Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96128571 PCT11i~96/00391
PROCEDE DE DETECTION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE
DE LESIONS DE L'ADN
La présente invention a pour objet un procédé de détection qualitative
et quantitative de lésions sur de l'Acide DésoxyriboNucléique dues à des
agents physiques ou chimiques ainsi qu'un procédé de détection qualitative
et quantitative de l'activité de substances modulatrices de réparation
5 d'extraits cellulaires sur de l'Acide DésoxyriboNucléique lésé.
Pour la suite de la description et pour les revendications, on appelle
"produit lésant", tout agent chimique pur spécifique, tout mélange artificiel
d'agents chimiques, ou toute composition naturelle d'agents chimiques ou
encore tout agent physique tel que les rayonnements notamment les
10 rayonnements ionisants et les rayonnements ultraviolets.
On sait que l'ADN sert de support à l'information génétique et qu'il
peut être lésé par des produits lésants avec des conséquences importantes si
ces lésions ne sont pas réparées. En effet, la division cellulaire est
dépendante de ces informations et la vie même de la cellule est concernée
15 puisque les gènes exprimés dans la cellule sont nécessaires au bon
fonctionnement cellulaire.
Aussi une lésion peut conduire à un,e mutation sur l'ADN, qui peut
entraîner un dysfonctionnement de la cellule et par conséquent induire un
problème au niveau de l'organisme.
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/FR96/00391
Il est donc important d'analyser les réactions de l'ADN d'un individu
vis à vis de produits lésants pour en tirer des informations intéressantes,
notamment pour le suivi de l'évolution de certaines maladies ou pour en
prévenir les conséquences. Il faut donc, à partir de cellules contenues dans le
s sang ou dans un quelconque tissu, récupérer l'ADN puis le purifier et analyser son comportement en regard des produits lésants en dosant les
conséquences induites par ces lésions.
Ainsi, dans l'industrie du médicament, on peut avoir besoin de
déterminer qualitativement -et quantitativement la génotoxicité ou l'anti-
lo génotoxicité d'un composé ou d'un mélange de composés vis à vis de l'ADN,et si possible les capacités de réparation des lésions ainsi générées. Une telle
détermination est utile à partir de cellules développées et cultivées in vitro ou
isolées ex vivo. Des applications de ce type de détermination sont la
détection de xénobiotiques génotoxiques, le suivi des patients en
chimiothérapie, ou le suivi des personnes travaillant au contact des
génotoxiques.
Il est un autre but du procédé selon l'invention qui, dans le cas
d'agents lésants chimiques, cherche à vérifier les capacités d'inhibition d'un
composé vis à vis de ce produit, c'est notamment le cas des oxydants et
20 antioxydants.
On connaît différents tests concernant l'ADN et notamment la
demande de brevet EP 0.472.482 au nom du présent demandeur, qui
concerne le dosage de microquantités d'ADN présentes en position
extracellulaire dans un liquide biologique, notamment dans le plasma sanguin.
25Ce procédé consiste à fixer, par adsorption, I'ADN sur un support
solide grâce à des substances présentant une grande affinité pour l'ADN.
Ainsi on peut choisir cette substance notamment parmi les complexes
macromoléculaires cationiques.
Le support solide est généralement une plaque de microtitration
30 comprenant des puits, qui sont sensibilisés par incubation dans un milieu
contenant ces complexes macromoléculaires cationiques.
~ - -
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/FR96/00391
Cette plaque est incubée avec l'échantillon dont on cherche à doser la
proportion d'ADN. L'ADN est adsorbé et la plaque est lavée en tampon
Borate avec un tensioactif ou en tampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane.
L'ADN ainsi fixé est soumis à une réaction de biologie moléculaire
s mettant en jeu plusieurs enzymes spécifiques de l'ADN afin d'incorporer au
moins un nucléotide marqué chimiquement par une substance pouvant être
ultérieurement révélée, par exemple par réaction enzymatique.
Une telle incorporation est prévue dans ce procédé antérieur de dosage
par la réaction de "Nick translation", c'est-à-dire par une réaction de
lO déplacement de coupure haplotomique. Un tel marqueur, décrit dans cette
demande précédente, est un nucléotide modifié reconnu par un composé
avidine/enzyme ou streptavidine/enzyme, l'enzyme étant la péroxydase.
Après interruption de la réaction enzymatique, la révélation du
marqueur incorporé est obtenue au moyen d'un appareillage susceptible de
15 quantifier le signal émis. On mesure ainsi au moyen d'un spectrophotombtre
la réaction colorée obtenue avec la biotine.
Un tel procédé de dosage de l'ADN présent en très petite quantité
dans un échantillon apporte de nombreux avantages, notamment:
pas d'extraction de l'ADN préalablement à son dosage,
. pas d'utilisation obligatoire de marqueur "chaud" c'est-à-dire radioactif,
pas d'appareillage spécifique lourd,
. grande sensibilité,
mise en oeuvre simultanée sur plus de cent échantillons, et
obtention de résultats en quelques heures.
