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, 9 ~ ~
WO 96/40989 8/FR96/00836
8y~tème dc sondes ~. d'effectuer le typa~e ELA DR, et
procédé de typn~e utilisant 1esdites sondes.
LA préaento lnvention a pour objet un procédé pour ~t~rm~ner
le génotype HLA de claase II d'un individu et se rapporte plus
part~r.~ la ~tect~nn des gène~ polymorphes nLA DR. Ce
procédé est Arrl~rAhl~ n~t ' au typzge HLA en trAn~r1AntAf~rn,
au ~rJnn~t~r médical, ~ la médecine légale, etc.
Le système HLA (antigène des ly~phocytes humains) est codé par
le complexe d'histocompatibilité ma~eur chez l'homme. Il constitue
une crntrr~nte très importante au cours des tr~n~rlAntations
d'organes entre les individus en ~rr~ une ~t~nrt~rn entre le
soi et le non-sol. De plus, les facteurs du HLA sont impliqués dans
la rre~1~rn~t~rn à un grand nombre de maladies. Les antlgènes du
aystème HLA ont donc été utillsé~ dans des prccédés de typage pour
~ht~rmlnrr les rAr~rt~rlytiques entre dcnneura et receveurs lors de
trAn~rlAntAt~on~ d~organea (F. H. BACH et J.J. VAN ROOD, N. Engl. J.
Med., 295, pagea 806-13 (1976)), ainsi que la rr~ rn~t~rn d'un
individu à certaineJ maladies.
D'un point de vue g~n~t~qrc, le système HLA e~t bien
rArArt~r~é et con~iste en un ensemble de loci plus cu moins
polymorphes situéa dans un lntervalle d'envircn 2 centimcrgana ~cM~
~ur le bras court du o} 6. Trol~ loci dans ce système (HLA-
A, B et C) codent pour une claaae d'All~nt~g~n~ exprim~s de façon
ro~ 'nAnte ~claaae I). Une autre région (HLA-D) qui ccntient en
fait plualeurs gènes code pour une seconde claase d'alloantigène
e-primés de façon co~ 'nAnte avec un degré important de
pol~ rrh~, (cla~se II). Pluaieurs autreY loci qui rnntr~lont
notamment les _ - ~ C2, C4 et le facteur Bf de la cascade du
1.' appartiennent également au systeme HLA (classe III). Le
auccèa des greffes d'organes dépend dans une grande meaure de
l'identité HLA (clasaes I et II) entre receveur et dcnneur. En
~ e, le typage HLA doit etre le plu~ exact possible. Ce
besoin concerne pr~ rAlr les trAn~rlAntAt~nn~ de reins (P.J.
Norria et A. Ting (1982) Immunol. Rev 66, 103 - G. Opelz (1989)
TrAnspl. Proc. 21,609 - E.L. LAGAAIJ, P.H. 1 -- , M. Ruigrck et
al. (1985) New Engl. J. Med 321,701) et les greffes de moelle
os~euse (P.G. Beatty, R.A. Clift, E.M. M~r~ nn et al. (1985) New
Engl. J. Med 313,765 - J.M. Hows et 8.A. Bradley (1990) Briti~h J.
Hematol. 76,1). Dans le cadre de la greffe de moelle osseuse,
l'identité parfaite au niveau des antigènes HLA classe II r~rr~nte
un facteur d~-~rm~nAnt pour le ~uccès de la greffe, c'est-à-dire
WO 96/40989 2a ~ 2 ~17 c~ _ /rh_~C~ '
pour éviter un re~et du qreffon ou le dév~l~FF d'une maladie
greffon-contre-hcte (P.G. Peatty, J. Han9en, G.M. Longton et al.
~1991) Tr~n~p~AntAtion 51, 443 - R.C. Ash, J.T. Casper, C.R.
Chit mbar et _l. (1990~ New Engl. J. Med. 322, 485 - C. Ana3etti, D.
Amo8, P.G. BeAtty et Al. (1989) New Engl. J. Med. 320,197~.
Le pol~ des produits d'expre~ion des gènes de la
région HLA D est défini hoh~t~ t par des techniques
~rnlrrJ~rp.~ baséeY sur l'analyse par des All~nt~rA des produits
des gène~ HLA exprimés à 1A- Aurface dea cellules (J.J. Van Rood et
A. Van Leeuwen (1963) J. Clin. }nve3t. 42,1382 - J.J. Van Rood, A.
Van Leeuwen, J.J. ~oning, A.B. Van Oud Ablas (1975) Tissue Antigens
5, 73). La précision et 1A- r~rroA"~t~h~l~té ~r~n~nt des lots de
sera A~r~n~hl~ Cependant, meme dans les ~llr~rrc cAnA~tlnnc~ un
très grand nombre des allèles exlst_nts ne sont paA ~tertAhl~c par
ce_ ~rhn~q~l~c ~brolorJ;~ --. LeJ limite_ de l'analyse 3~r~l0~rpl~
ré~ultent easent~ell~ de l'abaence d'Allo~nt;~éra mono-
~Pér~f;~, d'une A;Arr;m;n-t~n Ir lète avec des reactivités
croiaéea entre dea ~r~r~f~r;t~ trèa prochea, par excmple DR3 et
DRw13 ou encore d'une ~rrr~ n altérée des molécules nLA classe II
à 1A- aurfAce deA cellulea, par exemple de celluleg l~l~r~m;rp~A
Grace à ln biologie l~r~lA~re, on sait ~-lnt~n~nt cu'il
existe un plus grcnd nombre de gènes HLA qu'on ne le 3~rro~-;t
auparAv_nt et, aurtout, beaucoup plus a'allèles A~ff~r~ntc, Cette
diveraité est lnt~ ~Arr~rtlAr;-~ AU niveau des aéquenceA d'ADN
de~ A~ffArrnt~ gènes et allèles. Selon le dernier rapport du comité
de r -l~t~re HLA (voir The WHO " -lAt~re Committee for factors
of the HLA system (1990) T - ;rA 31, 131 - ~nd - J.G. Bodmer,
S.G.E. Marsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, B. Dupont, H.A. Erlich, B.
Mach, W.R. Mayr, P. P_rham, T. S_aazuki, G.M.T. Schre~ r, J.L.
St 'ng~r~ A. Sve~ga_rd et P.I. Ter_saki (1991) Ti~sue Antigens 37,
97), le pol~ HLA claAse II se repartit comme suit : locus
DRBl : 47 allèloa, locus DRB3 : 4 allèles, locus DRB4 : 1 allèle,
locus DRB5 : 4 allèles, locus DQBl : 17 allèles, locus DQAl : 13
_llèles, 1OCU-A DP31 : 21 allèles, locus DPAl : 4 allèles.
Beaucoup de ces alleles echappent à l'analyse flbr~l~g;~e et
ne sont ;A~nt~f;r~l~c qU~A-u niveau de l'ADN. On peut Lllustrer les
limiteo du typAge ~' lo7~, ~ par la er~o;flr~té s6rolr,g~ DR4,
~r~ ~n-~t subdiviaée en 11 so~a t~s (DRBl*0401-0411) (voir J.G.
Bodmer, S.G.E. MArsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, B. Dupont, H.A.
wo 961409i9 16 9 Z~ ~ C
Erlich, 3. M_ch, W.R. Mayr, P. Parham, T. Srs-zuki~ G.M.T.
Schreuder, J.B. 5t 'n~r~ A. Sve~gaard et P.I. TerasDkl ~1991)
~ Tisaue Antigens 37, 97), l~n~lf~r~le~ ge~ _u niveau de la
~équence d'ADN.
Dc meme, la ~péo~f~r;té DRw6, cui peut etre subdivi3ée en
DRw13 et DRw14 par guelquea All~An~ rA~ contient en réalité 10
5~ r alléligues (DRBl*1301-1305 et DRBl*1401-140S (volr la
p~-hlloAf~- de Bodmer JG citée ci-desAus) qui, là au88$, ne peuvent
etre ~ r~m~ que p_r l'analyse genotypique au niveau de la
10 ~équence d'ADN.
~'analyse génotypique est une nouvelle approche p ~ Ant
d'analyser la diversité du système HLA classe II ~-eot~ - au
niveau des genes. L'analyse génotypique est bAaée aur le principe de
l'hyh~ t~nn ~]é~ A;~e et la première approche qui fut propo~ée
15 est la te~hn~ dite "RFLP~ qui consiate à f _ ' e- l'ADN par
ut~ n d'enzymes de r~t~r~n et à _nalyser la taille des
frAgmenta d'ADN ~r~fl~-~ générés par ces enzymes (voir C.T. ~ake,
E.O. Long et B. MAch (1982) Nature 300, 372 - J. B~hme, M;
Dn~ An, G. r~ On~ E. Miller, P.A. Peterson et L. P~a~k (1985)
J. Tmmunol. 135, 2149 - J.L. Bidwell, E.A. Bidwell, D.A. Savage, D.
M~let~n, P.T. ~louda et B.A. Bradley (1938) TrAr~pl~ntAt~on 45,
640).
L'AnAlyse p_r RFLP ne permet de rerAnn~'fre que certaines des
~ffe-en~a Al~ T~ tsrtAhle~ pAr la ab~s~o~ et oette
te~hn~que pré~ente encore des l~m~f~fl~n~. En effet, un allèle
portant une aéquence d~ff~-~nte est l~n~flrhle ~ ai le
nucléotide différent est dAns le aite de r~onn~r-nre de l'enzyme
de reatriction utillaée dAns l'an_lyse et donc un gr_nd no_bre
d'_llèlea HLA cl_aae II ne aeront p_a reconnus pAr cette analyae. De
3C plua, l'anAlyse RFLP met rarement en évldence une f~A~n dans
une aéquence codAnte, et ne fournit p_s d ~ aur la nature
erActe de 1A ~f~rAl~n. Enfin, cette t~ ~ ~T-e est longue et
lourde c_r elle implique d'utlllaer de8 qv~nf~t~ rel_tivement
importantes d'acides nl~ qui dolvent etre digérées avec
pl~iev~ enzymea de restriction, de8 électrorho-~ ~~ et des
t-An-fe-f~ aur filtrea.
Pour illuatrer leo limltes de 1~ te~hn~ RFLP, on peut
~ que les sv~b ty~A des rr~r~f~f~ DRl, DR4, DRw8, DRwll
ou DRw13, ne sont pas d~fe~hle~ par RFLP.
. .
.... . ..
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Une nouvelle technlcue d'analyse génotypiquo de ~LA classe II
a été proposee, c;ui est la methode dite de typage par
nl;rJr,n~rl~otLdeg . Grace a la cnnn~ Anre des séquences d'ADN des
gènes de ~LA classe II et en particulier des gène3 DR~, qui scnt de
loin les plus polymorphea, on peut ut$1iser des ol~gnn~ ~tides qui
aont apécificues d'un endroit donné de la Jéquence du gène comme
traceura pcur l'an_lyse du polymorphiame par hyhr;~t;on. Ces
nlir;rn~rléot;~o~ sont chcls1s de façon à être les plus ;nf~- ;f~
poa~;hle8 et a i re l'i~ontifiratir~n deg ~iiff~ront~ allèles,
sur la base de leurs différences de a~T~onro~. Dans la pratique,
n'importe quelle différence de séquence, meme d~un geul n.~ ti~o,
peut etre détectée.
