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PCTAFR96/01093
WO 97/06276
TFST CO-DOMINANT DE DIAGNOSTIC GENFTIQUE
La présente invention porte sur un test de diagnostic génétique co-
dominant, c'est-à-dire qu'il permet de disli,,y~er dans une population des
individus homozygotes et hétérozygotes pour un allèle polymorphe.
Une méthode de détection rapide et efficace de mutation ponctuelle
au niveau de l'ADN génomique est essentielle à l'identification des
polymorphismes aussi bien pour des études génétiques et la prévision d'un
o risque de pathologie lié à ce polymorphisme, que pour l'étude des bases
molécuiaires des maladies héréditaires, et à la mise au point d'un test de
diagnostic génétique.
Dans tout ce qui suit on parlera de mutation ponctuelle, ce terme
englobant un cnangement de séquence soit une transition, soit une
transversion, soit une délétion ou une addition de nucléotides; y sont
incluses plus généralement les transitions, transversions, déletions ou
additions de 1 à 6 nucléotides.
Ce type de ",éll,ode de détection rapide, erricace, et peu onéreuse
peut être, de ~açon plus générale, appliquée à la détection de mutations de
toute organisme vivant, que ce soit des micro-organismes, ou des animaux
ou des plantes, la méthode présentant essentiellement un intérêt pour les
organismes diploïdes. Les dor"a"les d'appJication de ce type de détection
peuvent ainsi s'étendre du secte~lr agro-alimentaire, la médecine ou le
diagnostic vétérinaire ou enfin la sélection animale ou végétale.
La PCR (1 ) a fait ~aire un grand pas à l'analyse de l'ADN génomique.
Sa technique a permis le diagnostic de maladies génétiques quand elles
sont combinées avec d'autres techniques (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9); cela peut
être la combinaison de la PCR et le séquençage direct (2, 3, 4, 10) ou, la
technique appelée Oligo-nucléotide Spéci~ique d'Allèle (ASO) (11, 12).
Dans certains cas, I'apparition d'une mutation ponctuelle peut créer
ou détruire un site de reconnaissa,-ce d'une enzyme de restriction (13); la
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pr~se"ce ou l'absence de ce site de restriction peut être utilisée pour
réaliser des diagnostics comme cela a éte récemment démontré pour un
diagnostic d'anémie falciforme (7); de la meme manière un polymorphisme
de restriction peut être lié à une mutation non caractérisée qui permet
d'établir un diagnostic dans des familles par analyse de ce polymorphisme
après amplification. De nombreuses techniques ont été développées avec
pour objectif de permettre la detection de ces mutations en combinant la
PCR avec d'autres types de réactions. Il s'agit r~ola""~ent:
- de la technique appelée "PCR amplification of specific alleles" (PASA) qui
o est une modification de la technique PCR par l'utilisation soit d'une a",or~e
oligo-nucléotidique qui s'hybride avec l'allèle sauvage mais qui ne
s'hybride pas avec l'allèle mutant soit l'inverse: le produit amplifié sera
donc spécifique de l'allèle pour lequel ont eté choisies les amorces et
l'amplification se trouve alors inefficace si il n'y a pas d'hybridation de
I'amorce avec l'allèle cor,espondant (14);
- HEIM and al. (15) ont utilisé un jeu d'a",orces dirrért:,ll pour amplifier lesdeux allèles ces amplifications étant suivies par une PCR spécifique
d'allèle;
- SCHUSTER and al (16) ont combiné la PCR asymétrique avec la PCR
spécifique d'allèle en utilisant un jeu de 3 amorces oligo-nucléotidiques
dans un seul mélange réactionnel pour détecter une mutation ponctuelle
dans le gêne de l'apoB; mais cette technique simple ne permet pas de
distinguer pour les maladies récessives les individus porteurs d'un seul
allèle muté des individus malades qui ont leurs deux allèles mutés.
2~i D'autres méthodes ont été appliquées notamment pour mettre en
évidence la création par mutation d'un site de restriction à partir d'un
produit d'amplification. Ceci a été utilisé nolan""ent pour la détection de
l'hemophilie B (17) ou de l'hémophilie A (18).
