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PROCBDE DE PRODUCTION DE LIGNINE-PEROXYDASE ET DE
MANGANESE-PEROXYDASE A PARTIR D'UNE CULTURE DE
~ PEAN~3ROCHAE~I'E CH~YSOSPO~I UP~.
La présente Invention est relative à un pro-
~ 5 cédé de production de peroxydases à partir du champignon
Phanerochaete chrysosporium.
Phanerochaete chrysosporium est un champignonassocié à la " pourriture blanche du bois ". C'est un
hym~nomycète, qui ~ait partie de 1'ordre des aphylo-
phorales et de la ~amille des corticaceae. I1 présente lapropriété de dégrader la lignine jusqu'à minéralisation
(produits ~inaux : CO2 + H20).
Ce champignon produit des peroxydases exo-
cellulaires : il s'agit en par~iculier des iso~ymes de la
manganèse-peroxydase (MnPs) [KUWAHARA et al. FEBS Let.,
169, p. 247-250, (1984)], et de celles de la lignine-
peroxydase (LiPs) [TIEN M. et KIRK. T.K., Science, 221,
p. 661-663, (1983); GLENN et al. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 114, p. 1077-1083]. Ces enzymes sont des
hé~noprotéines glycosylées, dont la masse moléculaire
moyenne est de 40 kDa [LEISOLA et al., J. Biol. Chem.,
262 p. 419-424, (1984)].
Les manganèse-peroxydases et lignine-
peroxydases sont capables de catalyser l'oxydation de
nombreux substrats aromatiques, en particulier la li-
gnine, en utilisant l~eau oxygénée comme cosubstrat. Ces
propriétés trouvent leurs applications principales dans
le domaine de la papeterie et celui du traitement des
déchets.
Jusqu'à présent, ce sont essentiellement les
lignine-peroxydases qui ont été utilisées dans ce type
d'applications.
Par exemple, le Bre~et Fran~ais 2 574 427
décrit deux souches de Phanerochaete chrysosporium,
possédant une acti~ité lignine-peroxydase
particulièrement éle~ée, et leur culture sur un milieu
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contenant une source d'azote assimilable, ainsi qu'une
source de carbone assimilable, et une source de sels
minéraux assimilables.
Il a également été proposé (Brevet Fr~n~
2 600 077) de cultiver Ph~nerochaete chrysosporium sur un
milieu de culture de base supplémenté avec des acides
gras insaturés, et/ou des acides aminés naturels.
D'autres équipes ont proposé l'addition de détergent du
type 'l'W~ [FAISON et KIRK , Appl. Environ.
Microbiol.(1985),49, p.299-304~, ou bien celle d'alcool
vératrylique [LEISOLA et al., J. Biotechnol.(1985),3,
p.97-107], afin d'augmenter la synthèse de la lignine-
peroxydase.
L'équipe des Inventeurs a également, lors de
travaux précédents, mis en évidence différents paramètres
dont l'optimisation permettait d'augmenter la production
de lignine-peroxydase : ajout d'acide oléique et/ou de
phospholipides exogènes, contrôle de la température de
culture, etc... Ces travaux ont abouti à la mise au point
d'un procédé de production de lignine-peroxydase, qui
fait l'objet du Brevet Européen 0 437 500.
Ce procédé comprend plusieurs étapes
successives, chacune d'entre elles étant effectuée dans
des conditions de culture différentes ; la première étape
est effectuée sur milieu synthétique, comprenant des sels
minéraux, une source de carbone et une source d'azote, en
présence d'extrait de levure, d'une source de
phospholipides, et d'acides gras émulsifiés ; le mycélium
formé est alors cultivé dans un milieu de culture
partiellement renouvelé, additionné d'alcool
vératrylique, mais ne comprenant pas d'acides gras
émulsifiés, et dont la teneur en phospholipides ne
représente que 1/7 à 1/8 de celle du milieu de culture
utilisé dans la première étape ; lors d'une troisième
étape, le milieu est entièrement remplacé par un milieu
neuf, comprenant la même proportion de phospholipides et
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d'alcool vératrylique que celui de la deuxième étape, et
la source de carbone, la source d'azote, et l'extrait de
levure, au 1/4 de leur teneur dans le milieu de la
premiere étape ; une quatrième étape de culture est enfin
ef~ectuée dans un milieu dépourvu d'extrait de levure, de
source de carbone, et d'acides gras émulsifiés, mais
comprenant la même proportion de phospholipides et
d'alcool vératrylique que celui des étapes précédentes.
