Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR DES RECEPTEURS DE LA MELATONINE ET LEURS
APPLICATIONS
La présente invention est relative à des séquences nucléiques codant
pour des récepteurs de la mélatonine de xénope de type MEL 1 A, également
dénom-
més ci-après Mellr, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, à
leurs
applications en tant que sonde et pour l'expression de protéines et/ou de
fragments de
celles-ci ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type
MEL1 A,
aux vecteurs utiles pour ladite expression, aux hôtes cellulaires contenant
lesdits vec-
teurs ainsi qu'à un modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage
de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des protéines ayant
une action
de récepteur de la mélatonine et à des trousses ou kits pour la détection du
degré
d'affinité de différentes substances pour lesdites protéines à activité de
récepteur de la
mélatonine.
Un récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis a été décrit
(EBISAWA T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6133-6137). II
s'agit
d'une protéine de 420 aminoacides.
Toutefois, des amorces localisées dans la partie 3' des séquences
nucléiques correspondantes n'ont pas permis d'amplifier la séquence codant
pour cette
protéine.
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de rechercher
des séquences nucléiques aptes à coder le récepteur de la mélatonine de type
MEL1 A,
lesquelles séquences étant aisément amplifiables dans leur intégralité.
La présente invention a pour objet des séquences nucléiques codant
pour des récepteurs fonctionnels de la mélatonine, de type MEL1 A et de
structure
différente de celle du récepteur décrit dans EBISAWA et al. et présentant des
proprié-
tés de couplage et de régulation différentes de celles du récepteur
antérieurement
décrit, lesquelles séquences sont sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N
1, SEQ
ID N 3, SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 7, telles que présentées dans la liste des
séquences
incluse dans la présente Demande.
Ces séquences selon l'invention présentent, en 3' une séquence non
codante plus ou moins longue (séquences longues : SEQ ID N 1 et SEQ ID N 5 ;
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
2
séquences courtes : SEQ ID N 3 et SEQ ID N 7), qui intervient de manière
cruciale
sur la régulation de l'ARN :'/a vie de l'ARN, modifiée par rapport aux
séquences de
l'Art antérieur.
En particulier, les SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3 codent pour une
protéine présentant 65 aminoacides en moins, par rapport à la séquence décrite
dans
l'Art antérieur, les 2 aminoacides en position C-terminale étant, en outre,
différents.
Cette protéine correspond au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Aa ou
Mellc(a)=
Les SEQ ID N 5 et SEQ ID N 7 codent pour une protéine présen-
tant également 65 aminoacides en moins, par rapport à la séquence décrite dans
l'Art
antérieur ; en outre, 6 résidus d'aminoacides sont différents, par rapport à
ladite
séquence de l'Art antérieur. Cette protéine correspond au récepteur de la
mélatonine
dénommé MEL1 Ab ou Mellc(Q).
Aussi bien la séquence codant pour le récepteur MEL1 Aa ou
Mellc(a) que la séquence codant pour le récepteur MEL1 Ab ou Mellc(Q)
pourraient
entraîner des modifications dans la régulation de l'ARN, en rapport avec la
séquence
non codante en 3' (régulation par un ligand agoniste, durée de vie de l'ARN).
De manière inattendue, seul le récepteur MEL1 Aa ou Mellc( ) inhibe
l'adénylyl cyclase ; en effet, le récepteur MELl Ab ou Mellc(R) est dépourvu
de cette
propriété à inhiber l'adénylyl cyclase.
En outre, d'autres signaux biologiques sont associés à ces protéines
en particulier, ces deux isoformes allèliques sont capables de moduler le GMPc
intra-
cellulaire (modulation dose-dépendante) et notamment d'inhiber l'accumulation
de
GMPc induite par un inhibiteur de phosphodiestérase.
La présente invention a également pour objet les fragments desdites
séquences, utiles soit pour une expression fonctionnelle du peptide
correspondant au
récepteur de la mélatonine correspondant, soit à la détection de la séquence
codant
pour ledit récepteur.
Parmi lesdits fragments, l'invention englobe, entre autres :
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
3
- une séquence constituée d'un segment de 230 paires de bases nu-
cléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1286 des SEQ ID N 1 ou SEQ
ID
N 5;
une séquence const:ituée d'un segment de 69 paires de bases nu-
cléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1125 des SEQ ID N 3 ou SEQ
ID
N 7.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidi-
ques, caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences
nucléotidiques telles
que définies ci-dessus.
Des conditions d'hybridation convenables sont notamment les suivan-
tes : l'hybridation est réalisée à 42 C dans un tampon comprenant : 4X SSC, 40
% de
formamide, 0,2 % de SDS et tampon Denhardt 5X.
De telles sondes ont notamment l'avantage de permettre la caractéri-
sation des différents variants du récepteur fonctionnel de la mélatonine de
type
MEL1 A(1V1EL1 Aa ou MEL1 Ab).
La présente invention a également pour objet les protéines et/ou
fragments de protéine, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence
nucléoti-
dique telle que définie ci-dessus et en ce qu'ils présentent une activité de
récepteur de
la mélatonine de type MELI fonctionnel.
Conformément à l'invention, ladite protéine est sélectionnée parmi
l'une quelconque des séquences SEQ ID N 2 (la SEQ ID N 4 étant identique à la
SEQ
ID N 2) ou SEQ ID N 6 (la SEQ ID N 8 étant identique à la SEQ ID N 6), telles
que
présentées dans la liste de séquences incluse dans la présente Demande.
Les SEQ ID N 2 et N 4 correspondent au récepteur de la mélato-
nine dénommé MEL1 Aa ou Mell al ; les SEQ ID N 6 et N 8 correspondent au
récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Ab ou Mel1c(R).
Ces deux protéines, dont la structure est différente de celle de la
protéine de l'Art antérieur, présentent, de manière inattendue, des réactions
et des
signaux biologiques différents de ceux antérieurement décrits, notamment en ce
qui
= 30 concerne le couplage aux protéines G (signalisation).
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
4
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant
de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence
nucléo-
tidique conforme à l'invention.
On entend au sens de la présente invention, par vecteur recombinant
aussi bien un plasmide, un cosmide qu'un phage. Selon un mode de réalisation
avantageux dudit vecteur, il est consti-
tué par un vecteur recombinant dans lequel est insérée une séquence
nucléotidique telle
que définie ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'une
protéine ayant
une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A,
conforme à
l'invention.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit
vecteur est constitué d'un plasmide pcDNA3 (Invitrogen), comprenant un
promoteur
RSV et la SEQ ID N 1.
Un tel plasmide a été dénommé X-MEL1a et a été déposé sous le
n I-1583 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures
de
Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation,
ledit vecteur est constitué d'un plasmide pcDNA3 (Invitrogen), comprenant un
promo-
teur RSV et la SEQ ID N 5.
Un tel plasmide a été dénommé X-MEL1b et a été déposé sous le
n I-1584 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures
de
Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appro-
priée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est
transformée
par un vecteur d'expression conforme à l'invention.
Une telle cellule est capable d'exprimer une protéine, ayant une acti-
vité de récepteur fonctionnel de la mélatonine, de type MELI A.
Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notam-
ment constituée par les cellules de la lignée L.
La présente invention a également pour objet un processus
d'expression d'une protéine conforme à l'invention, caractérisé en ce que la
cellule
hôte, résultant de la transformation par un vecteur contenant une séquence
nucléotidi-
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
que selon l'invention codant pour une protéine ayant une activité de récepteur
fonc-
tionnel de la mélatonine de type MFLl A, est cultivée de manière à produire et
à trans-
porter ladite protéine exprimée vers la membrane, de telle sorte que les
séquences
transmembranaires dudit récepteur soient exposées à la surface de la membrane
de
5 l'hôte cellulaire transformé.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude des
récepteurs de la mélatonine de type MEL1 A, caractérisé en ce qu'il est
constitué par
des cellules hôtes conformes à l'invention, c'est-à-dire exprimant un
récepteur fonc-
tionnel de la mélatonine de type MEL1 A à la surface de leur membrane
cellulaire.
Un tel modèle permet l'étude, d'un point de vue pharmacologique,
des récepteurs de la mélatonine, notamment en permettant l'identification des
ligands
spécifiques des récepteurs de type P/IEL1 A (agonistes et antagonistes) et
ainsi la mise
au point de médicaments actifs sur la régulation de l'horloge biologique, avec
des
applications particulièrement intéressantes, notamment dans le domaine
cardiovascu-
laire (lipolyse) et en cancérologie (mise en phase des cellules).