Dans toutes leurs mises en oeuvre les techniques de test de
diagnostic décrites sont peu propices à une utilisation large dans la
population car elles nécessitent soit des étapes lourdes complexes
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chères et mettant en oeuvre un savoir-faire technique de haut niveau, soit
ne permettent pas de différencier des individus homozygotes et
hétérozygotes; d'autres techniques telles les oligonucléotides spécifiques
d'allèles sont de types dominants et ne permettent pas de differencier un
individu hol,-o~ygote d'un individu hétérozygote ayant un allèle normal et
un allèle mutant. Or pour ce qui est du dia~noslic génétique et nola"llllent
de la prévision du risque dans des pOpl ll~tions données vis-à-vis de
matadies génétiques, il est extrêmement important de pouvoir identifier ces
deux populations sans mettre en oeuvre des techniques complexes et
o chères.
La présente invention permet de su~monler les inconvénients des
différentes techniques décrites dans la littérature et notdl 1 ll l lent de
S'drrl dl IC hir de l'utilisation de radio-eléments ; elle est relative à une
méthode de détection de l'état hGmo~ygote ou hétérozygote d'une mutation
présumée dans un acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle met en
oeuvre deux amplifica~ions d'acides nucléiques, ces deux amplifications
demandant en oeuvre respectivement au moins deux couples d'amorces:
- le premier couple est consLiL-Ié d'un oligo-nucléotide spécifique de l'allèle
sauvage (A) et d'un 2ème oligo-nucléotide (B) clirr~le,-L de (A),
- le deuxième couple est consLiLué d'un oligo-nucléotide spécifique de
l'allèie mutant (A') et d'un deuxième oligo-nucléotide (C), lui-même étant
différent de (A') et de (B),
la différence de longueur entre les fragments amplifiés entre (A) et (B) et
entre (A') et (C) étant suffisante pour être détectée par des méthodes
d'analyse classique.
Ces deux amplifications sont simultanées.
Par simultanée, il est entendu que les produits de la réaction sont
analysés simultanément par des méthodes classiques r lolal 1 ,l l lent de
séparation analytique ou préparative d'ADN nolanl~nel-t I'électrophorèse en
gel de polyacrylamide ou en gel d'agarose; néar,-noil-s il va de soit pour
l'homme du métier que toute autre méthode d'analyse, comme la
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chrc""alographie, de la taille des fragments amplifiés doit être considérée
comme moyen équivalent dans la méthode de l'invention.
Les deux réactions d'amplification peuvent être réalisées soit dans
deux mélanges réactionnels dirre~e"ls si (A) et (A') sont complémentaires
de la même chaîne d'ADN, soit ré~lisees dans le même mélange
réactionnel si (A) et (A') sont compléme~taires des brins (+) et (-) de l'ADN
respectivement.
En particulier, les différences de longueurs peuvent être détectées
par l'existence de deux bandes différentes après une migration en
o électrophorèse en gel d'agarose par exemple; mais il va de soi que à partir
du moment où les méthodes de détection vont s'affiner, les différences de
longueurs entre les fragments amplifiés pourront être réduites.
De manière plus générale, toute technique d'amplification d'une
sequence d'ADN qui comprend l'ulilisaliG, . d'au moins deux amorces et
d'une polymérase permettant de synthétiser la séquence complémentaire
comprise entre les deux a,norces, et quel qu'en soit son perfectionnement,
peut être appliquée à la mise en oeuvre de l'invention qui, pour cette
demière, réside dans l'utilisation simultanée de deux couples d'a",orces
differents, et de la visualisation simultanée des produits de PCR.
Des couples d'amorces (A) et (B) d'une part, (A') et (C) d'autre part,
peuvent être symétriq~les ou inversés, autrement dit (A) et (A') hybridables
avec un même brin de la double hélice, et (B) et (C) avec l'autre brin, ou au
contraire, le couple (A) (B) d'une part, et le couple (A') (C) d'autre part,
peuvent être inversés, c'est-à-dire (A) et (A'~ sont hybridables aux brins
complémentaires de la chaîne d'ADN, tout comme (B) et (C).