La te-hni~ e de typage par oligcnucléotide~ peut etre
Arpl;~v~e aussi bien à l'ADN, comme décrit dans la publication
d'Angelini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vcl. 83, pages 4489 -
4493 (1986), ou'à l'ARN (voir C. Ucla, J.J. Van Rood, J. Goraki et
B. ~ach (1987) J. Clin. Invest. 80, 1155).
Cette nouvelle approche est baaée sur le principe de
l'hybridation moléculaire en utiliaant les propriétes
or~nct4r; t;q~As dea scides n~ é;i - 9 qUi aont les rna~ih;l;t~a
d'$nteragir avec une sériuence c ]~' A;re par l';nt~rr~;A;re de
llaiaona l.y~ ..ea et de former ainsi un hybride stable, selon les
loia d'arr~r;~ connues, c'eat~à-dlre A-T, G-C, pour l'ADN et A-
U, G-C pour l'ARN. Ainai, des ol;gonvrleotidea de aynthèae
corro ~ à des a/, - d'ADN ou d'ARN dea allèle8 connus
peuvent etre utiliaés comme aondes pour i~~nt;fi~r, dans un
trhnnt;llnn une sériuence n--rl~;~ appelée cible, contenant une
séquence ~ A;re de celle de la sonde. Le marcuage de
l'hybride formé entre la cible et la aonde permet l_ détection et la
cu-nt;f~rat;nr de la cible dana l'ér~-nt;11nn. Ce marquage eat
effectué par tout marqueur connu, tel que marqueur en~ ;T'~~
chimique ou ra~iioArt;f. Sur la base de ces rrinr;re~ la première
~rrl;r~inn de typage par ol;rJnn~lrl~oti~i~ pour le RLA claaae II a
ttttt } '~ tte par Angelini et al. dans la r.~hl;rAt;nn pl~
citte, avec vt;l;~st;n~ de la t~rhn;TVo dite SUU1..~ selon
laquelle l'ADN cible eat dépoaé aur une me~brane de nylon et la
~i~tectinn egt ~rr~ t~ à l'aide d'une sonde ol;gnnn-l~o~;t;Tuo
marquée. La terhniT~e a ensuite été appliquée à la ~Ateotinn
d'allelea RLA claaae II non identifiablea par la ~érologie de
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routine (voir J.M. Tiercy, J. Goraki, M. Jeannet et B. Mach (1988)
Prcc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 198 - J.M. TLercy, J. Gorskl, H.
Bétuel, A.C. Freidel, L. GebAhrer, M. Jeannet et B. Mach (1989)
~uman Lmmunol. 24, 1?. Une autre Arrl~rAt;nn directe au typage ~LA
r S claase II e9t celle décrite dans la demande de brevet PCT WO
89tll547 utlliaant la technique dite Dot-Blot . Une -~f~rAt~r,n à
ce~ terhn~q mo~ eat rorro~ntée par la méthode dite Rever~e Dot
Blot qui oonaiate à fixer ~ur une membrane de papier,
nitroc ~ ln~e ou un mélange de~ deux, une aonde n~rlort~A~l~r et à
offe_~ r la Aotoct~nn d'une hyhr;~At~nn avec une cible marquée.
Cette tec_nique a été Arrl~T vv au typage ~LA-DQA et ~ la detection
dea At~nn~ de la ~ -th-lA~om~e torrAnoonno (R.K. Saiki et
Al., Proc. NAtl. Acad. Sci. USA, Vol 86, pages 6230-6234 (1989)).
Com~e décrit I ' et expl$qué dan~ lea p.hl~rAt~nn~ et
la demande de brevet citéea cl-dessus, le typage colll~lA;re
noco~te la Aotect~nn de At~nn~ pnnrt~-cllo~ dans le génome et
implique la mi~e au point de aondes ~"ff~ L ~hl~ pour
détecter et ~~ ff~ronr1or dea séquence3 homologues à un nucléotide
prèa, et on a trouvé qu'il fallait utiliaer des aondes de oourte
t~ille, A,OnOrAl, de ~ ina de 30 n-~rl~At~Ao~ qui cnnf~r~nt au
test une grande apér~f~r~té, tout en conservant une bonne
~en~;h~l~té. L'~f~ t~nn d~rl~gon~r~éotLdes de courte taille
permet de diapoaer d'un grand eventail de sélectivite.
Dana le c~a od l'on utili e un teat .nt la fix~tion
d'une aonde aur un support aolide reate poaé le problème lié à
~ t~on d'une aonde courte, ~nf~r~o~re ~ 30 nucléotidea,
aur un tel support aolide. R.~. SAI~I et al., dana la p~hl~rnt~r,n
1 5~ citée, ont propoaé une méthode qui con~iate à coupler à
~ tr~m~fé 3' d'une ~onde _ .nt entre 15 et 20 ba~es, une
queue poly(dT) de 400 baOea et ~ or la aonde par
l'~nfr- '''A~rO de cette queue aur un filtre de nylon par o~rr,~f~nn
a dea rayons ultraviolets, de facon i coupler par covalence lea
baaea thymine~ aux ~mine~ primairea I 5~ o~ dana le nylon.
Cependant, cette methode n'est pas ont~A aAt~fA~ nfe,
car elle préaente dea probleGe~ de ~r~r~f~r~fo En effet, lea baaea
thyminea de la aonde peuvent ~ réagir, aou~ ~
U.V., avec le aupport, ce qui implique une ~~m~n~tlnn de
l'~ffJr--~fS d'hyb~ f~~n.
Par ailleura, pour dea rai~on~ d'~n~--~tr~Al~-~f~~n, il eat
W096140989 ~ 2 ~o~ P~l/r i~ ~
qo--hA~t~h10 de mettre au point un procév'é de typage qui pré3ente une
grande qp~r1f~r~té et une bonne ,qon~1h~1~f~ mai3 qui de plus soit
aimple à mettre en oeuvre, d'oy~c~ on rapide, peu onéreux,
~Vt ~ ' ~ 'phl ~ et ~-~li Y'~l o pour le typage individuel.
On a 1n~. .ne trouvé un nouveau procedé pour ~torminer le
génotype HLA DR d'un individu, qui pallie les inccnvenionts décrits
ci-dessu8 en r- ~nt de détecter ot de ~iff~ron~;or des sécuences
1r.~oq a un n~r1oQti~o près.
Ie procédé de l'inventlon peut être _i8 en oeuvre à l'aide d'un
ensemble de sondes nucléotidiques choisies dc façon à po ~ro un
typage avec un nombre min$mum de 80nde8. Cet ensemble de sondes
préaente notamment l'avantage de permettre d'op4rer a une
t ~r~t~re unique, notamment a 37~ C. (bien qu'il soit po3rible
d'-~pérer à une autre t~ ' re, comme on le verra dans la prrtie
orp~ri ~10 ci-aprè8). Un tel ensemble de sondes fait ~g~1
partie de l'invention.
L'ense~ble des sondeY de l'invention qui sera défini ci-aprè3,
peut etre utilisée sous la forme de sondes de ~oto~ n (marquées
avec un agent traceur usuel~ dans les torhn~ - du type Southern,
ou, de 1 ~f~' ~re, sous la forme de aondes de capture (technicue
#andwich ou reverse dot blot) ~ ooY sur un support solide,
acLt par fixatlon passive (adsorption~ directement ou par
l'into ' "~re d'un ligand), tel qu'un ligand hyv v~Lv've (voir par
exemple la demande de brevet européen N~ O 405 913), soit par
1'4t~hl~r d'au ~ ina une llaiaon covalente qui peut etre faite
ici encore A~ ' OU pOr 1'1 ~ re d~un ligand capable de
ae fixer par c~ nre aur le aupport (voir par exemple la demande
de br_vet PCT N~ WO 88/01302). L'~ ~1iq~ei~n des sondas peut etre
réaliaée soit à l'alde de procédé8 connu8, soit à l'alde .d'autres
procédéa qul aeront décrita cl-après.
Les aondes de l'invention ~80nde8 nucléotldiques) vont etre
décritea rr~n~r~ aous la forme de aéqvonro- r-.~ t~
Il est évident pour l'homme du métier que, meme pour le caq de
aondes ~oq~n~o~ a détecter dea ~t1~n~ ponct~ oq, à une
t~ t--re donnée, il est poasible d'envisag_r l'--t~1lr-t~or de
aondea de longueur ~nombre de nucléotide8) variable, dans une
certaine mesure, grace n~e~ ~ l'emploi de 80~ nnq, tampons
~avoriaant plua ou moin~ la ~h~1~te des complexes d~hybri~ei~n
Lea aondes de l'invention aont donc dafinies par une séquence qui
W 0 96/40989 r ~ . ~r ~, ~. I ~
~ 2 11 3~ 6 ~ 2 1
pourrA etre 7ono-Al~ rnn~i~orée comme maximum (en r~rtic~lior 81
on aouhaite travailler à t~ ' relativement baase, par exemple
a 37~ C~, avec en outre l'~ rP~nn d'une séquence minimum qui sera
encore u~ .ohlo à ladite t~ 'rPt~re et qui sera sensible à une
mutation meme pnnrtuollo.
Il est évident pour le~ spér~ te~ qu'à chac,ue sonde
nucléotidicue pArticulière c~L~ ..d une sonde ~ re, qul
Qst bien entendu capable de ~ouer le meme role en tant que aonde de
capture ou de detection. L'invention a'étend donc ~ de telles sondes
ayant une Jéquence 1~ A i ro de celleg cui seront décrites ci-
Aprea .
Il egt ég~l évident pour leq sréri~l~qto~ cu'il estgOnOrAl po~sible de lAror, dana un ensemble de aondea,
l'une des sondea reeonnAi~aAn~ une qrér~f~r~té ~-olrnn~-o X par un
système de deux aondes recnnnA~qont l'une, dea ~ror~firito~ X et Y,
et l'_utre, des rré~f~c;téa X et Z, auquel ca~ des réponaes
poaitivea a la foia avec 1A ronde XY et avec la sonde XZ r t ont
de conclure ~ la préaence de la ~rér~f;r~té X. L'invention s'étend
donc a un système de sondes, tel cu'il ~era d~fini ci-après, dans
lequel une cu plusieurs aondes sont lAcéoq par un tel système
écuivalent de deux sondes ou plusieurs sondes. Lien entendu, un tel
aystème A~aor~if peut etre _ppliqué a un nombre de qré-~f~r~téq
aupérieur ~ 2.
L'invention a pcur objet des sondes ~ lonL;fi~T~o~
nLilio-~lo~ dans les torhn~ de typage par nli7nn..~10n~o~ pour
effectuer le typage HLA DR, ceG sondes etant chcisies p~rmi les
suivantes :
- TGGCAGCTTAAGTTT
-- ~'CTP~ r.
- Gcr~rTc~r~rcT
p~ .qrr
Les cuatres séSIuences qui viennent d'étre innnoo~ aont
désLgnées, respectivement, par les numéros de référence lOl, 102,
103 et 104.
La sonde lDl permet d'~fionL~f~or le type DREil~Ol.
La sonde 102 permet d';~on~;f~r le type DREil~02.
W 096/40989 2 ~ 9 B ~ /r~ ~
La sonde 103 permet dli~nj-ifl~r le type DRB4*01 et
la nonde 104 sert dann 1'1~~ni-~fir~finn du type DRB1~1305.
L'inventlon concerne egalement un ennemole de nondes
n~ n~iri~ c~ ou un kit de type EiLA, comprenant au moinn une nonde
choisLe parmi les nonden 101 à 104.
L~invention a également pour ob~et un tel ennemble de
sonden contenant en outre au moinn une nonde cholnie parmi les
~uivantcn :
- GT~~~~DD~ArTG - GATACTTCTATCACCAA - orrTr-~Tr~~r~~TDr-
- TGGCAGGG~Dr-~ATAAr. -=~ ~A - l'b~,~I~L~CA
- GGAGGAGGTTAAGTT _ r~orA~o.~gq.Arrr~ _ Tr~~D~~r~~~r~
_ TcrGrArr~rTrvrA _ DDrr~r~~r~~ rOTG - AC~CTACGGGTGAGTG
- GACACCTATTGCAGAC -
La partLe soulignee ~LL~ ..dant à une néquence mlnLmum.
Len treize séquences qui vLennent d'etre 1nnn6~c nont
dénignéen renpectivement sous len numéron de reference 105 a 117.
