CA 02210166 1997-07-16
WO 96/22535 PCT/FR96/00095
- 1 -
Procédé de dosage ultrasensible de la trononine I cardiacrue
La présente invention concerne un procédé de dosage ultrasensible
de la troponine I cardiaque, effectué par chimiluminescence.
L'infarctus du myocarde (IDM) représente toujours une urgence
médicale et demeure la principale cause de mortalité et de morbidité cardio-
vasculaire dans le monde.
Dans tous les cas, le traitement instauré. a pour but de protéger le
tissu myocardique de la nécrose irréversible. De nouveaux moyens
thérapeutiques,
o comme les thrombolytiques ou l'angioplastie de première intention,
permettent
aujourd'hui de restaurer rapidement la circulation coronarienne, de façon à
limiter la
taille de la zone infarcie et de réduire l'incidence de la mortalité et de la
morbidité.
Ces outils thérapeutiques sont d'autant plus efficaces qu'ils sont mis
ts en oeuvre au plus tôt après le début des manifestations cliniques. Les
cliniciens
confrontés à cette pathologie doivent pouvoir disposer d'outils diagnostiques
de plus
en plus performants.
Le dosage des protéines sériques et en particulier des enzymes est
2o devenu un élément déterminant pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde
et pour
l'appréciation du succès ou de l'échec d'une reperfusion.
On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire,
constitué de 3 protéines, les troponines C, I et T.
25 La troponine I cardiaque est une protéine contractile exclusivement
présente dans le muscle cardiaque [Wilkinson J.M. et al, Nature (1978), 271,
p. 31-
35 ; Wade R. et ai, Genomics (1990), 7, p. 346-357].
Son rôle physiologique est d'inhiber, en l'absence de calcium,
30 l'activité ATPasique du complexe active-myosine et donc d'empêcher la
contraction
musculaire [ferry S.V., Biochem. Soc. Trans (1979), 7, p. 593-617].
Lors de l'infarctus dû à l'obstruction de l'une des artères nourricières
du coeur (artère coronaire), il apparaît une ischémie puis une nécrose
myocardique
35 qui se traduit par une destruction des cellules cardiaques et la libération
de la
troponine I cardiaque dans le sang. La troponine I représente donc un marqueur
très
spécifique de l'infarctus du myocarde.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
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Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine I pour le
diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde [Am. Heart J. (1981 ), 110, p.
1334-
1344 ; Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278].
De plus, il est désormais acquis que chez certains patients l'angor
instable - qui représente une étape critique de l'ischémie myocardique -, peut
être
associé à un haut risque de survenue d'infarctus du myocarde ou de mort
subite.
Les études post-mortem sur cette catégorie de patients ont montré que
l'apparition
de ces complications était très sowent précédée de micro-infarctus cardiaques
i o [Davies M.J. et al, Circulation (1985), 71, p. 699-708].
Le dosage de la troponine I cardiâque semble donc être
particulièrement intéressant dans la détection des sujets à risque, chez les
patients
atteints d'angor instable, plus spécialement pour le diagnostic des micro-
infarctus.
Par ailleurs, le dosage de la troponine I peut être envisagé lors de la
surveillance d'un traitement thrombolytique pour confirmer le succès ou
l'échec de la
reperfusion, comme aussi lors du suivi postopératoire des interventions en
chirurgie
cardiaque (pontages coronariens, angioplasties etc.). Le dosage de la
troponine I
trouve aussi son application dans le diagnostic des rejets de greffes
cardiaques
2o après transplantation et le suivi des thérapeutiques cardiotoxiques
utilisant par
exemple des anthracyclines.
On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la
détermination de la troponine I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29 2 ,
p. 271-
2~ 27 ô ; Cli, ~. Cfiem. (1993), 39 6, p. 9r 2-979] décrivent un procécé de
dosage
immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique
le
substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)- H2O2. Après la révélation, la
lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, selon
les auteurs,
est de 0,2 ~Cg/I.
Un autre procédé immunoenzymométrique de ia troponine I Cscr~t
par Bodor et al permet de détecter cette dernière à des concentrations de
l'ordre de
1,5 à 3,1 Ng/I [Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38 11, p. 2203-2214 ; Adams
J. et a.,
Circulation (1993), 88 1 , p. 101-706]. Ce dosage utilise pour la révélation
3s enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le
p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm.
