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WO 96/29400 PCT/FRg~100S~7
PROCEDE DE REGUIaTION DE L'EXPRESSION D'~N G~N~ DANS ~N
BAC~LOvl~uS, PAR ~JN SITE DE FIXaTION D'~N ~5~ r-L~-:u~ DE
L'ACIDE KlsLlNoIQ~E~ ET Vl~ ~LJK PO~R LA MISE EN Cl~;uv~;
D~DIT PROCEDE.
La présente Invention est relative à de
nouveaux vecteurs d'expression obtenus à partir de
baculovirus.
Les baculovirus, representes par le virus de
la polyedrose nucleaire Autographa californica (AcMNPV),
possèdent plusieurs promoteurs, acti~s à di~érentes
phases du cycle de replication virale. Certains de ces
promoteurs sont utilises en génie génétique pour
contrôler l'expression de gènes héterologues insérés dans
le genome du baculovirus. Parmi les plus couramment
employés, on citera deux promoteurs très tardi~s ~orts :
celui de la polyedrine (polh) et celui du polypeptide
P10, qui ne sont actifs qu'en fin de cycle d'in~ection,
apres la replication du génome viral, et qui permettent
d'exprimer a un niveau élevé les genes placés sous leur
contrôle.
Les promoteurs polh et P10 sont décrits de
maniere détaillée dans les publications suivantes
POSSEE et HOWARD [Nucleic Acid Research, vol. 15, p.
10233-10248 (1987)], pour le promoteur de la polyédrine,
et QIN et al. [J. Gen. Virol. vol. 70, p. 1273-1279,
(1989)] pour le promoteur P10. On dé~init généralement
comme : ~promoteur de la polyédrine" la sé~uence
localisee entre les positions (-71 et +1) dé~inies par
rapport au A(+1) de l'ATG de la polyédrine, et comme :
"promoteur P10" la séquence localisée entre les positions
(-70 et +1) dé~inies par rapport au A(+1) de l'ATG du
polypeptide P10.
Pour obtenir, a partir d'un baculovirus, un
vecteur capable d'exprimer un gene étranger sous contrôle
transcriptionnel d'un promoteur dudit baculovirus, l'on
procede généralement, selon des methodes connues en
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elles-mêmes, à la construction d'un vecteur de transfert
renfermant ledit promoteur, puis à la recombinaison avec
l'ADN du virus sauvage, et enfin à la s~lection des
recombinants.
Lors du cycle de réplication du baculovirus
s'expriment d'abord les gènes precoces : la transcription
de ces gènes fait intervenir l'ARN polymérase II de la
cellule-hôte.
Ultérieurement, les gènes tardifs et très
tardifs comme polh et Pl 0, sont transcrits par une ARN
polymérase particulière, d'origine au moins en partie
virale, insensible à l'a-amanitine.
Un motif A/GTAAG commun à tous les genes
tardi~s, constitue le site d'initiation de la
transcription. Ce motif est indispensable a la
reconnaissance de ces promoteurs par l'ARN polymérase et
donc à leur activité. Les mécanismes qui gouvernent
l'activation transcriptionnelle ne sont toutefois pas
encore précisément connus.
Des travaux precédents de l'équipe des
Inventeurs ont montré qu'il est particulierement
intéressant, pour augmenter le niveau d'expression d'un
gene hétérologue placé sous contrôle de l'un des deux
promoteurs très tardifs forts polh ou P10, de construire
un baculovirus dans lequel un seul de ces deux promoteurs
tardifs forts est inactivé, et de faire exprimer ledit
gène sous contrôle du promoteur restant.
Ce principe a servi de base à la construction
de plusieurs baculovirus modifiés [D~m~n~P Européenne
n~ 91 913 605.1, aux noms de l'INSTITUT NATIONAL DE LA
RECHERCHE AGRONOMIQUE (I.N.R.A.) et du CENTRE NATIONAL DE
LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (C.N.R.S.) ; CHAABIHI et al.,
J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)], dans lesquels soit le
promoteur P10 (baculovirus dénommé AcSLP33, par exemple),
soit le promoteur de la polyédrine (baculovirus denomme
AcSLP10, par exemple) est inactive par délétion .
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Dans le cadre de la poursuite de leurs travaux
sur la régulation de 1'expression chez les baculovirus,
les Inventeurs ont eu l'idée d'étudier l'in~luence de la
séquence codante du gene P10 sur l'expression de celui-
ci. Dans ce but, ils ont réalisé, a partir du baculovirussauvage AcMNPV, des constructions comprenant le gene
rapporteur CAT inséré a l'une des positions +16, ~150, ou
+230 de la séquence codant pour la P10 (ces positions
sont dé~inies par rapport au A (+1) du codon d'initiation
ATG de la P10), et ont étudié l'expression simultanée du
gene rapporteur CAT et du gène de la polyédrine, dans les
virus recom~inants (dénommés respectivement AcCAT+16,
AcCAT+150, et AcCAT+230) obtenus, par rapport au
baculovirus sauvage AcMNPV et au baculovirus modifié
AcSLP33 (dans lequel le promoteur P10 est inactivé).