6elon un mode de ff~l i c~l i nn prefére, la nonde lll ent
ut$1Lsee sous sa forme complate, y comprLn len deux T non noulLgnén
i l'extremLte 3'. Elle a la même cp~r;f1rii-~ que ln nonde 45.
La sonde 115 est utLllsee de ~LeréL~ sous la forme de la
sequence soulignee nuqmentée des deux A non souligné5 à l'extrémLte
5'. Elle a la m2me rp~r1f1rlt~ que la sonde 28.
Len sonden 105 à 110, 112 a 114, 116 et 117 nont utlllsén
de ~L~feL... ~ soun la forme des sonden ayant dann la partle
experimentale cl-cprès len numeros de reference 43, 9, 10, 14, 17,
44, 46, 4a, 47, 24 et 27.
L'inventicn concerne nctaoment un ennemolo de sonden tel
que défini ci-densus, caracterise par le fait qu'il ccmprend en
outre l'une au moinn den nonden nulvanten (la partLe nouliynee
C~LLC, ' ' à la s6quence optLmum) :
W0 96140989 ; , r _9_ ~ /r ~
6 9 2 ~
~TTr"'~'CT _ l~D. ~ _r~r~ - c-p--Tr~rr-~aT
- TTr(~r~-p-r-~ c~ T~rTTcc-
Les cinq sequence~ qui viennent d'être l nnno~ sont
désLgnbes respeotivement par les numeros de reference 118 ~ 122. Ces
sequences sont utll$sees notamment sous la ~orme des sondes portant
les numéros de référence 42, 42 bLs, 52, 37 et 55.
Les sondes spéc$fLques indiquées cl-dessus peuvent etre
utilLsées not_mment comme sondes de c~pture ou de détectlon. Elles
sont utLliséer de l ~r~ _ ~ 30us la forme de sondes de capture
0 ; ' i 1; QOO~ OU i ' ~ hlo~ sur un support sollde.
L'invention a ég~l 8 pour objet un procédé pour abtorminor
le typage nLA DR~ d'un indivldu, 3elon les terhn~noQ usuelle3 de
tvp_ge par oligonucléotides, cA~ctér~Qe par le fa$t que l'on
utilise comme sondes de c_pture ou de détection, soit
~ ~oll~ ~ aoit ~1 ltr-~ , au ~ ins une partie des sondes
de l'enaemble de aondes tel que déflni ci-dessus :
D_na un procédé Aut~ ~ ', on utiliaera l'enaemble des
sondes. Dans d'autreJ ca8, il est évLdemment pcas$ble de les
utlllser l'une après l'_utre, et d'Arreeter le procédé loraque les
ZO ron~o; 3 ~ re~o~ 1 1 i Q 8-~f~ ~ont à ~otorrl1 nor le typ_ge.
Le procédé de l'irlve~tlon comprend dcnc oYAont i ol 1~ ' le8
ét~pes c~nQ~AtAnt
- 1 mettre en cont_ct aelcn une techn$que r~rt~c..l~ore chola$e, des
éch-nt~llon~ d'acldea nll~lb~ -- clblea c~ntr--nt les réglona
Z5 polymorphes du gène nLA DR d'un indlvldu, avec au molns une partle
de l'ensemhle des sondes tel que définl ci-deasus,
- ~ ~alre incuber, selon les méthodes connues, dana dea cAn~t~n~
prb~bto-r~ - telles quo l'hyh-~t~n avec chaque sonde ne ae
prodult que 81 la clble contient une aéquence parfaltement
l ~ ro de celle de ladite aonde, et
- 1 ~oto-m~no~ selon les te~hni~ ~~ de ~iotect~on usuelles,
l'hyhr~t~on ou l'absence d'hy,hr~t~ avec chacune des sonde3
utllisées.
Lea info ~~nY L~ o~ gont enaulte ut~ -- pour
W O 96/40989 -10- ~ h_~l
t~h~rm~nor le typage en fonction d'un plan de typage pr~é~hlil
tenAnt compte des sonde3 utillaées e~ de la ronnt~o~t~re des types
HLA DR et/ou 80U8 types associés répertorlés. Ce travall est
~ l;fl~ par l~ Q.t;rn d'un plan de typage, c'est à dlre en
pratlque un tableau donnant t~r~ct~ les types et/ou sous types
en fonctlon des r2ponsea positives (hyhr~tlor~tn~s)~ observées. Pour
l'enaerble des aondes de la préaente invention, un tel tableau est
dcnne ci-après dAns la partle ~ ~' ' t r 1 A (volr t_bleau 6).
L'lnventlon concerne en rAr~r~ er un procédé tel cue défini
c~-desaus, dans lequel on utlllae lesdites sondeo comme sondea de
capture, ce procédé poav_nt etre o~rArt~r~é par le fait qu'll
comprend les ét2peg crn~rron~ à
a~ immoblllser chacue sonde de capture sur un support sollde,
b) mettre en contact chaque sonde de capture ~ r'~ avec
un milleu llqulde conten_nt au moins un fr~gment d'aclde nuclélcue
clble, dans des rr~t~rn~ rr~A~nrm~n~t.~ pr ont l'hyhr~ t~n
81 la aécuence r 1~ A~ re de celle de la sonde est présente rl2ns
la cible et
c) détecter la pré~ence d~hybride8 evAntllt~l lr formés.
Blen entendu, les 80ndes de l'inventlon rt~rmAt~tn~ de detecter
_ua~l blen des ~rAgments clblea d'ARN cue d'ADN. Par _llleurs,ll est
évldent que l'on peut utlll8er comme sonde de tl~ter~on outre les
aondea cl-deaaus,toutea ~ondes approprlées, notamment l'une des
aondea décrltea cl-_prèa d_ns l'oxemple 5.
~O
LCraqUe 1A aonde de cApture eat trèa courte, c'est-~-dire
lnférieure à 20 n~rléot~tiA~ et en partlculler lnférleure a 17
n.lrlko~t~t~ il devient n~oe~o;re de mettre en oeuvre des moyens
permettant d'Améllorer la flxatlon de la 30nde 8ur un support
~olide. L_ fixation de la _onde aur le support est ~rri l ~r alorA
_OUa 1A- forme d'un dérive réault_nt du couplage covalent de la sonde
avec un llgAnd ~rC~l~fAnt la ~lxatlon 8ur le 8upport sollde. Le
ligand, qul peut une pArtle h~dL~ho~a est nn~l un
llgand . Au moins un ., fnnr~nnnAl polaire, par
WO 96i40989 l l~/r~>Ll ~
~ . ,
exomple un ,~ aminé. Le ~, : f~r~t ~ ~nn~l peut servir a
_ixer la sonde aur le suppport Yollde par établissement d'une
liaiaon covalente. Loraque le , ~ fonrt;~nn~l polaire ne
reagit paa avec le aupport, il améllore la fiYation par ~orpt~n
aur le YUppOrt, meme Yi le support est l.yd~hoLe.
Le ligand eYt par exemple choiai parmi leY protéinea et lea
composéY telY que r~pr~An~6~ respectivement par lea formules I et
II ci-deaaous :
~
' ~Z
0 ~ M+
( I )
danJ laquelle :
~ -~rréa~n~e un radical alkyle ou alcényle de 2 ~ 12 atomea de
carbone, linéaire ou ramlfie, non aubYtitué ou aubstitué par un ou
rl~;e~ y~ ~-L Y choiJis parmi leY ~ hydroxy et/ou
amino, et m+ r~p-~a~n~ not = ht un ion alcalin ou ammonium.
Ce lig~nd eat couplé r~f~nt;~ll à l'extrémité S' do la
aéquence n~cl~o~ de la aonde de capture
~COn- NH2
- Cl~- CH-CH2-OH
. ( II )
danY laquelle n eat un nombre entler pouvant varier de 1 ~ 4 et de
rr~fA~ e n - 1 ou 4.
Ce ligand est couplé rr~fA ;All ~ à l'extrémité 3' de la
séquence n~ o~ de la sonde de capture.
Loraque le ligand eat une proteine, on cholalt par exemple une
albumine, de pr~f~r~nre l'albumine de aérum de bovin, qul peut etre
couplée a l'extremité 5' ou 3' de la aéquence n~ t;~;~ ~ de la
aondo de capture.
Le upport de la preaente lnventlon peut etre tout aupport
WO 96/40989 ~ r ~r - n~
21!~6Ç~21
t ' ~n~ d~ '~ or une séquence nucléotidlque ou un dérivé
selon l'invention, aoit par adsorption pa~sive soit par covalence
Les supports peuvent être réalisés en tout matériau h-h~t~
utilisé tel que n~rrcoll-llose~ nylon, papier, ou de yLéféL..~ en
5 un matériau 1.ydL.,yhobe tel qu' un polymère de 3tyrène ou un
copolymère à base de styrène ~ ~nt au moin3 10 % en poids de
motifs styrène.
Le support solide 3elon l'invention peut etre sans ~ At~on
~sous la forme d'une plaque de m$crotitration, d'une feuille, d'un
lO tube, d'un cone, de puit3 ou analogues.
Selon le procédé de la présente invention, un érh-nf~l lrn
contenant un acide nucléique est obtenu a partir d'un individu dont
le qénotype HLA DR dolt être deter_iné. Tout type de tissu contenant
de l'acide n~rlo~qve IILA DR peut etre utilisé dans le cadre de la
lS pré ente invention. Il est ainsi possible d'utiliser des fragments
d'l~cide n~ o~rl~mo ~ADN cu ARN) cbtenus après coupure par voie
chimique, e~ ~.o ou analogue de l'acide nucléique pré~ent dans
l'érhJln~llrn de l'individu.
Cependant l'inccrporation d'une étape préalable
20 d'~ l~f;cA~rn de l'ADN ou de l'ARN cible peut faciliter le procédé
de typage par nl ~gonl~rloo~o de la pré~ente invention. Le principe
de l'anAlyse du pol~ ~ HLA par hybr~ rn d'rl~rJ~ rléot~os
spécifiques de aéquences reste le memc, mais une étape
d~ flrAt~nn gélective permet un onr~h~ ~ en 3equences de
25 ll- cible, ce qui ~ f~o la technique (R.K. Saiki, T.L. Bugawan,
G.m. Horn, 1~.8. Mullia et H.A. Erlich ~1986) Nature 324, 163 - J.M.
Tiercy, M. Jeannet et B. Mach (1990) Eur. J.Immunol. 20, 237).
L' l;f~rA~rn peut etre obtenue soit à partir d'ADN, soit à
partir d'ARN. Il est évident pour un homme du métier que
30 1'. .l~f~rJl~on des séquences de la cible HLA DR dang un érl~-n~llrn
pcut etro Al , l ~o par toute méthode connue qui permet d'obtenir
une ~ l~f~rl~t;rn 5-~ff~nte pour que la séquence de la cible puisse
etre détectée par hybr~ f~An d'un acide nl-rlo~r,l-e à une ~onde.
En géneral, l'acide n~rl~1~ ? dans l'échantillon sera de
35 l~AnN~ le plus souvent de l'ADN gén 'rl~o- /-oron~An~ la présente
invention peut ég~l etre mise en oeuvro avec d'autres acides
nl~rlo~ql~e~ tel:~ que de l'ARN messagcr ou de l'ADN cloné, et l'acide
n.~cl~ d~ms l~érh~nt~llrn de l'individu pourra etre sous la forme
d'un simple brin ou d'un double brin. Bien entendu, lorsque l'acide
WO 96l40989 -13- r~ . /r .
-- '~ i i s, ' 2 ~ ~52 11
. . . ~ ,~
nuclé$que est sou3 la forme double brin, il ent n~res~-~re de
pratiquer une étape de ~6nAt~ t;nn pour obtenlr un acide n~rl~;r
slmple brin.
