention portent une séquence
35 d'ADN hétérologue. Cette séquence d'ADN hétérologue permet l'expression d'une
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activité biologique recherchée au niveau des cellules tumorales. De préférence, la
séquence d'ADN hétérologue comprend au moins un gène choisi parmi un gène
toxique pour la cellule infectée, un gène dont l'expression permet d'inhiber au moins
parti~ll.om~nt la division cellulaire, ou un gène codant pour une lymph~ in~. Les
s adénovirus de l'invention peuvelll en outre con-po-le, plusieurs de ces séquences, afin
d'obtenir dans certains cas un effet synergique anti-tumoral.
Parmi les gènes toxiques pour la cellule i~fectée, on peut citer
éfele~ m~nt les gènes dont le produit d'e~.e~ion confère à la cellule une
s~n.cihilite à un agent thél~peulique. Plus préféLellliellement, le gène toxique est choisi
0 parmi le gène de la l~-yn~;d ne kinase, dont le produit d'eA~Ie~ion confère aux cellules
irè.es une s~ncihilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou
l'acyclovir. La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de
phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir. Ces
molec~ c malifiees peuvel-l être incorporées dans une chaine d'ADN encours
d'ék~ng~tinn~ ce qui a pour consé4uence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la
mort de la cellule (F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet
ainsi d'élimin~r spécifiquè-l.e,-L les cellules e~l~lim~nl le gène suicide. De plus, la
synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules encours de division sont
affectées.
Plus préfé-e,.liellement, on utilise dans le cadre de la présente invention le
gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1). La séquence de
ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic
Acid. Res. 8 (1980) 5931).
Il est é~l~m~nt possible d'utiliser le gène de la cytosine ~les~ ;n~ce~ dont le
2s produit d'e~es~ion confère aux cellules ~K~;rèlès une s~n.~ihilité à la 5-fluoro-
cytosine (5-FC). Par ailleurs, parmi les gènes toxiques ~Itili~hles dans le cadre de la
présente invention, on peut citer égalernent les gènes dont le produit d'expression
induit une apoptose de la cellule infectée.
Parmi les gènes dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la
division cellulaire, on peut citer plus particulièrement les gènes suppresseur de tumeur
(ou anti-oncogène) ou tout dérivé actif de ceux-ci; les séquences antisens ou les
ribozymes, dont l'expression dans la cellule cible permet d'inhiber au moins partiel-
lement l'expression de gènes favorisant la division cellulaire.
Parmi les gènes suppresseurs de tumeur lltili.e~hl~ dans le cadre de la
présente invention, on peut citer plus particulièrement le gène p53 (Baker et coll.,
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Science 244 (1989) 2]7); le gène Rb (F!iend et coll., Nature 323 (1986) 643; Huang
et coll., Science 242 (1988) 1563), le gène rap lA (Kitayama et coll., Cell 56 (1989)
77); le gène DCC (Fearon et coll., Science 247 (1990) 49), les gènes k-rev2 et k-rev3;
ou tout autre gène suppresseur de tumeur décrit dans la lilLé,alu~e (Cf part exemple
5 WO 91/15580).
La séquence d'ADN hétérologue peut eg~lem~nt co.~.p-endre une séquence
~nti~Pn.c, dont l~ ;on dans la cellule cible permet de contrôler ll~A~ sion de
gènes ~IVUliSall~ la prolifération cellulaire. Ce controle peut ~ au niveau de la
lldl~cri,vlion, du splicing du prémessager, de la dégradation du messager, de sa10 traduction en protéine, ou de modifications post-traductionnelles. ~ ,el,liellement.
la séquence d'ADN hétérologue comporte un gène codant pour un ARN ~nti.cens
capable de controler la traduction d'un ARNm cible (EP 140 308). Parmi les séquences
~nticf~.n.c utili~bl~s dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement
toute séquence ~nticen.c permettant de .li",in,ler les niveaux de production des15 oncogènes ras, myc, fos, c erb B, etc.