Dans la première branche de l'alternative, les deux amplifications
réalisées par les deux couples d'amorces doivent être réalisées
séparément, puis les produits de la réaction doivent être mélangés pour
être analysés par les méthodes classiques.
En revanche, dans la deuxième branche de l'altemative, les produits
de la réaction peuvent être mélangés dès le départ, I'amplification entre (A)
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et (C) ne pouvant alors être réalisée. Mais, dans ce demier cas, les
a",olces (A) et (A') devront avoir une séquence suffisamment différente
pour éviter une hybridation parasite entre (A) et (A') dans le melange
réactionnel. Le seul impératif est que (A) et (A') soient porteurs du
nucléotide correspondant à celui dont la mutation est recherchée.
Enfin, cette technique peut être mise en oeuvre quel que soit
l'organisme contenant l'ADN, à savoir micro-organisme, bactéries, virus,
animaux ou plantes, mais présente un intérêt certain pour les organismes
diploïdes ou polyploïdes.
L'utilité de cette nouvelle technique a été démontrée pour identifier
une mutation dans des populations Amish du Sud de l'lndiana porteuses
d'un gêne codant pour une protéine impliquée dans une maladie
tosomale récessive: de type dystrophie musc~ ire des ceintures.
Si la méthode PCR cl~csiq~ ~e s'est avérée extrêmement puissante
pour amplifier des séquences cibles, nolal"",enl dans des génomes
complexes, il arrive souvent que de petites bandes parasites artéfactuelles
~ppci,aissent dans le spectre des bandes obtenues après amplification.
Cela est souvent i~ler,urtté comme une erreur d'amorçage sur la chaîne
cible ; aussi R.H. DON (19) a-t-il mis au point une technique dite
"touchdown" qui permet d'éliminer ces ~ r;3~,ls d'une façon beaucoup plus
rigoureuse, que les techniques utilisées préalablement qui étaient
essentiellement des ajustements en conce, lll dlion de magnésium ou
l'augme"lalio" de la température d'hybridation de l'amorce avec l'ADN. La
méthode de ~ Touchdown ~ tire parti de la nature exponentielle de la
2~ réaction PCR qui peut commencer au-dessus de la temperature
d'hybridation standard: la temperature de la réaction coi"",el,ce 5 à 10~C
au-dessl 's de cette température d'hybridation (par exemple 65~C) puis
decroît régulièrement de 1 à 2~C par cycle jusqu'à l'obtention de ta
temperature d'hybridation standard par cette technique; toute différence
de Tm entre les réapparie" ,enls corrects et incor, ~cls va donner un
avantage au produit correct vis à vis du produit incorrect, toutes choses
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étant égales par ailleurs. Ainsi une différence de 5~ permet de donner un
avantage de 45 fois (19).
Afin d'éviter les risques d'erreurs inhérents aux techniques
d'amplification, dans la méthode selon l'invention les fragments amplifies
ont de prérére"ce des longueurs respectives co"",rises entre 50 et 200
nucléotides; en outre et pour que l'ider,Liricalion des segments amplifiés
entre (A) et (B) d'une part et (A') et (C) d'autre part ne présente pas de
carac;lère d'ambigufté la ~irrer~nce de longueur doit être de préférence
d'au rnoins 10%. La méthode de l'invention est particulièrement
o intéressante à mettre en oeuvre pour la détection de mutations ponctuelles
telle que définies ci-dessus.
L'invention porte également sur une trousse ou kit de diagnostic de
présumées mulaliol ,s ponctuelles I ,or"o~ygotes ou hétérozygotes et est
cara~;lérisée en ce qu'elle contient au moins:
a) une polymérase II,e""ostable;
b) un premier couple d'a")orces constitué d'un oligo-nucléotide (A)
spécifique de l'allèle sauvage et d'un deuxième oligo-nucléotide spécifique
(B) distinct de (A);
c) un deuxième couple d'al "orces constitué d'un oligo-nucléotide
spécifique de l'allèle mutant (A') et d'un deuxième oligo-nucléotide (C)
distinct de (A) la taille des fragments amplifiés entre les amorces (A) et (B)
d'une part et les amorces (A') et (C) d'autre part dirréranl de prér~rence
d'au moins 10%.