L'invention a également pour objet un procédé de détection de la
capacité d'une substance à se comporter comme ligand vis-à-vis d'une protéine
conforme à l'invention, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préala-
blement transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention,
laquelle
cellule hôte exprime ladite protéine (récepteur de la mélatonine), et laquelle
mise en
contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison
entre l'un
au moins des sites spécifiques et ladite substance et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe de type
ligand-protéine.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé pour l'étude
de l'affinité d'une protéine conforme à l'invention pour un ou plusieurs
ligands déter-
minés, lequel procédé est caractérisé en ce qu'i1 comprend :
- la transformation d'uiie cellule hôte appropriée par un vecteur con-
forme à I'invention ;
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions per-
mettant l'expression du récepteur de la mélatonine de type MEL 1 A, codé par
la
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
6
séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur de la mélatonine exprimé
vers la
membrane de ladite cellule de sorte que les séquences transmembranaires du
récepteur
fonctionnel de la mélatonine soient exposées à la surface de la cellule hôte
transfor-
mée ;
- la mise en contact de ladite cellule avec les ligands déterminés et
- la détection d'une réaction affine entre ladite cellule transformée et
lesdits ligands déterminés.
L'invention a, en outre, pour objet un kit pour la détection de
l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine conforme à l'invention,
lequel kit est
caractérisé en ce qu'il comprend :
- une culture de cellules hôtes transformées par un vecteur
d'expression conforme à l'invention ;
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques
pour induire l'expression d'une protéine (récepteur de la mélatonine de type
MELl A),
codée par une séquence nucléotidique conforme à l'invention, contenue dans un
vec-
teur dont le promoteur est inductible ;
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour
ladite protéine ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de
l'activité biologique de la protéine exprimée.
De manière inattendue, les récepteurs de la mélatonine de type
MEL1 A selon l'invention sont effectivement des récepteurs fonctionnels et
permettent
la réalisation de toutes les applications précitées.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore
d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui
se réfère à des
exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec
référence
aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente un schéma de la technique de clonage de =
l'ADNc du récepteur de la mélatonine, à partir de Xenopus laevis ;
- la figure 2 illustre les différents fragments de clonage utilisés ; la
localisation des amorces sens (S) (~) et anti-sens (AS) (F-) spécifiques de la
séquence
d'ADNc codant pour le récepteur de la mélatonine, antérieurement identifiée à
partir
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
7
de mélanophores de derme de Xenopus ; la localisation des amorces qui ne
correspon-
dent pas à cette séquence (~=) sont également illustrées à cette figure ;
la figure 3 illustre les étapes de clonage et de séquençage des frag-
ments d'ADNc du récepteur de la mélatonine ;
= 5 - la figure 4 correspond à une comparaison des séquences codant
respectivement pour les récepteurs de la mélatonine Mell a) et Mel1c(R): la
séquence
du récepteur de la mélatonine Mell a) est illustrée (O) et les substitutions
caractérisant
le récepteur de la mélatonine Melir(R) (0) sont indiquées à la figure 4A ; les
séquences
d'ADN de la région 3' non traduite longue et courte sont illustrées à la
figure 4B. Les
récepteurs Mellc( ) sont préférentiellement associés à la région 3' non
traduite courte
(3 :1, court :long), alors que les récepteurs Meli,(R) sont préférentiellement
associés à
la région 3' non traduite longue (1 :3). A la figure 4B, les sites de clonage
EcoRI sont
soulignés.
- la figure 5 illustre la partie codante de séquence d'ADNc codant
pour le récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A (a ou b) en
comparai-
son avec la séquence EBISAWA et al. (référence précitée) ;
- la figure 6 illustre la caractérisation des ADNs codant pour les
récepteurs Mellc(a~1VIe11 R) chez différents types de Xenopus. L'amplification
PCR
utilisée dans ce test fournit le fragment 3 de la figure 2. Les enzymes de
restriction uti-
lisées pour la digestion des produits d'amplification PCR obtenus sont : Afl
II (1 site à
la fois dans la séquence Mellc(a) et la séquence Mel1c(Q , Bsp120 I(1 site
dans la
séquence Mellc a), pas de site dans la séquence Melic(p , Pmll (1 site dans la
séquence Me11c(R), pas de site dans la séquence Mellc(a . L'analyse de
restriction est
effectuée à partir des produits PCR. issus des ADN génomiques suivants : 1, X.
tropi-
calis ; 2, X. ruwenzoriensis ; 3, individu X. laevis homozygote (ff); 4, ADNc
de
= Melle(a) cloné ; 5, ADNc de MelI~(Q) cloné ; 6, ADNc de X. laevis amplifié à
partir
d'un pool d'ARNm de peau ; 7, individu X. laevis hétérozygote (rf) ; ND,
produit de
PCR non digéré.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
8
- la figure 7 illustre la spécificité pharmacologique de la liaison 2-
(125I)-iodomélatonine/récepteurs à la mélatonine, en présence de cellules L
stables
exprimant un récepteur selon l'invention (Mellc(a) ou Mel1c(Q ; la figure 7A
montre
l'isotherme de saturation de la liaison 2-(125I)iodomélatonine ; la liaison
non-spécifique
est mesurée en présence de mélatonine 10 M ; cette figure 7A comprend en
incrusta-
tion la représentation Scatchard des données. La figure 7B représente l'étude
des liai-
sons par compétition de la 2-(125I)-iodomélatonine (400pM) au récepteur,
effectuées
sur des membranes de cellules L, exprimant soit le récepteur Mellc(a), soit le
récepteur
Melic(R), en présence d'I-mélatonine (0), de mélatonine (M), de N-acétyl-5-
hydroxy-
tryptamine (NAS) (O), de S22153(,&) et de S20098 (M).
- la figure 8 illustre la modulation de l'accumulation d'AMPc, stimu-
lée par la forskoline, par les récepteurs Mellc ) et Mel1c(R). Les clones
stables de cellu-
les L transfectées avec de 1'ADNc codant soit pour le récepteur Melic( ) (0),
soit pour
le récepteur Mel1cCR1(O) sont stimulés par la forskoline (FK) (10 M) en
présence des
concentrations indiquées de mélatonine (en abscisse) ; en ordonnée, cette
figure
comprend le taux d'AMPc intracellulaire en %. La valeur 100 %(O) correspond à
la
valeur moyenne d'AMPc en présence de forskoline 10 M ;(a) indique la valeur
d'AMPc, en présence de mélatonine (10 M) seule (*P<0,05).
- la figure 9 illustre la modulation de l'accumulation d'AMPc stimu-
lée par l'isoprotérénol, par les récepteurs de la mélatonine, dans des essais
de transfec-
tion transitoire. Le récepteur Mellc(a) ou le récepteur Mel1c(R) est co-
exprimé avec le
récepteur (32 adrénergique ((32-RA), en quantités égales dans des cellules L
et stimulé
avec de l'isoprotérénol (ISO, 10 .M), en présence ou en l'absence de
mélatonine (Mel,
10 M) : les taux d'AMPc sont mesurés ; NT signifie nontransfecté. Le nombre
de
sites de liaison spécifiques au 125ICYP et à la 2-125I-iodomélatonine
[représentés
comme suit : (sites de liaison spécifiques ICYP/sites de liaison spécifiques
iodo-
mélatonine) et exprimés en finol/mg de protéine], dans ces cellules
transfectées sont
respectivement : NT (24/0) ; Mell al (5/77) ; Melic(R) (13/148) ; (32-RA
(622/0) ; (32-
RA/Meltc( ) (386/54), (32-RA/Mel1c(R) (416/151) (*P<0,05).
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
9
- la figure 10 illustre la modulation de l'accumulation du GMPc par
les récepteurs de la mélatonine. A la figure 10A, des cellules L transfectées
de façon
transitoire avec un ADNc codant soit pour le récepteur Melic(a) (d, (D), soit
pour le
récepteur Mellc(R) (i, =), sont incubées avec les concentrations indiquées en
abscisse
de mélatonine, en présence (O, =) ou en l'absence (^, M) de 1 mM d'IlVMX. A la
figure 10B, les cellules L transfectées de façon transitoire avec un ADNc
codant soit
pour le récepteur Meltc(a), soit le récepteur Mellc(p), sont préincubées soit
dans un
tampon, soit avec de la toxine de Pertussis (PTX, 100 ng/ml) pendant 18
heures, puis
incubées en présence de 1 mM d'liBMX et en l'absence ou en présence de 10 M
de
mélatonine. Les taux de GMPc intracellulaires (en ordonnée) sont déternùnés.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés
uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne
constituent en
aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: Isolement et identification des 4 séquences fonctionnelles du
récepteur de la mélatonine de type MEL1 A.
a) Amplification de la partie codante du récepteur de la mélatonine de
Xenopus laevis.