Grâce à ces dosages, il a été possible de mettre en évidence la
présence de la troponine I dans le plasma des patients, environ 4 heures après
le
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
CA 02210166 2002-12-06
3
début des manifestations cliniques de l'infarctus du myocarde (Adams J. et al,
Circulation (1993), 88(1), p. 101-106).
Toutefois, la sensibilité de ces dosages immunoenzymométriques
est largement inférieure à celle obtenue par des dosages basés sur des
méthodes
très sophistiquées et difficiles â mettre en oewre, par exemple des dosages
basés
sur la mesure de 1a radioactivité [Am. Heart Journal, (Jupe 1987), 113 6 , p.
1333-
1334J.
On sait aussi que des dérivés cyclïques d'hydrazines, notamment
les diacylhydrazines, pewent être utilisés comme réactifs de chimiluminescence
[Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 5,~7, p. 409-423J. L'utilisation de
ces
1 o réactifs a été envisagée ou effectuée lors de certains dosàges
immunoenzymatiques
[Thrope G.H.G. et al, Clin. Chem. (1985), 31, p. 1335-1341 ; Thrope G.H.G. et
al,
Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353J (Demande WO 88/00695). Par ailleurs,
on connaît des méthodes de détection par chimïiuminescence mettant en oeuvre
la
décomposition enzymatique de dérivés du 1,2-dioxetane.
Toutefois, il est connu que la mise en oeuvre de ces réactifs
nécessite des recherches intensives puisque l'homme de l'art est confronté à
de
multiples facteurs limitant pour la mise au point des dosages sensibles
(affinité des
différents composants de dosage et notamment du système antigène/anticorps,
marqueur enzymatique, substrat, principe de détection etc.). En effet, un
choix
adéquat des différents réactifs et conditions de dosage s'impose. II est
évident que
l'on ne peut pas imaginer un dosage sensible et spécifique lorsque le bruit de
la
2 o mesure (bruit de fond ou bruit de blanc) est important ou lorsque le
rapport
signal/bruit de la mesure est trap petit. Or justement ce bruit de la mesure
dépend
des différents réactifs et conditions de dosage choisis.
II a été maintenant trauvé qu'il était possible, en utilisant un certain
type d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque et de substrats
adéquats
pour la révélation enzymatique, de procéder au dosage par chimiluminescence de
la
troponine I avec une très grande sensïbüité. En effet, en appliquant le
procédé de
l'invention il est passible d'obtenir une sensibilité de l'ordre de 2 à 5
ng/l, ce qui
représente une sensibilité 40 à environ 1500 fois supérieure à celles des
procédés
immunoenzymométriques de la troponine I les c.:~lus sensibles connus jusqu'à
3 0 ~resent.
i i ,. . ,
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4
La présente invention vise un procédé de dosage immuno-
enzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque,
caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) des échantillons ou des standards sont mis en
contact avec deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque pour former un mélange réactionnel, un des
anticorps est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels
anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité, ont
pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation
IO à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M,
b) le mélange réactionnel est lavé,
c) une révélation enzymatique est effectuée par
addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé du diacyle
hydrazine ou du 1,2-dioxétane,
d) la quantité de troponine I cardiaque est évaluée
par une lecture directe d'un signal lumineux obtenu.
De préférence, la présente invention a plus
précisément comme objet, un procédé de dosage immuno-
enzymatique de type sandwich, de la troponine I cardiaque:
20 - qui met en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-
troponine cardiaque dont un est couplé avec un marqueur
enzymatique, lesquels anticorps ont, soit naturellement,
soit par coopérativité une grande affinité pour la
troponine I cardiaque, donc une constante de dissociation à
l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence
égale ou inférieure à 10-9 M; et
- qui utilise pour la révélation enzymatique un substrat
chimiluminescent qui est soit un dérivé d'une
diacylhydrazine, soit un dérivé de 1,2-dioxetane.