2s Un tel procédé a donc un but bien déterminé qui est le dosage de
l'ADN en vue de déterminer les éventuelles variations du taux d'ADN, plus
particulièrement chez l'homme mais aussi en conditions expérimentales pour
quantifier les phénomènes de mort cellulaire.
On connaît un test décrit par Wood et coll [(1988) Cell, 53, 97-106] et
Sancar et coll. [Sibghat-Ullah et al (1989) Nucleic Acids Res., 17, 4471 -
4484], qui permet de détecter les lésions sur de l'ADN.
-
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/E~96/00391
Cet essai consiste à placer deux plasmides très purs et de tailles
différentes, I'un lésé et l'autre non lésé en tant que référence, en présence
d'un extrait cellulaire, transcriptionnellement actif, en présence, entre autres,
d'une composition connue de dNTP, de dATP marqué et de Magnésium.
Les lésions sont reconnues, incisées, et la synthbse d'ADN réparatrice
subséquente permet l'incorporation de dNTP radio-marqués dont la présence
sera ensuite quantifiée.
Un certain pourcentage de lésions est réparé par ce mécanisme
d'incision-excision et resynthèse, de l'ordre de 7 %.
lo On linéarise les plasmides, on fait migrer sur un gel d'électrophorèse
afin d'assurer la séparation et on étudie le signal radioactif émis par les
chaînes réparées dans lesquelles un marqueur "chaud" est présent. Le
rapport des signaux donne un rapport de réparation.
L'activité d'incision-excision peut aussi être directement mesurée
15 [Calsou et Salles (1994) Biochem.Biophys.Res.Comm.,202. 788-795].
Un tel test présente de nombreux inconvénients et notamment le fait
que l'application à l'industrie dans des conditions d'automatisation
satisfaisantes est difficile si bien que cet essai reste réservé aux laboratoires.
Les délais d'obtention des résultats, (de l'ordre de deux jours), sont trop
20 longs et les coûts trop élevés. Comme autre contrainte, on peut citer la
nécessité de disposer de plasmides purifiés, avec des quantités de l'ordre
200-300 ng et à ce sujet, on remarque que ce test ne paraît pas transposable
à l'analyse de lésions d'ADN de toute provenance in vitro ou ex vivo.
De plus on constate que les marqueurs sont des isotopes dont la
25 manipulation est moins aisée et que le remplacement par des marqueurs
d'autre nature semble délicat.
En outre, dans le domaine des marqueurs, une tendance forte est de
penser que les marqueurs radioactifs sont plus sensibles que les autres si
bien que tout chercheur est amené instinctivement à recourir à de tels
30 marqueurs et même à être dissuadé d'utiliser des marqueurs froids.
On connaît bien sûr des tests permettant ensuite de détecter les
mutagènes puisqu'une relation existe entre lésions et mutagénèse. Ce sont
CA 02215493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/FR96/00391
plus particulièrement le test d'AMES [Ames et al (1973) Proc.Natl.Acad.Sci
.USA,70,2281-2285)] complété par le test dit du micronoyau [Mac Grégor et
al. (1987) Mutat. Res. 189,103-112] qui permet l'analyse des cassures
chromosomiques et des tests permettant de détecter des mutations dans des
s gènes tels que HPRT codant pour une enzyme de biosynthèse des bases de
I'ADN .
Dans l'industrie pharmaceutique, on utilise très souvent et surtout en
cas de doute avec les tests précédents, le test UDS "Unscheduled DNA
Synthesis" qui consiste également à mesurer l'incorporation d'un ou plusieurs
0 nucléotides marqués dans l'ADN de cellules soumises à des agents
potentiellement génotoxiques.
Ce test présente à nouveau l'inconvénient de prévoir la manipulation
de radio-isotopes et d'être semi-quantitatif.
Un perfectionnement de l'UDS a proposé un marqueur non radioactif
15 lSelden et al.(1994) Mutat.Res.,315, 147-167], mais cet intérêt est rendu
moins pertinent par le fait que l'analyse des résultats nécessite la mise en
oeuvre de la cytométrie de flux, qui est une technique très lourde.
Le procédé selon l'invention a donc pour but de pallier les
inconvénients de l'art antérieur en permettant de déterminer qualitativement
20 et quantitativement les lésions induites dans de l'ADN, qu'il provienne de
cellules ex vivo (cellules, tissus) ou qu'il s'agisse d'ADN in vitro (purifié ouissu de cellules en culture). Le procédé selon l'invention permet aussi de
déterminer la capacité d'une substance ou d'un mélange de substances à
inhiber l'effet lésant d'un produit lésant.
