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NOUVEAUX INHIBITEURS DE FARNESYL TRANSFERASE LEUR
PREPARATION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
QUI LES CONTIENNENT
La présente invention concerne de nouveaux inhibiteurs de farnésyl transfé-
rase de formule générale :
R'2
X NY COOR
2
5 I
1 (I)
ç R
R1~N~
R~
X1 Y1
éventuellement leurs sels, leur préparation et les compositions
pharmaceutiques qui les
contiennent.
L'inhibition de la farnésyl transférase et, par conséquent, de la
farnésylation de
la protéine Ras, bloque la capacité de la protéine Ras mutée à transformer les
cellules
normales en cellules cancéreuses.
La séquence C-terminale du gène Ras contient le motif "CAAX" ou "Cys-
Aaal-Aaa2-Xaa" dans lequel Aaa représente un aminoacide aliphatique et Xaa
représente un aminoacide quelconque.
Il est connu que des tétrapeptides avec une séquence CAAX peuvent inhiber
la farnésylation de la protéine Ras. Par exemple, dans la demande PCT WO
91/16340
et dans la demande EP 0 461 869 ont été décrits des peptides inhibiteurs de la
famésyl
transférase Cys-Aaal-Aaa2-Xaa qui sont particulièrement représentés par les
peptides
Cys-Val-Leu-Ser, Cys-Val-Ile-Met et Cys-Val-Val-Met qui manifestent leur
activité
inhibitrice à des concentrations voisines de 10-6 ou de 10-7M.
Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente
invention,
que les peptides de formule générale (I) manifestent leur activité inhibitrice
(IC50) à
des concentrations de l'ordre de 10-8 ou de 10-9M.
Dans la formule générale (I),
Rl représente un radical de formule générale Y-S-Al- dans lequel Y représente
un
atome d'hydrogène, ou un reste d'aminoacide ou un reste d'acide gras ou un
radical
alkyle ou alkoxycarbonyle, et Al représente un radical alcoylène droit ou
ramifié
contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué en a du groupement
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.~ . '
>C(X1) (Y1) par un radical amino, alkylamino, alkanoylamino,
alkoxycarbonylamino
dont la partie alkyle ou aikanoyle droite ou ramifiée contient 1 à 6 atomes de
carbone,
X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O,
R'1 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle droit ou ramifié
contenant 1
à 6 atomes de carbone,
X représente un atome d'oxygène ou de soufre,
R2 représente un radical alkyle, alkényle ou alkynyle droit ou ramifié
contenant 1 à 6
atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hydroxy, alkoxy
contenant
1 à 4 atomes de carbone, mercapto, alkylthio contenant 1 à 4 atomes de
carbone,
alkylsulfinyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou alkylsulfonyle contenant 1
à 4
atomes de carbone, étant entendu que, lorsque R2 représente un radical alkyle
substitué par un radical hydroxy, R2 peut former avec le radical carboxy en a
une
lactone,
R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle droit ou ramifié
contenant 1
à 6 atomes de carbone, et
R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle contenant 1 à 6 atomes
de
carbone éventuellement substitué par un radical alcoxy contenant 1 à 4 atomes
de
carbone, alcoylthio contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylsulfinyle
contenant 1 à 4
atomes de carbone, alkylsulfonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, phényle,
phénoxy, phénylthio, phénylsulfinyl, phénylsulfonyl, alcoylamino contenant 1 à
4
atomes de carbone, dialcoylamino dont chaque partie alcoyle contient 1 à 4
atomes de
carbone, ou un radical phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs
atomes ou
radicaux choisis parmi les atomes d'halogène et les radicaux alcoyles,
alcoyloxy,
alcoylthio ou alcanoyle.
Plus particulièrement,
Rl représente un radical de formule Y-S-Al- dans lequel Y représente un atome
d'hydrogène ou un reste lysine ou un reste d'acide gras contenant jusqu'à 20
atomes de
carbone et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement
substitué
par un radical amino,
X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec =
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O,
R'1 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle,
X représente un atome d'oxygène,
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R2 représente un radical alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone
éventuellement
substitué par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto, méthylthio,
méthylsulfinyle ou
méthylsulfonyle,
R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, et
R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes
de
carbone, éventuellement substitué par un radical alcoxy, ou un radical
phényle.