-La lignine-peroxydase peut ensuite être ré-
o cupérée à partir du milieu de culture. La mise en oeuvre
de ce procédé permet d'accroître très significativement
la teneur en enzyme i l'activité lignine-peroxydase dans
le milieu est d'environ 240 U par litre et par jour.
~es recherches effectuées jusqu'à présent ont
principalement porté sur l'accroissement de l'activité
lignine-peroxydase ; cependant, les manganèse-peroxydases
apparaissent de plus en plus comme suscepti~les de jouer
un rôle clef dans la biotransformation de composés aro-
matiques polymériques de type lignine. En effet, con-
trairement aux lignine-peroxydases dont l'activité est
limitée par la faible pénétration des parois lignifiées
par l'enzyme, les manganèse-peroxydases agissent par
1~intermédiaire d'espèces de faible poids moléculaire,
diffusant aisément. En bref, le cycle catalytique des
manganèse-peroxydases ~ait intervenir l'oxydation du
Mn(II) en Mn(III) qui, après complexation à des acides
organiques, génère des espèces oxydantes diffusantes
capables de dépolymériser la lignine naturelle [WARIISHI
K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, p. 269-276,
(l991)].
BONNARMB et JEFFRIES [J. Ferment. Bioeng.
70:158-163 (1990)] ont étudié la régulation de la
production de lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase
de Phanerochaete chrysosporium sous différentes
conditions de culture ; ils ont ainsi obser~é ~ue la
quantité de ces enzymes variait, en particulier, en
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fonction de la concentration en Mn(II) : à ~aible
concentration, la lignine-peroxydase est pré~érentielle-
ment produite (760 nmol/ml.min dans les conditions
optimales), tandis qu'à concentration élevée c'est la
production de manganèse-peroxydase (950 nmol/ml,min dans
les conditions optimales) qui est privilégiée.
Les Inventeurs se sont ~ixé pour but
1'augmentation de la production de peroxydases
exocellulaires de Phanerochaete chrysosporium à partir de
cultures de ce champignon, ainsi que l'augmentation du
rapport MnP/LiP.
Dans ce but, les Inventeurs sont parvenus à
obtenir de nouvelles souches (dénommées ci-après MIC 3g0,
MIC 249, et MIC 396) hypersécrétrices des peroxydases
exocellulaires lignine-peroxydase et manganèse-
peroxydase. Ils ont en outre mis au point des conditions
de culture spécifiques, pouvant être mises en oeuvre soit
avec des cellules libres, soit avec des cellules
immobilisées sur support. Ceci permet d'augmenter, de
manière très si~nificative le r~n~m~nt en lignine-
peroxydase et manganèse-peroxydase, par rapport à celui
obtenu avec les cultures de l'art antérieur : par
exemple, les cultures obtenues con~o~",P,n~,tt à l'Invention
peuvent produire environ 2 ~ois plus de lignine
peroxydase que celles du Brevet EP 0 437 500 et l0 fois
plus de manganèse-peroxydase que celles obtenues
précP~emm~nt par BONNARME et JEFFRIES.
La mise en oeuvre de la présente Invention
permet en outre de contrôler et de modifier, selon les
besoins, le rapport manganèse-peroxydase/lignine-
peroxydase. ,
La présente In~ention a pour objet les souchesde Phanerochaete chrysosporium MIC 249, MIC 390, et MIC
396, qui ont été déposées le 20 décembre 1994, auprès de
la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-
organismes) tenue par l'Institut Pasteur, 26 rue du
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Docteur Roux à Paris, sous les numéros respectifs I-1511,
I-1512, et I-1513.