Parmi les gènes codant pour des lymph~in~s, on peut citer plus
particulièl~.,-el,t les gènes codant pour les interleukines (IL-1 à IL-3 de pl~félellce),
les interférons, les facteurs de nécrose des tumeurs, les facteurs de stimulation des
colonies (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc), le TGF-13, etc. Par ailleurs, le gène codant
20 pour la lymrhokine co,l,p~e,ld généralement, en amont de la séquence codante, une
séquence signal tliri~nt le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la
cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la
lymph~1~inP, mais il peut eg~lemP.nt s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle,
ou d'une séquence signal artificielle. De telles constructions pennettent en particulier
25 d'augmenter les taux de lymphokine de manière très localisée, et ainsi, en présence d'un
antigene spécifique de tumeur, d'amplifier la réponse jmmlmit~ire contre un typeparticulier de tumeur, ce qui donne un effet particulièrement avantageux.
Comme indiqué ci-dessus, la séquence d'ADN hétérologue est placée sous le
contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. De
30 cette façon, le gène utilisé n'est exprimé et ne produit son effet que lorsque le virus a
effectivement infecté une cellule tumorale.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il s'agit de signau~;
d`eA,ul~s~ion induitc par ou actifs en présence de virus respon.ca~lçs ou associés à des
tumeurs. Encore plus pr~félentiellement, on utilise dans le cadre de la présente
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invention un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le
virus du papillome.
Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est associé à deux types de cancers hllm~in.s:
le ly...phn..~e de Burkitt et le cancer du nasopharynx. L'~ltili.~ation d'un adénovirus
5 recombin~nt colnpreilan~ un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur in~t~ctible
par l'EBV permet av~nt~ nt d'exprimer spé-ifiguem~nt ce gène toxique dans
les cellules tumorales du nasopha..ynx. Dans les hiop~ c de cancers du nasopharynx,
un seul ~nti~en~ nucléaire est réguliè~ en~ présent, EBNA1, qui est impli~ e dans la
l"~;n~ ce du génome viral dans les cellules infectées par l'EBV en phase latente, et
qui transactive le promoteur viral BCR2. Un objet particulier de l'invention réside donc
dans l'~ti~ tion~ pour l'expression spécifique d'un gène dans les cellules de cancers du
nasoph~yn~, d'une séquence répondant à EBNA1 (EBNA1-RE: EBNA1 "responsive
element"). En particulier, l'invention concerne un adénovirus co--,preilant comme
signal d'ex~ ion un promoteur chimère col-lprenal,L une séquence répondant à
EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, le promoteur du gène de la
terminale protéine 1 (TP1). Les exemples décrits dans la présente ~l~m~n~ montrent
bien que ce promoteur chimère est inductible par EBNA1.
Les virus du papillome (notamment le virus HPV 16 et 18) sont responsables
de 90 % des cancers du cervix chez la femme et ont été i~ntifi~s dans des lésions
épithéliales pré-cancéreuses (Riou et al., Lancet 335 (1990) 117). Le produit du gène
E6 conduit à la forrnation de turneurs en ~ nl.~ fo-l~nle-ll la quantité de p53
sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-posilives (Wrede et al., Mol.
Carcinog. 4 (1991) 171). L'utili~ticn d'un adénovirus recomhin~nt co",~rellant un
gène toxique sous le contrôle d'un promoteur in~ chhle par le HPV (par exemple la
protéine E6) perrnet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans
les cellules humorales co.lespondantes.
Il peut encore s'agir de signaux d'expression inactifs dans les cellules norrnales
et actifs dans les cellules tumorales. En particulier, on peut utiliser dans le cadre de la
présente invention le promoteur de l'a-foelop,.~léine (Alpert E., dans Hepatocellular
carcinoma, Okuda & Peters (eds), New York, 1976, 353) ou le promoteur P3 de
l'IGF-II (Sussenbach et al., Growth Regulation 2 (1992) 1), qui sont actifs chezl'adulte, uniquement dans les hépatocarcinomes. Il est également possible d'utiliser des
promoteurs induits par des hormones dans le cas de tumeurs horrnono-dépPn-l~ntes ou
hormonaux associées (turneur du sein ou de la prosla~e par exemple).
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En outre, ces séquences promotrices peuvent être modifiées par addition de
séquences d'activation, de régulation, etc.