Les virus recombinants AcCAT+16, AcCAT+150, et
AcCAT+230, sont schématisés a la Figure 1.
Les Inventeurs ont ainsi pu constater que
lorsque le gene rapporteur est inséré en +16 (cette
insertion s'accompagne de la délétion d'une partie de la
séquence codant pour la P10), l'expression du gène
rapporteur est ~aible et celle du gene de la polyédrine
augmente tres significativement, bien que le promoteur de
la P10 soit intact, jusqu'à atteindre un niveau
comparable a celui observé dans un virus ou le promoteur
de la P10 est inactivé, tel que le virus AcSLP33.
En revanche, lorsque le gene rapporteur est
inséré plus en aval (+1~0 ou +230)j l'expression dudit
gène augmente, et celle de la polyédrine ~;minlle pour
revenir a un niveau de base comparable a celui observé
dans le baculovirus sauvage AcMNPV.
D'autre part, au cours d'autres
expérimentations entreprises indép~n~mm~nt, les
Inventeurs ont cherché à exprimer les iso~ormes a et ~ du
récepteur hl~m~i n de l'acide rétinoïque (hRAR) dans des
cellules d'insectes, et ont dans ce but construit à
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partir de baculovirus sauvages AcMNPV, des baculovirus
recombinants qui expriment respectivement lesdites
isoformes a ou y sous contrôle du promoteur de la
polyédrine. Or, au cours de ces expérimentations ils ont
observé une surexpression inattendue du gène Pl O dans ces
baculovirus.
Cette activation se manifeste par un taux
d~ARNm qui est 2 fois supérieur au témoin (constitué par
le baculovirus sauvage AcMNPV,) dans le cas du récepteur
a, et 5 fois supérieur dans le cas du récepteur y:: il
s'agit donc d'une activation au niveau transcriptionnel.
D'autre part cette activation est observée non
seulement lors de la transfection d'une cellule avec un
virus double-recombinant, mais également lors de la co-
transfection d'une cellule avec deux plasmides (l'unexprimant un RAR, et l'autre portant un domaine RARE
localisé dans le gène P10) ; il s'agit donc d-'une trans-
activation.
Les Inventeurs ont établi un rapprochPm~nt
entre les résultats des deux séries d'expérimentations
relatées ci-dessus et ont procédé à l'analyse de la
séquence de la région P10, afin de rechercher llexistence
éventuelle de séquences apparentées à celles constituant
des sites de fixation pour des récepteurs nucléaires, et
en particulier pour des récepteurs rétinoïques.
Les récepteurs de l'acide rétinoïque (RARs)
appartiennent a la famille des "récepteurs nucléaires'l,
qui comprend également, par exemple, chez les vertébrés,
les récepteurs de la vitamine D3, ou les récepteurs
thyroïdiens. D'autres récepteurs, dénommés RXRs, et qui
sont comme les RARs, activés par l'acide rétinoïque ou
par d'autres rétinoïdes ont également été décrits.
On sait que les récepteurs nucléaires sont
capables d'activer la transcription d~un gene-cible.
Cette activation fait intervenir d'une part la liaison de
ces récepteurs nucléaires avec leur ligand spécifique, et
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d'autre part leur fixation à l'ADN, qui implique la
reconnaissance de courtes séquences consensus d'ADN
t ~nomm~es ~ elements de réponse ~ généralement situées en
amont du gène-cible. Les RARs et RXRs reconnaissent ainsi
5 des séquences consensus qui sont répétées une ou
plusieurs ~ois, en tandem ou en palindrome, et
définissent des portions d'ADN ~Pnomm~es respectivement
éléments RARE ou RXRE [GORDMAN et al. Mol. Cell. Biol. 2,
1044-1051 (1982)]. Di~érentes séquences consensus ont
10 été identifiées. Par exemple, les éléments de réponse au
recepteur RAR~, qui sont décrits dans la D~m~n~ PCT
WO 91/07488, comprennent des répetitions en t~n~m de la
séquence GTTCAC ; la Dem~n~e PCT WO 92/16658 décrit des
éléments de réponse RXRE, et en particulier un élément
15 RXRE obtenu à partir du promoteur du gène CRBPII de rat,
qui comprend des répétitions en tandem de la séquences
AGGTCA.
Les éléments de réponse aux récepteurs
nucléaires ont une spécificité variable. Certains, comme
20 les éléments de réponse au récepteur de l'hormone
thyroïdienne (TRE) répondent non seulement à leur propre
récepteur mais également aux RARs et aux RXRs. D'autres
sont plus spéci~iques, comme les éléments de réponse au
récepteur RAR~, qui ne répondent que faiblement aux RXRs.