Plus particulièrement encore,
Rl représente un radical de formule Y-S-Al- dans lequel Y représente un atome
d'hydrogène et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement
substitué par un radical amino,
Xl et Yl représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O,
R'1 représente un atome d'hydrogène,
X représente un atome d'oxygène,
R2 représente un radical méthyle, éthyle, propyle ou butyle éventuellement
substitué
par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto ou méthylthio,
R'2 représente un atome d'hydrogène, et
R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes
de
carbone.
Tout particulièrement intéressants sont les produits de formule générale (I)
dans laquelle Rl représente un radical mercapto-2 éthyle ou amino-1 mercapto-2
éthyle, Xl et Yl représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble
avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, R'1 représente un
atome
d'hydrogène, X représente un atome d'oxygène, R2 représente un radical
n.butyle ou
méthylthio-2 éthyle et R'2 représente un atome d'hydrogène, et R représente un
atome
d'hydrogène ou un radical méthyle.
La présente invention concerne également les formes stéréoisomères des
produits de formule générale (I). Les restes des aminoacides représentés par
R1C(Xl)(Yl)(NR'1) et R'2CH(NR'2)CO-OH ont de préférence la configuration des
aminoacides naturels.
La présente invention concerne également les sels minéraux ou organiques
des produits de formule générale (I).
Les nouveaux produits selon l'invention peuvent être préparés par application
des méthodes connues dérivées des méthodes utilisées plus particulièrement en
chimie
peptidique pour l'assemblage de chaînes.
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Généralement, les produits de formule générale (I), laquelle Xl et Yl fornient
ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O et X
représente un atome d'oxygène sont obtenus à partir de l'acide 5-nitro-1,2,3,4-
tétrahydro-naphtyl-1-carboxylique
sur lequel est condensé un aminoacide de formule
générale : b
R'
2
HNYCOOR' (II)
R2
dans laquelle R2 et R'2 sont définis comme précédemment et R' représente un
radical
alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un
radical
phényle, de préférence un radical tert-butyle, en opérant en présence d'un
agent de
condensation, tel que l'hydroxybenzotriazole et le dicyclohexylcarbodiimide,
et d'une
base, telle que la triéthylamine, dans un solvant organique, tel que le
diméthyl-
formamide, pour donner un produit de formule générale :
R'
X 1 2
Ny COOR'
R2
( (III)
NO2
dans laquelle X représente un atome d'oxygène, R2, R'2 et R' sont définis
comme
précédemment qui est réduit, de préférence au moyen de chlorure stanneux, en
produit
de formule générale :
R' 2
~
X Ny COOR' 5 R2
(IV)
NH2
dans laquelle X représente un atome d'oxygène, R2, R'2 et R' sont définis
comme
précédemment, sur lequel est condensé un produit de formule générale : F
R1 ~OH
(V)
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dans laquelle R1 est défini comme précédemment et Xl et Yl forment ensemble
avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, étant entendu que
les
fonctions amino et mercapto portées par Rl sont Pventuellement protégées par
des
groupements protecteurs appropriés tel qu'un radical trityle pour la fonction
mercapto
5 ou un radical tert-butoxycarbonyle pour la fonction amino, en opérant de
préférence
en présence d'un halogénoformiate d'alcoyle (chloroformiate d'isobutyle) et
d'une base
organique (N-méthylmorpholine) dans un solvant organique inerte
(tétrahydrofuranne)
pour obtenir un produit de formule générale :
R'
X Z
NY COOR'
2
1 (VI)
5 ç R
Rl>< NH
X1 Y1
dans laquelle les symboles X, X1, Yl, Rl, R2, R'2 et R' sont définis comme
précédemment dont les groupements protectetzrs sont remplacés par des atomes
d'hydrogène, au moyen d'acide trifluoroacétique en présence d'éthaneditiol,
lorsque les
groupements protecteurs représentent des radicaux trityle, tert-
butoxycarbonyle ou
tert-butyle, pour obtenir un produit de formule générale (I) dans laquelle Xl
et Y1
forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement
>C=O.