Les sondea ~ e~ dans la présente invention Yont des
rl;gnnnrl~t;~ ~ rr~rif;~ - d'une néquence (OSS~ qul, dans dea
ron~;~;rn~ appropriées, peuvent ae lier rrer;f;~- - leura
~ ;re~ Sl une sonde par~;r~l;ere peut etre
utLliaée pour ;~nn~;f;~r ~n;~-- un allèle, la oonde est alora
appelee OSA, c'eat-a-dire rl~jrn~-rléct;~ srér;f;r,~ d'un allèle. Il
est poaaible qu'une seule sonde ne aoit paa capable d" ~n~;f;nr à
elle ~eule un allèle ~rér;f~ DR~ en raiaon de la nzture
~;ff~r~nte entre divers _llèles D ~ .
Selon le procédé de l'invention, l'identité d'un allèle est
dédulte à partir d'un modèle de l$aison d'un ensemble de sondes,
chaque aonde indlviduelle de l'ensemble étant ~péciflque de
~;ff~r~nl~ partiea du genea HLA DR. Grace AU choix de lt;rl~
aondes co ~ aux a~ d'ADN des allèle~ connus, ln
rr~r;f;r;té du procede de typage par rl;grn~lrl~o~ de ln préaente
invention permet d';~ 1f;Pr toua les allèles des loci DRBl, DRB3
et DRB5. Bien entendu, le procédé de la présente invention pourralt
etre utiliaé pour ;~nf;f;~r les allèles d'autres loci ~r
polymorphes tela que DQBl et DPBl. Comme leg ~;ff~r~nr~ l;rp~
aont ~a~n~ lnrAl; ~ dana l'exon codant pour le premier
domaine dea ler~ HLA (aa 5-94), lea aondea aont choialea pour
etre l~ de aéquencea ar~r;f;r~ lnr~ éea dana cette
région. Au cn~ ou de nou-eaux allèleY aernient découverta, ceux-ci
aont ; '~;Atl répertoriéa dana un regiatre de ~ , - HLA
clas~e II, qul permet d'r~t~-rl; ~r la cnllecttnn de traceurs
;-- ;f~ et donc d'adapter la hn~nlA-~ a la détection de tout
nouvel allèle.
Pour ~_t;on~ le typage HDA clnaae II complet, on a
propoaé d~lntro~l;re tout d'abord une première étape du typage DR
générique, lequel peut, avec un nombre limlté de aondea
r~rnrn-~re les rr;nr;r~l~q sré~;f;r;t6~ HLA-DR, c'est-à-dlre HLA-
DRl-DRw18. Cette étape est suffl~ante pour un grand nombre
d'--rrl;r~;nn~ clinlques (voir B. Mach et J.N. Tiercy (1991) Human
Immunol. 30, 278).
8ur la baae dea ré~--lt~ta de cette premiere étape, 11 eat
poaaible de choialr les sondes apéclfl:, ~ néce~a-;rea pour
W 0 96t40989 -14~ /rh~_.'C C
2 ~ --
réaliaer, dans un deuxième temp3, un micropolyn~~rrh~ DR~, pour
détecter le pol~ rph~ DQ31 et sl n~r~Yc-~re pour caractérlaer
les allèles DBBl.
L'analy3e des cr~r;f;o;t~ ~LA-DRl-DRwi8 par la technique de
typrge par ollgonucleotlde3 peut etre appliquée dan3 les
~h~r~to;re3 d'h;YtC ;h;l;t~ pour le typage DR de routlne, en
, lr ' de la 3~r~l~g~e DR, notamment pour effectuer le typage
DR de patient3 en li3te d'attente pour une greffe renale ou le
typage de donneur3 de re;ns potentiel3, le typage DR de patient3
leucémique3 pour le3quels une greffe de moelle os3eu3e e3t
enviaagée, aln3i que de3 membre3 de leur famille ou des donneur3
potentiel3 non apparentés, le typage DR à grande échelle pour la
r~n~t;t--~;rn de regi3tre3 de donneur3 de moelle volontaires, pour
détorminer de3 a330ciations entre de3 maladies et le 3ystème HLA,
par exemple dan3 le ca3 de diabete3 ;n~--l;no-~ , pour de3
~rpl;rr~;nn~ en médecine prédictive ou encore pour de3 .. ~ de
patcrnite et autre3 ;~rnt;f;r~t;rn~ ;n;~;ro~
On donne ci-aprè3 quelque3 ~f;n;~;~n~ de terme3 utili3é3 dan3
la préaente demsnde :
"genotype" fait référence à l'en3emble de3 caractéri3tiques
génotypiques d'un individu par orro~;t;~n au phénotype qui 30nt
lea cAr~rt~r;~;rn~ d'un individu telle3 qu'eller re330rtent de
l'analyae des produita d'expreaaion du gène et notamment de3
protéinea.
nllèle3~ 30nt le8 differente3 forme3 alternative3 d'un meme gène
cui pr~Y~n~n~ de8 différences au niveau de la aéquence nucléique.
Ce3 différences se manifestent au niveau de l'ADN, de l'ARN et des
protéinea.
polymorphiame car~ctériae la diveralté introduite dnns une
p~r~ ;on par l~T;~nre d'allèles ~;ff~r~nt7 pour un meme gène.
oli0onucléotide tel qu'utilisé ici désigne les amorces, les
sondes, lea f-- ~ d'acides n~rl~;T~ devant etre détectes,
etc... Les ol;g~norl~otides peuvent etre préparés par toute méthode
~rrgrr; ~r connue.
~onde n~c~oti~ é3cnte un fragment d'ADN ou d'ARN
naturel, ou un oligonucléotide naturel ou de 3ynthese, ou un
fragment d'ADN ou d'ARN de aynthèse, non modifié ou ~ une
ou pluaieurs basos ~;f;~- telle3 que l'ino3ine tO~ ~ l;Y~e pnr la
lettre I), la méthyl-5-déaoxycytidine, la diméthylamino-5-
W O 96/40989 -15- PCT~FR96/00836
Z 1~ 9 ~T ~ 2 ~ -
d4aoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-
désoxyuridine ou toute autre base modifiée r~ LAn~ l~hyhr;~
Par ailleurs, dans la pré~ente demande lorsque les s~ n~~.q des
ndee de oapture aont so-~l;qn4~~q, ceci représente la séquence
optimale pour un typage selon l'invention. ~ien entendu, oes
~~, s optimales peuvent etre rAll~ng~eq a l'~~r~m;té 3' et/ou 5'
par au moins une base. Dans ce cas, certaines ~a3es pouvant etre
ajoutées fAr~ 9;vement ont 4té indiquées entre r~r~n~h~-~q oomme
~ 10 on peut le voir par exemple à lalecture de la description ci-dessus.
Enfin, il est poqsible pour un homme du métier de modifier la
longueur des e4q~~nr~q nt;l;q4es en fonction des ~n~onq
opératoires (telles que : les températures d'hybridation, de
lavage, la nature du tampon d'hybridation et/ou de lavage) et du
plan de typage.
L'invention sera mieux comprise a la lecturc de la A~qcr~r~;~n
détaillée qui va auivre, faite en r4f~r~nre à des exemples non
l~m;tAt~f.q illu3trant des modes de r~Al;~t;~n préfér~q du procédé
de l'invention.
T R'FlMPT.r 1 : ~
Les ligands utilisés dans la pr~3ente invention et donnés ici à
tltre d'exemple, peuvent ~tre dea compoa4e ~J~r~n~hl~5 dana le
commerce tel8 que dana le tableau 1 ci-aprè8 :
T2 l~T.Tr.111T 1
ligand Formule r~u~l~;a~eu~ rsf
O ~~----------____
Il /OcI-l~
CF,~ NH-(CHd,OP
a N(isoPrJ2Applied Biosystems40080O
3 S -- ----
O (CH"~2~N
MMTr-NH-lcH2)~ ~ P/
b N (isoPr)2Cbntech Lab Ir~c 5206-1
,
WO 96/40989 --16-- r ~ . /r n.3 L '~ ' ~
2~6~2~
~(CH2),CN
MMTr-NH (CH2),~ F~/
c N (isoPr)2 1~ 10-1903
5Fmoc-NH CH2CH CH2O DMTr
O (CH2)~CN
OP
N(isoPr), Clontech Lab Inc 5203-3
10 ---- ------ ------ _ --___ __ ____
CHiNH Fmoc
CPG LCMOCH2CHCH~ODMTr Clontech L ab Inc 5221-1
(CH2);NH-Fmoc
CPGLCM~CH2-CHCH2~DMTr Clontech Lsb Inc 5222-1
f _ _ _ _ _ _
N~Tr -hnYytrityl
DMTr - dimethoxytrityl
Fmoc- _luorenyl-~ hnYycarbonyl
CPG - billes de verre à poroslté control6e
LC~A - longue chalne alkyle amine Ibras espaceur)
Le couplage d'un ligand rhnsrhn~r~~ta à un ol~r,nn--rl~Qtide
est eftectué ~elon le protocole générnl auivant :
Un olignnllrlént~a est synthétisé Yur un appareil A~ rS~e
381 A de la société. APPLIFD BIOSYSTFMS en utlllsant la chimie des
rhn~phorr~~tea ~elon le protocole du constructeur. Le llgand
phoarhnr~m~ e dissout dans de l'acétton~tr~la anhydre à une
3 r~nnran~r~nn de 0,2 M, e8t placé en position X du 8yn~h~allr et
l'~ddition du ligand ~e falt à l'extrémlté 5' de l'cl~r,nn-.rl~r.tlde
~elon le protocole ~tandard de la synthè3e Al~ ' ique lorarlue la
aynthèse de l'nl~gn"~.rl~nt~a est achevée.
Dan~ le cas où le llgand est porteur d'un y~
protecteur dlmethoxytrltyle, tel .que pour le composé d, 11 est
r~ra~a-;re d'affect~ar une étape a~-rrl ~-e de déprotection du
J'~ L ' trityle par l'aclde tr~rhl~ q~la en fln de gynthèse.
Aprèa ~r-oteot~on une nuit à 55~ C dans NH40H 33 t, sulvie
d'une précipltatlon dan~ de l'éthanol à - 20~C, l'ol~g~n--rléotide
W 0 9~40989 ~ -17- I~I/r~
2 1 ~ ~ ~ 2 1
est séché soua vide et reprla dans 1 ml d'H20.
Pour les compoaég référencés b et c, une étape ~..rrl~ A~r~
de clivage du y.~l, mcnomethoxytrityle est e~fectuée selon le
protocole du fnhrl~Anr ~CLONTECH et GLEN RESEARCH respectivement)
aprè~ ~6prot~rt;nn~
Dans lo cas dea composéJ portant la r~ n_e e et f, 12
synthèse automatlque démarre par la 3ilice greffée par le ligand
~elon le protocole standard. Le ccuplage ligand et ollgon~r
A'effectue par l'extrémité 3' de ce dernier.
Dans tous les ca~, les oligonucléotldes modifiés a leurs
~r~ Q 5~ ou 3' sont purifiég par ~h o~r~rh~ licuide haute
pression (CLNP) en phase inverse sur une colonne Brownlee RP18 (lO
mm - 25 cm).
Cnn~1t~n~ déblt 4,6 ml/min
Gradient 10 % à 35 % de tampon B en 30 min.
35 ~ ~ 100 ~ de tampon B en 3 min.
Lea ~nr~-t~r;nt$ques dea tampons A et B sont les suivante~.
Tampon A : 0.1 molaire Triethyl ~ ~é~te (TEAA~ pH 7,00
T~mpon B : 50 ~ Tampon A + 50 ~ CH3CN.
T.'.ln~MPT.F~ 2 -
Couplage d'un ol;gon~ o~ à l'Albumine de Sérum de boeuf
(ASB).