La trousse co, Iru~ I,,ément à l'invention contient outre les quatre
a",olc;es (A) (A') (B) (C) ci-dessl~s tous les élémenl~ qui permettent de
réaliser une amplification par PCR ou toute méthode pel rec Liol " ,ée et
dérivée et notamment la méthode dite de '~ouchdown ~ PCR.
La trousse co"rc,r" ,ément à l'invention est plus particulièrement
utilisable pour ~étecler ou identifier l'état homozygote ou hétérozygote de
mutations ponctuelles que ces mutations soient des transitions ou des
transversions. De fait par ces deux amplifications simultanées on aboutit à
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une lecture aisément i"Le"~)rétable d'un test de diagnostic co-dominant
qu'aucun des procédés précédents ne permettaient.
Une telle trousse de diagnostic col ,rO, ."ément à l'invention peut
trouver aussi bien son application dans le cJo",ai"e de la santé humaine
OU animale que dans tout autre secte~ Ir d'appiication tel l'environnement
les semences ou l'agro-alimentaire pour lesquels la détection et le suivi de
l'état sanitaire ou infectieux du milieu peut être i",po, Lal)l.
Le diag"oslic peut etre également appliqué dans un processus de
sélection d'animaux ou de semences.
o Les exemples suivant ainsi que les figures qui leur sont annexées
sans être limitatifs ~"G"l,e"l la pe,ro",)ance de l'invention sur la détection
d'une mutation ponctuelle dans le gène LGMD2E codant pour la protéine
impliquée dans un type de dystrophie ml ~sc~ IlAire des ceintures.
La figure 1 est un schéma qui illustre le système de l'invention quand
les couples d'a,),o,ces sont symétriques. Dans cette figure N correspond à
l'allèle normal et M à l'allèle mutant. Les flèches représentent les amorces
et le sens reflète le sens ~' ~ 3'.
La figure 2 est un schéma qui illustre le système de l'invention quand
les couples d'a",o,ces sont antisymétriques. N et M et les flèches ont la
même signification que dans la figure 1.
La figure 3 illustre la ségrégation de la substitution thréonine vers
l'arginine dans une population Amish. Dans cette figure la ligne A présente
le pedigree de la famille A620 dans laquelle les individus affectés ou sains
sont indiqués par des symboles noirs ou blancs respectivement. Par
~ sains ~ il est entendu que les individus peuvent être non porteurs ou
porteurs hétérozygotes; B représente le résultat obtenu en éleclruphorèse
par gel d'agarose des mélanges des produits d'amplification par
a Tûuchdown ~ PCR des fragments de 100 et de 158 paires de base
respectivement; C représente la ségrégation des haplotypes sur le
chromosome 4 au sein de la famille; les cl"~""osor"es portant la mutation
sont entourés et le CA12T représente le micro-satellite i"tla53énique.
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Exemple de r~5alis~tion:
Les Figures 1 et 2 illustrent la technologie de l'invention. Dans cet
exemple les amorces ont toutes une longueur de 20 nucléotides.
5 a) Cas où les couDles d'amorces (A)fB) d'une Part et (A')(C) d'autre Part
sont svmétriques:
Ce cas est représenté dans la figure 1.
Dans cette fiqure le premier couple d'a",orces (A)(B) spécifique de
l'allèle normal permet d'obtenir un produit d'amplification de 180 pb; en
effet I'amorce (B) est située à 140 pb en aval du nucléotide dont la
mutation est recherchée et l'a",orc;e (A) contient ledit nucléotide à son
extrémité 3'.
Le second couple d'amorces (A')(C) qui sert à identifier le génotype
mutant a une a"-orce identique à l'a",or~e (A) mais possède à la place du
lS nucléotide normal en 3' le nucléotide muté M. L'autre amorce (C) en aval
de la mutation sera choisie de telle ~açon que le produit obtenu par PCR
soit significativement dirrérent du produit (A)(B) ici de 120 pb.