Généralement les produits de formule générale (I) dans laquelle les symboles
Xl et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène peuvent être obtenus par
action
d'un aldéhyde de formule générale :
Rl-CHO (VII)
dans laquelle R1 est défini comme précédemment, étant entendu que les
fonctions
amino et mercapto portées par Rl sont éventuellement protégées par des
groupements
protecteurs appropriés tel qu'un radical trityle pour la fonction mercapto ou
un radical
tert-butoxycarbonyle pour la fonction amino, sur un produit de formule
générale (V)
en présence d'un agent réducteur tel que le cyanoborohydrure de sodium, le
borohydrure de sodium, le triacétoxyborohydi-ure de sodium ou l'hydrogène en
présence d'un catalyseur. Généralement la réaction s'effectue dans un solvant
organique tel qu'un alcool comme le méthanol éventuellement en association
avec un
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autre solvant organique tel qu'un éther comme le tétrahydrofuranne. Il est
particulière-
ment avantageux d'opérer en milieu anhydre.
La condensation de l'aldéhyde avec l'amine étant réalisée, les groupements
protecteurs sont remplacés par des atomes d'hydrogène par application des
techniques
-
habituelles. Ainsi, les groupements protecteurs Boc ou trityle ou tert-butyle
peuvent
être remplacés par des atomes d'hydrogène au moyen d'acide trifluoroacétique
en
présence d'éthanedithiol.
Généralement, les produits de formule générale (I) dans laquelle X représente
un atome de soufre peuvent être obtenus à partir d'un produit de formule
générale (III)
dans laquelle X représente un atome d'oxygène par thionation puis en
effectuant les
étapes de réduction, de condensation ou d'amination réductrice selon le cas et
de
déprotection décrites précédemment pour la préparation d'un produit de formule
générale (I) dans laquelle X représente un atome d'oxygène.
Lorsque dans la formule générale (I) le symbole R2 forme avec la fonction
carboxy en a une lactone, le traitement en milieu basique du produit
correspondant
conduit au produit de formule générale (I) dans laquelle R2 représente un
radical
alkyle substitué par un radical hydroxy. Généralement, l'ouverture de la
lactone
s'effectue dès que le pH devient supérieur à 7. Il est particulièrement
avantageux
d'opérer en présence d'une base minérale (soude, potasse) en milieu hydro-
alcoolique
tel qu'un mélange eau-méthanol.
Les produits de formule générale (I) dans laquelle R représente un radical
alcoyle éventuellement substitué ou un radical phényle éventuellement
substitué
comme indiqué précédemment peuvent être obtenus par estérification d'un
produit de
formule générale (I) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène dans les
conditions habituelles d'estérification qui ne touchent pas au reste de la
molécule.
Les produits de formule générale (I) dans laquelle R représente un atome
d'hydrogène peuvent aussi être obtenus par saponification d'un produit de
formule
générale (VI) suivi du remplacement des groupements protecteurs portés par Rl
dans
les conditions décrites précédemment.
L'acide 5-nitro-1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl-1-carboxylique, qui peut être
obtenu en mélange avec l'acide 7-nitro-1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl- 1 -
carboxylique, peut être préparé selon le procédé décrit par T. NAKAYAMA et
coll., Chem. Pharm.
Bull., 32, 3968 (1984).
Les produits de formule générale (I) peuvent être purifiés selon les méthodes
habituelles telles que la chromatographie.
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Les exemples suivants illustrent la préparation des produits selon
l'invention.
EXEMPLE 1
On prépare l'acide 5-nitro-1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl- 1 (R,S) -carboxylique
selon la méthode de NAKAYAMA, T et coll., Chem. Pharm. Bull., 32, 3968 1984).
A une solution de 1,23 g d'acide 5-nitro-1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-
carboxylique dans 25 cm3 de chloroforme et 7,5 cm3 de diméthylformamide, on
ajoute
1,24 g de chlorhydrate de l'ester méthylique de la (L)-méthionine, 0,84 g de
1-hydroxybenzotriazole, 0,9 cm3 de triéthylamine et 1,28 g de dicyclohexyl-
carbodiimide. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 jours à une
température
voisine de 20 C, filtré sur verre fritté, puis lavé par 50 cm3 de chloroforme.