~ La présente invention a également pour objet
un procédé de production de lignine-peroxydase et/ou de
manganèse-peroxydase à partir d'une culture de
Phanerochaete chrysosporium, lequel procéde est
caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au
moins une souche de Phanerochaete chrysosporium choisie
dans le groupe constitué par les souches MIC ~49, MIC
390, et MIC 396 mentionnées ci-dessus.
Ces cultures sont réalisées, selon les
techniques usuelles de culture de Phanerochaete
chrysosporium, connues en elles-mêmes, à partir d'un
inoculum constitué par des fragments mycéliens obtenus à
lS partir d'une préculture, ou de spores (2.105 spores par
ml environ).
Le milieu de culture comprend au moins une
source de car~one, au moins une source d'azote, des sels
minéraux, des oligo-éléments, des vit~m;nes et il est
additionné d'extrait de levure.
La concentration en source de carbone est de
préférence comprise entre 5 et 20 g/l.
Une source de carbone préférentiellement
utilisée comprend du glycérol, mais d'autres sources de
2s carbone assimilables plus lentement ou plus rapidement,
sont uti lisables; seules ou en mélange ; il s'agit par
exemple de sources de carbone telles que le maltose, le
raffinose, l'amidon, le xylose, le rhamnose, l'arabinose,
le fructose, le sorbitol, le mannose, le cellobiose, la
cellulose.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du
procédé conforme à l'Invention, la source de carbone
comprend au moins un phospholipide choisi dans le groupe
constitué par la phosphatidylcholine (PC), la
lysophosphatidylcholine (LPC), la phospha-
tidyléthanolamine (PE), l'acylphosphatidyléthanolamine
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(APE), le phosphatidylinositol (PI), l'acide phosphati-
dique (AP), ou un mélange desdits phospholipides ; il
peut s'agir dans ce cas d'un mélange de phospholipides
reconstitué, ou bien d'un melange de phospholipides
provenant d'une source naturelle, par exemple des
phospholipides de soja. A~antageusement, si l'on utilise
un mélange de phospholipides, celui-ci comprend plus de
25~ de phosphatidylinositol et moins de lS~ de PC.
De préférence, la concentration du
phospholipide ou du mélange de phospholipides
(reconstitués, ou issus du soja) est comprise entre 0,l
et lO g/litre.
La source d'azote peut être par exemple
constituée d'acides aminés, de nitrate de sodium ou d'un
mélange de ces différentes sources d'azote, en
combinaison avec l'extrait de levure. La concentration en
source d'azote est de préférence comprise entre 0,S et 20
g/l .
Les sels minéraux assimilables comprennent les
sels de potassium, de calcium et de magnésium, et sont
utilisés à une concentration comprise entre 0,5 et
lO0 mM.
Les oligo-éléments sont principalement com-
posés de sul~ate de fer, de sul~ate de zinc, de sul~ate
de manganèse, et de sul~ate de cuivre. Les concentrations
en sul~ates de fer, de zinc, et de cuivre, sont les
concentrations habituellement utilisées pour la culture
de Phanerochaete chrysosporium, (cf. par exemple le
Brevet Européen 0 437 500). La concentration en Mn2+ n'a
a pas d'in~luence sur la production de manganèse-
peroxydase dans les conditions de culture conformes à
l'Invention, et peut varier dans une gamme relativement
large ; elle est de pré~érence comprise entre l et 600
mM .
Le milieu est aussi additionné d'une source de
vit.~m; nes ; on peut par exemple utiliser un mélange de
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,
wo s6nl00s ~ J~l746
vit~m;nPs dont la composition respecte celle donnée par
[TATUM et al. Am. J. Bot., 37:38-46 (1950)]. Le mélange
de vit~m~n~s est utilisé à une concentration comprise
entre 0,001 g et 1 g par litre.