L'ARN total de la peau de Xenopus laevis est préalablement traité
avec 0,3 U d'une DNAse I sans RNAse (RQ1 DNase, Promega) pendant 20 min à
37 C par mg d'acide nucléique. La synthèse de l'ADNc est réalisée par
incubation de
200 ng d'ARN (chauffé à 65 C pendant 5 min avant la réaction) avec 100 unités
de
MMLV inverse transcriptase "Stratacript RNAse H-" de Stratagène pendant 30 min
à
37 C.
Après inactivation à 95 C (5 min), l'ADNc est amplifié par PCR avec
différents couples d'oligonucléotides spécifiques du récepteur de la
mélatonine de
Xenopus laevis, de l'ADN polymérase lPwo (Boehringer Mannheim) avec son propre
tampon, en présence de 2 mM de MgSO4, dans un volume de 50 l. L'ADNc est
dénaturé 2 min à 94 C, amplifié 40 fois ; une élongation de 3 min à 72 C est
ensuite
réalisée. Un cycle correspond à 15 sec. à 94 C ; 30 sec. à la température
spécifique du
couple d'oligonucléotide et 90 sec. à 72 C (GeneAmp PCR System 9600 de Perkin-
Elmer Cefus). Les couples d'oligoniucléotides nùs en oeuvre pour amplifier
différents
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
fragments de l'ADNc codant pour le récepteur de la mélatonine de X. laevis
(figure 2)
sont les suivants :
- fragment 1: 5'AGAAATGATGGAGGTGAATAGCA3' (SEQ ID
N 9) (3S, position 28) et 5'CGGCAATAGACAAACTGACAACA3' (SEQ ID N 10)
5 (3AS, position 241) (température spécifique d'hybridation de 54 C) ; =
- fragment 2: 5'TATTGGTCATTTTGTCTGTC3' (SEQ ID N 11)
(5S, position 183) et 5'CCAGGTGCTTCTTTGATTAT3'(SEQ ID N 12) (5AS,
position 462) (température spécifique d'hybridation de 50 C) ;
- fragment 3 : 5'CTTCAACATAACAGCCATAGC3' (SEQ ID
10 N 13) (6S, position 391) et 5'TGCTTGATTGTTGTTGGTTAC3' (SEQ ID N 14)
(6AS, position 764) (température d'hybridation de 50 C) ;
b) Amplification de l'extrémité 3' du récepteur de la mélatonine du
Xenopus laevis.
Le fragment 4, contenant la région 3' non traduite est amplifié en uti-
lisant le kit Amp1iFINDERTM RACE (Clontech) et les oligonucléotides suivants :
5'TATGGTGTGCTAAATCAA.AACTTCCGCAAGGAGTA3' (SEQ ID N 15) et
5'TACTGATGTCCTTATTGACTCCAAGACTGTTGTTT3' (SEQ ID N 16)
(température d'hybridation de 58 C).
Par ailleurs, l'ADNc codant pour tout le récepteur de la mélatonine
peut être amplifié avec les amorces suivantes : 5'AGAAATGATGGAG
GTGAATAGCA3' (SEQ ID N 17) (3S) et 5'TTAGAATGAATGGACAGAA3'
(SEQ ID N 18) (12AS) (température d'hybridation de 52 C).
Plusieurs amorces ont été testées pour leur capacité à amplifier
l'ADNc du récepteur de la mélatonine (figure 2).
Plus de 80 % de l'ADNc désiré a été amplifié en utilisant 3 paires
différentes d'amorces qui comprennent des séquences chevauchantes (fragments 1-
3),
qui correspondent à la région codant pour le fragment allant jusqu'à Ala 349.
Tous les efforts pour amplifier la dernière portion de région codante
en 3' et la région 3' non codante n'ont pas abouti.
Cette partie restante de l'ADNc du récepteur de la mélatonine a été
amplifiée à l'aide d'une réaction PCR modifiée, en utilisant le site de
polyadénylation, à
l'extrémité 3' de l'ADNc en tant qu'amorce (principe décrit à la figure 3).
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCTIFR96/01167
Il
Deux fragments d'amplification (estimés à 400 pb (fragment court) et
600 pb (fragment long), respectivement) ont été obtenus en utilisant cette
approche. Le
fragment court de 400 pb contient 250 bp non-codantes (3' court) et 150 pb
codantes ;
le fragment de 600 pb contient 450 pb non-codantes (3' long) et 150 bp
codantes.
La digestion de ces fragments avec deux enzymes de restriction
montrent le profil de restriction attendu.
Les produits d'ainplification ont été clonés séparément dans un vec-
teur et caractérisés par digestion enzymatique et par séquençage par la
méthode aux
didésoxy (4-6 clones/fragment).
Le fragment 1 correspond à la séquence 28-241 : 3 clones ont été
séquencés, qui sont identiques avec la séquence publiée (EBISAWA et al.).
Parmi les clones des fragments 2 et 3, certains sont identiques à la
séquence publiée tandis que d'autres montrent des différences au niveau de la
séquence
nucléique.
Dans un variant du fragment 2, on observe deux substitutions
nucléotidiques silencieuses (pas de modification de la séquence en
aminoacides), tandis
que les variants du fragment 3 contiennent 26 substitutions nucléotidiques
silencieuses
et 6 substitutions entraînant une modification de la séquence en aminoacides
corres-
pondante (voir figures 4 et 5).
A la fois les fornles courtes et longues des fragments 4 présentent
une forte homologie avec la séquence publiée du récepteur de la mélatonine
jusqu'à la
méthionine en position 353.
Pour ce qui concerne le fragment 4 court (voir SEQ ID N 5 et N 7)
(fragment C), au-delà de la méthionine 353, deux aminoacides différents ont
été détec-
tés, c'est-à-dire tyrosine à la place de leucine (position 354) et valine à la
place de
glycine (position 355), suivis par un codon stop, entraînant la perte de 65
aminoacides,
si l'on compare avec la séquence publiée du récepteur de la mélatonine de
Xenopus
laevis (figure 4A).
L'alignement en aminoacides dudit récepteur, à partir de Xenopus, de
l'Homme et du mouton, montre que la séquence publiée du récepteur de la
mélatonine
à partir de Xenopus présente une queue C-terminale beaucoup plus longue que le
récepteur cies deux autres espèces (REPPERT et al., 1994).
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
12
Contrairement à la séquence publiée, le récepteur de la mélatonine
selon l'invention obtenue à partir de Xenopus laevis présente la même taille
que le
récepteur de la mélatonine obtenu à partir de l'Homme ou du mouton.
Pour ce qui concerne le fragment 4 long (fragment L) (voir SEQ ID
N 1 et N 3) : 4 clones ont été séquencés, l'un d'eux correspond à la
séquence publiée
jusqu'à la méthionine 353, 3 d'entre eux montrent le même changement que celui
observé dans le fragment court, jusqu'à la méthionine 353. Dans tous les
clones, les
aminoacides 354 et 355 sont modifiés par rapport à la séquence publiée et
présentent
un codon stop en position 356, comme visible dans le fragment court.
En plus, la région non codante en 3' du fragment long est identique
avec celle du segment court, jusqu'à la queue de polyadénylation ; il
comprend, en
outre, 160 pb, suivi par sa propre queue de polyadénylation (voir liste des
séquences,
SEQ ID N 1 et N 3) (voir figure 2).
Les différences de séquences retrouvées dans toute la séquence sont
soulignées dans la figure 5.
De manière inattendue, le séquençage du récepteur de la mélatonine
obtenu par PCR-RT révèle donc deux séquences différentes (MEL1 Aa et MEL1 Ab).
En outre, l'ADNc codant pour le récepteur complet de la mélatonine
peut être amplifié à partir de l'ADN de peau de xénope, par PCR, utilisant les
amorces
3S et 12AS, localisée dans la région 3' non-codante (voir figure 2).
L'analyse de restriction de plusieurs clones confirme que 2 ARNm
différents pour le récepteur de la mélatonine sont effectivement présents dans
les
échantillons analysés.
Les 2 ARNm codent pour des protéines de 354 aniinoacides qui sont
très similaires au récepteur Melir de poulet (78 % d'homologie).
Le fragment C(fragment court) a en conséquence également été
dénommé Mell,(a) et le fragment L(fragment long) (comprenant de nombreuses
substitutions) a été dénommé Melic((3).
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
13
EXEMPLE 2: Construction d'un vecteur pour l'expression du récepteur fonc-
tionnel de la mélatonine de type MEL1 A.
Le récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis a été cloné confor-
mément à la méthode RT-PCR (voir figure 1).
L'ARN est isolé de la peau de Xenopus et transcrit en ADNc à l'aide
de la transcriptase inverse.
Une amplification sélective de l'ADNc du récepteur de la mélatonine
est réalisée en utilisant des amorces PCR spécifiques de ce récepteur.
Le récepteur amplifié est cloné dans le vecteur d'expression
pcDNA3-RSV dérivé du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) et son identité a été
vérifiée
par séquençage, comme suit :
Des préligations successives des fragments entre eux, grâce à des
enzymes de restriction communes deux à deux, a permis d'insérer la totalité du
récep-
teur de la mélatonine dans le plasmide pcDNA3/RSV aux sites HindIII/ Bsp120I à
bout
franc, sous le contrôle du promoteur du rous sarcoma virus (RSV). Les
fragments 2 et
3 sont tout d'abord liés au niveau du site enzymatique commun "HindIII", en
position
455 de la séquence codante. Ce dernier est ensuite lié avec le fragment 1 au
site
commun "Bsu361" en position 202 et avec le fragment 4 au site commun "Xba1" en
position 1016. Chaque fragment est préalablement coupé par les deux enzymes
indis-
pensable pour les ligations successûves. Ce fragment purifié, composé des
fragments 1,
2, 3 et 4 dont les extrémités 5' et 3' sont respectivement HindIIl et EcoRI à
bout franc,
est enfin inséré dans pcDNA3/RSV'.