Le procédé selon l'invention permet également de tester des agents
modulateurs de la réparation.
En effet, la modulation, plus précisément l'inhibition de l'activité
réparatrice de l'ADN d'une cellule est une voie thérapeutique du traitement
de cancers. On cherche ainsi à développer des molécules présentant des
30 propriétés d'inhibition de la réparation de l'ADN.
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/ER96100391
Aussi pourrait-ii etre très utile de tester de telles molécules, ce qui
permettrait de les cribler rapidement et de ne retenir que les plus efficaces
pour des études plus poussées.
C'est donc l'objet aussi de l'invention de proposer de mesurer la
s modulation, par une molécule ajoutée au mélange de réparation, de
l'efficacité de réparation d'un ADN prélésé, donnant un signal de réparation
significatif, en l'absence de ladite molécule.
De plus la présente invention permet par une rnise en oeuvre d'une
étape supplémentaire spécifique de traiter directement des cellules par un
10 produit chimique lésant et de déterrniner, toujours qualitativement et
quantitativement, les lésions subies par l'ADN de ladite cellule.
Le procédé contribue à simplifier ce type d'étude des lésions, il peut
être automatisé ce qui lui donne une connotation industrielle certaine, il
s'applique à tous types d'ADN et sur des quantités très réduites grâce à une
15 très grande sensibilité du test.
La rapidité de la réponse est également un avantage prépondérant,
notamment pour l'industrie, puisque l'ordre de grandeur est de quelques
heures.
La possibilité d'utilisation de marqueurs "froids" et la non nécessité de
20 recourir à des marqueurs "chauds" tout en la laissant possible est un
avantage supplémentaire. Ceci a pour corollaire l'emploi d'un matériel
spécifique pour la lecture certes, matériel qui correspond au marqueur
incorporé mais ces appareillages sont d'un usage courant et d'une mise en
oeuvre relativement simple pour l'homme de l'art, sans commune mesure
25 avec un appareil de cytométrie de flux.
Enfin, on peut noter comme avantage évident la possibilité d'analyser
simultanément un nombre d'échantillons beaucoup plus important, avec un
coefficient proche de 10.
On entend pour la suite de la description les définitions
30 complémentaires suivantes:
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96128571 PCI~/FR96100391
SucPort sensibilisé: tout support notamment solide y compris la
gélatine, ayant été traité par des substances présentant une très forte
affinité pour le matériel nucléique (ADN ou ARN).
Extrait cellulaire: extrait cellulaire partiellement purifié, composants
s purifiés et isolés avec recombinaison éventuelle au sein d'une
~ composition de certains de ces composants purifiés ou encore
composant obtenu par biologie moléculaire.
Marqueur: nucléotide modifié avec un marqueur radioactif ou non
radioactif, du type greffé chimiquement.
A cet effet, le procédé de détection qualitative et quantitative de
lésions sur de l'ADN, caractérisé en ce que les étapes sont réalisées
directement sur un support sensibilisé sur lequel l'ADN lésé est fixé:
. action d'une composition comprenant au moins un extrait cellulaire
possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant
des marqueurs,
. révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement
incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, et
. Iecture comparative par rapport à un échantillon de contrôle
lesdites étapes étant séparées par au moins une étape de lavage.
Plus précisément, le procédé se caractérise en ce qu'il comprend les
différentes étapes suivantes:
fixation de l'ADN cible sur un support sensibilisé,
. action d'une composition à tester comprenant au moins un produit
lésant,
. action d'une composition comprenant au moins un extrait cellulaire
possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant
des marqueurs, et
. révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement
incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, et
. Iecture comparative par rapport à un échantillon de contrôle
Selon un autre mode de mise en oeuvre, les étapes sont les suivantes:
CA 022l~493 l997-09-09
WO 96/28S71 PCT/ErR96/00391
. action d'une composition à tester comprenant au moins un produit
lésant,
fixation de l'ADN cible sur un support sensibilisé,
. action d'une composition comprenant au moins un extrait cellulaire
possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant
des marqueurs,
. révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement
incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, et
Iecture comparative par rapport à un echantillon de contrôle.
o L'invention propose aussi un procédé de rnesure de l'effet de
modulation de l'effet inhibiteur de la réparation d'au moins une molécule, qui
comprend les étapes suivantes:
préparation d'ADN lésé fixé sur un support sensibilisé,
. action d'une composition comprenant au moins un extrait cellulaire
possédant une activité réparatrice sur cet ADN, ledit extrait contenant
des marqueurs, et conjointement action d'au moins une molécule ayant
un pouvoir modulateur de l'action de réparation,
. révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement
incorporés dans l'ADN, en cas de réparation, et
. Iecture comparative par rapport à un échantillon cle contrôle.