Un nl;gon~ nt;~ portant le bras 'nnl;n~ 2 référencé a
dans le tHbleau 1 est synthétisé tel que décrlt dans l'exemple 1 :
3. 10 8 mole d'~l~gnn---l~otide aont aéchéa Jous vide et repria dana
25 ~1 de tampon borate de aodium 0.1 N, pH 9.3. On a~ nnn~ 500 ~1
d'une solution à 30 mc/ml de DITC (phénylène-1,4-~ o~h~ncyanate
Fluka 78480) dans le DNF. Le mélange est agité 1,5 h à t~ 'r~ re
~mbiante avant l'addltion de 3 ml d'H20. Après ~_trn~on de la
aolution par le butanol (3 x 3 ml), la phase acueuse restante (500
~l) est séchée sou~ vide puis repriae par 1.10 7 mole (6,6 mg) d'ASB
(Pierce 30444) dans 400 ~1 de t3mpon borate (0,1 molaire pH 9.3).
Après une nuit sous ~g;tn~;nn à t~ _'rnt-lre ambiante, le conjugué
eat purlflé par échange d'ions en CLNP aur une colonne AX300
(BROWNLEE 4.6 x lOO mm) par un gradient de NaCl (Tableau l~. Le pic
du conjugué est dlalysé contre de l'eau (2 x 1 lltre) concentré sous
W 096/40989 -18~ r~l/r~
vide, roprl~ par l ml H2O et stocké à - 20~ C.
rr~n~t~n~ rh ~rArh~r~
Gradient de : 10 % B' à 56 % B' en 25 min.
56 % B' à l00 % B' en 2 min.
LeY rAr?rt~ q~oY des tampons A' et B' sont les suivantes :
A' - 20 mM phoaphate de sodium, pH 7,00; 20 % CH3 CN.
B' Tampon A' + 1 M NaCl ou 2M NaCl.
E~rMPLr. 3 :
On a r~rr~nté dans le tableau 2 les A~ d'acide~
~minés des rlJff~r~nt~ allèles du gene DR Beta dans le but de definir
les po~t~r~n~ des acides aminés mutés par rapport à la sériuence
lS con~enaus choioie ~appelée ~DR CONS~). Ces A~Irn~ rr ~l ~ l à
des ~t~rn~ non ~lrnr~r~ au niveau de l'ADN c'est à dire des
~ rn~ cui in~ rrnt un rhA- ~ d'acide aminé. On sait en
ef_et gue les acides aminé9 9cnt codé9 au niveau de l'ADN par des
triplet~ de ba~eO. Une mutation ~ur la troisième position
n'~ntrA~n~rA g6n~rA1 pas de rhr- d'acide aminé. Par
contre le rhr-_ de la seconde base induira assez scuvent un
rhr- d'acide aminé. Enfin, une mutation sur la première base
-n~r~ toujours une ~f~rA~rn de l'acide aminé.
Dans le cas du typage des A~ ff~r~nf~ alleles, cn utilise donc
le plus aouvent les ~;rn~ 8ur l~ADN ,~ $~ nt aux mutations
non 8~1~nr~ ~. ~aiJ il est possible de détecter une mutation ce
tvpe ~ nr1~ e~ par exemple dan9 le but de ~ff~r~nrl~r 2 alleles
trè~ proche~.
Dans le tableau 3, on a ._~.6L_..Lé les Al~gn Y des
n~rl6r~ du gène DRBeta pour tous les allèle3 connus et publiés
dans la 11tt6rAt~re à ce ~our, par rapport à la meme sequence
consensus que dans le tableau 2.
La ~ -1rtllre utilisée pour désigner les différents allèles
at celle proposée lors de la oinguième oonference
d'h~'t~ ~h~l~t~ ~Leiden, Hollande, 1991). Les ~n~rA~on~ entre
paronthèses dans le tableau 2 rrrr6~n~r la - -1At~-re rr6ré~nte.
~A~T.~IJ 2
60 70 80 9o
***i**~**,,,,***
DR c~s PRF~ n~~ y~ GRrDA~
DRBl*O101 (DWl) ~ -L-~ L C-CI - '
3RBl*OlC2 ~DW20) ----~w-L-r L-C-CI 5 AV--------
DRBl*0103 (rv3cN) tl L r- L E-CI 5 I--DE
DR31*1sol IDW2) K r n 5 r I A v
DRBl~lso2 ~Dw12~ W r n 5 r I A
DRBl*1601 ~D~21) - W r n c r--D --~
DRBl*1602 ~Dw22~ ~ r n c L--D
DRBl*0301 ~DRv17~ l Y ll 21 r K-cn 21 v
DRBl*0302 ~DRwlai -----IDI- r ll 1I K cn
DRBl*0101 ~DV~) V n ll K
DR31~0402 ~DW10) v ll II I--DE v
DRBl'0~03 DW1~A3 V ll ll L V
DRBl'0104 DWl~)
DRBl'O~OS DW15) V n n 5 ~ f
DRBl~0106 KT2) v ~ r
DR~31~0~07 r~ V ll ll r. 6
DRBl~o~os v n
DR31'0~09 v ll ll - K
Df~Bl'O~10 ~l ~ V 6C~
DRBl'0411 II _ r V fr~
DRBl'0701 ~Dw17) ----N-G-YK Q--E-L------F v 5 I--D--GQ v
DR31~0702 ~D31) ----w-G-yK----------Q--E-L------r v - I--D--GQ v
DRBl~osol ~MADDRA)-----YSTG--Y- 3 r--D L
DRLl~oso2 ~srL) -----YSTG--Y r--D---L
DRBl*oso3 ~TA3) -----YSTG--Y _ I--D---L
DRBl*osol -----YSTG--Y r--D L V
DRBl*osol ~rw23) --------Y-N-GI ll V 5 r--R---E V
DRLl*1001 -----EV-~ L-r.-RvN-----A-Y n
DR31*1101 ~SVEIG) -----~ r----------E--------~--D
DRBl'1102 ~JVH) -----YST r----------E--------I--DE v
WO 96/40989
--20- PCT/FR96/00836
~ 1~8~2 ~
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WO961409t9 P~,I/rt~
2 ~
ER~MPL~ 4 -
En utilisant le3 2 proto~coles c~crits prér~ on a
~ynth6tisé des ol~gcnl~rleotides portant 30it un ligand, tel cue
d~crit dans l'eYemple 1 et cui sont résumés dans le tableau 4, soit
~ 5 couplé ~ l'ASB, tel cue décrit dan3 l'eYeAmple 2 et c,ui sont réauT4é8
dans le table~u 5 -l'~RT.rT.~TT 4
~-f' ~~-iU~n _ 5~-~. ttt llgand X t tr Y~
6 c~Tr-~ Tcrl c .11
6 Tr~~ TrrAT ,63
6 rAnaAT~~TATGA ~ .52
7 Gr~ TA~GTATGA ,7
1)~ '' ' AAaTATr.
Tr~~~- AT~rTc . ,
7 1- ~r-~~- rTArTG a
__._, _TArTG b .,
.~A~ a
CCTGATGAGGAGTA ~
r-r-~T~AT~TAAG o - ,
rr.rr~~~TATAAC A _,
Trr~'----~T~'~TAT
_rrl-r~TAACTATA~~ b , .-
1~GGCAGGGTAAGTATAAG a
- I ~ .,
~lAl~,l~AUA _ r
GGAGGAGGTTAAG c
TrA~.-.rA~A ~ 1 ,
~A ~
Gr~Ar AA ~, o
r.~ r a
1766Ul~l VV~l~A~l' C _ ~
990 ~ V~lA.~ A~ a ~,
1067 ~ ~ a ',
1068 A~ . _ a
802 AAT a
9 ~ ,A~T ~ _
. ... ArT u
,- AYT ~:
r~ T
rr ~T AA ~~T .1
~ ,., ,A,AT
34 1-r~Ar-rTr~~ T
A.~. . . ,A.
~ . ~.
~ . ,..... . r ~ ,4
",".... .... _,~r ~ .39
~ ~ _ ,9
~A~A~,l 1~1 C - ~ 35
- - - - ~ , 0 5
42 ~ a ,79
35 * X ~r~rn~e le ligand selon la rl ~t---r utlllsée
dans le tableau 1
*A r~A-r r~rré~rfe le temp8 de rétention en mlnutes (min~ de
l'oligonucléotide en CLnP dana le8 cnn~tlrnA décrltea dan3
l~exemple 1 taolonne BROT~TLEE RP 1~(4,6 mm-25 cm) d~bit 1 ml/min).
FEUIUE DE REMPIACEMENT (REGU 16)
_ = _ , . _ _ _ = -- ,,,: ,, ,, ., .. _ , .. ..
W0 96/40989 r~l~Ksec
-24-
*** la lettre I dans les sel ~e~ 33, 34 et 34 bis représente
l'inosine.
Tll~RT Rl~TT S
SEQ~FNCE 5'-3' TR * RATIO **
OhIGO/ASB
~_TG~ ~T 7,85 ~
~~GCGGTATC ~ ACA 8,69 /~ 0,8
GGAGGAGG- ~G 7,76
~ 16,85
~r ~ - 17,78 I -,
,~ Ar ~ 16,65 ) -,-
T ~ 8,56 ~~~., -,
GA -,A
1 0
(~ C ''-T
P. T __~ . _, . 1
1 6B ~- - r~
6B ~ ''
. . .
- - ~-- _ , , ,,_
_, .
. _ C ~ _ , ~ . 1, 1
* Tr représente le temp9 de rétentlon en minutes ~min) de
l'oligonucléotide couplé à l'ASB en CLHP dans les conditions
décrites dans l'exemple 2,
~lM) signifie que le tampon B contient lM NaCl,
~2~) signifie que le tampon B contient 2M NaCl,
** L'olignn~lcléot~ est A~-nt~f(6 en picomoles par spectrométrie
U.V. en mesurant l'~hsA-~An~e a 260 nm selon le protocole APPLIED
BIOSYSTEMS. L'ASB est dosé p~r la méthode de BRADFORD ~BRADFORD
~.~., Anal.Biochem,, 72,2~8 (1976)) en picomoles.Le ratio oligo/ASB
est le rapport de ces 2 valeur~.
On a définl dans cet exemple de8 Al~gAn~rl6Atides de capture
que l'on peut 8ynth6~ ~ r - r~ aans ligAnd, avec un llgand ou bien
coupler par exemple a l'ASB, he choix des sequences des
oligonucléotides synfh6t~~f~ tient compte de l'rl;gr ~ des
séA,~n~ d'ADN des ~ff6~nt~ allèles décrits dans le tableau 3 de
l'exemple 3, Les sondes ol~An~l~l6ot~Arl~ r61ect~ ~ , utili3ées
par exemple comme sondes de capture, ~ 8~nt d~etfectuer un plan
de typage comme décrit dan8 le tableau 6, Il est bien évident pour
l'homme de l'art que d'autres plar~8 de typage peuvent etre définis
Avec d'Autres ol~gAnll~l,6,A,~
- FEUIUE DE REMPLACEMENT (RE&LE 26)
W0 96/40989 ~ 9 2 ~ F~ l /r ~g c l
, ;.
.~
+ +
~t +
U~ + + + +
o o
+ + + + + +
+ + ++
+ + +
~ ++ ++ + ++
+ +
+
+ + + + + +
~D ~ +
~$ +
~' + +
~r +
o + +
o~ + +
+ +
Ul + + +
~ + + +
o j~o8
W 096/40989 -26- P~l/r -~a
6 9 2 ~l ~C
Dans le tableau 6, les indicatlons entre parenthèses
représentent la nomenclature utilisée avant la conférence
d'h'qtr 1h1l1t~ (1991) des sous types de l'allèle DRB5.
Le sirJne + signlfie que le sous type de la ligne rrnq~rl~r~e du
tablQau 6 donne une hybridation avec la scndo de la cclcnne
,, ... ~ ,.~.,....~...,1 ,...
A l'aide du tableau 6, il est po~sible d'interpréter
~acilement les résultata obtenus (hybrldation ou absence
d'hybridation) avec diverqes sondes par exemple une cible donnant
une réponse positive avec les scndes 43, 14, 28 et 37 correqpond aux
tyces DRB1*0301/DRB1*07.