EXEMPLE 3: Caractérisation du locus Mell, dans plusieurs espèces de xénopes.
Les récepteurs Meli al (ou Mell Aa) et Mellc(p) (ou Meli Ab)
hautement homologues peuvent représenter soit 2 allèles différents au niveau
du même
locus génomique, soit 2 isoformes codées par différents gènes.
Pour pouvoir répondre à cette question, le fragment 3 codant pour
les récepteurs Mellc (ou Mell A) ont été amplifiés par PCR, à partir d'ADN
géno-
mique de 43 Xenopus laevis.
Plusieurs de ces animaux sont des animaux consanguins, tandis que
d'autres spnt des animaux sauvages importés d'Afrique du Sud.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
14
Les fragments d'ADN amplifiés de la taille attendue sont digérés
avec des enzymes de restriction convenable spécifiques des ADNc Mellc(a) ou
Mel1,(R)
(figure 6).
Chez un individu X. laevis (ff), homozygote pour le complexe majeur
d'histocompatibilité et d'autres marqueurs génétiques, seul le gène codant
pour le
récepteur Mellc(a) est trouvé.
L'analyse PCR d'une seconde grenouille X. laevis (rf), connue pour
être hétérozygote pour les marqueurs génétiques mentionnés ci-dessus, révèle
la pré-
sence des 2 gènes (gène codant pour le récepteur Mell,( ) et gène codant pour
le
récepteur Mel1c(R (figure 6).
Cette observation confirme l'hypothèse selon laquelle les 2 isoformes
du récepteur de la mélatonine sont codées par le même locus génomique.
L'analyse des
41 autres animaux montre la présence soit des 2 gènes (40 individus) soit du
gène
Mellc(a) seul (1 individu). Aucun animal ne présente que le gène du récepteur
Melic(R).
Deux autres espèces de Xenopus ont été étudiées selon la même
approche.
L'analyse de l'ADN génomique de X. ruwenzoriensis, une espèce
connue pour être polyploïde, révèle la présence du gène codant pour le
récepteur
Mellc(a). Deux gènes codant pour le récepteur de la mélatonine clairement
différents de
Mell,(a) et Mel1c(R) ont été révélés par la comparaison des profils de
digestion
enzymatique de X tropicalis et X. ruwenzoriensis (figure 6).
EXEMPLE 4: Pharmacologie du récepteur fonctionnel de la mélatonine de type
MEL1 A.
a) Expression stable
Le vecteur pcDNA3-RSV contenant la région codante et la région
non-codante 3' du récepteur de la mélatonine du Xenopus laevis selon l'exemple
2, est
transfecté dans les cellules L de souris.
La veille, 3x105 cellules sont passées dans les flasks de 25 cm2 dans
un milieu DMEM 4,5 g/l de glucose; 1 mM glutamax; 1 mM pyruvate; 10 % FCS
(DMEM/PCS). Le jour de la transfection, le milieu est changé (6 ml de
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
DMEM/FCS/flask) et les cellules sont incubées pendant 3 heures à 37 C.
Parallèlement
une coprécipitation de l'ADN et du CaPO4 est préparée de la manière suivante :
dans
un volume final de 500 l, on mélange 30 g d'ADN carrier (pGEM3Z de Promega),
2 g du vecteur pcDNA3-RSV contenant la région codante et la région non-
codante 3'
5 du récepteur de la mélatonine du Xenopus laevis et du CaC12 (250 mM
final)(Solution
A). 450 l de cette Solution A sont rajoutés goutte à goutte, en vortexant, à
450 l de
HBS 2x (1,64 g NaCI; 1,19 g Hepes; 0,04 g Na2HPO4-12H20 additionnés à 100 ml
H20) et le pH est ajusté à 7,12. Le mélange est laissé sans agitation à
température
ambiante pendant 45 min. 400 l du coprécipité sont ajoutés dans une flask
contenant
10 les cellules L. Après 4 heures d'incubation à 37 C, les cellules sont
lavées une fois avec
6 ml de DMEM et ensuite incubées 2:min dans 4 ml de glycérol à 15%. Ensuite
les
cellules sont lavées deux fois avec du DMEM et laissées dans 6 ml de DMEM/FCS,
supplémenté avec 5 mM de nabutyrate à 37 C pendant une nuit. Le lendemain, le
milieu est retiré, les cellules sont de nouveau lavées au DMEM/FCS puis
incubées pen-
15 dant une nuit dans du DMEM/FCS. Le troisième jour les cellules sont
distribuées dans
des plaques de 96 puits à différentes dilutions (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32)
dans un milieu
DMEM supplémenté avec : du FBS à 10 % (v/v), 4,5 g/l de glucose, 100 U/inl de
pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, 1 mM de glutamine et 400 g/ml de
G418
(généticine de Gibco Life Technologies). Des clones résistants à la généticine
sont
testés pour l'expression du récepteur de la mélatonine par liaison avec la
(125)Iodo-
mélatonine (200 pM) dans un voluine final de 250 l (tampon: 50 mM Tris/HCI pH
7,4 ; 5 mM MgC12 ). La liaison non-spécifique est déterminée en présence de 10
mM
de mélatonine.
b) Expression transitoire
Pour l'obtention d'une expression transitoire, les cellules L sont éta-
lées soit sur des plaques comportant 6 puits (pour les tests AMPc, 0,5.106
cellu-
les/puits), soit dans des boîtes de 10 cm de diamètre (tests GMPc, 2.106
cellules/boîte)
et transfectées par la méthode au DEAE-dextran (LOPOTA et al., N.A.R., 1984,
12,
5707-5717), le jour suivant.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
16
Après un lavage avec du PBS, du DMEM sans sérum, contenant de
l'Hepès 50 mM, du DEAE-dextran à 200 g/ml et 1 g/ml d'ADN plasmidique plas-
mide pcDNA3-RSV), est ajouté.
Après incubation pendant 8 h à 37 C, le milieu est remplacé par du
DMSO à 10 % dans du DMEM sans sérum pendant 1,5 min. Les cellules sont lavées
avec du PBS et incubées dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal
à
%. Les essais sont réalisés trois jours après la transfection.
a. Test de liaison du radioligand.
* Méthode
10 Les monocouches de cellules sous-confluentes sont lavées avec du
PBS, incubées pendant 5 min à 37 C avec de la trypsine à 20 %, de l'EDTA 2 mM
et
remises en suspension dans du DMEM supplémenté avec du sérum de boeuf foetal à
10 % (v/v).
Après centrifugation à 450 x g pendant 5 min à 4 C, les culots cellu-
laires sont remis en suspension dans du PBS pH 7,4.
Les suspensions cellulaires sont incubées avec 400 pM de 2-(125I)-
iodomélatonine (pour les essais de liaison sur les récepteurs à la mélatonine)
ou 200
pM (1251)-CYP (pour les tests de liaison aux récepteurs adrénergiques (32) en
l'absence
ou en présence de 10 M de ligands froids (mélatonine ou D/L-propranolol,
respecti-
vement).
Les tests de liaison sont effectués dans les conditions suivantes
60 min à 25 C dans un volume réactionnel final de 0,25 ml. Les réac-
tions sont arrêtées à l'aide d'une filtration rapide à travers un filtre de
fibre en verre
Whatman GF/C, préalablement trempé pendant 30 min dans un tampon PBS contenant
0,3 % de polyéthylène imine (pour réduire les liaisons non-spécifiques).
Les concentrations en protéines sont mesurées sur les homogénats de
cellules par la méthode de Bradford (Analytical Biochem., 1976, 72, 248-254),
en
utilisant le système d'essai des protéines Bio-Rad. La sérum albumine bovine
est utili-
sée comme standard.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
17
* Résultats
Parmi les différents clones exprimant les sites de liaison à la (luI)-
iodomélatonine, un clone Mellc(a) exprimant 200 finol de récepteur/mg de
protéines
totales et un clone Mel1C(R) exprimant 150 finol de récepteur/mg de protéines
totales
ont été plus particulièrement caractérisés.
Les constantes de dissociation KD de l'agoniste radiomarqué 2-(125 I)-
iodomélatonine sont de 160 32 et 143 25 pM respectivement (figure 7A),
valeurs
qui sont en accord avec celles déterminées pour d'autres récepteurs de la
mélatonine de
forte affinité, y compris ceux antérieurement clonés, à partir de mélanophores
de X.
laevis. Les expériences de compétition ont montré que l'affinité vis-à-vis de
différents
ligands est caractéristique des récepteurs de la mélatonine (figure 7B et
Tableau I).
Tableau I
Ki (nn
Ligand Mel lc(a,) Mel1c(R) Xenopus
(Ebisawa et al.)