25 D'autres, comme l'élément RXRE qui est décrit dans la
D~m~n~ PCT WO 92/16658 peuvent ~ixer des récepteurs RAR
ou RXR, mais seuls ces derniers provoquent une réponse
qui entraîne l'activation du promoteur placé en aval de
cet élément RXRE. Cette trans-activation par les RXRs est
30 bloquée en présence de RARs.
Il existe également chez les insectes des
protéines voisines des RARs ; il s'agit en particulier du
récepteur normonal de l'ecdysone (EcR) et de la protéine
USP de la Drosophile. ~a Demande PCT WO 92/14695 décrit
35 un récepteur de type RXR, dénommé XR2C, obtenu à partir
de la drosophile.
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Il a été proposé de placer des el~ments de
réponse aux RARs ou aux RXRs en amont du promoteur d'un
gene, à une distance dudit promoteur comprise entre 3Opb
et lOOOOpb, a~in d'obtenir l'activation dudit gène par
1'intermédiaire de récepteurs RAR ou RXR exprimés dans la
même cellule. Par exemple, la Demande PCT WO 91/07488
propose l'utilisation des elements de reponse au
recepteur RAR~, pour activer la transcription de gènes
dans des cellules de mammifères. La D~m~n~ PCT WO
92/16658 propose l'utilisation des elements de réponse
RXRE qu'elle décrit pour étudier la trans-activation de
gènes par des récepteurs RXR, et le blocage de cette
trans-activation en présence de récepteurs XRA dans des
cellules de mammifères, d'oiseaux ou d'insectes. La
D~m~n~ PCT WO 92/14695 mentionne plusieurs éléments de
réponse qui seraient utilisables avec le récepteur XR2C ;
en ~ait, elle ne décrit l'utilisation de ce récepteur
qu'avec un élement de reponse TRE place en amont du
promoteur ADH de drosophile.
L~analyse de la séquence de la région P10,
e~ectuée par les Inventeurs a révele l'existence dans le
gène de la P10, d'une séquence intragénique
GTTGACAGTGTTCA, similaire à une séquence consensus
reconnue par les RARs, et constituant donc un élément
RARE putati~. Cette séquence est localisée, chez AcMNPV
de type sauvage, en position +61 par rapport au A(+1) du
codon d'initiation ATG de la P10.
Des expériences complémentaires e~ectuées par
les Inventeurs ont permis de montrer que l'activation du
gène P10, ou d'un gène rapporteur placé sous contrôle
transcriptionnel du promoteur P10, en présence du produit
d'un gène RAR placé sous contrôle du promoteur de la
polyédrine, intervient à condition que le domaine de type
RARE localisé dans le gène P10 soit présent. En outre,
cette activation intervient également lorsque le domaine
de type RARE est enlevé de sa position initiale et
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replacé dans une autre position a proximité du promoteur
P10, en amont ou en aval de ce promoteur. En~in, si l'on
place, de la même ~acon, le ~o~;ne de type RARE a
proximité d'un autre promoteur, on observe l'activation
de cet autre promoteur. Dans tous les cas, cet élément
RARE est acti~ qu'il soit placé en amont ou en aval du
promoteur, et quelle que soit son orientation par rapport
a celui-ci.
L'analyse de séquence du gene Pl O chez les
baculovirus Choristoneura fumiferana NPV et Bombyx mori
NPV révèle la conservation du moti~ RARE. Ces baculovirus
peuvent donc, au même titre que AcMNPV, être utilisés
pour la mise en oeuvre de la présente Invention.
La mise en évidence par les Inventeurs, de
cette séquence intragénique de type RARE, et de son rôle
e~ecti~ dans la régulation de l'expression du gène P10,
permettent de proposer de nouveaux moyens de régulation
de l'expression de gênes hétérologues codant pour des
protéines d'intérêt, sous contrôle de promoteurs de
baculovirus.
La présente Invention concerne ces moyens de
régulation, qui comportent plusieurs variantes.
Selon une première variante de l'Invention,
l'activation d'un promoteur de baculovirus dans une
cellule-hôte, en particulier d'un promoteur tardif ~ort
tel que le promoteur P10 ou polh est obtenue en présence
du produit d'un gène RAR dans la même cellule-hôte, et
d~une séquence de type RARE, située en cis et à proximité
dudit promoteur de baculovirus.
Au sens de la présente Invention, on considère
qu'une séquence RARE est ~'à proximité d~un promoteur" si
elle située en aval ou en amont dudit promoteur, à une
distance comprise entre 10 et 10000 pb, de pré~érence
in~érieure à lOQOpb, du site d'initiation de la
transcription dudit promoteur.
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WO 96129400 PCTi~ C/00~1~7
La présente Invention a pour objet un procédé
pour réguler l'expression d'un gène placé sous contrôle
transcriptionnel d'un promoteur de baculovirus dans un
vecteur d'expression comprenant une séquence de type RARE
située à proximité dudit promoteur de baculovirus, lequel
procédé est caractérisé en ce que l'on procède à
l'expression dudit gène en présence du produit de
traduction d'un gène codant pour un récepteur hormonal du
type RAR.