Lorsque les produits d'amplification sont mélangés après la phase de
PCR puis déposés sur un qel d'agarose à 4% contenant du bromure
d'éthidium en tampon TBE1X on obtient deux bandes dans la même piste
lorsque l'échantillon de départ contenait un allèle normal et un allèle
mutant. Ainsi on a transformé le système de diagnostic ~ d~",i"a"l ~
conventionnel avec une réponse de type a tout ou rien ~ pour chacune des
réactions de PCR en un système co-dominant facilement i"ler~rétable.
2~ Les homozygotes ne produisent qu'une seule bande de 120 ou 180
pb selon que l'homozygote est muté ou est normal.
b) Cas où les amorces sont antisvmétriques:
La figure 2 illustre ce cas. On voit clairement dans ce cas que les
couples d'amorces (A)(B) d'une part et (A')(C) d'autre part conduisent
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comme dans le cas précédent, à des produits d'amplification de 120 pb
pour le mutant et de 180 pb pour le sauvage.
Il ap~araît dans cette figure que, quand l'amplification PCR est
conduite dans un seul milieu réactionnel contenant les 4 amorces, on
obtient alors un mélange de 3 produits d'amplification: les 2 produits
correspondant aux allèles sauvages et mutant respectivement de 180 et
120 pb, et également un produit co"~:spG"dant a une amplification entre
les amorces (B) et (C) qui a une longueur de 260 pb.
Le dépôt sur un gel d'agarose en 4% de bromure d'éthidium des
o produits de la réaction PCR va, quand l'ADN amplifié est hétérozygote et
porte les deux allèles N et M à l'observation de 3 bandes correspondant
respectivement aux produits de 120, 180 et 260 pb.
Si, au conL, ai~ e, I'ADN est homozygote pour l'allèle normal, les
produits d'amplification comporteront uniquement 2 bandes de 180 et 260
pb.
Enfin, si l'ADN est homozygote mutant, le produit de la réaction
comportera 2 bandes de 120 et 260 pb.
Ce système de diagnostic a donc tous les avantages des autres
systèmes utilisant la PCR, sensibilité, test non radio-actif, automatisable,
etc. . ., mais surtout présentant en plus l'avantage de lrausfor" ,er des
marqueurs dominants en marqueurs co-dominants.
Exemple d'al~Plication: identification d'une mutation dans des Patients
Amishs Porteurs de LGMD2E
a) sélection des familles
Six familles dejà décrites antérieurement (20) et co" ,prel ,ant 52
individus dont 13 affectés ont été analysées. Puis 5 familles additionnelles
ont également été inclues comportant en tout 39 individus dont 13 affectés.
Dans la recherche de l'idenLiricaLio" de la protéine impliquée dans ces
familles, des analyses en Northern blot ont été réalisées sur l'ARN total
isolé de biopsie de muscle squelettique pour déterminer si l'ARN messager
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du gène LGMD2E était affecté dans sa taille ou dans la quantité produite.
Or, la population de transcrits d'A~N, de taille de 4.4 Kb, sont présents en
quantité et en taille normale aussi bien dans les échantillons provenant de
patients affectés que dans les contrôles sains. Ceci su3gérait très
fortement que la mutation était probablement due à une mutation
ponctuelle telle que définie ci-rless~C. Pour vérifier cette question, des
fragments d'ADNc du gène LGMD2E ont été amplifiés après une
transcription reverse à partir de l'ARN total pré~are de six biopsies de
muscles. Les produits de RT-PCR ont été séquencés et une simple
10 transversion de C vers G au nucléotide 461 a été détectée chez les deux
patients dont les deux allèles sont mutés. Le changement de codon est de
ACA vers AGA et résulte dans une substitution de la thréonine par
l'arginine correspondant à une mutation faux sens au résidu 151.