Mélatonine-I 0,26 :E 0,25 0,24 0,11 0,11
S20098 0,66 t 0,10 0,41 f 0,14
Mélatonine 1,28 f 0,12 2,10 f 0,56 1,30
6-OH-mélatonine 35,70 f 4,04 46,90 f 1,88 20,00
S22153 195,00 t 6,64 359,00 f 140
NAS 1425,00 327 1771,00 ~ 670 2000,00
Aucune différence significative n'est trouvée entre les récepteurs
Mellc a) et Mellc(p) dans les tests de liaison.
b. Détermination des taux intracellulaires d'AMP cyclique.
* Méthode
Les cellules mises en croissance dans des plaques contenant 6 puits
sont lavées 2 fois avec du DMEM sans sérum, préincubées pendant 15 min à 37 C,
puis incubées pendant 15 min à 37 C dans un milieu DMEM contenant 1 mM d'IBMX
(3-isobutyl-1-méthylxanthine) avec ou sans isoprotérénol (10 pM) (essais sur
les
cellules transfectées transitoires), ou 10 M de forskoline (essais sur les
clones
cellulaires stables) et des quantités croissantes de mélatonine.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
18
Le tampon d'incubation est éliminé et les cellules sont lysées dans de
la soude 1 M pendant 20 min à 37 C. Après neutralisation du pH avec de l'acide
acé-
tique 1 M, les lysats cellulaires sont centrifugés dans une microcentrifugeuse
à 17 000 x
g pendant 5 min. Les surnageants sont testés pour leur contenu en AMP cyclique
à
l'aide du système AMP cyclique 3H (Amersham). Alternativement, les tests de
mesure
de l'AMP cyclique peuvent être réalisés dans des plaques contenant 24 puits
(0,5 x 106
cellules dans 300 l). Les cellules sont alors incubées pendant 15 min et la
réaction est
stoppée par l'addition de 100 l d'acide trichloracétique à 20 % et les
'surnageants sont
testés pour leur contenu en AMP cyclique.
* Résultats
- Les récepteurs de la mélatonine, présentant une forte affinité, sont
connus pour participer à l'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase.
Dans les cellules L exprimant le récepteur Mell al, la mélatonine
entraîne l'inhibition de l'accumulation de l'AMPc stimulée par la forskoline
(figure 8).
La valeur IC5o de cet effet est d'environ 6.10-10M, ce qui est en
accord avec les valeurs obtenues précédemment avec les récepteurs de la
mélatonine
présentant une forte affinité.
De manière surprenante, dans les cellules exprimant le récepteur
Mellc(p), un tel effet ne peut pas être observé même à des concentrations en
mélatonine
supérieures à 0,1 mM.
Toutefois, les taux de base d'AMPc ne sont affectés par la mélato-
nine dans aucune des lignée cellulaires étudiées, même en présence d'IBMX.
L'inhibition de l'accumulation d'AMPc par les récepteurs de la méla-
tonine est couplée aux protéines G;., par l'intermédiaire de leurs sous-unités
oc.
- Afin de vérifier que le signal produit avec le récepteur Me11c(R) n'est
pas dû à un changement quantitatif des sous-unités Gia, des cellules L
contrôles et des
clones exprimant soit les récepteurs MellC( ) ou MeliC(R) sont comparés pour
ce qui
concerne leur contenu en sous-unités Gia, conformément au protocole suivant :
Les cellules sont solubilisées dans un tampon Laemmli contenant 2 %
de SDS et 40 mM de dithiothréitol et soniqué à 4 C. Après centrifugation dans
une
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
19
nzicrocentrifugeuse à 17 000 x g, 50 l de surnageant est séparé en ses
composants
dans un gel SDS/polyacrylamide à 1.2 %. L'analyse des immunoblots est réalisée
comme décrit dans SELZER E. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 1609-
1613), avec 84 antisérums qui correspondent aux 3 sous-types de Gia=
L'analyse en Western blot avec un anticorps spécifique reconnaissant
les 3 sous-types de Gi , ne permet pas de détecter de différences
quantitatives
significatives.
- Etude du signal de transduction (signalisation)
Il a été étudié après transfection transitoire des 2 isoformes d'ADNc
de Mellc dans des cellules L de manière à exclure un artefact potentiel
associé à la
sélection des clones. Les cellules L sont co-transfectées avec l'ADNc du
récepteur
adrénergique 02 humain et avec soit l'ADNc du récepteur Mellc(a) ou du
récepteur
Me11,_(R) ; la co-expression de ces différents récepteurs permet d'étudier
sélectivement
la sous-population de cellules qui a effectivement internalisé l'ADN exogène.
Trois jours après la transfection, les cellules sont étudiées pour leur
inhibition de l'accumulation d'AMP cyclique-mélatonine dépendante, en réponse
à
l'isoprotérénol, agoniste (32-RA et pour le nombre de sites de liaison (3
adrénergique et
mélatonine (figure 9).
Aucun site de liaison, pour aucun des récepteurs, ne peut être mesuré
dans les cellules contrôles sauvages. Dans les cellules transfectées avec
l'ADNc de
récepteur adrénergique (32 seul, l'incubation avec de l'isoprotérénol entraîne
une aug-
mentation d'un facteur 5 de l'AMPc. Dans les cellules co-transfectées avec des
quanti-
tés identiques (1 g d'ADN plasmidique) d'ADNc codant pour les récepteurs
Mellc(a)
et adrénergique P2, l'incubation simultanée avec de l'isoprotérénol et de la
mélatonine
entraîne une diminution significative de l'accumulation d'AMPc (65t5 % du
contrôle,
p<0,05) (figure 9).
Dans les mêmes conditions, les récepteurs Mel1c(R) ne sont pas capa-
bles d'inhiber l'accumulation d'AMPc induite par l'isoprotérénol, malgré
l'expression
d'un nombre équivalent de site de liiaison aux récepteurs.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
Des résultats similaires sont obtenus, lorsque l'ADNc codant pour le
récepteur Mellc-(R) est en excès d'un facteur 10 par rapport à l'ADNc codant
pour le
récepteur adrénergique (32.
Les récepteurs Mellc( ) inhibent l'accumulation d'AMPc stimulée par
5 la forskoline de manière dose-dépendante avec une valeur IC50 d'environ 6.10-
10 M,
une valeur en accord avec celle rapportée pour les récepteurs de la mélatonine
précé-
demment décrite.
En contraste avec ces résultats, la liaison de la mélatonine aux récep-
teurs Mell,:(R) ne stimule aucune modulation des taux d'AMPc bien que la
forskoline
10 stimule une accumulation d'A.MPc similaire dans les lignées cellulaires
exprimant soit
les récepteurs Melic(a), soit les récepteurs Mell R).
L'inhibition de la fonction adénylyl cyclase est principalement
couplée aux protéines Gi activées.
L'analyse en Western blot montre la présence de quantités similaires
15 de sous-unités a Gil-3 à la fois dans les 2 lignées cellulaires
transfectées et dans les
cellules L non transfectées contrôles, excluant la sélection potentielle de
clones cellu-
laires exprimant des quantités peu importantes de protéines Gi. De plus,
l'absence de
modulation d'AMPc est également observée dans les essais de transfection
transitoire,
confirmant que le récepteur Meli,:(R) lui-même est incapable d'activer cette
voie
20 biologique.
La différence entre les récepteurs Mellr,( ) et Mellc(R), à savoir
essentiellement la substitution de 5 aminoacides, localisée dans les domaines
intracellu-
laires, constitue la base moléculaire de ce phénomène ; dans les récepteurs
appartenant
à la fan-fflle des récepteurs incluant 7 domaines transmembranaires, ces
régions intra-
cellulaires sont connues pour être impliquées dans le couplage à la protéine
G. Dans
des conditions expérimentales appropriées, la mélatonine peut stimuler
l'accumulation
d'AMPc dans des cellules exprimant l'adénylyl cyclase de type H. Un tel effet
n'est pas
observable avec les clones stables exprimant le récepteur Meltc(a) ou le
récepteur
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
21
Melic(l3), ni dans les cellules L transfectées de manière transitoire avec les
ADNc
correspondants.
c. Détermination des taux intracellulaires de GMP çvclique.
* Méthode
Les cellules transfectées transitoirement, mises en croissance dans
des boîtes ayant un diamètre de 10 cm, sont incubées à 37 C pendant 15 min
dans un
milieu DMEM sans sérum, en présence ou en l'absence de 1 mM d'IBMX et de
quanti-
tés croissantes de mélatonine. Le milieu est ensuite remplacé par 1 ml
d'éthanol à 65 %
glacé et les extraits cellulaires sont cen,trifugés à 2 000 x g pendant 15 min
à 4 C. Les
surnageants sont séchés ; les culots sont remis en suspension dans 250 l d'un
tampon
acétylé.
Le GMP cyclique est dosé conformément au kit EIA (Amersham).
Des voies additionnelles telles que la modulation du contenu en
GMPc a été proposée pour le récepteur de la mélatonine (VANECEK J. et al.,
Brain
Res., 1989, 505, 157-159).