Selon un mode de réalisation tout à fait préférentiel, le support est un
support solide, notamment une plaque de microtitration à puits ou des billes
de "latex" .
Le support est sensibilisé par des substances présentant une très forte
25 affinité vis à vis de l'ADN de façon à provoquer une fixation de cet ADN par
adsorption .
Ces substances sont choisies parmi les substances cationiques ou les
protéines, au pH utilisé pour l'adsorption du matériel nucléique.
Les substances cationiques sont plus particulièrement choisies parmi
30 les polyacides aminés de type polylysine ou polyargine, lévogyre, dextrogyre
ou lévogyre/dextrogyre.
CA 022l~493 l997-09-09
WO 96/28571 . PCT/IJR96/00391
Dans le cas de la polylysine, son poids moléculaire retenu se situe dans
la fraction 15 000 à 30 000 Daltons.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier, la sensibilisation du
support est réalisée par incubation en tampon phosphate 10mM, chlorure de
sodium 137 mM et un pH compris entre 6,5 et 8, plus particulièrement 7,2.
De façon préférentielle, le produit lésant, dans le cas d'un produit
lésant chimique, est dilué dans une solution tamponnée et bioactivé.
Un exemple de solution de lavage est une solution en tampon
phosphate 10 mM, chlorure de sodium 137 mM et un tensioactif non ionique,
par exemple du "Tween 20" en proportion égale 0,05 à 0,15 % et plus
particulièrement 0,1 %.
Selon l'invention le procédé peut aussi être mis en oeuvre pour la
capture de l'ADN issu directemerlt à partir de cellules vivantes traitées et
comprend les étapes suivantes:
lS . action d'un produit lésant directement sur les cellules,
Iyse des cellules dans une solution,
fixation de l'ADN sur un support sensibilisé.
Cette Iyse des cellules dans la solution adaptée s'effectue en présence
du support sensibilisé.
A partir de cellules vivantes traitées, le procédé se caractérise aussi
par les étapes suivantes:
~ ac~ion d'un extrait cellulaire possédant une activité réparatrice sur cet
ADN, ledit extrait contenant des marqueurs,
. révélation directe ou indirecte des marqueurs éventuellement
incorporés dans l'ADN, en cas de réparation,
lesdites étapes étant séparées par au moins une étape de lavage.
Le présent procédé de détermination des lésions d'ADN et le procédé
associé de capture et de purification de l'ADN en vue de la détermination des
' lésions, ainsi que la détermination et la mesure de l'effet modulateur de la
30 réparation sont décrits ci-après, assortis d'exemples d'essais réalisés avec les
résultats obtenus.
CA 022l~493 l997-09-09
WO 96/28571 PCT/ER96/00391
Les graphes annexés permettent d'illustrer la description du procédé
selon l'invention en association avec les résultats indiqués dans la descriptionqui va suivre, et les figures de ces dessins représentent:
figures 1 A à 1 F, un schéma illustrant les étapes du procédé, les
s figures 1 A', 1 B' et 1 C' correspondant à une variante de
l'ordonnancement de certaines étapes,
. figure 2, graphe du rapport du taux de capture de l'ADN par
adsorption en pourcentage sur un support rigide sensibilisé à la
polylysine par rapport à un support non sensibilisé,
lo . figure 3, graphe de la cinétique de réparation d'ADN lésé,
. figure 4, graphe du rapport de réparation en fonction de la quantité
d'extrait cellulaire,
. figure 5, graphe du rapport de réparation en fonction de la
concentration de KCI,
1S . figure 6, graphe du rapport de réparation en fonction de différentes
doses de produit lésant, en l'occurrence des rayons ultraviolets,
. figure 7, graphe du rapport de réparation en fonction de la dose de
méthylmethanesulfonate ~MMS) ajouté avant ou après adsorption de
l'ADN dans le puits,
. figure 8, graphe du rapport de réparation en fonction de la dose de 1-
méthyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine (MNNG) incubé avec l'ADN dans
un solvant organique avant adsorption dans le puits, et
. figure 9, un graphe montrant les valeurs de l'effet inhibiteur de
différentes molécules sur l'activité de réparation d'extraits cellulaires.
Les essais menés à l'aide du procédé selon l'invention ont consisté à
réaliser les étapes suivantes a/ à f/, représentées schématiquement sur les
figures 1 A à 1 F et détaillées ci-après:
Figures lA - lB: préparation et adsorption de l'ADN sur des puits sensibilisés
30 a/ Un plasmide 2959 bp résistant à l'ampicilline est préparé par la méthode
de Iyse alcaline à partir d'Escherichia coli, JM109, suivi, par exemple, par
une chromatographie sur colonne Qiagen..