Le promoteur de baculovirus peut par exemple
être le promoteur PlO, le promoteur polh, l'un des
promoteurs des gènes IE1, IEN, ou un promoteur
synthétique Avantageusement, il s'agit d'un promoteur
tardi~ ~ort, tel que le promoteur P10, ou le promoteur
15 polh.
De pré~érence, le récepteur hormonal du type
RAR est un récepteur RARa, un récepteur RAR~, ou un
recepteur RAR~, et la séquence d'ADN RARE est une séquence
(identifiée dans la liste de séquence en ~nnP~P sous le
numéro SEQ ID NO :1) répondant à la ~ormule générale
GTTGANNNNGTTCA ou N represente A, ou C, ou G ou T, et en
particulier la sequence GTTGACAGTGTTCA, identi~iee dans
la liste de sequence en annexe sous le numero SEQ ID
NO :2.
Selon un mode de mise en oeuvre pre~ere d'un
procede con~orme a l'Invention, l'expression du gene
place sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur de
baculovirus est e~ectuee en presence, dans la même
cellule, d'un gène exprimant un recepteur hormonal du
type RAR.
Le promoteur de baculovirus et le gene
exprimant un recepteur hormonal du type RAR peuvent être
portes par une même molécule d'ADN, ou bien par deux
molecules d'ADN di~erentes.
Le gène exprimant un recepteur hormonal du
type RAR peut être place sous contrôle d'un promoteur
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quelconque, pourvu que ledit promoteur s'exprime dans la
cellule hôte. Avantageusement, il est placé sous contrôle
d~un second promoteur de baculovirus ; ce second
promoteur et celui sous contrôle duquel est exprimé le
gène d'intérêt, peuvent être identiques ou dif~érents.
Pour la mise en oeuvre d'un procédé conforme a
l'invention, on peut par exemple utiliser des vecteurs
d'expression, connus en eux-mêmes, qui ne portent pas de
gene exprimant un récepteur hormonal du type RAR, et qui
comprennent au moins la partie du gène P10 constituée par
le promoteur dudit gène, suivi de la portion de séquence
codant pour la protéine P10 qui comprend la séquence
GTTGACAGTGTTCA, ledit promoteur et ladite séquence
codante étant disposés de manière identique à celle du
gène Pl O sauvage. Ces vecteurs sont utilisables en
présence, dans la même cellule hôte, d'une autre molécule
d'ADN exprimant un récepteur hormonal du type RAR.
On peut également utiliser de nouveaux
vecteurs recombinants, qui font partie de l'objet de la
présente Invention.
Des vecteurs recombinants con~ormes à
l'Invention, utilisables pour la mise en ~uvre d~un
procede dans lequel le promoteur de baculovirus et le
gène exprimant un recepteur hormonal du type RAR sont
portes par deux molécules d'ADN différentes, sont
constitués par des baculovirus recombinants, comprenant
une séquence d'ADN constituant un site de fixation pour
un récepteur hormonal du tvpe ~A~; placée à proxi mi té
d~un promoteur de baculovirus sous contrôle duquel on
veut exprimer un gène codant pour une protéine d'intérêt,
à condition que, si le promoteur de baculovirus est le
promoteur P10, et la séquence RARE est la sequence
GTTGACAGTGTTCA, ladite sequence soit située, par rapport
audit promoteur, à un emplacement di~férent de celui
qu'elle occupe dans le gène P10 sauvage, ou soit separee
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dudit promoteur par une séquence dif~érente de celle qui
la sépare du promoteur P10 sauvage.
D'autres vecteurs recombinants con~ormes à
l'invention, utilisables pour la mise en oeuvre d'un
procédé dans lequel le promoteur de baculovirus et le
gane exprimant un récepteur hormonal du type RAR sont
portés par la même molécule d'ADN, sont constitués par
des baculovirus recombinants, comprenant une séquence
d'ADN RARE constituant un site de ~ixation pour un
récepteur hormonal du type RAR, placée à proximité d'un
premier promoteur de baculovirus, sous contrôle duquel on
veut exprimer un gène codant pour une protéine d'intérêt,
et une séquence d'ADN codant pour un récepteur hormonal
du type RAR placee sous contrôle transcriptionnel d'un
second promoteur de baculovirus.
Le premier et le second promoteur peuvent par
exemple être le promoteur P10, le promoteur polh, les
promoteurs des gènes IE1, IEN, ou des promoteurs
synthétiques. On peut également utiliser comme second
promoteur une copie du premier promoteur.
Avantageusement, le premier promoteur est le
promoteur P10, et le second promoteur le promoteur polh,
ou bien une seconde copie du promoteur P10. De manière
également avantageuse, le premier promoteur est le
promoteur polh, et le second promoteur le promoteur P10,
ou bien une seconde copie du promoteur polh.