La
solution organique est lavée 2 fois par 50 cm3 d'une solution aqueuse
d'hydrogénocarbonate de sodium à 10 %(p/v) puis une fois par 50 cm3 d'une
solution
aqueuse d'acide citrique à 10 %, une fois par de l'eau distillé, et enfin par
une solution
aqueuse saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du
sulfate
de magnésium, filtrée puis concentrée à sec sous pression réduite. On obtient
3,68 g de
l'ester méthylique de la N-(5-nitro-1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-
carbonyl)-(L)-
méthionine sous forme d'une huile dont les caractéristiques sont les suivantes
:
-spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (300 MHz ;(CD3)2S0 d6 ; 8
en ppm ; constantes de couplage J en Hz) : 1,55-2.10 (mt, 6H : CH2CH2 en 2 et
CH2
en 3) ; 2,07 (s, 3H : SCH3) ; 2,56 (mt, 1H : CH en 1) ; 4,45 (mt, 1H : CHCOO)
;
7,35-7,55 et 7,77 ( 2 mts, respectivement 2H et 1H : H en 6 et H en 7 et H en
8) ;
8,63 et 8,69 (2 d, J = 8,5, 1H : CONH).
A une solution de 3,68 g d'ester méthylique de la N- (5 -nitro- 1,2,3,4-
tétrahydro-naphthyl-1 (R,S) -carbonyl) - (L) -méthionine dans 100 cm3
d'éthanol, on
ajoute 6,32 g de dihydrate de chlorure d'étain (II). Le mélange réactionnel
est agité
pendant 30 minutes à une température voisine de 70 C puis refroidi à une
température
voisine de 20 C. Après dilution par 100 cm3 d'acétate d'éthyle, le mélange
réactionnel
est versé sur de la glace puis amené à pH = 7-8 par addition d'une solution
aqueuse
d'hydrogénocarbonate de sodium à 5 %. Le mélange obtenu est filtré sur verre
fritté
garni de célite. La phase organique est séparée par décantation et la phase
aqueuse est
extraite 2 fois par 150 cm3 d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont
réunies,
séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées et concentrées à sec sous
pression
réduite. On obtient ainsi 2,49 g d'ester méthylique de la N-(5-amino-1,2,3,4-
tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-carbonyl)-(L)-méthionine sous forme d'une huile dont
les
caractéristiques sont les suivantes :
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- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (300 MHz ;(CD3)2S0 d6 ;
S
en ppm ; constantes de couplage J en Hz) : 1,50-2,10 (mt, 6H : CH2CH2 en 2 et
CH3
en 2) ; 2,10 (s, 3H : SCH3) ; 2,39 et 2,53 (2 mts, 2H chacun : CH2S et CH2 en
4) ;
3,66 (mt, 1H : CH en 1) ; 3,69 (s, 3H : CHCOO) ; 4,75 (s large, 2H : NH2) ;
6,30-
6,60 et 6,82 (2 mts, respectivement 2H et 1H : H en 6 et H en 7 et H en 8) ;
8,48 (d,
J = 9,1H : CONH).
A une solution de 1,24 g d'ester méthylique de la N-(5-amino-1,2,3,4-
tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-carbonyl)-(L)-méthionine dans 60 cm3 de méthanol, on
ajoute 3,73 g de S-triphénylméthyl-N-tert-butoxycarbonyl-cystéinal, 0,48 cm3
d'acide
acétique concentré, du tamis moléculaires (3A) puis 0,52 g de cyanoborohydrure
de
sodium. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 jours à une température
voisine de
C puis filtré sur verre fritté garni de célite. Le verre fritté est lavé par
du méthanol.
Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est dissous
dans 150 cm3
d'acétate d'éthyle et lavé par 100 cm3 d'une sohrtion aqueuse
d'hydrogénocarbonate de
15 sodium à 10 %(p/v), 100 cm3 d'une solution aqueuse d'acide citrique à 10 %
(p/v),
100 cm3 d'eau distillé, encore 100 cm3 d'une solution aqueuse
d'hydrogénocrbonate de
sodium à 10 %(p/v), et enfin par 100 cm3 d'une solution aqueuse saturée de
chlorure
de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium, filtrée
et
concentrée à sec sous pression réduite. On obtient 5,62 g de l'ester
méthylique de la
20 N-[5-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylmercapto-propylamino)-
1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-carbonyl]-(L)-méth.ionine sous forme d'un
meringue
beige dont les caractéristiques sont les suivantes :
- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (300 MHz ;(CD3)2SO d6
avec quelques gouttes de CD3COOD d4 ; S en ppm ; T = 393 K constantes de
couplage J en Hz) : 1,38 (s, 9H : C(CH3)3) ; 1,50-2,05 (mt, 6H : CH2CH2 en 2
et
CH2 en 3) ; 2,06 (s, 3H : SCH3) ; 2,05-2,45 et 2,53 ( 2 mts, respectivement 4H
et 2H:
2 CH2S et CH2 en 4) ; 2,85-3,05 (mt, 2H : NH2) ; 3,63 (mt, 1H : CH en 1) ;
3,63 et
3,67 (2 s, 3H : COOCH3) ; 3,71 (mt, 1H : CHN) ; 4,43 (mt, 1H : CHCOO) ; 6,30-
6,56 et 6,90 (2 mts, respectivement 2H et 1H : H en 6 et H en 7 et H en 8) ;
7,15-7,35
(mt, 15H : aromatiques) ; 8,36 et 8,39 (2 d résiduels, J = 10, 1H : CONH).