CA 0221~493 1997-09-09
WO ~6/28571 PCT/FRg6/00391
11
b/ Préparation d'un support solide, en l'occurrence une plaque de
microLilralion à puits du type Microlite ll, commercialisée par la société
Dynatech .
Les puits de cette plaque sont ensuite sensibilisés pendant une nuit avec
50 ~lL de poly-L-lysine dans la fraction moléculaire comprise entre 15 000
et 30 000 Daltons dans une solution tampon phosphate avec un sel, ceci à
une température de 4~C.
Cette plaque est lavée deux fois avec une solution de lavage comprenant
un tampon phosphate avec un sel auquel on rajoute un tensioactif non-
ionique, du "Tween 20", dans une proportion de 0,1%.
Pour la fixation de l'ADN sur la plaque, la solution d'ADN est soumise à
une agitation douce pendant 30 minutes à 30~C, puis lavée deux fois avec
une solution de lavage identique à la solution de lavage des plaques
15 Figure 1C: formation de dommages à l'ADN par l'action du produit lésant
c/ Génération de lésions sur l'ADN ainsi adsorbé, avec un rayonnement
ultraviolet germicide à 254 nm. Le taux d'émission est mesuré par un
dosimètre pour rayonnement ultraviolet et le rayonnement est émis avec
des puissances comprises entre 50 et 600 J/m2.
20 Des agents alkylants sont dilués en tampon phosphate 10 mM, au pH 7,2
et incubés avec l'ADN pendant 1 heure à 30~C.
Figures lA' - lB': Préparation et action d'un produit lésant sur de l'ADN
a'/ On peut aussi en variante inverser les étapes de lésion et de fixation. Un
25 plasmide est préparé de façon identique à celle du a/.
b'/ Durant cette phase, I'ADN lésé est obtenu soit en incubant en phase
aqueuse ou dans un solvant organique de l'ADN plasmidique avec au
moins une substance génotoxique, soit en purifiant l'ADN génomique de
cellules prétraitées avec au moins une substance génotoxique. Par
30 exemple, du monoazide d'éthidium est dissout dans une solution 10 mM
Tris-HCI, 1 mM acide éthylènediamine tétra-acétique et incubé avec
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/ER96/00391
12
I'ADN (80,ug/ml) avec différents rappor~s molaires (drogue/nuciéotide)
compris entre 1.10-3 et 4.10-2 pendant 10 minutes et soumis ensuite
pendant 270 secondes à l'action d'une lampe ballon de 500 W.
A la suite de ce traitement chimique, I'ADN est, par exemple, précipité
5 à l'éthanol.
Figures lC': adsorption de l'ADN sur des puits sensibilisés
c'/ Au cours de cette étape, I'ADN lésé est fixé sur les puits d'une plaque
10 support sensibilisée de microtitration de la même façon qu'à l'étape b/.
Les étapes suivantes sont communes aux deux modes de réalisation qui
viennent d'être présentés.
15 Figure 1 D: réaction de réparation et incorporation de DIG-11 dUMP aux sites
de dommage, en présence d'un extrait cellulaire
d/ Réparation en présence d'un extrait cellulaire et d'agents de type connu,
comprenant, par exemple, pour un volume de milieu réactionnel (MR), de
50 1ll:
. 150 ~9 d'extraits protéiniques extraits de cellules HeLa,
. 50 mM de KCI dans un milieu tampon contenant 40 mM Hepes-
KOH (pH 7,6),
. 5 mM de MgC12, 0,5 mM de DTT, 10 mM de phosphocreatine, 2,5
~19 de phosphocréatine kinase, 2 mM EGTA, 3,4% de glycérol, 18
~l9 d'albumine sérique bovine, 0,4 ~M de dGTP, de dCTP, de dATP
et de DIG- 1 1 dUTP.
Cette réparation est obtenue par une incubation de 3 heures à 30~C et les
puits sont lavés trois fois avec la même solution que précédemment.
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96128571 PCTIFR96/00391
13
Figure 1 E: incubation avec un anticorps anti-DlG conjugué à la phosphatase
alkaline et reconnaissance de l'anti-DlG par l'anticorps suivie d'une incubationavec un agent luminescent
e/ L'ADN marqué est incubé 30 minutes avec un anticorps anti-digoxygénine
couplé associé à une phosphatase alcaline diluée à 1/10 000 dans un
tampon phosphate avec sel, plus 0,025% d'albumine sérique bovine
acétylée et 0,1% de "Nonidet P40". Les plaques sont lavées trois fois avec
la même solution que précedemment.
lO Figure lF: émission de la lumière due à la déphosphorylation enzymatique du
"Lumi-Phos 530"
f/ Incubation avec un substrat chimioluminescent, "Lumi-Phos 530", pendant
15 minutes et mesure de la lumière émise avec un luminomètre
(nLuminoskan") et exprimée en unités relatives de lumière (Relative Light
Unit, RLU).