30 De préférence, la présente invention concerne un
procédé de dosage immunoenzymatique quantitatif de type
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4a
sandwich de la troponi.ne I ca:â~d:iac.[ue, <<aractérisé en ce que
l'on met en contact ~es échantil:.ons à doser ou les
standards avec: un arti~.Jorps monocl ~rna1 anti-troponine I
cardiaque coLUplé à un marqtzeux~ en._.jrm~tr_que et avec un autre
anticorps monoclonal ~.~rit_i l.rc.x~«r~ir~~_ I cardiaque, ces
anticorps monoclonaux, ::soit :ua~~urellement, soit par effet
de coopératiwi.té, ayant pou:r la t ro~onine 1 cardiaque une
constante de dissociation a~ l'équi.~;_ii.,re égale ou inférieure
à 10-8 M, de prêférenc;e égale ou infr~rieure à 10-~9 M, puis
1.0 que l'on effectue la révélation ena.ymatique par addition
d' un substrat chz.m.i.lumircesceznt chc:>is i et ensuite que l' on
procède â la lecture dirFact.e du sz.gnal lumineux obtenu.
Le procédé de l' irurention L~E:ut entre réalisé soit
par un système manuel (ki.t de dosage de d:iagno~>tic) soit
par un systëme automatisa. Selon .Le nuode de réalisation, il
est possible d'effectuer soit. ~zn do..age en un temps, soit
un dosage en deux temps.
La présente invention v:i.se aussi une utilisation
du luminol comme substra.zt~ chïrtlilcnrnir.~escent pour le dosage
20 immunoenzymatique de t,rpF~ sanc:~w,_cr~ de la troponine I
cardiaque mettant, en c>euvre des_~x Ç~nticorps monoclonaux
anti-troponine I ~;~~rdi_aquc~ dc_~,cnt. u~m couplé avec la
peroxydase, -wesquels , nticvo:cl.~ :;o:it~ mt ur~el_Lement. soin par
coopérativité, ont L..~our ~~.a tx:a.:>~>or~.s..cze I cardiaque une
constante de diss~.~ci~zt iow ait 1 ' é ~uï_ LVL r~~ égale ol.z infér::ieure
à 1C-~ M.
La p.nésez,Fte îr~rVerutz.or~ ~~-.à.~~e a~.assi une utilisation
du lumigen PPD cc.~mme ~ubstr,ar c:r~:i ni.lun~inescent. pour le
dosage immunoenz~y,nar_-wc~ue ~:~Fe tr~p~~ >a:2rïcïw:ich de la troponine I
30 cardiaque mettant, en «e~_'m~~~ ~am.~~~ <.tntic,orps monoclonaux
anti-troponine I :-v~~-diaque dc.COt. ur. couplé avec la
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~b
phosphatase alcaline, lesquels anticorps soit naturellement
soit par coopérativitë, ont pour la troponine I cardiaque
une constante de di.ssmcâ.ation ~-i 1. ~ équilibre égale ou
inférieure à 10-8 M.
La présente invente ion vi se a~uss i une trousse de
dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux
anticorps monoclonaux asti-trop>on:i.ne I cardiaque dont un
est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps,
soit naturellement, :soit par cc>c~pérativité ont pour la
troponine I cardiaque une constante de dissociation â
l'équilibre égale au inférieure â 1!~-9 M, et un substrat
chimiluminescent dérivTé d' une di.acy i hydrazine ou du 1, 2-
dioxetane.
De préférence, pour le dosage en un temps, les
échantillons à doser ou les standards sont mis en contact
simultanément avec. un ani~icorps mc~mocl~ona:l_ anti-tr_oponïne I
cardiaque couplé à un marqueur en-~ymatique et avec un
deuxième anticorps mc.~no~lc~nal anti--~=roponine I cardiaque
éventuellement fixé sur urr suppc~zt:, scl.ide. Après :incubation
et lavage, on procède G. ~.a r_évélat_ion enzymatique. Cette
dernière est ef fectuée ~e lon ~ ' .iruvent.ion par addition d' un
substrat chimiluminesc.~ent dêri~~-é d'tne diacylhydrazine ou
du 1, 2-dioxet;ane. I~~~ ~ya~ntit:.~-~ ~i~~ l.a t roponine I cardiaque
présente dans les éc~:~.ant.:.Llons 4~ doser ou 1 es standards,
est évaluée par 1a le~,tt:m.~e ~_~.=ir-e:ect~ï du signal lumineux
obtenu.