A un mélange de 5,45 g de l'ester méthylique de N-[5-(2(R)-tert-
butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylmercapto-propylamino) -1,2,3,4-tétrahydro-
naphtyl-1(R,S)-carbonyl]-(L)-méthionine dans 10 cm3 d'éthanedithiol, on
ajoute, à une
température voisine de 20 C, 110 cm3 d'acide trifluoroacétique. Le mélange
réactionnel est agité pendant 2 heures à une température voisine de 20 C, puis
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concentré sous pression réduite. Le résidu est trituré 3 fois par 25 cm3
d'éther
éthylique puis séché sous pression réduite. Le résidu est purifié par
chromatographie
liquide à haute performance (phase C18) en éluant avec un mélange acétonitrile-
eau
contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique. On obtient 0,4 g de
trifluoroacétate de
l'ester méthylique de la N-[5-(2(R)-amino-3-mercapto-propylamino)-1,2,3,4-
tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-carbonyl]-(L)-méthionine sous forme d'une poudre
dont les
caractéristiques sont les suivantes :
- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (300 MHz ;(CD3)2S0 d6
avec quelques gouttes de CD3COOD d4 ; T = 393 K ; S en ppm ; constantes de
couplage J en Hz) : 1,55-2,10 (mt, 6H : CH2CH2 en 2 et CH2 en 3) ; 2,04 (s, 3H
:
SCH3) ; 2,30-2,65 et 2,80 (2 mts, respectivement 4H et 2H : 2 CH2S et CH2 en
4) ;
3,30 et 3,35-3,50 (respectivement dd, J = 14 et 8 et mt, 1H chacun NCH2) ;
3,43 (mt,
1H : CHN) ; 3,63 (mt, 1H : CH en 1) ; 3,63 (s, 3H : COOCH3) ; 4,42 (mt, 1H :
CHCOO) ; 6,40-6,60 et 6,95 (2 mts, respectivement 2H et 1H : H en 6 et H en 7
et H
en 8) ; 8,35 et 8,38 (2 d résiduels, J = 8, 1H : CONH).
- analyse élémentaire : C20H31N303S2, 1,25 CF3CO2H
Calculé % : C= 47,7 ; H= 5,70 ; N= 7,4 ; S=11,9
Trouvé . 47,8 ; 5,37 ; 7,1 ; 10,6
EXEMPLE 2
A une solution de 1,98 g d'ester méthylique de la N-[5-(2(R)-tert-
butoxycarbonylamino3-triphénylméthylmercapto-propylamino)-1,2,3,4-tétrahydro-
naphtyl-1(R,S)-carbonyl]-(L)-méthiônine dans 8,4 cm3 d'eau distillée et 30 cm3
de
tétrahydrofuranne, on ajoute 0,17 g de lithine monohydratée (LiOH, H20). La
solution est agitée pendant 20 heures à une température voisine de 20 C, puis
concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissous dans de l'eau
distillée. Le pH
est amené à 3 par addition d'une solution aqueuse d'acide citrique à 10 %
p/v). La
phase aqueuse est extraite 3 fois par 100 cm3 d'acétate d'éthyle. Les phases
organiques
sont réunies, lavées avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium,
séchées
sur du sulfate de magnésium, filtrées et concentrées à sec sous pression
réduite. On
obtient 1,92 g de la N-[5-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-
triphénylméthylmercapto-
propylamino)-1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-carbonyl]-(L)-méthionine sous
forme
d'une meringue.
A un mélange de 0,5 g de N-[5-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphényl-
méthylmercapto-propylamino) -1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-carbonyl]- (L)-
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méthionine dans 2,5 cm3 de triéthylsilane, on ajoute, à une température
voisine de
C, 8 cm3 d'acide trifluoroacétique. Le mélange réactionnel est agité pendant
2 heures à une température voisine de 20 C, puis concentré sous pression
réduite . Le `
résidu est trituré 3 fois par 25 cm3 d'éther éthylique puis séché sous
pression réduite.