Par ailleurs, l'addition d'alcool vératrylique
(0,4 mM environ) permet de maintenir la stabilité des
enzymes produites.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la
présente Invention, le milieu de culture est en outre
supplémenté, en cours de culture, par ajout, à raison de
0,001 à 10 grammes par litre, d'au moins un élément
activateur de la production d'enzymes et/ou protecteur de
celles-ci ; cet élément activateur et/ou protecteur peut
être constitué par l'un des constituants du milieu
initial, ou par un mélange de plusieurs d'entre eux.
De préférence, cet élément activateur et~ou
protecteur comprend de l'alcool vératrylique, qui est
dans ce cas utilise à une concentration comprise entre
0,1 et 1 ~ u..e par litre. On peut ajouter également un
supplement d'une source phospholipidique riche en
phosphatidylinositol, qui est dans ce cas utilisee à
raison de 0,1 à 3 yrdl~LLes par litre.
Cet ajout peut être ef~ectue, sous ~orme de
solution, d~emulsion, ou de liposomes, par addition d'un
melange de surfactant (TWEEN 80 par exemple), avec des
acides gras (C18:12, C18:2) et des phospholipides riches
en phosphatidylinositol.
La supplémentation du milieu peut être
e~fectuee de manière continue (pompe) ou discontinue.
La supplémentation en élément(s) activateur(s)
et/ou protecteur(s) est e~ectuee lorsque la culture a
atteint un stade de croissance tel que l'on se situe au
début de l'expression des gènes codant pour les
peroxydases (production des ARN messagers codant pour les
manganèse-peroxydases et les lignine-peroxydases. Ce
stade, qui a été défini expérimentalement, est atteint
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après une période qui peut varier selon les souches et
les conditions de culture, mais qui représente
généralement en~iron 2 jours de culture, à une
température comprise entre 28~C et 40~C.
Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à
l'In~ention, les cultures peuvent être e~fectuées de
manière connue en elle-même, soit avec des cellules
immobilisées sur un support, soit avec des cellules
libres.
Dans le cas des cellules immobilisées, celles-
ci sont accrochées ou adsorbées sur un ou plusieurs
supports hydrophobes, hydrophiles, ou neutres, dont la
sur~ace est de préférence rugueuse, et comportant par
exemple des alvéoles, des maillages (grillages ou
écheveau), des creux, des trous. Ces supports, creux ou
non, sont disposés de manière ordonnée ou non, ~ixe ou
mobile dans la phase liquide constituée par le milieu
nutriti~ approprié, et peuvent avoir des ~ormes variées
(cylindrique ou cubique, en un ou plusieurs morceaux).
Ces supports de même que le milieu pourront être
remplacés et/ou renouvelés en continu ou discontinu au
cours de la culture.
A titre d'exemples non limitati~s de supports
non-ordonnés fixes, on citera des anneaux cylindri~ues
RASHIG, en grès, verre, métal, plastique ; des mousses de
polyuréth~nnP, polyester, polyamide ; de la l;m~- 11 e
métallique, ou plastique, des ~ils de plastique.
A titre d'exemples non limitatifs de supports
ordonnés ~ixes, on citera des grilles ou maillages
acier inoxydable, verre, plastique, polyuréth~nn~,
polyester, Nylon, polyacrylate, polyamide, etc
A titre d'exemples non limitati~s de supports
mobiles dans la phase liquide, on citera des supports en
polyuréth~nn~, polyester, polyamide, plastique extrudés.
Dans le cas des cellules libres, le mycélium
se trouve sous ~orme de pelotes pouvant avoir un diamètre
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de 0,5 à 5 mm. Les bioréacteurs employés sont de type
colonne à bulle ou airlift (rapport diamètre/hauteur
d/h = l/4 à l/6 env.) ou classique (d/h = l à l/2 env ),
et possèdent un module d'agitation, spécifique ou non,
par exemple : RUSHTON, hélice de bateau, MIG, ruban
hélicoïdal simple ou double.