T'Y~PLF' 5' rr~r~r~1r)n des sondes de detection
Selon l'exemple 2 l'oligrn~ rt1r~r~ activé et éché aous vide
est repris par 1,25 10 7 mole (5 mg) de peroxydase de r~i~ort
~ TN~ MaNNEIM 413470) dans 200 ~l de tampon borate de sodium
0,1M, pH 9,3.
Le protocole de purification est ~rlr~n~rr~ : le con~urlué est
~tocké à -20~C dans un tampon 50 mM tria NCl , pH 7,0 ,40~ glycérol.
Le tableau 7 resume les différent3 conjugués utilisés pour la
détection HLA DR.
~ATtT.T.ATT 7
8RQ~ENCE 5'-3' ***TR * RaTIO **
OLIGO/HRP
D1 C~GGGCÇ~ Ar(GT)GaGCTGGGGC 11,88 (2M) 1,4
D2 rr~6Gc~ rTrArrTr-rr~tclB,09 ~2M)1,8
D3 rh~r~--rAraArr.Ar 9,32 (2M)
* Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de
l'al~rJrn--rl~rt~Ha ccuplé à la percxydasc de raifort ~HRP) en CLHP
dans lea ron~ltion~ décrites dans l'exemple 2.
(2~) aignifie cue le tampon ~ contient 2M NaCl.
** L~ol1r~an~ o~lrlr~ est T~n~lf1~ en r1. l,~q par spectrométrie
U.V. on me~urant l'-'~o l~ à 260 nm selon le protocole APPLIED
rJr~la~ ~ La r~rrry~ e de rai~ort (HRP) est dosée par U.V. a 402
nm en pll lr.~. qelon ATOR M.A., J.Biol. Chem.,31,14954 (1987). Le
ratio oligo/HRP est le rapport de ces 2 valeurs.
W 096140989 -27- a 1 ~ ~ q9 ~ 1 F~l/r ~1
! ~
~.;
~ la lettre I dans la Jécuence D2 ~ e l'ino_ine.Danc la
Stécuence Dl, (GT~ sign$f$e qu'il y a un mélange éc;u$mola$re de_ 2
baqos G et T sur cette po_ition.
~.MpT.F. 6 : préparation du matériel g~nbt~rll~o
~o~trrr~1nn d~acidec n~lrl~rl~.n~ à part$r de sang total e_t
eEEe_L~e dans un appare$1 Appl$ed B$o_ystems d'après le protoccle
su$vant : 2 à 6 ml de sAng total _ont repr$s dans du t_mpcn TE ~10
mM Tr$~-HCl pN 8,00, 1 mM EDTA) (quant$té ,~ff~A~nte pour 6 ml) et
sont déposéa dans une ampoule d'~rAr~rn de 30 ml. Une solution de
protéinase ~ (840 un$tés danq 20 mM Tr$ -HCl pN 8,5) ect a~outée.
L'enaemble e~t $ncubé acus ag$tat$cn 1 heure a 55~C. L'excè3 de
protéinec présente3 est éliminé par 2 r~rAr~;onc c,~ lt~n~ c (8~5
lS ml) par un mélange de phénol chloroforme. L'ense3ble e_t Agité
pendant 20 minùtes à 60~C. Après éliminatlon de la phase organique
ur,e nouvelle ~trArt~nn rhbnnl~rp~_ est e_feotuée. L'excès de phénol
est élimlné par une r~rAetlnn au rhlrrofn (9,5 ml), 10 minutes à
37~C. L'ADN contenu dans la phase aqueuse e~t précip$té par add$t$on
20 de 0,S ml d'acétate de aodium 3 M pN 5,5 et 13,5 ml d':~oprrr-nrl
pu$s récupéré sur un Eiltre. L'ADN act onsuite repr$~ danc 1 ml
d'eau ~c~ e~ pu$s doaé en ~pectrophotométrie à 260 nm.
25 E~MPL~ 7 : l~flrAt~nn de l'ADN
L'~ l~f~rAt;rn _..~ est ~ff~ ~ '~ par la techniriue de
réactlon en ohatne par la polyméra_e (PCR) (MULLIS et FALOONA, Meth.
ir, Enzymol. vol. 155', pp 335-350) d'aprè~ le protocole ~u$vant :
Dan~ ~n tube de type Eppendorf sont a~cuté_ 0,1 a 2 ~g d'ADN
purifié ou non dans un volume total de l00 ~l du tampon suivant :
- l0 ~l do tampon de PCR l0 fois oonoentré (500 mM KCl, l00 mM Tr$s-
HCl pN 8,3 (20~c), 15 mM MgCl2, 0,1~ gélatine)
- 2 ~1 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, TTP) 0,5 ~
- 2 ~1 de chaque amorce ~ à 25 pmoles
- 1,5 unités de Tac polymerase (Perk$n Elmer Cétua)
- eau dist$llée (c,uant$té ~---ff~-~n~ pour l00 ~l)
- SO ~l d'hulle de paraffine
Le tube ect déposé danq un Thermocycler (Perkln Elmer Cétus)
. _ _ _ _ . _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _, _ _ . _ _ . _ . . _ _ _ _
W 096/40989 -28- r~i/r~;~
B ~ 2 1 C
dans lequel seront e_fectues le3 35 cycles de t 'r~t~r~Y suivants:
- 0,5 Qinute de ~nAt~lrAt~nn a 95~C
- 0,5 minute d'hyhr~At~nn à 55~C
- 0,5 minute d'~lnn~-tlnn à 72~C
Les amorCes utiliaées ont la séquence suivante :
Amorce 1 -- 5~-ccGGA~ r1~ccAr~;
amorce 2 5~-lC~ l~ACTGTGAAG-3'
~7MP~17 R :
Dans un puits d'une plaque de microt~trnt~nn en polystyrène
(Nunc 439454) sont dépo3és 100 ~l d'une solution d'un
oligonucléotide de capture d'une sré~f~lté DR donnée a une
cnrr~ntrAtlon de 0,15 ~N d~ns du PBS 3 x (0,45 M NaCl, 0,15 N
phoaphate de sodium pH 7.0). Il y a autant de puit3 remplis que
r~rnYYAIreY pour le typ~yQ.
Dans tous lea ca3 un controle positif doit etre a~outé dans
le but de vérifier l'Qffl~lt~ de l'étape d' l;f~At1nn ainsi que
l'étape de ~t~rt~nn La sonde de capture qui est utilisée comme
controle positif est présente sur tous les allèles connus a ce ~our
et a la aécuence suivante :
5'- ~7Gr~A~TA~ ~ACGGA~l~ - 3
La plaque eat lavée 3 _oia avec 300 ~l de PBS Tween (0,15 N
NaCl, 0,05 M rlo7ph~t~ de sodium, pH 7,0 ; 0,5 ~ Tween 20 (Nerck
82218q)~. Le produit d' l~fi~At~on (100 ~l) tel que décrit dan3
l'exemple 7 est dénaturé par 10 ~l de NaOH 2 N pendant 5 minutes
sous 7gltAtlon a t~ 'r~tnre ambiante. 10 ~l d'acide acétlque 2N
puia un volume de tampon PEG (Phoaphate de sodlum 0,1 M, pH 7,0 ,
NaCl 0,5 N, Tween 20 0,65 ~, ADN de aperme de aaumon (Slyma D 9156)
0,14 my/ml, PEG 4 000 (Merck 807490) 2 ~) équivalent ~ n x 50 ~l (n
étant le nombre de aondes de capture nbc~e~-ir~Y au typage) sont
additlonnée_ succes7sivement ~ cette solUtion. 50 ~l de cette
aolution sont répartis par puits suivis de 50 ~1 de la sonde de
~t~rt~nn (con~ugué nl~nn~ nt~ peroxydase) a une ~nn~nntrAt1nn
de lS nN dans le tampon PEG. La plaque eat incubée 1 h à 37~ C et
lavée par 3 x 300 ~1 de PBS Tween. 100 ~l de 8ub8trat OPD (ortho-
phenyl~n~d~ C '~ge Medical h'10te~hnnl~gy ref/q56) dan8 un
tampon OPD (0,05 M acide citrique, 0,1 N Na2HP04, pH 4,93) à la
W 096l40989 PCTAFR96J00836
a~ a 1 ~
rrnron~r~t;rn de 4 ms!ml ~uquel on a~oute oYt~ ' H2~2 à 30
volumes au 17i000, aont a~outés par puita. Aprè3 20 min de réactlon,
l'activité enzymatique eat blocuée par 100 ~1 d'H2504 lN et la
lecture eat effectué aur Axia M1crrro~or (h~Mor;o-lY) à 492 nm.
Fl~MPT~F. 9:
6 ADN, préparés selon la m~thode décr$te dans l'exemple 6,
sont amplifiés selon 1A méthode décrite dana l'exemple 7.
10 Le protocole de typage comporte lea sonde3 de capture suivantes:
5 ~-GATACTTCTATCACC 3 _ Q11rJ~n~lrlootide de sp~c~f;c~t~ DR 3
portant le ligand a en S' (réf~rencé 545 )
5 GA~ACT~C~A~CACC 3 - ol~ron~ t~o de ~équenoe ~3On~lr,l- mai~
15 s~ns li~nd (roforonr~ 545 nu)
5 ~-Trr~ArAArTArTG 3 - ol;7onllrl~Atide de ~roc~f~c~t~ DR 4 portant
le lig~nd a en 5~ (r~fArono~ 546 )
5' TrrArAArTArTG 3' - oIigonucléotide de 3équence ~on~1q~o mais
aana ligand (rof6ronr~ 546 nu)
Le protocole de typage eat conforme au protocole général
deorit dana l'exemple 8.
Les 30ndes Dl et D2 (tableau 71 50nt utili3éea en mélange 50~-
50~ comme Jonde3 de ~oter~on.
Les r~sultata sont présentés dan5 le t~bleau 8 oi-apres :
-
TAPT.F.ArT8
ADN TYPAGE DR3 DR3 DR4 DR4
64 ~J 5 54' ~U 6
DR11.'~Rll ~, , ',
~4.~4
~8.~7
D 3/~ 11 , . .
DR3 D 4
DR3 D 3
Les 2 aondes de capture ~ns 1igand ne ~ff~ronr~onf pas les
~r~r~f~r~o~ des ADN alors que les memes séquenoes aveo le ligand a
i L-n~ d';~ont~f~or le5 ~p~r~f~r~to~ DR2 et DR4 des ADN.
W0 96/40989 1~1/r~3LI
-30-
'~
2 ~ Q S ~ 2 11
Fl~7!MPT.F, 10:
24 ADN, préparé3 selon la methode decrite dan3 l'exemple 6,
aont amplifiés selon la méthode décrite dans l'exemple 7.
Le protocole de typage est conforme au protocole général décrit dans
l'e~emple 8.