On a pu constater que les plaques sensibilisées avec de la polylysine
permettent l'adsorption d'ADN alors que les plaques test non sensibilisées ne
retiennent pas l'ADN après lavage. Ceci est indiqué sur la figure 2, sur
laquelle la courbe avec les carrés représente le pourcentage d'accrochage de
20 I'ADN sur les plaques avec polylysine tandis que la courbe avec des cercles
représente le pourcentage d'accrochage de l'ADN sur les plaques non
sensibilisées .
Ces courbes sont obtenues par une mesure de la radioactivité utilisant
des marqueurs isotopiques, lors d'une manipulation spécifique visant à
25 déterminer uniquement les possibilités d'accrochage de l'ADN. Ces courbes
sont le reflet de la moyenne de trois essais successifs.
La saturation de la plaque avec une solution de 50 ~I d'ADN est
atteinte avec une concentration de 1 à 2 ~g/ml d'ADN correspondant à
sensiblement à 40-80 ng d'ADN fixé.
Ainsi, la fixation sur un support solide tel qu'une plaque de
microtitration à puits autorise maintenant les réactions de réparation
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/FR96/00391
14
permettant de quantifier la capacité de l'ADN à être réparé, comme cela est
maintenant décrit.
La présence de lésions de l'ADN est détectée par la réaction de
réparation par excision adaptée en milieu in-vitro.
Après incubation de l'ADN lésé et de l'ADN non lésé en présence d'un
extrait cellulaire, on peut déterminer le rapport de réparation par
chimioluminescence .
Dans toutes les figures faisant état d'un rapport de réparation, celui-ci
est défini comme le rapport du signal brut luminescent obtenu pour une
o condition "test" sur le signal obtenu avec un ADN contrôle non traité.
Les essais ont consisté à faire varier les parametres suivants: temps
d'incubation, importance de la lésion, concentration de l'extrait cellulaire,
concentration en sels, ou quantité d'ADN, de façon à optimiser la réaction de
réparation .
Ainsi, la cinétique de réparation avec un extrait cellulaire HeLa,
représentée par le graphe de la figure 3, montre que le maximum de
réparations est obtenu en 3 heures, durée à l'issue de laquelle la cinétique de
réparation stagne.
Ainsi, avec un ADN ayant été soumis à une dose de 300 J/m2 de
20 rayonnement ultraviolet, le maximum de synthèse de réparation de lésions
est obtenu en présence de 300~9 d'extrait cellulaire, comme le confirme la
figure 4.
Afin d'optimiser encore la synthèse réparatrice, la figure 5 montre des
essais avec différentes concentrations de sel, en l'occurrence du chlorure de
25 potassium, KCI. La courbe présente un maximum avec 70 mM de KCI.
Pour la suite des essais, les valeurs optimales retenues sont:
. durée d'incubation: 3 heures,
~ quantité d'extrait cellulaire: 150 ~g, et
. 70 mM de KCI.
Le procédé selon l'invention consiste ensuite à révéler les lésions ainsi
générées et deux possibilités sont offertes, la prerrlière dans laquelle les
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCI'/FR96/00391
lésions sont générées préalablement à l'étape d'adsorption et, la seconde,
dans laquelle les Iésions sont générées postérieurement à l'étape
d ' adsorption .
Sur la figure 6, la courbe avec les carrés correspond à la soumission de
s l'ADN au rayonnement ultraviolet avant l'étape d'adsorption et la courbe
- avec les cercles correspond à la soumission de l'ADN au rayonnement
ultraviolet après l'étape d'adsorption.
Des résultats similaires ont été trouvés en ce qui concerne le rapport
de réparation des lésions.
0 De façon complémentaire, d'autres essais ont été menés en utilisant
comme produit lésant des composés génotoxiques qui conduisent notamment
à la formation d'adduits.
De la même façon que pour un traitement de l'ADN aux rayons U.V., Ia
formation de lésions de type adduits détectées par le test selon l'invention
lS peuvent avoir été produites sur de l'ADN adsorbé dans le puits ou
préalablement à l'adsorption comme cela est montré sur les figures 7 et 8.
Sur la figure 7, on a traité l'ADN avec un agent alkylant le
méthylméthanesulfonate (MMS) qui induit des lésions par fixation covalente.
Dans le cas de la courbe avec les carrés, on a traité l'ADN une fois
20 qu'il a été adsorbé dans le puits et dans le cas de la courbe avec les ronds,on a traité préalablement l'ADN en phase liquide avec le MMS puis on l'a
adsorbé dans le puits.
On peut constater que dans cet exemple, une mise en contact de
l'ADN avec le MMS avant l'étape d'adsorption permet un efficacité de lésions
25 supérieure comme en témoigne le rapport de réparation.