La ségrégation de cette mutation a été étudiée dans cette famille et
dans d'autres familles porteuses de dystrophie des ceintures en
séquençant puis en amplifiant le rla~~",e,)t correspcs,-dd,-t par la technique
de touchdown PCR décrite plus haut.
b) Touchdown PCR
50 ng d'ADN ont été soumis à un procédé de touchdown PCR (19)
dans un melange réactionnel de 50 ~ litres contenant 10 mM Tris HCI,
pH8.8, 50mM KCI, 1,5 mM MgC12, 0,1% Triton X-100, 200 mM de chaque
dNTP, 100 ng de chaque amorce, et 2 unités de Taq Polymerase (Perkin
Elmer). Après 5 minutes de dénaturation à 96~C, la première étape
d'amplification est réalisée de la manière suivante :40 sec. à 94~C puis 30
2~; sec. à 63~C (ceci co,.slilue un cycle) avec une diminution de 1~ tous les 2
cycles de 63~C à 59~C. Au total, 10 cycles de PCR seront faits à raison de
deux cycles à chaque température de 63~C à 59~C compris. La deuxième
étape est réalisée en 25 cycles additionnels d'amplification consistant en
40 sec. z 94~C et 30 sec. à 58~C.
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Coupies d'amorces utilisés:
Premier couple d'd,l,orces:
a) couple d'd",orces de type AB permettant l'amplification de l'allèle
sauvage:
T461: 5'~1 1 1 1 I CAGCAAGGGACAAC-3'
m1: 5'-C I I I I CACTCCACTTGGCAA-3'.
Deuxième couple d'a~ "orces permettant l'amplification de l'allèle
mutant: A461: 5'-(~i 1 1 1 1 I CAGCAAGGGACAAG-3'
m3: 5'TAi I I I GAGTCCTCGGGTCA-3'
lOOn remarquera que dans le T461 le G en 3' a été substitué par le C en
3' cor,espondant à la transversion C vers G dans la séquence d'ADNc.
Les produits d'amplification ont été analysés par électrophorèse en
gel d'agarose à 4% coloré au bromure d'ethidium.
c) Résultats
Les résultats sont présentés dans la partie B de la figure 1 dont la
légende est détaillée ci-dessus. La dir~re"ce des tailles des segments
amplifiés est de 58 paires de bases sacl ,ar,l que les produits
d'amplir,caliGn de la paire T461/m1 est de 100 paires de bases et celui de
20la paire A461/m3 est de 158 paires de bases.
L'analyse de la figure 1 montre que les parents qui ont un phénotype
normal sont en fait des hétérozygotes puisque le produit d'amplification
contient les deux types de fragments. Il est clair que si l'un des individus
était homozygote normal, le profil obtenu après cet ensemble d'opérations
2~ne col)lpGIle~ait que des bandes cG"~s,uondant à un poids moléculaire de
158 paires de bases.
La technologie de l'invention permet donc, pour la première fois, de
distinguer de manière non ambiguë l'état homozygote ou hétérozygote
d'une mutation dans une population, tout en évitant des opérations
30complexes de type digestion enzymatique ou création de sites de
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restriction par exemple. Elle est rapide et drr,d"~llit l'expérimentation de
l'utilisation de radio-éléments.
La détection des hétérozygotes revêt une importance tout à fait
considérable dans le cadre de ce qu'on appelle la médecine prédictive;
pour les maladies récessives liées au sexe, la possibilité de détecter des
femmes conductrices dans des familles à risques est un progrès
considérable. En ce qui co..ce"~e les maladies dominantes à expression
tardive, les porteurs du trait génétique sont des malades en puissance et
ce type d'analyse permet de détecter le risque quelle que soit la
o pénétrance de la tare et son degré d'expressivité. Dans ce cas, la méthode
de l'invention permet de réaliser un diagnostic pré-symptomatique c'est-à-
dire avant l'apparition des premiers signes d'une maladie éventuelle.
Enfin, il est évident pour l'homme du métier que si la maladie ou plus
généralement le phénotype recherché résulte de la combinaison de
différentes mutations ponctuelles, le principe même d'amplification par
deux an ,orces et une polymérase thermostable donnant des produits
d'amplification dont la taille varie pour chaque allèle permet d'associer
plusieurs de ces couples d'a."or~es à partir du moment ou les produits
d'amplification ont chacun une taille définie, et différente d'un produit à
I'autre, visualisable.
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