De pré~érence, le récepteur hormonal du type
RAR est un récepteur RAR~, un récepteur RAR~, ou un
récepteur RAR~, et la séquence d'ADN RARE est une séquence
telle que de~inie dans la liste de séquences en annexe,
sous le numero SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.
Avantageusement, la séquence d'ADN RARE est
placée en aval du premier promoteur.
Selon un mode de réalisation pré~éré, ces
vecteurs comprennent en outre au moins une séquence
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hétérologue codant pour la protéine d'intérêt que l'on
veut exprimer, placee sous contrôle transcriptionnel du
premier promoteur, ou au moins un site pour l'insertion
de ladite séquence.
Des vecteurs conformes à l'invention sont par
exemple les virus double-recombinants, obtenus à partir
des virus recombinants Ac+150 et Ac+230 décrits ci-
dessus, par insertion d'un gène codant pour un des
recepteurs RARa ou RAR~ de l'acide rétinoïque, sous
contrôle du promoteur de la polyédrine.
Selon une deuxième variante de l'invention,
une activation du promoteur polh similaire à celle
observée dans les vecteurs d'expression ou le promoteur
Pl O est inactivé est obtenue en utilisant des vecteurs
d'expression dépourvus de la totalité de la sequence
codant pour la protéine P10.
Conformément a cette deuxième variante, la
présente Invention a pour objet des vecteurs
recombinants, utilisables pour augmenter l'expression
d'un gène sous contrôle transcriptionnel du promoteur
polyédrine de baculovirus, et qui sont constitués par des
baculovirus modi~iés, comprenant un promoteur polyedrine
et un promoteur Pl O intacts et ~onctionnels, et ou le
voisinage du promoteur Pl O est depourw de toute sequence
constituant un site de ~ixation pour un recepteur
hormonal du type RAR.
Selon un mode de realisation pre~ere des
vecteurs con~ormes a cette deuxieme variante de
l'Invention, ils sont dépourvus de la totalité de la
séquence codant pour la protéine P10.
Selon un autre mode de réalisation préféré des
vecteurs conformes a cette variante de l'Invention, ils
comprennent en outre au moins une séquence, codant pour
une protéine hétérologue que l'on souhaite exprimer,
placée sous contrôle transcriptionnel du promoteur de la
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polyédrine, ou au moins un site pour l'insertion de
ladite séquence.
Des vecteurs conformes à cette deuxième
variante de l'invention peuvent par exemple être obtenus
à partir d'un virus recombinant Ac+16.
Selon un autre mode de réalisation préféré des
vecteurs con~ormes à cette deuxième variante de
l'Invention, ils comprennent en outre une sequence d'ADN
codant pour un récepteur hormonal du type RAR, laquelle
séquence est placée sous contrôle transcriptionnel d'un
promoteur de baculovirus autre que le promoteur Pl O .
En effet, les Inventeurs ont observé que
lorsqu'un gène, (tel que par exemple le gène rapporteur
CAT) est inséré sous contrôle transcriptionnel du
promoteur Pl O, et en 1'absence de la séquence RARE, on
note non seulement une absence d'activation, mais même
une inhibition de son expression lors de la co-expression
avec les RARs.
Des vecteurs de ce type peuvent être obtenus a
partir de Ac+16 par insertion d'un gene codant pour un
des récepteurs RAR~ ou RAR~ de 1'acide retinoïque, sous
contrôle du promoteur de la polyédrine;
Des vecteurs conformes a l'Invention, peuvent
constituer des vecteurs de transfert ou des vecteurs
d'expression. Ils peuvent être obtenus à partir de
n'importe quel baculovirus ou construction (telle qu'un
vecteur de transfert) dérivée de baculovirus, à condition
que ledit baculovirus ou ladite construction comprenne
les séquences constituant le promoteur de la P10, telles
que de~inies ci-dessus.
La presente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se
refère a des exemples de construction et de mise en
oeuvre de vecteurs d'expression conformes à l'Invention.
Il doit être bien entendu toute~ois que ces
exemples sont donnes uniquement à titre d'illustration de
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WO 96/294~0 PCTlh~9GI~ 7
l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune
manière une limitation.
Les protocoles utilisés dans les exemples qui
suivent font appel à des techniques classiques du genie
génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et
al.[Molecular cloning : A Laboratory M~n~ ; Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989], ou par
O'REILLY et al. [Baculovirus Expression Vectors : A
Laboratory M~nll~l ; Freeman and Cie, New York, (1992)]
pour la manipulation de l'ADN de baculovirus. Les
conditions particulières à chaque expérimentation sont,
s'il y a lieu, précisées dans l'exemple correspondant.