Les adénovirus recomhin~ntc défectifs selon l'invention peu~enl être préparés
par toute technique connue de l'homme du mhier (Levrero et al., Gene 101 (1991)
195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être
p~éparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un p1~mi~P portant
entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recomh;.~ n homologue se produit
après co-t~reclion desdits adénovirus et pl~emi~lP dans une lignée cP11~ ire
app,up.iée. La lignée cellulaire utilisée doit de p~ ence (i) être transformable par
lo lesdits PlemPnt.C, et (ii), colJ.poller les séquences c~p~hl~P~ de compléllle~ r la partie
du génome de l'adénovirus défectif, de pl~:Çé~nce sous forme intégrée pour éviter les
risques de recoml~inaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de
rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui
c-ntiçnt nol~n~.~P~.~ intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un
adénovirus Ad5 (12 ~o). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des
adénovirus ont également été décrites dans les (lPm~n~P,s n FR 93 05954 et
FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon
les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
La présente invention concerne également une composition pharm~ceutique
co.llprenant un ou plusieurs adénovirus rec- mbin~nt.c d~re~ s tels que décrits
précé~mmPnt. De préférence, les compositions ph~rm~- elltiques de l'invention
conti~nnPnt un véhicule pharm~ceutiquement acceptable pour une form~ ti~-n
directement injectable dans les tumeurs à traiter. Il peut s'agir en particulier de
2s solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mmPnt Iyophili~éçs, qui,
par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la
con.~titution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur à traiter est
avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thél~peulique au niveau des tissus
affectés. Toutefois, il est ég~lPmPnt possible d'utiliser des compositions pharmaceu-
tiques formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intra-
nasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif 1Itili~éçs pour l'injection peuvent
être adaptées en fonction de différents paramètres, et not~mment en fonction du mode
d'a~ .;ni~llalion utilisé, de la pathologie concernée, du gène à e~rimer, ou encore de
la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus
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recombinants selon l'invention sont formulés et ~rlmini.ctrés sous forme de doses
comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de ple~erence 106 à 101 pfu/ml. Le terme pfu
("plaque forming unit") correspond au pol,vc,ir infectieux d'une solution de virus, et est
déterminé par infection d'une culture cellulaire approp~iée, et mesure, généralement
5 après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de
détermination du titre pfu d'une solt~ti~n virale sont bien documentées dans la
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou
la pic~v~l~lion des c~n~rs. Elle est tout particuliè~,llen~ adaptée au traitement des
0 cancers du nasopha,y,~ ou des h~pator~rcinomes.
En outre, ce tr~it~m~nt peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel
que les ovins, les bovins, les animaux domesti-lues (chiens, chats, etc), les chevaux, les
poissons, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples
15 qui suivent, qui doivent être c-~n.~i~f~res comme illustratifs et non li~ t;
LéPende des f sJures
Figure 1: Représentation du vecteur pONT-tk
Figure 2: Représentation du vecteur pONT-~-gal
Techni~ues pénérales de biolo~ie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les
extractions ~ p~aLives d'ADN r~mi~liqu~, la centrifugation d'ADN pl~,mi~ ue en
gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la
purification de fragm~ntc d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au
phénol ou au phénol-chlol.~fc,l,l,e, la pré~ipit~tion d'ADN en milieu salin par de
25 l'éthanol ou de l'isol)ropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc sont bien
connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis
T. et al., "Molecular ('.kming, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laborator~,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~mi-les de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont
d'origine commerciale (Reth~s~l~ Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragm~nt~ d'ADN peuvent être séparés selon leur taille
par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un
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mélange phénol/chlOr~folme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le r~mpli~s~ge des e~lé-"iles 5' proéminentes peut être effectué par le
fragrnent de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications
5 du fol~rni~e~r La destruction des e~l,~,-,i~és 3' proéminentes est effectuée en présence
de l'ADN Polyrnérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~nd~til~n~ du
fabricant. La destruction des e~lle"-i~s 5' prcç~..;n~ es est effectuée par un traitement
ménagé par la nucléase S1.
La m~lt~enèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthhiques peut
0 être ~rr~;lllée selon la méthocle développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13
(1985) 8749-8764] en 1~tili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fr~gmPntc d'ADN par la technique dite de PCR
[~olymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-
1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être
15 effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les
spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode
développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en
lltili~nt le kit distribué par Amersham.