Les cellules L exprimant soit les récepteurs Mel1c(a), soit les récep-
teurs Mellc(p), sont incubées avec de la mélatonine et les effets sur le GMPc
intracellu-
laire sont analysés. La mélatonine (jiusqu'à 10 M) n'a aucun effet sur les
taux de base
de GMPc dans aucune des lignées cellulaires.
Le contenu intracellulaire en GMPc dépend de l'activité opposée des
guanylyl cyclases, qui synthétisent le GMPc et des phosphodiestérases (PDE),
qui
dégradent le GMPc.
L'inhibiteur de PDE, IBMX lorsqu'il est ajouté au milieu, bloque la
dégradation du GMPc par le PDE. Dans ces conditions, le taux de GMPc augmente
d'un facteur 3, indiquant la présence d'une activité PDE basale dans les
cellules L non
stimulées.
L'incubation avec de la mélatonine inhibe l'accumulation de GMPc
stimulée par le PDE, de manière dose-dépendante dans des cellules L exprimant
soit le
récepteur Mellc(a), soit le récepteur Mel1c(13) (figure l0A).
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
22
La valeur ICso de cet effet (environ 10-9 M) correspond aux valeurs
de Ki de la mélatonine obtenues dans les essais de compétition et est proche
de la
valeur IC50 obtenue lors de l'inhibition de l'adénylyl cyclase par le
récepteur Mel1c(a)=
La stimulation par la mélatonine des cellules témoins n'affecte pas
l'augmentation de production de GMPc par IBMX. '
La toxine de Pertussis, qui catalyse la ribosylation inactivante d'ADP
des sous-unités a G;/o de protéines G, bloque l'inhibition de l'accumulation
d'AMPc
liée à la protéine Gi et stimulée par les récepteurs à la mélatonine. La
préincubation de
cellules avec la toxine de Pertussis abolit complètement l'effet de la
mélatonine sur
l'accumulation de GMPc, suggérant que cette voie est également dépendante de
la
protéine Gi/o.
Les 2 ADNc de récepteurs de la mélatonine Mellc( ) et Melic(R) se
trouvent soit sous forme longue, soit sous forme courte. L'ADNc du récepteur
Melic(a) se présente pour la plupart sous la forme courte (3:1, court:long),
alors que
l'ADNc du récepteur Mellc(R) est plus abondant sous la forme longue (1:3). Les
régions non-traduites en 3' de plusieurs récepteurs de la même famille, tels
que le
récepteur adrénergique (32 ou le récepteur muscarinique contiennent des
déterminants
moléculaires impliqués dans la régulation de la stabilité de l'ARNm. Ceci
suggère que
les ARNm courts et longs codant pour les récepteurs Mell,( ) et Mell,(R) sont
soumis à
des régulations différentes.
Dans la mesure où les isoformes du récepteur ont des affinités simi-
laires pour la mélatonine mais des signaux biologiques différents, une telle
régulation
pourrait moduler la réponse cellulaire à la stimulation par la mélatonine.
Le rôle du GMPc comme second messager dans la voie biologique
du récepteur à la mélatonine est encore controversé. L'agrégation pigmentaire
dans les
mélanocytes de Xenopus sont régulés par la mélatonine et par l'AMPc alors que
des
résultats contradictoires existent en ce qui concerne sa régulation par le
GMPc. Le rôle
du GMPc dans la stimulation de signaux biologiques liés à la mélatonine dans
d'autres
systèmes cellulaires n'a pas été approfondie. Un second argument en faveur de
la
modulation du GMPc par les récepteurs à la mélatonine ressort des essais
réalisés sur le
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
23
tissu d'hypophyse de rat néonatal clans lequel un effet inhibiteur de la
mélatonine sur la
production de GMPc est observé. Dans les essais tels que rapportés ci-dessus,
les
récepteurs Mellc(a) et Mel1c(R) activés par la mélatonine inhibent
effectivement
l'accumulation de GMPc d'une manière dose-dépendante avec une valeur d'IC5o
d'environ 10-9 M. Cette inhibition n'est évidente que lorsque l'inhibiteur du
PDE
IBMX est inclut dans le milieu d'incubation, sans doute en raison d'une
activité basale
PDE importante dans les cellules L.
Les données rapportées ci-dessus confirment que les récepteurs de la
mélatonine à haute affinité peuvent moduler le GMPc à concentration
physiologique de
mélatonine et montrent que les récepteurs MeII,,(R) sont fonctionnels en terme
de
transduction du signal.
L'effet des récepteurs sur le GMPc est complètement aboli par la
toxine de Pertussis, indiquant que les protéines G;/o sont impliquées dans la
transduc-
tion de ce signal.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nul-
lement à ceux de ses modes de nûse en oeuvre, de réalisation et d'application
qui vien-
nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire
toutes les
variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans
s'écarter du
cadre, ni de la portée, de la présente invention.
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
24
LISTE DE SEOUENÇES
(1) INFORMATIONS GENERALES
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: ADIR et CIE
(B) RUE: 1 rue Carle Hebert
(C) VILLE: COURBEVOIE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92415 CEDEX
(A) NOM: JOCKERS Ralf
(B) RUE: 24 rue Lazare Hoche
(C) VILLE: PALAISEAU
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 91120
(A) NOM: MARULLO Stefano
(B) RUE: 3 Place de l'escadrille Normandie Niemen
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013
(A) NOM: STROSBERG Arthur Donny
(B) RUE: 66 rue de Javel
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR DES
RECEPTEURS DE LA MELATONINE ET LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 95 08947
(B) DATE DE DEPOT: 24-JUL-1995
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1311 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1065
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATG ATG GAG GTG AAT AGC ACT TGC TTG GAT TGC AGG ACA CCT GGT ACC 48
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
ATA CGA ACA GAG CAG GAT GCA CAG GAC AGC GCA TCT CAG GGA CTC ACC 96
I1e Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gin Gly Leu Thr
20 25 30
TCT GCC CTG GCG GTG GTT CTT ATA TTC ACC ATT GTT GTG GAT GTC CTG 144
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr I1e Val Val Asp Val Leu
40 45
GGC AAT ATA TTG GTC ATT TTG TCT GTC CTG AGG AAC AAG AAG CTG CAG 192
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln
50 55 60
AAT GCT GGA AAT CTC TTT GTT GTC AGT TTG TCT ATT GCC GAT CTG GTT 240
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
65 70 75 80
GTT GCT GTG TAT CCC TAT CCG GTA ATT CTC ATA GCT ATT TTC CAG AAT 288
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
85 90 95
GGG TGG ACG CTT GGA AAT ATC CA7' TGT CAG ATC AGT GGC TTC CTG ATG 336
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met
100 105 110
GGA CTC AGC GTT ATT GGA TCA GTC TTC AAC ATA ACA GCC ATA GCT ATC 384
Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
115 120 125
AAC AGG TAT TGC TAC ATC TGC CAC AGC CTG AGA TAT GAC AAG CTT TAT 432
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr
130 135 140
AAT CAA AGA AGC ACC TGG TGC TAC CTT GGC CTG ACA TGG ATA CTA ACT 480
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
145 150 155 160
ATA ATT GCA ATC GTG CCA AAC TTT TTT GTT GGA TCA CTA CAG TAT GAC 528
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
165 170 175
CCC AGG ATT TTT TCT TGC ACA TTT GCG CAG ACA GTG AGT TCC TCA TAC 576
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
180 185 190
ACC ATA ACA GTA GTG GTG GTG CAT TT'.C ATA GTC CCT CTT AGT GTT GTG 624
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
195 200 205
ACA TTC TGT TAC TTA AGA ATA TGG GTT TTA GTG ATC CAA GTC AAA CAC 672
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His
210 215 220
AGA GTT AGA CAA GAC TTC AAG CAA AAG TTG ACA CAA ACA GAC TTG AGA 720
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg
225 230 235 240
AAT TTC TTG ACC ATG TTT GTG GTC TTT GTA CTT TTT GCA GTT TGC TGG 768
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
245 250 255
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
26
GCC CCC TTA AAC TTT ATC GGC CTT GCT GTG GCC ATT AAT CCG TTT CAT 816
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His
260 265 270
GTG GCA CCA AAG ATT CCA GAA TGG CTG TTT GTT TTA AGC TAT TTC ATG 864
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met
275 280 285
GCC TAT TTT AAC AGT TGT CTC AAT GCT GTT ATA TAT GGT GTG CTA AAT 912
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn
290 295 300
CAA AAC TTC CGC AAG GAG TAC AAA AGA ATA CTG ATG TCC TTA TTG ACT 960
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr
305 310 315 320
CCA AGA CTG TTG TTT CTT GAC ACA TCT AGA GGA GGA ACT GAG GGA TTG 1008
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
325 330 335
AAA AGT AAG CCT TCG CCA GCT GTA ACC AAC AAC AAT CAA GCA GAT ATG 1056
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
340 345 350
TAC GTG TAA ACACAGCTTT CCACCAATAT GTACTCTGTT TCAACTATGA 1105
Tyr Val *
355
ATACAAGTTT CTTTTATGGC AGTTGCACCA TGTGCCTAAT TCTGTCCATT CATTCTAAAA 1165
TTTTTGTATA AACATACATT CTGTTGGTTT GACAGGGACA AGAGGTCTTG CTTCTCTGCA 1225
GAAAAGAAAT ATTTTGAAAT CTTGGCTGAT TTGTTATTAA TAACCATAAA TGGAATATCT 1285
TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GAATTC 1311
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr
20 25 30
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gin
50 55 60
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
65 70 75 80
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
85 90 95
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/1FR96/01167
27
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gin Ile Ser Gly Phe Leu Met
100 105 110
Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
115 120 125
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr
130 135 140
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
145 150 155 160
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
165 170 175