EXEMPLE 1
1) ADN plasmidiques et vecteurs de transfert
Une série de trois vecteurs de transfert
dénommés respectivement pMX16, pMH150, et pME230, a été
construite, afin d'introduire le gène bactérien codant
pour la CAT (Chloramphénicol Acétyl Transférase) dans la
séquence codant pour la P10, aux positions +16, +150, et
+230.
La Figure 2 représente une carte de la région
Pl O, montrant les positions concernées.
Dans ces trois constructions, le codon ATG de
la P10 a été muté en AGC, et un site de restriction PvuII
a été créé (séquence ATG TCA mutée en AGC TGA).
- pMH16
Le plasmide pMH16 est dérivé du vecteur de
transfert pGml6. Le vecteur pGml6 contient un insert
obtenu à partir du fragment EcoRI-P du baculovirus
GmMNPV, muté comme indiqué ci-dessus au niveau du site
d'initiation de la traduction de P10, et où la sequence
comprise entre les bases +16 et +265 du gène P10, a été
délétée, et remplacée par un lieur BglII.
Pour obtenir pMH16, un fragment HindIII-NsiI
de 1900 pb, isolé à partir du fragment HindIII-Q de
CA 022l6~97 l997-09-lS
W 096/29400 P~llr~100437
14
AcMNPV, qui contient les séquences hr5 et le gène p26, a
~té introduit entre les sites ~a~III et NsiI de pGml6.
Le ~ragment BglII-BanI de 790 pb obtenu à
partir du plasmide pBLCAT2 (LUCKOW and SCHUTZ, Nucleic
Acid Res., 15, (13) 5940 (1987), et comprenant la
se~uence codant pour la CAT, a ensuite été introduit dans
le plasmide, au site BglII.
- pMH150 et pMH230 :
Les plasmides pMH150 et pMH230 dérivent d'une
même construction, qui a été réalisée en inséran~ un
~ragment NsiI-E~oRI de 1900 pb portant les mutations
indiquée ci-dessus du ~ragment EcoRI-P de AcMNPV, entre
les sites _~lI et ~E~nI du ~ragment HindIII-Q de AcMNPV,
préalablement cloné dans le vecteur pUC18.
Pour obtenir le plasmide pMH150, le ~ragment
BglII-BanI de pBLCAT2 comprenant la séquence codant pour
la CAT, a été introduit au site BglII situé en position
+150 dans la séquence codant pour la P10. Pour obtenir le
plasmide pMH230, ledit ~ragment BqlII-BanI a été
introduit au site HindIII situé en position +230 dans la
séquence codant pour la P10.
La Figure 3 représente schématiquement les
inserts des plasmides pMH16, pMH150, et pMH230.
- Plasmide pPH-RAR~ et pPH-RAR~
Un ~ragment KpnI-StuI de 1518 pb, ou un
~ragment NccI-SmaI de 1564 pb, comprenant la totalité des
séquences codant respectivement pour les éléments hRAR~
[PETROVITCH et al. Nature, vol. 330, p. 444-450 (1987)]
et hRAR~ [BENBROOK et al., Nature, vol. 333, p. 669-672
(1988)] ont été introduits en aval du promoteur de la
polyédrine, dans le site SmaI du plasmide pGmAc34T
[DAVRINCHE et al. Biochem. Biophys. Res. Com., vol 195,
p. 469-477].
CA 02216~97 1997-09-1~
W096/29400 PCTn~6100437
- Plasmides pRARa(Pl0) et pRAR~(Pl0)
De la même manière, les séquences codant pour
les éléments hRAR ont été introduites au site BglII du
plasmide pMHl6~
2) Obtention de baculovirus recombinants :
Pour chacun des vecteurs de trans~ert décrits
ci-dessus 4 106 cellules S~9 sont co-transfectées par
lipofection (DOTAP, BOEHRINGER ~N~IM), avec l0~g de
vecteur, et l~g d'ADN viral.
Les recombinaisons au site de la polyédrine
sont e~fectuées en co-trans~ectant le plasmide concerné
avec de 1'ADN de virus AcMNPV sauvage, tandis que les
recombinaisons au site Pl0 sont e~ectuées en co-
trans~ectant le plasmide concerné avec 11ADN d1un
baculovirus modi~ié (AcSLPl0) dans lequel le promoteur et
le gène de la polyédrine ont été excisés, et la séquence
codant pour la polyédrine replacée sous contrôle du
promoteur Pl O .
Deux clones de chaque recombinant ont été
puri~iés indép~n~mm~nt.
La Figure 4 représente schématiquement les
di~érents virus recombinants obtenus. Les promoteurs
( Pl O et polyédrine) sont représentés par un rectangle de
couleur noire unie, la séquence Pl O est représentée par
un rectangle de couleur blanche unie, la séquence codant
pour la polyédrine est représentée par un rectangle en
pointillés serrés(~ , les séquences codant pour les RARs
sont représentées par un rectangle en pointillés
espaces(..), la séquence codant pour la CAT est
représentée par un rectangle hachuré.