De préférence, pv.~u.z: ïe ~:iosa<~e en deux temps, on
met en contact: 1_es êc:ha.nt:i.l L~:n~ï ;'=v d.>;~er. ou les standards,
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- soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé
à un
marqueur enzymatique, puis après incubation, avec un deuxième anticorps
monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support
solide et
ensuite on incube de nouveau,
- soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque
éventuellement fixé sur un support solide, puis après incubation et un
éventuel
lavage, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque
couplé à
' un marqueur enzymatique et ensuite on incube à nouveau.
Dans les deux cas, on procède ensuite éventuellement à un lavage,
i o puis à la révélation enzymatique qui est effectuée selon l'invention, par
addition d'un
substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ôu du 1,2-dioxetane. La
quantité de ta troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou
les
standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
Pour le dosage en deux temps, de manière préférentielle, les
échantillons à doser et les standards sont mis en contact d'abord avec un
anticorps
monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique puis
après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque
fixé sur un support solide et ensuite incubés de nouveau.
Comme anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, on peut
2o utiliser tout anticorps monoclonal ayant une grande affinité pour la
troponine I
cardiaque et dont la constante de dissociation à l'équilibre est égale ou
inférieure à
10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M. On peut aussi utiliser
tout
couple d'anticorps monoclonaux ayant une liaison coopérative vis à vis de la
troponine I cardiaque, cette coopérativité produisant comme résultat une
augmentation de l'affinité de l'un des deux anticorps monoclonaux pour la
troponine I
cardiaque (constante de dissociation à l'équilibre s 10-8 M) lorsque la
troponine I
cardiaque est déjà liée avec le deuxième anticorps.
De manière préférentielle, comme anticorps monoclonaux anti
troponïne I cardiaque, on peut utiliser les anticorps monoclonaux 11 E12 et
8E1 de
3o souris décrits dans Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. En effet, de
manière
surprenante il a été constaté que l'anticorps monoclonal 11 E12 bloque la
libération
de la troponine I cardiaque liée à l'anticorps 8E1. Ce phénomène a été mis en
évidence en utilisant le système BIACORET" de PHARMACIA, et en mesurant les
constantes cinétiques d'association et de dissociation de la troponine I
cardiaque
(cTnl) sur l'anticorps monoclonal 8E1, en présence ou en l'absence de
l'anticorps
11E12.
Les différents résultats sont donnés dans le Tableau I.
FEU~LI.E DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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TABLEAU I
AcM 8E1 : cTnl AcM 8E1 : cTnl+11E12
seule
CONSTANTE CINETIQUE DE DISSOCIATION3,2.10-3 2,8.10-4
Koff(SW )
CONSTANTE CINETfQUE D'ASSOCIATION5,8.105 4,5.1 OS
Kon (M-1 x S-1 )
' CONSTANTE DE DISSOCL4TION A 5,7.10-9 0,6.10-9
L'EQUILIBRE
Koff/ Kon (M)
s Les résultats du Tableau I démontrent que pour l'anticorps 8E1,
l'affinité est 10 fois plus élevée si la troponine I cardiaque est en présence
de
l'anticorps monoclonal 11 E12. Plus précisément, la constante de dissociation
à
l'équilibre est 10 fois plus faible (la constante cinétique d'association ne
varie pas). II
existe donc une coopérativité de la liaison des deux anticorps monoclonaux
anti-
io troponine I vis à vis de la troponine I cardiaque. Grâce à cette effet de
"blocage" de
la dissociation du complexe il est possible de réaliser le procédé de dosage
immunoenzymatique, objet de la présente invention, avec ce couple d'anticorps
monoclonaux.
15 Pour la formation du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque-marqueur enzymatique on utilise comme marqueur enzymatique soit la
phosphatase alcaline soit la peroxydase.
On utilise la phosphatase alcaline lorsque le substrat
chimiluminescent est un dérivé de 1,2-dioxetane et la peroxydase lorsque le
2o substrat chimiluminescent est un dérivé d'une diacylhydrazine.
On peut utiliser notamment les anticorps monoclonaux 8E1 ou
11 E12 pour préparer les conjugués avec un marqueur enzymatique. De préférence
on prépare des conjugués de l'anticorps monoclonal 11 E12 avec la peroxydase
et
des conjugués de l'anticorps monoclonal 8E1 avec la phosphatase alcaline.