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
180 185 190
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
195 200 205
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His
210 215 220
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg
225 230 235 240
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
245 250 255
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His
260 265 270
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser
275 280 Tyr Phe Met
285
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn A].a Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn
290 295 300
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr
305 310 315 320
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
325 330 335
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
340 345 350
Tyr Val *
355
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1147 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE:
.(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1065
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
28
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG ATG GAG GTG AAT AGC ACT TGC TTG GAT TGC AGG ACA CCT GGT ACC 48
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
ATA CGA ACA GAG CAG GAT GCA CAG GAC AGC GCA TCT CAG GGA CTC ACC 96
Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr
TCT GCC CTG GCG GTG GTT CTT ATA TTC ACC ATT GTT GTG GAT GTC CTG 144
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu
GGC AAT ATA TTG GTC ATT TTG TCT GTC CTG AGG AAC AAG AAG CTG CAG 192
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln
AAT GCT GGA AAT CTC TTT GTT GTC AGT TTG TCT ATT GCC GAT CTG GTT 240
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
GTT GCT GTG TAT CCC TAT CCG GTA ATT CTC ATA GCT ATT TTC CAG AAT 288
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
GGG TGG ACG CTT GGA AAT ATC CAT TGT CAG ATC AGT GGC TTC CTG ATG 336
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met
GGA CTC AGC GTT ATT GGA TCA GTC TTC AAC ATA ACA GCC ATA GCT ATC 384
Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
AAC AGG TAT TGC TAC ATC TGC CAC AGC CTG AGA TAT GAC AAG CTT TAT 432
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr
AAT CAA AGA AGC ACC TGG TGC TAC CTT GGC CTG ACA TGG ATA CTA ACT 480
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
ATA ATT GCA ATC GTG CCA AAC TTT TTT GTT GGA TCA CTA CAG TAT GAC 528
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
CCC AGG ATT TTT TCT TGC ACA TTT GCG CAG ACA GTG AGT TCC TCA TAC 576
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
ACC ATA ACA GTA GTG GTG GTG CAT TTT ATA GTC CCT CTT AGT GTT GTG 624
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
ACA TTC TGT TAC TTA AGA ATA TGG GTT TTA GTG ATC CAA GTC AAA CAC 672
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His
AGA GTT AGA CAA GAC TTC AAG CAA AAG TTG ACA CAA ACA GAC TTG AGA 720
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg
AAT TTC TTG ACC ATG TTT GTG GTC TTT GTA CTT TTT GCA GTT TGC TGG 768
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
GCC CCC TTA AAC TTT ATC GGC CTT GCT GTG GCC ATT AAT CCG TTT CAT 816
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His
GTG GCA CCA AAG ATT CCA GAA TGG CTG TTT GTT TTA AGC TAT TTC ATG 864
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met
GCC TAT TTT AAC AGT TGT CTC AAT GCT GTT ATA TAT GGT GTG CTA AAT 912
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn
CAA AAC TTC CGC AAG GAG TAC AAA AGA ATA CTG ATG TCC TTA TTG ACT 960
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr
CCA AGA CTG TTG TTT CTT GAC ACA TCT AGA GGA GGA ACT GAG GGA TTG 1008
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
29
AAA AGT AAG CCT TCG CCA GCT GTA ACC AAC AAC AAT CAA GCA GAT ATG 1056
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
TAC GTG TAA ACACAGCTTT CCACCAATAT GTACTCTGTT TCAACTATGA 1105
Tyr Val *
ATACAAGTTT CTTTTATGGC A.AAAAAAA.AA AAAAAAGAAT TC 1147
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gin Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr
20 25 30
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln
50 55 60
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
65 70 75 80
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
85 90 95
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met
100 105 110
Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
115 120 125
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr
130 135 140
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
145 150 155 160
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
165 170 175
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
180 185 190
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
195 200 205
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His
210 215 220
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg
225 230 235 240
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
245 250 255
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His
260 265 270
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met
275 280 285
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn
290 295 300
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr
305 310 315 320
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
325 330 335
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
340 345 350
Tyr Val *
355
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1312 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1-.1065
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
ATG ATG GAG GTG AAT AGC ACT TGC TTG GAT TGC AGG ACA CCT GGT ACC 48
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
ATA CGA ACA GAG CAG GAT GCA CAG GAC AGC GCA TCT CAG GGA CTC ACC 96
Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr
TCT GCC CTG GCG GTG GTT CTT ATA TTC ACC ATT GTT GTG GAT GTC CTG 144
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu
GGC AAT ATA TTG GTC ATT TTG TCT GTC CTG AGG AAC AAG AAG CTG CAG 192
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln
AAT GCT GGA AAT CTC TTT GTT GTC AGT TTG TCT ATT GCC GAT CTG GTT 240
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
GTT GCT GTG TAT CCC TAT CCG GTA ATT CTC ATA GCT ATT TTC CAG AAT 288
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
GGG TGG ACG CTT GGA AAT ATC CAT TGT CAG ATC AGT GGC TTC CTG ATG 336
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met
GGA CTC AGC GTT ATT GGA TCA GTC TTC AAC ATA ACA GCC ATA GCT ATC 384
Gly Leu Ser,Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
AAC AGG TAT TGC TAC ATC TGC CAC AGC CTG AGA TAT GAC AAG CTT TTT 432
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
31
AAT CAA AGA AGC ACC TGG TTC TAC CTT GGC CTG ACA TGG ATA CTA ACC 480
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
ATA ATT GCC ATT GTG CCA AAC TTT TTT GTT GGA TCA CTA CAG TAT GAC 528
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
CCC AGG ATT TTC TCT TGC ACA TTT GCG CAG ACC GTA AGT TCC TCA TAC 576
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
ACC ATA ACA GTA GTG GTA GTG CAT TTT ATA GTC CCT CTT AGT GTT GTG 624
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
ACA TTC TGC TAC TTA AGA ATA TGG GTT TTA GTG ATC CAA GTC AAA CAC 672
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His
AGA GTT AGA CAA GAC TTC AAG CAA AAG TTG ACA CCA ACA GAC TTG AGA 720
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gin Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg
AAT TTC TTG ACC ATG TTT GTG GTC TTT GTA CTT TTT GCC GTT TGC TGG 768
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
GCA CCC TTG AAT TTT ATC GGC CTT GCT GTG GCC ATT AAC CCA CTC CAC 816
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His
GTG GCA CCA AAG ATT CCA GAG TGG TTG TTT GTG TTA AGC TAT TTC ATG 864
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met
GCC TAT TTT AAC AGC TGT CTC AAT GCT GTC ATC TAC GGT CTG CTA AAT 912
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn
CAA AAC TTC CGC AAG GAA TAC AAA CGA ATA TTG ATG TCC TTA TGG ACT 960
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr
CCA AGA CTG TTG TTT CTT GAC ACA TCT AGA GGA GGA ACT GAG GGA TTG 1008
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
AAA AGT AAG CCT TCG CCA GCT GTA ACC AAC AAC AAT CAA GCA GAT ATG 1056
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
TAC GTG TAA ACACAGCTTT CCACCAATAT GTACTCTGTT TCAACTATGA 1105
Tyr Val *
ATACAAGTTT CTTTTATGGC AGTTGCACCA TGTGCCTAAT TCTGTCCATT CATTCTAAAA 1165
TTTTTGTATA AACATACATT CTGTTGGTTT GACAGGGACA AGAGGTCTTG CTTCTCTGCA 1225
GAAAAGAAAT ATTTTGAAAT CTTGGCTGAT TTGTTATTAA TAACCATAAA TGGAATATCT 1285
TTAAAAAAAA P.AAAAAAAAA AGAATTC 1312
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
32
Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr
20 25 30
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln
50 55 60
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
65 70 75 80
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
85 90 95
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met
100 105 110
Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
115 120 125
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe
130 135 140
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
145 150 155 160
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
165 170 175
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
180 185 190
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
195 200 205
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His
210 215 220
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg
225 230 235 240
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
245 250 255
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His
260 265 270