Les sondes Dl et D2 (t~bleau 71 sont utilis~es en melange 50~-
50% co~me 30nde~ de A~t~r~n
Le protocole de typage comporte les 30ndes de capture
~ rit~ dans le tableau 9 ci-aprè3:
'rART.F.llrT 9
reference nu méro sequence 5'-3'
63 ~-TGGAMGATGCA
~'03 '.AGCAGGATMCTATG
43 71B 3GAC~ACTAC
9 4 5 GA--~ C-TCT~ TC ~CC
1 o 9 8 CCl CA-GAGC A TA
14 91 GGr-~Gt3GTM5 ATMG
' 25 17 595 GGCC.I~il~:A
44 574B GC(-~TATCTGCACA
5 6B GG~3GA~GTTAAG
46 5-5B TGGMGACGAGC
4- 8 7B GG~AGA~AAGCG
so 4- 7 6B Gfr~3~.3CACTGG
2 o 2 ~ -AGC''QGG~GMCGT
2~ 106 C~C-~X~GTGAGT
2 106d ACA TA - GCAGA
5~ 997' GAGr ~C~ A~G
3 ~ 1033 1 1~1 ~iGA~ AGA~',AC
986B GGA3AGA~A TTC
4'- 1060 AGGAGGA~ C
Lea réaultata du typage aont donnéa d~na la t~bleau 10:
WO 96/40989 ' r~ h5
--31--
2 1
o o~ o~ o~ o~ o- _ o~ o o o o o~ o ô o o o o o o o o o
O O O ~ ~ CO 00 ~ Y~ ~ ~ ~ O ~ ~ ~D 00
oo~o~o~o~_ooo~ooooo~oooooooooo~
;~ ooooooooooooooooooôôooo_
v~ ~ ~ A ~ A A ~ A ~ ~ ~ ~ A ~ ~ A ~ A ~ ~ ~ ~
o o o ~o ~o o o ~o o o o o o 8 g g o g o og o o o o
V~ ooooooooooooôôoooooooooo
~ ~: o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o~ g o
ooôôôôôoooooooooooooooôo
~ ~ o o ~o o o o o o o o o o o o 1,~ o o o o o o o og o
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
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~ ~ ~' 8 ~ o ~ uo~ ~ o o~ o o o ~L ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
~r V~ _ooooôôoôoooooooooooooôO
~ 8 ~' ~o 8 _ ~o ~ ~ o ~ o ~ ~ ~ ~ o o o
~ ~ ~~ ~ ~ A ~~ ~~ A ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
~~ OOOOOggOOO--OOogo~oo~oVloooo
O O O O O O O O O O -- O O O O O O O O O -- O O O
O ~ O ~o ~ gO _ ~
~ ~ ô o~ o- o~ o- o' o ~O o O- o O O ô ~O- O- O O- O- O' O- ~O- o' o~
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
O a~A ~~ ~~ ~ ~~ ~~ ~ ~ ~~ ~ OA ~ ~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
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z ~ ~ ~ Y o ~ oo ~ o ~ ~ v~ o ~
g~~g8~~88og~~~~~~
p 8~ ~ ~~ ~~ ~ ~ ~~ ~ u, ~ ~~ ~ ~ V~. ~~ ~~ U~, ~~ ~~ ~ V. ~~ ~8 ~o
_ 8 AAAAAAAAAAAAAA~AAAAAAAAA
P ~ ~ ~~ ~' ~ o C'' ~
S! O O ~~ OA ~ ~ ~~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~~ ~~ ~ ~ ~~ ~ ~~ ~ ~ ~~ ~ ~~ ~~
O ~ O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
~ ~ OO~ Og~OO.O000O~~OO00~
. ~ 000000000000000000000000
-
~ ~~~O~OoOo,~OOOO~O~g,O,O,OO~O~OOO,O
-- 00~O000~OOOOOOOOOOOO0000
CO ~ ~ . O ~ ~ ~ O CO _ ~ g ~ ~ ~ 00 ~ ~
~ Og~~OgO0~oo~O~D~O~g~_~ggOv-~
00000000000000000000 -.'.
~ O O O, ~ O O~ ~O~, ~ g ~ 0~ 0 8 0 og O O O O O ~ ~
-- 000000000000000000000000
-- O O O O O O O O O O O O O O ~ O O O O O O O O~ O
~ O c.~ ~ O O C~ ~ C .~ ~
OC~OC~_~OOO~___~O OOOOOOO
Z ' Z
Z ~ E t3 ~ o~o ~ ~ ~
W 0 96l40989 I~l/r .C
-33-
2 ~ 2 ~
! , :
La méthode décrlte nous permet de typer sans ambiguïté les 24
ADN testés.
~MPLR 11:
L~ t~ 'rAt~re pr6~r~nt~ll~ d' hyhr~At~n pour le typage
~L~ DR décrit dan~ la présente lnventlon eat 37 ~C.
Il est cependant possible de modlfier cette t~ ,'rAtllre
10 d' hyhr; ~1At ~ ~n .
L'exe~ple suivant est identique a l'exemple 10 à l'exception
de la t-, 'rnt~lre d'hyhr~At;~n qui a été modifiée de 37~C à 45~C.
Le typage est réalisé sur 11 ADN.
Lea ~ondes de capture utillsees sont données dans le tableau
11 ci-après:
reference numéro sequence 5'-3'
1 563 TGGAMGATGCA
ô 0 3 ~,~ GC ~.GGATMGTATG
43 571B ~GA ~ACTACT
9 545 ~.--A -TCTATCACC
1 0 ~ 9 8 CC 3A--GAGGAGTA
14 '~9 G~AGGGTA,43TATMG
17 9 t~G~lWl~C~
4 ~ 574 GC ~G -A CTG' -ACA
4 ~ 55 ~ GGAGt AGGTTAAG
4' 55 TG('MGACGAGC
4- ô67~ G GAAGAl~ M G CG
4 75 GCGGA~ACTGG
2 - ô O CCAGGAGGAGAACGT
Lea résultata du typage sont donnés dans le tableau 12 cl-aprè~:
W096/40989 P(,l/l'h~
2 1 ~ ~ ~ 2 1 !
o o o o o o o o o o o
.~, .
~ ~ o o 8 8 0 0 0 o O 0 0 " ~ * _1 0 0--I ~ g
" ~ 8 8 8 08 8 8 8 o ~ ~ ~' ~ eO Qo ~ ~o ~o ~ e Q ~ ~
o o o o o o o o o o
o ~ ~ _, * ~ * * ~ * ~ ~ * *
~r ~ 8 0 0 0 t- 0 ~ 0 0 0 0 ~ ~1
o o o o o o o ô o o o ~ 0~ C~ P~ CC ~ ~ P~ P~
aaa~aaaa~ ~ a
~OoCO~OC~-- C' 8888g888888
~ o~ o~o 8 8 8 8 0 8 0 0 0 o ~~ ~, ~- ~- ~ ~- ~- ~- ~ ~ ~ ~
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~, A A A A A A A A A A A
~' ~ 8 8 8 ~ 8 8 8 8 ~ g ~ ~ ~ O O o o ~ ~ o o ~5 ~ o
~r ~ O O ~ ~ ~ O O O -~ ~ S 8 g O O 8 8 8 o o
8C'lO O 8 O0 8 i~ oooôooooo o o
o o o o o o o o o o o ;~ ô ~ 8 o 8 ~ 0 0 ~ O O
z p~ z
WO 96/40989 1~ 1 /rl~,5,1
~ - --35--
2 li ~ fi ~ 2 'd
E~RMPL~
Le tampon d'hybridation rn~f~r~nt;~l nommé tampon PEG ut$1i é
pour le typage HLA DR oomme décrit dans l'exemple 8 a la
_~;f;nn ~uivante : ~ho~phate de 80dium 0,1 N, pH 7, NaCl O,S M,
T~een 20 0,65 %, ADN de sperme de saumon (Sigma D 9156) 0,14
mg/ml, PEG 4000 (~erck 807490) 2 %).
On a utili~é le meme tampon contenant de la form~mide (10%
flnal). Il est connu que la form~mide permet de diminuer la
~ 'r~f~-re d'hybr~ ~t; nn-
Si l'on effectue tou~ours l'hyhr;~f;nn à 37~C en présence de
formamide, on dolt donc aur~menter la ~r~c;f;r;t~ de la détection.
Le typage est réalisé sur 24 ADN qui sont ceux qui ont été
utiliséa dan3 l'exemple lO.
Lea sondes de capture utili~ées et les valeurs obtenues sont
données dans le tableau 13 ci-aprè~:
WO96/40989 --36- F~ rl~8.'l ' ~
a ~ a ~ ~'
~ X ~ ~ X 1-- 0 ~ ~ X O~ ~ ~ X ~ ~ ~ ~ ~D t~ X C~
!;; ~ o- 8~ 8 0 8 0 0 0 8 0 0 0~ 0~ 0 0 0 Oo~ 0 0 0~ 0 0 0 0
O X O X ~ t ~ X C~ O ~ ~ ~ O X X ~ X
. ooooooooooooooooooooooo~
~o oooooooooooooooooooooooo
x x ~ ~ ~ x ~ ~ x ~ x _ ~ o -- oo ~ ~ x ~
8 8 ~ 8 ~ ~ 8 ~ 8 0 0 8 ~ o o ~ ~, o ~ 8 8 8 0 ~
ôoooôoooooôooooooooooooo
x ~ c~ ~ x c~ ~ x ~ ~ o ~ ~ x o~ ~ ~ _ ~ ~ x
~, ~ 8 8 o~ 8 8 8, 8, o o 8, 8~ 8 g o o g o g 8 o 8 o 8 8
~ oôoooooooooooooooooôooôo
w g 8 8 g g ~ o o 8 g o ~ O O O O ~~ v, ~ ~ ~ ~ c~
5 ~ ~o 1~ x ~ O O o o o o q q q
ooooôoooooôôoooooooooooo
c ~ -c t~ _ o ~
u o o o o oq o oq oq o 0- Oq O Oq 0 80~ 8 0 0~ Oq 8 8 0 8 q
e
o 8 ~ 8 o, ~ 8 8 o g o o o g o, 8 8 8 8, 8 g 8
o ~ 8, 8 8 0 0, o o o 8 0--o 8 8 8 _ 8 o 8 8 o 8 g 8,
ooo,o,ooooooooooooo~ooo--~~
ooooooooooooooôooooooooo
o, o 8 ~ o, o 8 8 ~ ~ o 8 g ~ ~ 8, o ~ ~ o o, 8 8 8
- ~ 8, ~; ~, 8, ~ o ~ ~ o, ~ o 8, 8, 8, 8, o o 8, 8, 8 o, ~, o, 8,
' z
O ~ s ~ s O ~ ~
W ~
~'
W096/40989 _37_
~ ~ ~ 6~ 2
o ~ o
~ -- o o
E~~~o ooooooo~ooo oo o _~
~ ~ , ~ _ _ , Ul ~ _ ~ ~ o o ~ ~ o U7 ,
e ~o ~ e e ~ Q ~ e e ~ e ~
oo~*oo*_ooo*oooo**o**oooo~,
QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ
Zr~ O~ ~3
~ ~ ~88888888888888888888888
. ~ A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
_ cr~ O _ O ~ _ O~ w O O O ~ ~ ~ C~ O ~ ~D Ç~ _
u ~ o 8000, ~o o 88 ~ ~ o o o ~ ~ 8 o o g 8 o o o o
o oôooooôoooooôooooooooooo
-
~ ~ o o _ 8 ~ ~
~~ ~~C'L~~~--v~oo,o~oo,o,oo,o,~oooo
--~oo~o -ooooooooooooooooo
~ ~ ~ oj O -- O ~~ ~ w ~ O ~ D 00 w O
o 8888 o 8 o o~ 8 o o o o 888 o o
~~ Q- Q- ~ ~ g Q ~ o 8 o og o g 8 Q Q ~ ~ 8
o o o o _ _; = = c o o o o o o o o o o o o o
o o ~ o o o 8 ~OG,_ 88 o ~ o o o O o o o o 8
o o 8 o 88 ~ 8 _ _ O O O O O O O- O O o o o o o
~d '
cO $ ~ ~ C g ~
cq ~
W 0 96/40989 -38- I~l/r~; t IC
La t~ '.r~t~e pr~férentlelle d'hybridation e5t 37~C et le
tampon d'hybridation préférentlel est le tampon PEG, mai3 comme le
montrent les résultats de l'exemple 11 et 12, on voit cu'lL est
posslble de falre varler à la fol9 la t- SrAt~re d'hyhr1~At;on et
le tampon d~hybr;~At~nn.