La Figure 4A représente, de haut en bas :
- le virus AcMNPV sauvage ;
- un virus dépourvu du promoteur et du gène
polyédrine (AcD3) ;
- un virus obtenu après recombinaison d'un
plasmide pPH-RAR avec l'ADN de virus sauvage (AcRARPl0);
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W096/29400 PCT~6/00437
16
- un virus obtenu après recombinaison d'un
plasmide pPH-RAR avec l'ADN de virus dépourvu du
promoteur et du gène PlO(AcRAR~P10);
- un virus obtenu après recombinaison d'un
plasmide pRAR(P10) avec l'ADN de virus dépour~u du
promoteur polyédrine (AcSLPlORAR);
- un virus obtenu après recombinaison d'un
plasmide pRAR(P10) avec l'ADN de virus sauvage (AcPHRAR).
La Figure 4B représente schématiquement les
recombinants portant le gène CAT à différentes positions
à l'intérieur de la séquence P10 (+16, +150 et +230), et
le gène RAR~ ou ~ au locus polyédrine :
- un virus obtenu après recombinaison d'un des
plasmides pMH16, pMH150, ou pMH230 avec l'ADN de virus
sauvage (AcPlOCAT) ;
- un virus obtenu après recombinaison d'un
plasmide pPH-RAR avec l'ADN de virus AcPlOCAT (AcRARCAT);
EXEMPLE 2 : EXPRESSION DE P10 DANS LES
K~O_~INANTS RAR.
Les cellules (Spodoptera frugiperda S~9) sont
maintenues à 28~C dans du milieu TC100 (GIBCO/BRL)
supplémenté avec 5~ de sérum de veau foetal inactivé par
la chaleur.
Les cellules sont in~ectées par une suspension
virale (AcMNPV sauvage, ou recombinant à tester) avec une
multiplicité d'in~ection de 10 PFU (Plage Forming Units)
par cellule. Après une heure d'adsorption, l'inoculum
viral est remplacé par un milieu de culture frais.
Les cellules respectivement infectées avec
AcMNPV, AcRARaP10, AcRAR~P10, AcRARa~P10, AcRAR~P10, ont
été récoltées 48 heures après infection, lavées dans du
tampon PBS ~roid, puis re-suspendues dans du tampon
d'échantillon et portées à ébullition pendant 5 mn. La
même préparation est e~fectuée à partir de cellules non-
infectées.
CA 02216~97 1997-09-1~
W096/29400 PCT~ 0~7
Les protéines totales de chaque préparation
sont analysées par SDS-PAGE, sur un gel de polyacrylamide
à 12~. Les gels sont colorés avec du bleu de Coomassie.
~ a comparaison des profils électrophorétiques
des protéines totales de cellules infectées avec les
recombinants RAR (AcRARaPlO et AcRAR~PlO), avec le pro~il
électrophorétique de protéines totales des cellules
in~ectées avec le baculovirus de type sauvage AcMNPV,
montre qu'une protéine d'un poids moléculaire apparent de
10 kDa est surproduite dans les cellules infectées avec
les recombinants RAR. Cette surproduction est
particulièrement importante dans les cellules in~ectées
avec le recombinant AcRARyP10. La bande de poids
moléculaire apparent 10 kDa n~apparaît pas dans le pro~il
des protéines totales de cellules in~ectées avec des
recombinants AcRARa~P10 et AcRAR~P10.
Pour vérifier si les observations ci-dessus
re~letent une augmentation de la transcription du gène
P10, les ARN cytoplasmiques totaux ont été isolés, à
partir des cellules infectées, 48 h et 72 h après
l'in~ection, et analysées par hybridation "dot-blot", en
utilisant des sondes d'ARN marquées au P32,
complémentaires des séquences P10 et 39K, et obtenues en
utilisant le kit PROMEGA RIBOPROBE (PROMEGA, France).
Le comptage est fait dans un compteur à
scintillation.
Les résultats sont illustrés par le tableau I
ci-dessous, qui se réfère aux vecteurs représentés sur
les ~igures 4A et 4B.
CA 022l6~97 Iss7-os-l~
W096/29400 PCTn~6100437
TABLEAU I
cpm
Virus P10 39K
48 h 72 h 48 h72 h
Aucun 370 + 10 1010i 40 390+ 12 530 + 25
AcMNPV32900 + 580 26290 + 450 7390 i 370 6050 + 310
AcD331450 + 800 37970 + 720 7580 + 420 8520 + 470
RARal73920 + 1300 96740 + 880 8840 + 450 11980 + 630
RARa279530 + 1500 93120 + 950 9810 + 600 11500 + 600
RAR~plO10950 + 550 11200 + 600 9550 + 720 5770 + 220
RARyl98290 + 1100 146230 + 12005300 + 350 5820 + 280
RARy2138090 + 1450 142000 + 13806080 + 290 6400 + 300
h'~mPn des valeurs moyennes mesurées 48 h
apres infection révèle que la quantité d'ARNm de P10
produite par les recombinants AcRARaP10 et AcRARyP10 est
respectivement, deux ~ois et quatre ~ois plus élevée, que
celle observée avec le baculovirus sauvage, ou avec le
baculovirus AcD3 dépourvu du promoteur de la polyédrine.