A~antageusement, les cultures sont e~fectuées
sous aération et agitation du milieu.
L'aération du milieu est réalisée par
1'introduction d'air, d'oxygène pur ou de tout autre
mélange de gaz assurant un apport en oxygene suffisant au
micro-organisme, au moyen d'un dispositif permettant une
dispersion homogène de ce gaz (verre ~ritté, canne).
L'agitation du milieu peut être effectuée
mécaniquement. Elle peut aussi être obtenue de manière
pneumatique par action directe du système d'aeration, ou
par un système équivalent utilisé simult~n~m~nt.
Le niveau d'agitation et/ou d'aeration est
choisi de manière à permettre une occupation initiale
ho~ogène du support dans le cas des cellules
immobilisées, et la formation de pelotes mycéliennes d'un
diamètre moyen de 0,5 à 5 mm dans le cas de cellules
libres, tout en limitant les contraintes de cisaillement
subies par les hyphes mycéliens. Ce niveau pourra être
2s variable au cours de la duree de la culture.
Avantageusement, la periode d'incubation
initiale (2 jours environ) se ~ait à une temperature de
37~C environ, et peut être suivie d'un changement de
température favorable à la production de peroxydases,
comme décrit par exemple dans le Brevet EP 0 437 500.
La production de manganèse-peroxydase et/ou
celle de lignine-peroxydase, et en consequence, le
rapport MnP/LiP peuvent être contrôles en fonction de
l'âge de la culture et/ou de la présence d'activateurs,
ainsi que des souches utilisées. On peut ainsi obtenir
des cocktails enzymatiques majoritaires soit en
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manganèse-peroxydase, soit en lignine-peroxydase
(activité supérieure ou égale à 60~ de l'ensemble des
activités manganèse-peroxydase et lignine-peroxydase).
Selon une variante du procédé con~orme à
l'Invention l'on peut en outre contrôler le rapport
MnP/LiP, et augmenter préférentiellement soit la
production de manganèse-peroxydase, soit la production de
lignine-peroxydase. Cette variante est caractérisée en ce
que :
- pour modi~ier le rapport MnP/LiP en faveur
de la production de manganèse-peroxydase, 1'on procède à
la culture de P~anerochaete chrysosporium pendant une
durée supérieure à 24 heures et in~érieure à 90 heures,
en présence d'un mélange de phospholipides riche en
phosphatidylinositol, tel que dé~ini ci-dessus, à une
concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l, de pré~érence
de l'ordre de l,5 g/l ;
- pour modi~ier le rapport MnP/LiP en ~aveur
de la production de li~nine-peroxydase, 1'on procède à la
culture de Pha~eroc~aete chrysosporium pendant une durée
supérieure à 90 heures et inférieure à 350 heures, en
présence d'un mélange de phospholipides, tel que défini
ci-dessus, à une concentration comprise entre 0,5 et
5 g/l.
Selon les applications, les jus de culture
constituant ainsi des cocktails enzymatiques plus ou
moins enrichis en manganèse-peroxydase ou en lignine-
peroxydase, peuvent être utilisés directement, ou après
concentration, par exemple par ultrafiltration. Le cas
échéant, une purification sur colonne de type MONO-Q
(PHARMACIA BIOTECH S.A. ; France) est réalisée.
La présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se
réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé
conforme à l'Invention.
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Il doit être bien entendu toutefois que ces
exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de
l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune
manière une limitation.
I.- ~TI~ISATION DE SO~CEES ~r~ ~TRICES
Les souches qui ont été sélectionnées
con~or~m~nt à l'Invention sont les souches de
Phanerochaete chrysosporium MIC 249 (CNCM I-1511), MIC
390 (CNCM I-1512), et MIC 396 (CNCM I-1513).