5 Le résidu est purifié par chromatographie liquide à haute performance (phase
C18) en
éluant avec un mélange acétonitrile-eau contenant 0,1 % d'acide
trifluoroacétique. On
obtient 0,094 g de trifluoroacétate de la N-[5-(2(R)-amino-3-mercapto-
propylamino)
1,2,3,4-tétrahydro-naphtyl-1(R,S)-carbonyl]-(L)-méthionine sous forme d'une
poudre
dont les caractéristiques sont les suivantes :
10 -spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (300 MHz ;(CD3)2S0 d6
; S
en ppm ; constantes de couplage J en Hz) : 1,55-2,10 (mt, 6H : CH2CH2 en 2 et
CH2
en 3) ; 2,06 (s, 3H :SCH3) ; 2,30-2,65 et 2,75-2,30 (2 mts, respectivement 4H
et 2H:
2 CH2S et CH2 en 4) ; 3,30 et 3,35-3,50 ( respectivement dd, J= 14 et 8 et mt,
1H
chacun : NCH2) ; 3,43 (mt, 1H : CHN) ; 3,66 (mt, 1H : CH en 1) ; 4,37 (mt, 1H
:
15 CHCOO) ; 6,40-6,60 et 6,95 (2 mts, respectivement 2H et 1H : H en 6 et H en
7 et H
en 8) ; 7,95 (s large, 3H : NH3+) ; 8,33 et 8,35 (2 d, J = 9, 1H : CONH).
- analyse élémentaire : C19H29N303S2, 1,33 CF3CO2H
Calculé %: C= 46,2 ; H= 5,42 ; N= 7,46 ; S=11, 38 ; F=13,46
Trouvé . 45,8 ; 5,5 ; 7,47 ; 11,25 ; 13,2
20 L'activité inhibitrice de la farnésyltransférase et de la farnésylation de
la
protéine Ras peut être mise en évidence dans le test suivant :
L'activité farnésyltransférase est déterminée par la quantité de (3H) farnésyl
transférée à partir du (3H) farnésylpyrophosphate [(3H) FPP) sur la protéine
p21
H-Ras. Le mélange réactionnel standard est composé, pour un volume final de 60
l,
de Tris-HCI 5OmM, Mg02 5mM, dithiotréitol 5 mM, octyl-(3-D-glucopyranoside
0,2 %, p21 H-ras 200 picomoles, (3H) FPP (à 61000 dpm/picomole) 4,5 picomoles.
La réaction est initiée par addition d'environ 5 ng de farnésyltransférase
humaine purifiée à partir de cultures de cellules THP1. Après incubation
pendant 20
minutes à 37 C en plaque de microtitration contenant 96 trous de 1 cm3 par
plaque
(Titer Plate , Beckman), la réaction est stoppée par addition de 0,4 cm3 de
SDS à
0,1 % dans le méthanol à 0 C. Le mélange est ensuite additionné de 0,4 cm3
d'acide
trichloroacétique (TCA) à 30 % dans le méthanol. Les plaques sont laissées
pendant
1 heure dans la glace. Le contenu précipité est alors retenu sur membrane en
fibre de =
verre Filtermat , Pharmacia) avec l'unité de filtration (Combi Cell Harvester
,
Skatron) et rincé avec de l'acide trichloroacétique à 6 % dans l'eau
distillée. Les
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membranes sont séchées au four à micro-ondes puis imprégnées de scintillant
par
fusion sous air chaud de Meltilex (Pharmacia) et enfin comptées en cpm dans
un
compteur (3-Plate (LKB). Chaque essai est répété 3 fois.
L'unité d'activité est définie par 1 picomole de (3H) FPP transférée sur p21
H-Ras en 20 minutes.
Les pourcentages d'inhibition sont obtenus par comparaison des essais avec et
sans inhibiteur après déduction des blancs, les IC50 étant mesurées à partir
des
inhibitions obtenues avec 9 concentrations différentes en utilisant les
logiciels
Enzfitter ou Grafit .