20 F.~em~l~
Exemple 1. Construction du vecteur Ad-ONT-tk portant le gène tk sous le
contrôle d'un ~ t~llr chimère EBNAl-RE/TPl (figure 1).
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recom~in~nt co-l.pr~nant
le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un
2~ promoteur spécifinluement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur
chimère EBNA1-REm1).
1.1. Construction du plasmide p7tkl
Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase
ouverte de lecture du gène tk de 1131 paires de bases (ATG 114-116 et codon stop30 TGA 1242-1Z44), insérée dans un mtllti~ite de clonage.
Le fragment BgIII-NcoI conten~nt le gène de la thymidine kinase (tk) du
virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du pl~mi~le pHSV-106 (cl~mm~rcialisé
par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenow puis inséré au site SmaI du
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plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega). Les sites SmaI et BgIII sont
détruits lors de cette étape, le site NcoI est conser~é.
Le pl~mide obtenu a été désigné p7tkl.
1.2. Construction du pl~mi-le pONT1
Cet PyPmplP décrit la coristruction d'un pl~cmi~P contPn~nt un promoteur
chimère con~tit~lé d'une séquence nPcç~ire à la transaclivalion par l'antigène EBNA1
et du promoteur TP1 du virus EBV.
Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la
souche B95-8. La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al.
l0 (Nature 310 (1984) 207). Ce fragment contiPnt les séquences n~cPc~ires à la
transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986,
Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite étéfusionné au fragment NruI(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été
digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TP1. Le promoteur chimère
15 ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II
SK.
Le plasmide obtenu a été désigné pONT1.
1.3. Construction du plasmide pONTtk
Le pl~mirle pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de
20 l'herpès simplex (tk) cloné dans le pl~mi(lP p7tkl, sous le contrôle du promoteur
chimère EBNA1-RE/TP1 cloné dans le pl~mi~ie pONT1.
Pour construire ce pl~mi~e~ le fragment BamHI-XhoI de pONT1 qui
conti~nt le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment
XhoI-ClaI de p7tkl qui c-)nti~nt la phase ouverte de lecture de tk ont été clonés aux
25 sites BamHI (478) et ClaI (4550) du plasmide pAd.RSV~gal. Le plasmide
pAd.RSV~Gal conti~nt~ dans l'orientation 5'->3',
- le fragment PvuII correspondant à l'ex~ "ilé gauche de l'adénovirus Ad5
co,l,~lellant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d~enr~rc;rl~tion et
l'amplificateur ElA;
- le gène codant pour la ~-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la
recombinaison homologue entre le pl~cmide pAd.RSV~Gal et l'adénovirus dl324. Le
WO95/14101 2 1 7 6 5 8 5 Pcr~g4/01284
plasmide pAd.RSV~3Gal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90
(1992) 626).
Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a hé désigné
pONTtk (figure 1).
1.4. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-ONT-tk
Le vecteur pONTtk a été linP~ri~é et cotransfecté avec un ve~;~eu~ adénoviral
déficient, dans les cellules helper (lignée 293) appo lanl en trans les fon- tinn~ codées
par les régions E1 (ElA et EllB) d'adénovirus.
Plus pL~;~ nt~ l'adénovirus Ad-ONT-tk a été obtenu par re~omhin~i~on
homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dl324 (Thimm~ppaya et al., Cell 31
(1982) 543) et le vecteur pONTtk, selon le protocole suivant: le ~l~smirle pONTtk,
lin~ri~é par XmnI, et l'adénovirus dl324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-
transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de c~l~itlm, pour permettre la
recomhin~i~on homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été
sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirusrecombinant a été ~mplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant
de culture con~n~nt l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titred'environ 10l pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur
gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir not~mm~t Graham
et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-ONT-tk peut être conservé à -80C
dans 20 ~o de glycérol.
Exemple 2. Construction du vecteur Ad-ONT-l~gal
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant co,nprenant
le gène de la béta-galactos~ e d'E.coli (13gal) sous le contrôle d'un promoteur
spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère
EBNA1-RE/TP1).