Les résultats obtenus 72 heures après l'in~ection sont
très similaires à ceux observés 48 heures après
infection. Dans le même temps on n'observe pas de
di~ference signi~icative entre les di~erents vecteurs,
au niveau de la production de l'ARNm de 39K, mesuree à
titre de contrôle interne.
~ I~LE 3 : EXPRESSION DU G~ RAPPORTE~R CAT
SO~S CONTROLE DU PROIIOl~u~ PlO
Les baculovirus AcPlOCAT16, AcPlOCAT150, et
AcPlOCAT230 contiennent respectivement le gène rapporteur
CAT en position +16, +150 et +230 dans la séquence codant
pour la P10, et le gène codant pour la polyédrine sous
contrôle de son propre promoteur ; les baculovirus
AcRARaCAT16, AcRARyCAT16, AcRARaCAT150, AcRARyCAT150,
AcRARaCAT230, et AcRARyCAT230 contiennent respectivement
le gène rapporteur CAT en position +16, +150 et +230 dans
CA 02216~97 1997-09-15
W096/29400 PCT~U~61~0437
19
la séquence codant pour la P10, et, en outre, le gène
codant pour un récepteur a ou ~ de 1'acide rétinoïque SouS
contrôle du promoteur de la polyédrine. Ces différents
vecteurs sont obtenus comme décrit à l'exemple 1 ci-
dessus.
La présence de la protéine CAT ainsi que
l'acti~ité CAT sont recherchées sur les extraits
cellulaires préparés à partir des cellules S~9 in~ectées
par ces différents vecteurs et récoltées 48 heures après
infection.
L'expression du gène CAT est determinée après
trans~ert imml~noélectrophorètique : les protéines totales
sont analysées par SDS-PAGE comme decrit à l'exemple 1
ci-dessus, et transférées sur membrane de nitrocellulose.
La CAT est détectée avec des anticorps anti-CAT
(5 PRIME~3 PRIME INC.), ou par mesure de 1'activite CAT,
selon la methode classique decrite par GORMAN et al.
[Mol. Cell. Biol. n~ 2, 1044-1051 (1982). Les ~ormes
acétylées du substrat (Ac-CM) sont séparées du substrat
nati~ (CM), par chromatographie ascendante sur couche
mince de silice.
Dans le cas des cellules in~ectées par les
vecteurs de type +150 et +230, et co-exprimant un gène
codant pour un récepteur a ou ~ de l'acide rétinoïque.on
constate en immuntrans~ert, pour les virus AcRARaCAT150,
AcRARrCAT150, AcRARaCAT230, et AcRAR~CAT230, une très
nette augmentation du signal correspondant à la CAT par
rapport aux ~irus AcPlOCAT150 et AcPlOCAT230. Les
résultats observés sont con~irmés par la mesure de
l'activité CAT.
CA 022l6~97 l997-09-l~
W 096/29400 20 PCT/~9C/00q~7
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: lN~ll'lUl NATIONAL DE LA RE~R~ AGRONOMIQUE
- I N.R.A.
(B) RUE: 147, RUE DE L'UNIVERSITE
(C) VILLE: PARIS CEDEX 07
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75341
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
- C.N.R.S.
(B) RUE: 3, RUE MICHEL ANGE
(C) VILLE: PARIS CEDEX 16
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75794
(A) NOM: DEVAUCHELLE GERARD
(B) RUE: 137, CHEMIN DE L'ESPERVETTE
(C) VILLE: SAINT-CHRISTOL-LEZ-ALES
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 30380
(A) NOM: OGLIASTRO MARIE-HELENE
(B~ RUE: 28, RUE D'AVEJAN
(C) VILLE: ALES
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 30100
(A) NOM: ~KU'l"l'l MARTINE
(B) RUE: 2997, ROUTE DE MONTEZE
(C) VILLE: SAINT-CHRISTOL-LES-ALES
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 30380
(ii) TITRE DE L' lNV~llON: PROCEDE DE REGULATION DE L'EXPRESSION
D'UN GENE DANS UN BACULOVIRUS, PAR UN SITE DE FIXATION D'UN RECEPTEUR
DE L'ACIDE RETINOIQUE, ET VECTEUR POUR LA MISE EN OEUVRE DUDIT
PROCEDE.
CA 02216597 1997-09-15
WO 96/29400 21 PCTll~R96100437
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: 95 03412
(B) DATE DE DEPOT: 23-MAR-1995
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) L~N~u~u~: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: lineaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GTTGANNNNG ~TCA 14
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: lineaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GTTGACAGTG TTCA 14