Sur la figure 8, on a testé l'effet-dose du 1-méthyl-3-nitro-1-nitroso-
guanidine (MNNG), agent génotoxique connu, de référence. Dans ce cas, on
a préincubé l'ADN cible avec des doses croissantes de MNNG dissous dans
du diméthylsulfoxide (DMSO). Ceci montre.que l'on peut détecter de façon
30 dose-dépendante ce génotoxique.
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/FR96/00391
16
On peut remarquer que le procédé sur plaque selon l'invention est un
test d'une grande sensibilité puisque la détection est opérée sur 40 ng d'ADN
au lieu de 200 à 300 ng, dans le cadre d'un travail en tube.
De plus, le test selon l'invention peut être automatisé.
Ce même test peut également être utilisé pour cribler des composés
génotoxiques, certains d'entre eux pouvant être activés par des enzymes. De
même, on peut tester l'action de composés oxydants comme l'effet inhibiteur
d'agents antioxydants.
Des essais ont été menés avec des lésions générées par deux types
l0 d'agents oxydants:
- du peroxyde d'hydrogène H202,
- du bleu de méthylène.
a/ Le peroxyde d'hydrogène est connu pour produire des radicaux
libres par la réaction de FENTON. Des plaques de microtitration à
puits comportant de l'ADN fixé sont incubées pendant différentes
périodes de temps avec des quantités variables de peroxyde
d'hydrogène dilué en solution tampon phosphate à 37~C. Des essais
ont montré que le rapport maximum de réparation est obtenu pour
une quantité de 0,27 mM de peroxyde d'hydrogène, soit une dilution
de 1,6.10 de H202 à 30 %. Les plaques sont ensuite rincées deux
fois avec la même solution de lavage que précédemment utilisant le
tensioactif non ionique "Tween 20" à raison de 0,1%.
b/ Le bleu de méthylène est connu pour libérer par photoactivation, un
atome d'oxygène.
Pour les essais à suivre, le bleu de méthylène a été soumis à un
rayonnement en lumière visible pendant 20 minutes avec deux
lampes ballons de 100 W, une distance entre les lampes et les
plaques support de 30 cm et une concentration de bleu de
méthylène de 1 5 ng/ml .
L'étape de réparation des lésions est réalisée suivant l'enseignement
indiqué ci-avant, à l'aide du même milieu réactionnel MR.
CA 022l~493 l997-09-09
WO 96/28571 PCT/FR96/00391
17
De la même façon, les plaques, après action du milieu réactionnel MR
sont lavées trois fois avec la solution de lavage précédemment indiquée et
incubées 15 minutes avec un substrat chimioluminescent ("Lumi-Phos 530").
- Connaissant les actions de tels oxydants sur l'ADN, les essais ont
s permis de tester l'efficacité de composés antioxydants en analysant la
luminescence correspondant à la réparation qui doit être d'autant plus faible
que l'antioxydant est efficace.
Pour le premier essai, comme la production de radicaux libres à partir
du peroxyde d'hydrogène requiert la présence de fer, il a été utilisé un
0 chélatant métallique, mésylate déferroxamine, afin de vérifier si la production
de lésions peut être inhibée. On a pu constater que 10 ~M de ce chélatant
métallique inhibent totalement les effets du peroxyde d'hydrogène.
Pour le second essai, avec le bleu de méthylène, on a calculé l'activité
relative AR d'un antioxydant qui est égale à:
(contrôle RLU - test RLU)
AR =
(contrôle RLU - référence RLU)
formule dans laquelle:
* contrôle RLU correspond à la valeur du signal du bleu de méthylène seul
soumis au rayonnement,
test RLU correspond à la valeur du signal du bleu de méthylène soumis au
rayonnement ultraviolet plus une molécule antioxydante, et
* référence RLU correspond à la valeur du signal de la molécule antioxydante
seule.
Les calculs montrent ainsi que cela est regroupé dans le tableau
suivant que la silymarine présente une haute activité antioxydante tandis que
le plasma et la vitamine A n'ont aucun effet antioxydant.
silymarine A.R. A.R. vitamine C A.R. A.R.
(m M) (avec BM)(avec H202) (~M) (avec BM)(avec H202)
105 0,44 N D 1o5 0,22 0,12
104 0,47 N D 1o4 0,39 0,20
10-3 0,43 N D 103 0,21 0,19
CA 022l~493 l997-09-09
WO 96/28S71 PCTJFR96/00391
18
1 o-2 0,49 ND 1 o 2 0,24 0,30
1 o-l o,94 0.66 1 o-l 0,28 0,45
-1,2 (a) 0,56
Vitamine A A.R. A.R. Plasma A.R. A.R.