25 - Selon le mode de réalisation, on peut envisager somme support ,
solide soit des tubes en polystyrène sur lesquels est fixé l'anticorps anti-
troponine I
cardiaque (cas du kit de diagnostic), soit des particules magnétiques
(notamment
ferriques) ou non sur lesquelles est fixé l'anticorps monoclonal anti-
troponine I
cardiaque (dosage automatisé).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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.7
Les conjugués anticorps monoclon~~l anti-troponine I - marqueur
enzymatique sont préparés se~on les méthodes cornues [J. Histochem Cytochem
(1974), 22, p 1084-1091].
La préparation des anticorps monoclonaux anti-troponine I fixés par
exemple par des liaisons covalentes sur une phase solide, est aussi réalisée
selon
des méthodes décrites dans la littérature [J. Immunofogical Methods, (1979),
,~1, p.
231-23fiJ .
Lors de la mise en contact des échantillons à doser ou des
standards avec un anticorps monoclonal antï-troponine I cardiaque et/ou un
anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur
enzymatique,
z o le pH du milieu réactionnel doit être de préférence légèrement acide. Le
pH doit
notamment être compris entre 5 et 6, plus prëcisément entre 5,4 et 5,7. Pour
ajuster
le pH on peut utiliser différents tampons adéquats ou des solutions d'acides
organiques faibles, par exemple des solutions ou des tampons d'acide
succinique
ayant un pH de 5,2 à 5,4.
L'incubation entre le plasma ou 1e serum et les anticorps anti-
troponine I ou les standards, est effectuée entre 20'C et 3TC et le temps
d'incubation peut varier entre 5 et 20 minutes.
Après incubation, on procède à un ou plusieurs lavages qui sont
effectués à une température de 2' à 3TC, de préférence à une température
inférieure à 10'C. Pour les lavages, on utilise de manière préférentielle une
solution
de tampon phosphate pH 6,8 ou une solution tampon tris pH 8.
De ~~7_ms, de p-~~~êf ë:.re-nce , 1 ~:. s solut ions de lavage
utilisées avant révé=!_~~tiori peuvcent avoir ~.~n pH égal â 6,8-8
et une températ:mre c:~e '~'" <-x 3'ï°C', <1e préférence à une
température s_nférieure â 1ta°c~.
Comme il a été indiqué précédemment, comme substrat
luminescent on utilise soit un dérivé de diacyihydrazine, plus spécialement le
luminol
[5-amino-2,3-dihydrophtalazine--1,4-dioneJ, soifi un dérivé de 1,2-dioxetane,
plus
spécialement le lumigen PPD [sel disodique de 4-methoxy 4-(3-phosphatephenyl)
spiro (1,2-dioxetane 3-adamantane-2')J. Des sub:~trats luminescents contenant
du
' o luminol sont disponibles dans le commerce comme par exemple le luminol ECL-
immunoessai signal reagent HP~J 190*commercialisé par Amersharn ou le luminol
BM Chimiluminescence ELISA reagent 1582950*commercialisé par Boehringer
* (marques de cornme:rc~E
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'i a
Mannheim. On préfère des substrats qui contiennent un mélange de luminol et de
4-
iodophénol. Des substrats luminescents contenant du lumigen PPD sont aussi
disponibles dans le commerce comme, par exemple, le Lurni-Phos 53U*
commercialisé par Analytical Luminescence i_aboratory. Ce réactif contient du
lumigen PPD et un promoteur de la chimiluminescence qui est un tensioactif
déri~ré
de la fluorescéine.
* (marque de cc~mmert=c
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La révélation enzymatique est aussi effectuée à une température
comprise entre 20'C et 3TC. La lecture de la chimiluminescence est effectuée
de
préférence après environ 2-10 minutes.
Pour réaliser la gamme d'étalonnage d'un dosage quantitatif on
utilise des solutions standards (standards) de la troponine I cardiaque
humaine
purifiée (Larve C. et al, Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979).
L'invention concerne aussi l'utilisation du luminol et du lumigen PPD
comme substrats chimiluminescents pour le dosage immunoenrymatique de type
io sandwich de la troponine I cardiaque mettant en. oeuvre deux anticorps
monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un coûplé avec un marqueur
enzymatique, en particulier la peroxydase, si le substrat est le luminol, et
la
phosphatase alcaline, si le substrat est le lumigen PPD, lesquels anticorps
(soit
naturellement, soit par coopérativité) ont pour la troponine I cardiaque une
constante
de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M.