~LE 1 : CONP~R~T.~ON ~E LA PR~u~-llON DE LIGNINE-
PEROXYn~-CF.~ ET DE MAN~N~-p~o~yn~-c~ PAR Dl~r~
SO~C~ES
La capacité de production des souches
hypersécrétrices con~ormes à 1'Invention, MIC 249, MIC
390, et MIC 396, par rapport à la souche de ré~érence
BKM-F-1767 (ATCC 24725), est vérifiée sur des cultures
e~fectuées en Erlenmeyer de 250 ml, dans les conditions
suivantes :
Composition du milieu :
Glycérol 10 g/l
Tartrate disodique 2,3 g/l
Tartrate de ~;~mmo~;um l,842 g/l
KH2P04 2 g/l
CaC12, 2H20 0,14 g/l
MgS04, 7H20 0,70 g/l
FeS04, 7H20 0,07 g/l
ZnS04, 7H20 0,046 g/l
MnS04, H20 0,035 g/l
CuS04, 5H20 0,007 g/l
Extrait de levure 1 g/l
~ Nat89 0,5 g/l
Alcool vératrylique O,42 g/l
Conditions de culture :
. Le milieu est réparti en conditions stériles
à raison de 100 ml par erlenmeyer ; chaque erlenmeyer
contient des cu~es de mousse de polyuréth~nne.
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. L'inoculation est réalisée à l'aide de
fragments mycéliens d'une préculture.
. L'on procède à l'oxygénation des erlenmeyers
au début de la culture (T0), puis à l'incubation à 37~C
sous agitation, à 90 ou 120 rpm.
. A partir de 48 h de culture l'on procède a
l'oxygénation quotidienne des erlenmeyers et à la
poursuite de l'incubation à 37~C sous agitation à 90 ou
120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèse-
peroxydase sont mesurées au bout de 4 jours de culture
selon les protocoles suivants :
- a) détermination de l'activité lignine-
peroxydase : cette activité est déterminée en mesurant la
vitesse d'oxydation de l'alcool vératrylique en aldéhyde
correspo~nt, en présence de peroxyde d'hydrogène [TIEN
et KIRK, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2280-2284
(1984)]. La réaction est suivie, à 3Q~C, par
spectrophotométrie à 310 nm. Le coefficient d'extinction
molaire de l~aldéhyde vératrylique à cette longueur
d'onde est de g300 M~1.cm~1.
L'activité dans le milieu est exprimée en
nkatal.ml~l ou bien en unités/litre (U/l) : une unité
lignine-peroxydase correspond à une micromole d'aldéhyde
vératrylique formé par minute.
- b) détermination de l'activité manganèse-
peroxydase : cette activité est déterminée en mesurant la
vitesse d'oxydation de la vanillylacétone en présence de
MnSO4 [PASZCZYNSKI et al. FEMS Microbiol. Lett , 29:37-41
(lg85)]. La réaction est suivie, à 30~C, par
spectrophotométrie à 334 nm. Le coefficient d'extinction
molaire de la vanillylacétone à cette longueur d'onde est
de 18300 M~1.cm~1.
L'activité dans le milieu est exprimée en
nkatal.ml~l ou bien en unités/litre (U/l~ : une unité
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manganèse-peroxydase correspond à une micromole de
vanillylacétone formée par minute.
Les résultats sont résumés dans le tableau I
ci-dessous :
S TABLEAU I
SOUCHES A~llvll~ MnP A~llvllh LiP
(U/l) (U~l)
ATCC 24725 1200 900
10MIC 249 4800 4200
MIC 390 5520 2040
MIC 396 3S00 3150
Ces resultats montrent que dans ces
conditions, la souche I-1511 (MIC 249) produit 4 fois
plus de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que
la souche de référence BKM-F-1767 ; la souche I-1512 (MIC
390) produit environ 5 fois plus de manganèse-peroxydase
et 2 ~ois plus de lignine-peroxydase que la souche BKM-F-
1767, et la souche I-1513 (MIC 396) produit 2 fois plus
de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que la
souche BKM-F-1767.