2.1. Construction du plasmide pONT-~gal
Le fragment XbaI-(HindIII) du plasmide pONT1 qui contient le promoteur
chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2 et le fragment (StuI)-KpnI du pl~mi~le
pAd.RSV~gal qui conti~nt le gène de la ~-galactosidase ont été clonés aux sites XbaI
(484) et KpnI (4520) du pl~mide pAd.RSV~gal. Les sites HindIII et StuI sont
WogS/l4l0l 2 1 7 6 5 8 5 P~ ~1/0l284
détruits au cours de cette étape. Le plasmide obtenu a été désigné pONT-13gal (figure
2).
2.2. Construction de l'adénovirus Ad-ONT-~gal
Le vecteur pONT-~gal obtenu dans l'exemple 2.1, a été utilisé, par
5 recomb..laison homologue selon le protocole décrit dans l'exemple 1.4., pour ~Jlep~C~L
un adénovirus recomhin~nt coil.~renant le gène de la béta-galactosi~ e d'E.coli (~gal)
sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-REJI P1. L'adél~vi. us Ad-ONT1-Bgal
ainsi obtenu peut être conservé à -80C dans 20 % de glycérol.
Exemple 3. Construction du vecteur pONT-CAT
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur co~llprellant le gène de la
chlor~mphPnicol acétyl transférase (CAT) sous le contrôle d'un promoteur
spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère
EBNA1 -RE/ I P1) .
3.1. Construction du vecteur
lS Le promoteur TP1 de l'EBV a été isolé sous la forme du fragment
NruI(166241)-PstI(166559) de l'EBV. Ce fragment a ensuite été fusioMé au gène
CAT, et inséré, sous forme d'un fragment NruI-BamHI, dans le pl~mi(lP pGem7ZF
(Promega). Le plasmide résultant a été désigné pTP1-CAT. Le fragment NruI-BamHI
du plasmide pTP1-CAT a ensuite été fusionné, en aval du fragment EcoRI(7315)-
SmaI(8191) de l'EBV souche B95-8, cont~n~nt les séquences npcp~;.s~ s à la
transactivation par EBNA1 (Cf Py~mrle 1.2.). Le fragment obtenu, colnprenant le
gène CAT sous contrôle du promoteur cl~i"lè~ EBNA1-RE/TP1, a été inséré aux sites
EcoRI et BamHI du plasmide pBluescript SK pour générer le pl~midP pONT-CAT.
Un plasmide a également été construit dans lequel les PlP~PntS de réponse à l'antigène
2s EBNA2 du promoteur TP1 ont été délétés. Pour cela, le promoteur TP1 a été isolé
sous la forme du fragment NruI(166375)-PstI(166559) de l'EBV. Ce pl~mid~ a été
désigné pOST-CAT.
3.2. Activité in vitro
Cet exemple démontre que les constructions décrites ci-dessus sont induites
spécifiquement par des antigènes du virus d'Epstein Barr.
Les vecteurs pONT-CAT, pOST-CAT et pTP1-CAT ont été transfectés par
électroporation dans une lignée de lymphocytes B EBV- (cellules DG75), soit seuls,
Wo 95/14101 2 1 7 6 5 8 5 ~ ~ ~lr~ 1/01284
soit en présence de vecteurs d'expression des antigènes viraux EBNA1, EBNA2 ou
EBNA1 + EBNA2. 48 heures après la transfection, les cellules ont été Iysées par
congélation/déc-ng~l~tiQn, les débris cellulaires éliminés, puis les extraits obtenus ont
été normalisés suivant la quantité de protéines. L'activité CAT a ensuite été dosée dans
s ces extraits par dosage enzymatique. Les résultats obtenus sont les S~livilllLS:
Seul +EBNA2 +EBNA1 +EBNAl/A2
pTP1-CAT 1 35 2,5 17
pONT-CAT 1 16 34 136
pOST-CAT 1 1,4 19,5 22,5
Ces résultats montrent clairement que le promoteur ONT est spécifiquement
actif en présence des antigènes EBNA1 et EBNA2, et qu'il induit une très forte
expression du gène CAT.