Comme cela ressort de la deYcrlptlon ci-avant, le procédé de
la préYente invention combine les svantage3 pratiques suivants : une
~p~r;f;r~t~ optimale avec discr;~ t~on pcssihle de tous les
allèles,
une s;~rl;r;t~ d'exécuticn et un co~t réduit par rapport à l'analyse
3érologique,
une rapidite d'oYor-~t;nn avec nhtont1nn des résultat3 90 minutes
environ après l;f~rAt;nn, soit ùne durée totale in~érieure a 12
lS heures, ce cui est essentiel pour les donneura de reins,
une compatibilité au typage individuel essentielle pour les typages
d'urgence et l'u~;l;qat;nn en petits lAhorAto~ros~
un signal quantifiable par mesure de Densité Opticue et un
traitement éventuel des résultat5 par un système informatique
simple, et une p~AptAh~l;té a des systemes fUt~ ;qllOq.
EXEHPLE 13 : - -
De façon analoque 1 celle dëcrite ~ ' , on a
prepare des sondea de capture ~ ..dant aux n~ignnl.rlontl~ocdesignes par lea numercs de réference 101, 102, 103, 104, 115 et
111.
Ces aondes utLlisees comme scnde de capture rernnn~in~ont
les ~r~r~fir;toc lndiguées dana la descrlption.
En outre, on peut utiliser les sonde~ de capture de
l'invention avec les aondes de detection auivantea :
~r~ Tr7~ pr-rTt~-
~ r~rr~ r
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91)
ISAIEP
~ 21~6~21
I,ISTE Dl, SEQUENCE,S
(I) INrORMATlONS GENERAI,ES:
(i) DEPOSANT: ~
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: Chemin de l'Orme
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: rh~ANCE
(r) CODE POSTAL:69280
(G) TEI,EPI IONE: 78872000
(I l) TELECOPIE: 78872090
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Système de sondes pemlettant d'effectuer le lypage I II,A DR, et
procédé de typage utilisant lesdiles sondes.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 78
(iv) FORME DECHlrrRABLE PAR ORDlNA rL-,UR:
(A) TYPE DE SUPPORT:, Disquctte 3 1/,
(B) ORDLP~ATEUR: PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: I'C-I)OS/MS-DOS
(D) LOGICEL: MSWORL) 6.0 pour MS-D()S 6.20 / WINDOWS 3.10
(2) INrORMATlONS PO,UR LA SLEQ ID NO: 1:
~ (i) CARACTERIS1'IQUES DE l,A SIEQUEN(:,'I,:
(A) LONGUEUR:14
(B) TYPE: acide nucléique
. . (C) NOMBRE DE BRLNS: simple
(D) CONFIGURATION. Ii éaire. _
. . . ~ .
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GTGGACAACT ACTG 14
'(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO 2:
(i) CAR~;CTERIS'I'IQUES DE 1,~ SEQUENCE:
(A) I,~NGUEUR: i 7
(B) TYPE: acide nucléique
(C~ NOMBRE Dl, BRINS: simple
(I)) CONrlGURA'l'lON: lincaire
(xi) DESCRIPTION DE l,A SEQOENC'E: SEQ ID N():2:
G/~ I AC I rcT A T CACC/~/\ 17
~ . - : - ~ .. .
. ~ ~ 2 2~B~2~C
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3:
GCCTGATGAG GAGTAC i6
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:18
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFlGURAnON: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:4:
TGGCAGGGTA AGTATAAG 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:I5
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: sirnple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5:
GGGCCCTGGTGGACA 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:6:
TGCGGTATCT GCACA 15
2 1 ~
(2~ iNFORMATlONS POUR LA SEQ ID NO:7:
(i) CAi~ACTERlSTIQUES DE LA SEQUi,NCE: :
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRiNS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRiPTiON DE LA 3EQUENCE: SEQ ID NO 7:
GGAGGAGGTTAAGTT 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:8:
(i) CARACTERiSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRiNS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:8:
CTGGAAGACG AGCG ~ 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ iD NO:9:
(i) CARACTERlSTiQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRiPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:9:
TGGAAGACAA GCGG 14
(2) INFORMATiONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRiNS: simple
(D) CONFIGURATION: iinéaire
(xi) DESCRiPTlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
TGCGGAGCAC TGGA 14
4 2 1 ~ ~ ~ 2 1
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: liréaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
AACCAGGAGG AGAACZ;TG - 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESC~IPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
ACTCTACGGG TGAGTG 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: ~ide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA gEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
GACACCTATT GCAGAC 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOWCLE: base modifiée
(B) LOCALISATION: 7
(D) AUTRES INFORMATIONS: N représenle Inosine
=~ ~
21 ~2 1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
AACCAGNAGG AGAACGT 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS simple
(D) CONFIGURATION: lméaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
GAGGAGGACTTGCGCT 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DBSCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:16:
TACGGGGCTa TGGAG 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
GGAGCTGCGTAAGT 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1~:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION Iinéaire
6 2 1~
(xi) DESCRIPTION DE~ LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
TTCCTGGAGA GACAC 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONF~GURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:I9:
GGGAGAGATA CTTCC 15
(2) INFORMA~ONS POUR LA SEQ ID NO:20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13
(13) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: iinéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQULNCE: SEQ ID NO:20:
CTGGAAAGAT GCA 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:13
(B) TYPE: acide nucleique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE, SEQ ID NO:21:
TGGAAAGATG CAT 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:22:
(i) CARACTE~IST[QUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
~ 7
7 ~ ~g ;2 11
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO.22:
CAGGATAAGT ATGA ~ ~ 1 4
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:23:
GCAGGATAAG TATGA
(2) IMFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:24:
CAGCAGGATA AGTATG 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:25:
TGGACAACTA CTG 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:12
(B) TYPE: acide nucl~ique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCNPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:26:
GGACAACTAC TG ~ 12
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:27:
(i) CARACTENSTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCNPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:27:
GATACTTCTA TCACC 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:28:
(i) CARACTERESTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:28:
CCTGATGAGG AGTA 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:29:
CAGGGTAAGTATAAG 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:30:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
9 ~ 2 ~1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:30:
GCAGGGTAAG TATAAG 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:3 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEIUR: l 5
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3 1:
, ~
TGGCAGGGTA AGTAT 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:32:
(i) CARACTERtSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION lineaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:32:
_ _ . ..... . . . . .. .. .. . . .
GGCAGGGTAA GTATAAG 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:33:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:12
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:33:
GGCCCTGGTG GA 12
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:34:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
g ~ ~
lo
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO.34:
GCGGTATCTG CACA ~ 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:35:
ti) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:35:
GGAGGAGGTT AAG 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:36:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:36:
TGGAAGACGA GC 12
(2) INFORMAIIONS POUR LA SEQ ID NO:37:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:12
(B) TYPE: ~ide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:37:
GGAAGACAAG CG 12
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:38:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRiNS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
. . : . .
.
6 ~ 2 ~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:38:
CTCTACGGGT GAG 13
(2) INFOI?MATIONS POUR LA SEQ ID NO:39:
(i) CARACTERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lii:léaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:39:
CTCTACGGGT GAGT 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:40:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRlPTlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:40:
CACCTATTGC AGA 13
~2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:41:
(i) CARACTERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRlPTlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:41:
CACCTATTGC AGAC 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:42:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A)' LONGUEUR: 14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFlGURATlON: linéaire
i. ,
12 ~ ~ ~ 6 ~ 2 ~1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:42:
ACACCTATTG CAGA 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:43:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFICURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:43:
CCAGGAGGAG AACGT 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:44:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A~ NOMJCLE: base modifiée
(B) LOCALISATION: 5
(D) AUTRES INFORMATIONS: N représente Inosine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:44: ~
CCAGNAGGAGAACGT 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:45:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: base modifiee
(B) LOCALISATION: 6
(D) AUTRES INFORMATIONS: N représente Inosine
......... .. .. . . ... ..... . .. .. . . . . . .
2 ~ ~ 0~ ~ 1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:45:
ACCAGNAGGA GAACGT 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:46:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:46:
GAGCTGCGTA AG ~ 12
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:47:
(i) CARACTEERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:47:
TTCCTGGAGA GATAC 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:48:
(i) CARACTERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:48:
TCCTGGAGAG ATACT 15
(2) INFORMAnONS POUR LA SEQ ID NO:49:
(i) CARACTERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) Co~FlGuRATloN: linéaire
2 1~6~2 t
.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:49:
GGAGGACTTG CGC- l 3
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:50:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUl~:14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:50:
GGAGGACTTG CGCT 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:5 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5 1:
AGGAGGACTT GCGC 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:52:
(i) CARACTERTSTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:52:
ACGGGGCTGT GGA 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:53:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
2 ~ 2 ~
. 15
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:53:
TGGACAACTA CT 12
(2) INFORMATrONS POUR LA SEQ ID NO:54:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:12
(B) TYPE: acide nucléique
(C~ NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATlON: linéaire
(xi) DESCRlPTrON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:54:
_
GCGGAGCACT GG 12
(2) lNFORMATrONS POUR LA SEQ lD NO:55:
(i) CARACTERlSTrQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRlNS: simple
(D) CONFlGURATrON: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:55:
TGGAAGACAA GC 12
(2) INFORMATrONS POUR LA SEQ ID NO:56:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: sirnple
(D) CONFlGURATrON: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:56:
GAGGAGCTCC TGCGCT 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:57:
(i) CARACTERlSTrQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12
(B) TYPE: acide nuciéique
(C) NOMBRE DE BRiNS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
.,
~ 16 = ~ 6 ~ 2 ~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5i:
AGGAGAACGT GC 12
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:58:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:12
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:58:
AGCTGCGTAA GT 12
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:59:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ iD NO:59:
GAGAGACACT TCC ~ 13
(2~ INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:60:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRlPTlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:60:
GGAGAGATAC TTC 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:61:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
a 1 ~ ¢ ~ ~ ~
17
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:61:
GAGAGATACT TCC ~ ~ ~ 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:62:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:62:
ACGGGGCTGT G 11
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:63:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:63:
TACGGGGCTG T ~ '~ ~ 11
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:64:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11
(B) TYPE: acide nucleique
(C) NOMBRE DE BRINS simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:64:
_.
CGGGGCTGTG G 11
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:65:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:23
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
. , . _ _ . . . . .
2 1 ~ fi ~ 2 ~
18
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: base modifiée
(B) LOCALISATION: 13
(D) AUTRES INFORMATIONS: N représente Inosine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:65:
CCGGGCGGTG ACNGAGCTGG GGC 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:66:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:66:
GAACAGCCAG AAGGAC 16
(2) lNFORMATlONS POUR LA SEQ ID NO:67:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:27
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:67:
CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:68:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lineaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:68:
TCGCCGCTGC ACTGTGAAG 19
'' 19 21~6~2~
(2) INFORMAnONS POUR LA SEQ ID NO:69:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:36
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:69:
GGGGAGTACC GGGCGGTGAC GGAGCTGGGG CGGCCT 3
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:70:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:23
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFlGURAnON: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:70:
CCGGGCGGTG ACGGAGCTGG GGC 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:71:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:23
(13) TYPE: acide nucleique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:71:
. = . ...... . ... ...
CCGGGCGGTG ACTGAGCTGG GGC ~3
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:72:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:72:
TGGCAGCTTA AGm 15
.
'' ~ 20 2 1 ~ 6 ~ 2 ~
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:73:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR.14
(B) mE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRlPTlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:73:
CCTAAGAGGG AGTG ~ ~ ~ ~ 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:74:
(i) CARACnERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO:74:
GCGAGTGTGG AACCT ~~ 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:75:
(i) CARACTERlSTlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRlPTlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:75:
AAGACAGGCG GGC ~ 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:76:
(i) CARACTERlSnQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRlPnON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:76:
GCGGTGACGG AGCTGG 16
~ 21 ~ 2 ~
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:77:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:17
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:77:
ACCAGGAGGA GAACGTG 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:78:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: liné~ure
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:78:
AACCAGGAGG AGAACGT 17