II - INFLu~ DE LA COMPOSITION D~ MTr.T~ ET DES
CONDITIONS DE C~LT~RE S~R LA PR~u~10N DES LIGNINE-
pERoxyn~ ET DES MAN~ ~-PEROXYDASES
~ I~LE 2 : INFLu~N~b: DE L'AGE DE LA C~LT~RE.
La souche MIC 249 est mise en culture dans des,
conditions identiques à celles indiquées ci-dessus à
l'exemple 1. L'incubation est effectuée à 37~C sous
agitation à 90 rpm.
Les activites lignine-peroxydase et manganese-
peroxydase sont mesurées a différents temps de culture,
et le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats sont
resumes dans le tableau II ci-dessous.
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TA-LEAU II
AGE DE LA A~llvll~ A~llvll~ RAPPORT
CULTURE(h) MnP (U/l) LiP (U/l) MnP/LiP
63 3270 1746 1,87
109,5 2694 2634 1,02
229 2346 4290 0,55
EXEMPLE 3 : INFLu~N~ DE LA ~uN~NLKATION EN
PHOSPHOLIPIDES.
La souche MIC 390 est mise en culture dans les
conditions suivantes, sur un milieu de base dont la
composition est la suivante :
Glycérol 10 g/l
Tartrate disodique 2,3 g/l
Tartrate de di~mmonium 1,842 g/l
1~ KH2P04 2 g/l
CaC12, 2H20 0,14 g/l
MgS04, 7H20 0,70 g/l
FeS04, 7H20 0,07 g/l
ZnS04, 7H20 0,046 g/l
2Q MnS04, H20 0,035 g/l
CuS04, 5H20 0,007 g/l
Extrait de leYure 1 g/l,
Ce milieu de base est additionné d'un mélange
de phospholipides, le NAT89, à des concentrations
25. comprises entre 0,5 g/l et 1,89 g/l.
Le NAT 89 est fourni par la Société NATTERMAN
PHOSPHOLIPID Gmbh (Cologne, Allemagne), et sa composition
est la suivante :
- 12~ de phosphatidylcholine et de lysophos-
phatidylcholine ;
- 31 ~ de phosphatidyléthanolamine et acyl-
phosphatidyléthanolamine ;
- 27~ de phosphatidylinositol ;
- 30~ d'acide phosphatidique.
- ~ CA 02209082 1997-06-27
W O 96121008 ~ rn5shl746
Les cultures sont effectuées comme décrit à
l~Exemple 1. L'incubation est effectuée à 37~C sous
agitation à 120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèse-
S peroxydase sont mesurées à l'optimum de production dansle milieu de culture, a savoir à 4,5 jours de culture.
Le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats
sont indiques dans le tableau III ci-dessous.
TABLEAU III
10 CON~NlKATION A~llvll~ A~llvll~ RAPPORT
NAT89 (g/l) MnP (U/l) LiP (U/l) MnP/LiP
0,5 6564 1932 3,4
0,98 6780 1920 3,53
1,44 8664 1056 8,21
1,89 6474 384 16,86
III - PRO~u~lON EN REACT~uK DES LIGNINE-PEROXYn~ ET
DES MAN~NRCF-PERoXYn~F,~
~LE 4 : Cu~T~RE DANS ~N REAC-~uK A r~T-T-~T-~
INnUOBTT.T~2.~ SmR ~U~Kl
- Le corps du bioreacteur contient le support
d~immobilisation, qui est ici constitué par 2 cylindres
concentriques realisés en grillage metallique (~il de
0,15 mm de diamètre) ayant une maille de 0,5 mm, des
diamètres respectifs de 70 mm (cylindre extérieur) et 30
25 mm (cylindre intérieur) pour une hauteur de 2gO mm.