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met
275 280 285
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn
290 295 300
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr
305 310 315 320
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
325 330 335
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
340 345 350
Tyr Val *-
355
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/OI 167
33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1147 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1...1065
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATG ATG GAG GTG AAT AGC ACT TGC TTG GAT TGC AGG ACA CCT GGT ACC 48
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
ATA CGA ACA GAG CAG GAT GCA CAG GAC AGC GCA TCT CAG GGA CTC ACC 96
Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gin Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr
TCT GCC CTG GCG GTG GTT CTT ATA TTC ACC ATT GTT GTG GAT GTC CTG 144
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu
GGC AAT ATA TTG GTC ATT TTG TCT GTC CTG AGG AAC AAG AAG CTG CAG 192
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gin
AAT GCT GGA AAT CTC TTT GTT GTC AGT TTG TCT ATT GCC GAT CTG GTT 240
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
GTT GCT GTG TAT CCC TAT CCG GTA ATT CTC ATA GCT ATT TTC CAG AAT 288
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
GGG TGG ACG CTT GGA AAT ATC CAT TGT CAG ATC AGT GGC TTC CTG ATG 336
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gin Ile Ser Giy Phe Leu Met
GGA CTC AGC GTT ATT GGA TCA GTC TTC AAC ATA ACA GCC ATA GCT ATC 384
Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
AAC AGG TAT TGC TAC ATC TGC CAC AGC CTG AGA TAT GAC AAG CTT TTT 432
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe
AAT CAA AGA AGC ACC TGG TTC TAC CTT GGC CTG ACA TGG ATA CTA ACC 480
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
ATA ATT GCC ATT GTG CCA AAC TTT TTT GTT GGA TCA CTA CAG TAT GAC 528
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
CCC AGG ATT TTC TCT TGC ACA TTT GCG CAG ACC GTA AGT TCC TCA TAC 576
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
ACC ATA ACA GTA GTG GTA GTG CAT TTT ATA GTC CCT CTT AGT GTT GTG 624
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
ACA TTC TGC TAC TTA AGA ATA TGG GTT TTA GTG ATC CAA GTC AAA CAC 672
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His
AGA GTT AGA CAA GAC TTC AAG CAA AAG TTG ACA CCA ACA GAC TTG AGA 720
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg
AAT TTC TTG ACC ATG TTT GTG GTC TTT GTA CTT TTT GCC GTT TGC TGG 768
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
34
GCA CCC TTG AAT TTT ATC GGC CTT GCT GTG GCC ATT AAC CCA CTC CAC 816
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His
GTG GCA CCA AAG ATT CCA GAG TGG TTG TTT GTG TTA AGC TAT TTC ATG 864
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leû Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met
GCC TAT TTT AAC AGC TGT CTC AAT GCT GTC ATC TAC GGT CTG CTA AAT 912
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn
CAA AAC TTC CGC AAG GAA TAC AAA CGA ATA TTG ATG TCC TTA TGG ACT 960
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr
CCA AGA CTG TTG TTT CTT GAC ACA TCT AGA GGA GGA ACT GAG GGA TTG 1008
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
AAA AGT AAG CCT TCG CCA GCT GTA ACC AAC AAC AAT CAA GCA GAT ATG 1056
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
TAC GTG TAA ACACAGCTTT CCACCAATAT GTACTCTGTT TCAACTATGA 1105
Tyr Val *
ATACAAGTTT CTTTTATGGC AAAAAAAAAA AAAAAAGAAT TC 1147
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr
20 25 30
Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln
50 55 60
Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val
65 70 75 80
Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn
85 90 95
Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met
100 105 110
Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile
115 120 125
Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe
130 135 140
Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr
145 150 155 160
Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp
165 170 175
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCTIFR96/01167
Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr
180 185 190
Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val
195 200 205
Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val ile Gln Val Lys His
210 215 220
Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg
225 230 235 240
Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp
245 250 255
Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His
260 265 270
Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met
275 280 285
Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn
290 295 300
Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr
305 310 315 320
Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu
325 330 335
Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met
340 345 350
Tyr Val *
355
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
AGAAATGATG GAGGTGAATA GCA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
36
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CGGCAATAGA CAAACTGACA ACA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
TATTGGTCAT TTTGTCTGTC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CCAGGTGCTT CTTTGATTAT 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CTTCAACATA ACAGCCATAG C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
CA 02227554 1998-01-20
W O 97104094 PCT/FR96/01167
37
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
TGCTTGATTG TTGTTGGTTA C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
TATGGTGTGC TAAATCAAAA CTTCCGCAAG GAGTA 35
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
TACTGATGTC CTTATTGACT CCAAGACTGT TGTTT 35
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
AGAAATGATG GAGGTGAATA GCA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
TTAGAATGAA TGGACAGAA 19
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
38
No de la domand= Interntttonale: PCT/
MICRO.ORGANISMES
Fauil4 facuMattre rNaU.s au micro-orpanlsme m..+Uonn1 .n ~o -- 4-- -- . Mn..
15
da la d.scnptfon t
A. IDENTIFICATION Du DâPOT +
D'autrM dlpdta aont -d.ntMls sur un. hultta supplln euakm
Nww de t'InaUtutlon I. d,60Ot ~ Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes
AdrvssN d. 19nsUlutfon ds ddpOt (y compris I. cod. oostal .t I. paya) 4
28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15
oate du dépet = 7 juin 1995 I N- d' fdfe 6 I-1 5 8 3
S. INDICATIONS 3U/pLEMENTA1REf r(l n= r.mpllr au4 al nac.aaus). Un= f.ullle
séparla =tt loint= pour La sotte de c.s
r.nsNon.m.nts n
"En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un
brevet européen est demandé, un.échantillon du micro-
organisme déposé ne sera accessible, jusqu'à la publication
de la mention de la délivrance du brevet européen ou
jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée
ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un
expert désigné par le requérant. (règle 28.4) de la CBE)'r.
C. tTATi 0[fItSN[S POUR LIiOUELS LE: )MDICATION3 SONT DONNLE= s(sl Na
indluUons n. sont pas donni.s pour
tous La Etats dlslpMS)
EUROPE JAPON
AUSTRALIE NORVEGE
CANADA NOUVELLE-ZELANDE
CHINE ETATS-UNIS D'AMERIQUE
0. INOICATION= FOURNIES 99PARÉMENT s(à na nenpMr au. fl nlc.ssaln)
L.s indlcations Inumiri.a cl-apNs s.ront aoumisas uitérNurnm.nt au Cursau
Intsrnatlonal +(spocln.r 14 nsturt pdndralt d.a rndl- catlons p. .+., . No
d'orare ou dépOt s)
E. C La prla.nts laurlls a/ti rKu. arK la dlmande int.rnationali lorsoue c-tls-
cl aét1 daposN (i v{ r r l'ofRce rft.pt.ur) (Fonctlonnalre autorls4)
Oate de réception (.n pfo.snance du déposant) par iN Sur.au Intarnatfonal t= P
L
V
(Fonctlonnaln autodal) C
Formulair. PCTlRO/134 (Janrl.r 1Mt)
CA 02227554 1998-01-20
WO 97/04094 PCT/FR96/01167
39
No d4 la domand= Intern4tiondlt: PCT/
MICRO.ORGANIS MES
FWiifd 1iCY1[aUPtl rWtl~a 1Y mICrV-0rpanllm0 mMUpnrti pn ppM .-= =^ __. L~M 21
N Id d~atrtprl0n t
A. IOENTIf'1CATION DU DIPOT t
O'avtraa ddp6ü sont dantMia sw una hultla suppldmo..taks s U
Nom de t'instRUSf" de 06p0t 4
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
Adrsssa de Iinst)tvtlon de dipOt (y compris lo codi roostai N Is pays) 4
28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15
Datd du dlp0t a N. d'ordra a
7 juin 1995 I-1584
t. (NDICATIONs 3UPPLEM[NTAIR[i (i n= rampilr que d nicassain). Une laui)h
Npari= dat )oinl= pour la autt= da cia
ranaNpnamenta CD
"En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un
brevet européen est demandé, un échantillon du micro-
organisme déposé ne sera accessiblé, jusqu'à la publication
de la mention de la délivrance du brevet européen ou
jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée
ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un
expert désigné par le requérant. (règle 28.4) de la CBE)".
C. âTATi DgalliNilf POUR LIiOU[Lf L[f INDICA7IONi :ONT DONN[Es s(si INa
indlutlona ne sont pas donnias pow
tous laa Etats dldpMa)
EUROPE JAPON
AUSTRALIE NORVEGE
CANADA . NOUVELLE-ZELANDE
CHINE ETATS-UNIS D'AMERIQUE
D. INDICATION= FOURNI[s f~PAREM[NT s(~ M rsmpAr t,u~ s~ ndc-ssaln)
Laa indlcationa inum{Nss eI.apris st=ront aovmisn ulthNwamdnt au Oursau
intarnational r(spdelflar ta nature qdniralo dN indi=
CatiOn= p. =i., a No d'ordré du d1p01 s)
. E. C La prtaanta laudlr a dti r.<ua arec la damanda ~ntarnattonala IoraOVa
Calla-cl a il/ dipoaN (!t rinn par l'offict= ricaptaur)
= (Fonctionnaire sutoriad)N_-
~ Dato de rlctrpIJon (an plorananco du diposant) p4r N ffiuraau InldrMtloMl t=
O~
t~
(Fonctlonna)ra autorisl) c
O
Formulair= PCTIRO1134 (Janvier 1941)