L'invention a également pour objet une trousse de dosage de la
troponine I cardiaque comprenanf deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps,
soit
naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une
constante
2o de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-9 M, et un substrat
chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, de préférence le luminol ou un
dérivé,
de 1,2-dioxetane, de préférence le lumigen PPD.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent
2s l'invention.
EXEMPLE I
Dosage de la troponine I cardiaque avec un système automatisé
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique
est le système Access~ immuoessai, système commercialisé par Sanofi
Diagnostics Pasteur.
Le dosage est effectué de la manière suivante : Dans la cupule du
dosage sont introduits 50 NI de l'échantillon à doser, 25 girl d'une solution
'
d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 ~I d'une solution d'acide
succinique 0,1
M, 50 girl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de
souris '
8E1-phosphatase alcaline (C = 5 ~Cg/ml).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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9
Après incubation pendant 5 minutes à 37'C sont introduits 50 NI de
billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI---070!60) sur lesquelles sont
fixés par
des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque
de
souris 11 E12.
Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 3TC, puis les billes
de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au
lavage à l'aide d'une solution tampon iris pH 8 on ajaute ensuite 200 ~I de
substrat
Lumi-Phos'" 530.
1 o La révélation est effectuée à 3TC et on mesure la iumïnescence
générée par la réaction avec un luminomètre.
Le temps total d'analyse est de 15 minutes.
Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine
I cardiaque humaine purifiée.
On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des
concentrations comprises entre 0 et 50 ~g/I.
La sensibilité du procédé, évaluée par la courbe d'étalonnage, est
de 3,5 ng/I.
EXEMPLE II
Dosage de la trooonine I cardiaque avec un kit immunoenzymatlaue
Dans des tubes en polystyrène revétus d'anticorps monoclonaux
anti-troponine I cardiaque de la souris 8E1, vn introduit 150 ul d'une
solution tampon
succincte contenant du Tween*20 â 0,2 %, des immunoglobulines de souris non
spécifiques et 0,1 % de Kathon* 50 ~f du conjugué anticorps monoclonal anti-
troponine I cardiaque de souris 11 E12-peroxydase. et 200 NI d'échantillon â
doser
ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage.
Pour la gamme ëtalonnage on utilise du sérum humain contenant de
3 0 0 â 2 ~g/I de troponine i cardiaque r7umaine purifiée.
* (marques de r_~omrnerrc,E-)
CA 02210166 2002-12-06
~0
On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à
température ambiante, puis on procède au lavage des tubes de la façon suivante
- on renverse le contenu des tubes dans un récipïent et on éponge les tubes
sur un
papier absorbant,
- on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0,1 P~", pH 6,8
contenant du Tween~20 à 0,1 '~'o et 0,3 % de Kathon* en maintenant la
température au plus à 8'C. On répète cette étape 3 fois.
Après avoir procédé au lavage et élim'né toute trace de 1a soluticn
utilisée pour ce dernier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant
300 NI
1 o d'un mélange constitué de 100 parties de luminol (BM chimiluminescent
ELISA
reagent~oehringer Mannheim) et 1 partie d'eau oxygénée.
On laisse à température ambiante et on mesure la luminescence
avec un luminomètre après 3 minutes. Chaque tube est lu pendant exactement 30
secondes ou exactement 10 secondes.
La sensibilité de ce dosage est de 3 ng/I.
Les valeurs des rapports signal net/bruit de la mesure (S-B)/B
obtenues selon le procédé décrit ci-dessus et selon le procédé décrit par
Larue C. et
al [Mol. Immunol. (1992), 29(2), p. 271-278 ; Clin Chem. (1993), 39/f p. 972-
979]
sont données dans le Tableau II ci-après.
TABLEAU Il
Concentration en Procédé décrit par
Procedé de I"exemple
~ponine I cardiaque _ _ Larue et al
5..~_ __..; ~QO - ~5;~5 _ __e S ~ 150 - 50
100 ngh _~_ - _ _.____~~-.. - i i ,g B - _ SO - 2,0
ng/I s~ _ ~5 ~5 95 ~ 1.~x SB = 0 ~S = B)
Les valeurs des rapports signa.l/bruit de la mesure obtenue en
appliquant le procédé de l'invention prouvent .sa grande sensibilité et sa
spécificité
* (marqu.es de cornmerrE~;