(~LM) (avec BM)(avec Hz02) (dilution)(avec BM) (avec H202)
10~4 0,07 0,06 3.10~~ 0 0
-3 0,24 0,15 1.1 o-5 0,07 0,40
1 o-2 0,25 0,20 2.10-5 0,12 0,69
0~1 0,14 0,21 5.10-5 0 0,85
0,21 0,18 2.10-4 0 0,95
0,18 0,20 4.10~4 0 0,98
(a) une valeur négative signifie que la va eur test est supérieure à la valeur référence
ND: non déterminé
BM: bleu de méthylène
Au cours de l'étape de réparation, voir figure lD, des molécules pour
s lesquelles on cherche à mettre en évidence un effet modulateur de la
réparation peuvent être ajoutées. ces molécules sont préférentiellement
diluées dans l'eau ou dans du diméthylsulfoxyde (DMS0).
Sur la figure 9, on a montré la mesure de l'effet inhibiteur dose-
dépendant de la réparation par deux molécules ant,itumorales poisons de
o topoisomérase ll, à savoir l'actinomycine D (courbe avec les carrés) et la
doxorubicine (courbe avec les triangles) sur des extraits issus de cellules
HeLa.
Par contre, I'acide nalidixique, inhibiteur de la sous-unité gyrA de la
gyrase d'E.coli (courbe avec les ronds) est sans effet sur l'activité de ces
lS extraits issus de cellules HeLa.
Ceci montre qu'au moyen du procédé selon l'invention, de façon
simple et surtout très rapide, on peut tester l'effet d'un agent particulier ou la
combinaison d'agents modulant l'activité réparatrice d'extraits cellulaires.
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/li'R96/00391
19
On peut aussi capter l'ADN directement à partir de cellules ayant
subies l'action d'un composé susceptible d'induire des lésions sur l'ADN de
ces cellules, par exemple un génotoxique, ou un mélange de composés.
Parmi les composés, on peut citer les produits oxydants car ils
s génèrent des radicaux libres de type oxygbne singulet 102, et le radical
hydroxyl OH-, comme cela a été indiqué lorsque les tests sont produits
directement sur de l'ADN fixé sur support solide.
On opère de la même façon que précédemment pour l'analyse des
lésions et la détection mais le problème posé est la capture de l'ADN.
Selon l'invention, les cellules sont donc soumises à l'action du
composé à tester, par exemple un agent génotoxique puis, après une durée
d'incubation variable, en présence de cet agent génotoxique, les cellules sont
incubées en présence d'un agent de Iyse directement dans les puits d'une
plaque de microtitration sensibilisée, afin de capter l'ADN ainsi généré, qui
15 doit être analysé.
On peut citer comme composition de Iyse une solution en tampon
phosphate 10 mM, chlorure de sodium 137 mM, urée 5 à 20%
(préférentiellement 10%), bromure d'hexadecyltrimethyl ammonium 0,1 à
0,5% (préférentiellement 0,2%), protéinase K, de 200 à 500 ~g/ml.
L'étape de Iyse est comprise entre 30 minutes et 2 heures.
On a ainsi pu fixer de l'ADN sur un support solide, concomitamment à
la Iyse des cellules, et cet ADN peut ensuite subir toute analyse nécessitant
sa mise sur support.
En particulier, on peut analyser les lésions éventuellement subies, en
2s appliquant à cet ADN l'étape de réparation et de marquage à froid ou à chaud
et l'étape de révélation qualitative et quantitative, telles qu'elle viennent
d'être décrites précédemment dans la description.
Dans ce cas, les lavages sont effectués de la même facon que
précédemment, avec une solution adaptée, puis les puits de la plaque sont
30 incubés avec un extrait cellulaire en vue de permettre une éventuelle
réparation.
CA 0221~493 1997-09-09
WO 96/28571 PCT/FR96/00391
La révélation, notamment par chimioluminescence dans le cas d'un
recours à des marqueurs froids de ce type, permet l'étude des lésions
générées sur l'ADN lorsque la cellule qui le porte est soumise à l'action d'un
composé à tester.
s Ce procédé de capture et de fixation de l'ADN sur un support solide
est utile pour de nombreuses applications.
En effet, il s'applique plus généralement:
. à la capture et à la purification d'ADN ou d'ARN en vue d'amplifier
enzymatiquement des séquences nucléotides particulières,
. à la capture d'ADN de cellules soumises à des agents génotoxiques
en vue d'une analyse par un test UDS avec marqueur froid ou
encore,
. à la capture et à l'analyse des coupures sur l'ADN de cellules
soumises à un stress chimique ou physique.
ls Un tel procédé présente un intérêt pris isolément et plus
particulièrement dans le cas du procédé d'analyse précédemment indiqué. On
remarque qu'il nécessite une faible de quantité de matière initiale, ainsi,
I'ADN génomique provenant de 104 à 105 cellules peut être capté et les
lésions quantifiées lorsque la cellule a été traitée par un génotoxique
20 quelconque.