L'activité sur cellules peut être déterminée de la manière suivante :
La lignée cellulaire est la lignée THAC (cellules CCL 39 transfectées par
Ha-Ras activé) selon K. Seuwen et coll., EMBO J., 7(1) 161-168 (1988). Les
cellules
sont ensemencées dans des boîtes de Petri de 6 cm de diamètre contenant un
milieu
DMEM, sérum de veau foetal 5%, G418 1%.
Après 24 heures de culture, le milieu de culture est changé (avec ou sans
sérum) et le produit à étudier est ajouté en solution dans le
diméthylformamide
(DMF), en présence ou en absence de DTT (concentrations finales de 0,5 % en
DMF
et 0,1mM en DTT). Après 24 heures de culture à 37 C, les cellules sont lysées
dans
1 cm3 de tampon de lyse (Tris, HCl 20mM, Triton X114 1%, MgC12 5 mM, DTT
7 mM, NaCI 150 mM, pH = 7,4). Les lysats sont clarifiés par centrifugation à
4.000
tours/minute pendant 10 minutes. L'extraction par le Triton X114 permet de
séparer
la protéine Ras farnésylée de la protéine Ras non farnésylée [C. BORDIER, J.
Biol.
Chem., 256 (4), 1604-1607 (1981)]. La protéine Ras farnésylée qui est plus
hydro-
phobe se trouve dans la phase détergente tandis que la protéine Ras non
farnésylée est
dans la phase aqueuse. Les échantillons sont dénaturés par chauffage à 95 C
dans du
tampon de dénaturation pour électrophorèse et déposées sur un gel de
polyacrylamide
à 14 %. Lorsque le colorant atteint le bas du gel, les protéines du gel sont
transférées
sur une membrane PVDF. La protéine Ras est révélée par la technique de Western
blot : la membrane est incubée avec un anticorps monoclonal spécifique anti-
Ras
(pan-Ras Ab3, Oncogène Science) puis avec de la protéine A marquée à 1251.
Après
autoradiographie, les bandes sont identifiées, découpées et comptées dans un
compteur y. La radioactivité des bandes correspondant à Ras famésylée et à Ras
non
famésylée permet de déterminer le pourcentage d'inhibition de la farnésylation
de la
protéine Ras.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I.
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TABLEAU I
PRODUIT Activité inhibitrice % d'inhibition sur
IC50 nM cellules (THAC)
Exemple 1 15 > 10 (10 M)
Exemple 2 405 50 (50 M)
Les nouveaux produits de formule générale (I) peuvent se présenter sous
forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non
toxiques
comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique,
sulfurique,
bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides
acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoïque,
fumarique, méthânesulfonique, trifluoroacétique ou oxalique) ou avec les bases
minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires
comme la
triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine) selon la nature des symboles
Rlet R du
produit de formule générale (I).
La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques
qui contiennent au moins un produit de formule générale (I) en association
avec un
ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables qu'ils
soient
inertes ou physiologiquement actifs.
Ces compositions peuvent être administrées par voie orale, parentérale ou
rectale.
Les compositions pour administration orale comprennent des comprimés,
des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions le produit
actif selon
l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes tels que
saccharose, lactose
ou amidon. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les
diluants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de magnésium.
Comme compositions liquides pour administration orale peuvent être
utilisées des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des
suspensions, des sirops, des élixirs contenant des diluants inertes tel que
l'eau ou
l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent également comprendre des
substances
autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou
aromatisants.
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Les compositions selon l'invention pour administration parentérale peuvent
être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des
émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylèneglycol, un
polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive ou
des esters
~ 5 organiques injectables par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions
peuvent
également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants,
émulsifiants et
dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à
l'aide d'un
filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents
stérilisants ou par
chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions
solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de
l'eau stérile
ou tout autre milieu stérile injectable.
Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui
peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de
cacao.
Les compositions selon l'invention sont particulièrement utiles en thérapeu-
tique humaine dans le traitement de cancers d'origines diverses.
En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché, de la
durée du traitement et des facteurs propres au sujet à traiter.
Généralement, les doses sont comprises, chez l'homme, entre 0,1 et
mg/kg par jour par voie intra-péritonéale.
20 L'exemple suivant illustre une composition selon l'invention.
EXEMPLE
On dissout 200 mg du produit obtenu à l'exemple 1 dans 100 cm3 de sérum
physiologique. La solution obtenue est répartie aseptiquement en ampoules de
lOcm3.
Les ampoules sont administrées en injection unique ou en perfusion.
,
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