La composition du milieu de base est la sui-
vante :
Glycérol 12,5 g/l
Tartrate disodique2,875 g/l
Tartrate de di~mm~nium 2,302 g/l
KH2P04 Z,5 g/l
CaCl2, 2H20 0,175 g/l
MgS04, 7H20 0,875 g/l
FeS04, 7H20 0,0875 g/l
ZnS04, 7H20 0,0575 g/l
MnS04, H20 0,0437 g/l
CA 02209082 1997-06-27
' I W O 96~1008 ~ll~KS~ 746
16
~uS04, 5X20 0,0087 g/l
Extrait de levure 1,25 g/l
NAT89 0,625 g/l
2,5 litres de ce milieu sont introduits dans
le bioreacteur et l'ensemble est sterilise par autocla-
vage 30 min. à 120~C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37~C et
est aere avec de 1'air atmospherique ~iltre, introduit à
un débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circu-
laire ou d'un fritté formant un bullage régulier situe ala base des cylindres métalliques, assurant a la fois une
agitation et une aération homogène nécessaire à la ~orma-
tion d'un film mycelien adequat.
L'inoculation est réalise à l'aide de frag-
ments mycéliens d'une préculture.
Au bout de 48 heures de culture :
A) Le milieu est supplémenté stérilement par
un mélange phospholipidique (NAT89) additionné d'alcool
veratrylique (AVe).
Composition du melange :
- AVe 1,25 g
- NAT89 0,30
B) Le bullage d'air est remplacé par du bul-
lage d'oxygène pur à un debit de 20 l/h.
Les activites manganèse-peroxydase et lignine-
peroxydase obtenues, dans ces conditions, avec la souche
MIC 390 sont :
- activite MnP m~mllm 10000 U/l
- activité LiP m~ mllm 2400 U/l.
- CA 02209082 1997-06-27
W O 96/21008 ~ n~Slv1746
EXEMPLE 4 : C~T~RE D~ MICRO-ORGANISME DANS ~N REACTE~R A
rl;~T.T.~JT.~S T.TR~?FC: ~lY~E COLONNE A B~LLE
! La composition du milieu de ~ase est la sui-
vante :
Glycérol 6,8 g/l
Tartrate disodique 1,565 g/l
Tartrate de di~mm~um 1,252 g/l
KH2P04 1,334 g/l
CaCl2, 2H20 0,094 g/l
MgS04, 7H20 0,467 g/l
FeS04, 7H20 0,0461 g/l
ZnS04, 7H20 0,0310 g/l
MnS04, H20 0,0232 g/l
CuS04, 5H20 0,0046 g/l
Extrait de levure 0,680 g/l
NAT89 0,5 g/l
2,5 litres de ce milieu sont introduits dans
le bioréacteur et l'ensemble est stérilisé par autocla-
vage 30 min. à 120~C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37~C et
aéré avec de l'air atmosphérique filtré introduit à un
débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circu-
laire ou d'un fritté formant un bullage régulier, as-
surant à la fois une agitation et une aération homogène
2~ nécessaire à la formation des pelotes mycéliennes.
L'inoculation est réalisé à l~aide de frag-
ments mycéliens d'une préculture ou d~une solution de
spores à 2 x 105 spores/ml.
Au bout de 24 h., les pelotes mycéliennes de
0,5 à 1 mm de diamètre environ sont formées et le débit
d'air est réduit à 20 l/h.
Au bout de 48 h :
A) Le milieu est supplémenté stérilement par
un mélange phospholipidique comprenant de l'alcool
vératryli~ue (AVe).
CA 02209082 1997-06-27
r W O 96/21008 P~11~K5~/01746
Composition du mélange :
- Ave 1,05 g
- Source de phospholipide 0,25 g
B) Le bullage d'air est remplacé par du bul-
S lage d'oxygène pur à un débit de 20 l/h.
Les résultats obtenus dans ces conditions avec
la souche MIC 3gO sont :
- activité MnP m~lmllm: 3600 U/l
- activité LiP m~i mllm 162 U/l .
