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Carte d'analyqe a usage unigue comprenant un conduit
~'écoulement de liguides
La présente invention concerne l'analyse d'un ou
plusieurs echantillons liquides différents, dans lequel ou
0 5 lesquels on cherche a identifier, détecter et/ou
quantifier un ou plusieurs analytes, selon tous processus
simples ou complexes d'analyse, mettant en jeu un ou
plusieurs réactifs différents, selon la nature chimique,
biochimique, biologique, ou physique du ou des analytes
10 recherchés.
Les principes techniques, définis et decrits ci-
apres, ne sont pas limités a un analyte particulier, ce
terme generique designant aussi bien une composition, un
composé, que toutes especes chimiques, biochimiques, ou
15 biologiques ou autres entit~s, la seule condition requise
etant que l'analyte soit distribue dans l'echantillon
liquide de depart, a analyser, en suspension ou solution.
En particulier, le processus d'analyse mis en oeuvre peut
etre effectué, sous formes homogene ou heterogene, ou
20 mixte.
A titre d'exemple non limitatif, la présente
invention sera néanmoins illustrée par référence a
l'analyse biologique, d'un ou plusieurs ligands,
nécessitant pour leur détection et/ou quantification
25 l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Par
"ligand", on entend toute espece biologique, par exemple
un antigene, un anticorps, un acide nucléique, un fragment
d'acide nucleique, ou un oligonucleotide, susceptible de
se lier, avec un anti-ligand. Par conséquent, un exemple
30 d'application des techniques d'analyse décrites ci-apres
concerne les immuno-essais, quel que soit leur format, par
exemple par analyse directe ou par competition. Mais bien
entendu, dans le domaine biologique, les techniques
d'analyse decrites ci-apres sont appliquées de la même
35 maniere a la détection et/ou la quantification d'un
matériel nucl~ique ou de nucléotides.
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Dans le domaine de l'analyse biologique en
particulier, et à titre de produits jetables ou à usage
unique, des dispositifs ou cartes d'analyse sont
actuellement fabriques et disponibles, lesquels
comprennent de manière générale un corps sous forme de
plaque, dans lequel sont disposes ou menages :
- un orifice d'introduction d'un echantillon
liquide de depart;
- une pluralite ou multiplicité d'enceintes
operatoires, contenant des réactifs respectivement
différents, et agencees chacune pour recevoir une quote-
part ou aliquote de l'echantillon li~uide de depart,
traitee dans chaque dite enceinte opératoire;
- une pluralité ou multiplicité de conduits de
transfert de liquide, disposes en parallèle les uns par
rapport aux autres, et communiquant chacun d'un coté avec
l'orifice dlintroduction et de l'autre côté avec une
enceinte opératoire.
Avec une telle carte d'analyse, dont le volume
interne constitué par les éléments précités a été
préalablement mis sous vide ou sous dépression, on
introduit l'échantillon liquide de départ, à analyser, par
l'orifice d'introduction, moyennant quoi le liquide de
l'échantillon se trouve introduit et distribué, sans autre
intervention, dans les différentes enceintes opératoires.
Puis la carte d'analyse est scellée au niveau de son
orifice d'introduction, puis soumise à differents
traitements, notamment d'incubation, pour développer les
réactions propres au processus d'analyse retenu dans les
differentes enceintes operatoires, respectivement. Et
finalement, la détection et/ou quantification des produits
de réaction, par exemple par voie optique, dans les
différentes enceintes operatoires, fournit un ensemble
d'informations qualitatives et/ou quantitatives,
permettant d'exprimer un résultat d'analyse.
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Comme dit précédemment, les différentes étapes ou
séquences requises par l'analyse, une fois la carte
~ d'analyse scellee, sont en général mises en oeuvre de
manière automatique dans un équipement d'analyse
approprié, contrôlé ou commandé, notamment programmé pour
dérouler automatiquement les opérations requises.
Il r~sulte de la description précédente qu'une
telle carte d'analyse constitue en quelque sorte un
composant passif, au sens o~ il n'est plus possible de
déplacer un meme échantillon liquide de départ, ou un
echantillon liquide traité, d'une enceinte opératoire à
une autre, pour effectuer au sein de la même carte
d'analyse tout processus de traitement requis pour la
détermination de l'analyte.
Conformément au document EP-A-o 339 277, on a
décrit une carte d'analyse constituant un composant actif,
au sens où son agencement permet de déplacer tout
échantillon liquide d'un endroit à un autre de la carte. A
cette fin, le dispositif d'analyse propose comprend un
corps de forme aplatie, dans lequel sont disposés ou
menagés:
- outre un orifice d'introduction d'un échantillon
liquide de départ,
- un circuit de circulation de liquide,
susceptible d'être isole de l'extérieur, par o~turation
définitive de l'orifice d'introduction, comprenant au
moins une enceinte operatoire pour l'echantillon liquide
traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de
départ, et communiquant avec ledit orifice d'introduction;
ce circuit de circulation décrit, dans deux dimensions de
la carte, une ligne géométrique composée d'une extrémité à
une autre de branches successives, dont certaines en "cul
de sac", en sorte que, dans un plan ou referentiel
vertical, tout changement d'orientation de la carte, fait
circuler le liquide par gravité uniquement, d'une section
ou branche à une autre section ou branche du même circuit,
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par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte
opératoire.
Une telle carte, de dimensions relativement
importantes, permet de faire circuler tout liquide par
simple gravité, dans le circuit de circulation isolé par
rapport a l'extérieur, en raison de la section
relativement importante ou ouverte dudit circuit.
Tel n'est pas le cas avec une carte de dimensions
relativement faibles, et/ou mettant en oeuvre un circuit
de section relativement faible, du type conduit
capillaire, pour lequel les forces de tension
superficielle s'opposent à la circulation de tout liquide,
lorsque ledit circuit est isolé de l'extérieur.
La présente invention a donc pour objet un
dispositif d'analyse, notamment carte d'analyse a usage
unique, permettant, une fois ledit dispositif scellé ou
fermé par rapport à l'extérieur, une circulation réguliare
de tout échantillon liquide, y compris dans le cas d'un
circuit de circulation de type capillaire.
Comme précédemment, la gravité est retenue comme
source de d~placement ou mouvement de tout liquide au sein
de la carte. Et selon l'invention, le circuit de
circulation est à la fois continu, et bouclé sur lui-meme,
entre l'ori~ice d'introduction et l'enceinte opératoire.
En particulier, lorsque le dispositif comprend au
moins un conduit de transfert de liquide, disposé ou
ménagé dans le corps, communiquant d'un coté avec
l'orifice d'introduction, et de l'autre coté avec
l'enceinte opératoire, le circuit de circulation continu
est bouclé sur le conduit de transfert.
Par "continu", on entend la caractéristique selon
laquelle toute portion du circuit de circulation consid~ré
comporte de part et d'autre respectivement deux orifices
d'entrée et/ou sortie. Cette qualification s'oppose en
particulier à la notion de "cul de sac", qui implique que
la portion du circuit considére ne comporte qu'un seul
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orifice d'entree et/ou sortie. Cette qualification n'est
pas exclusive de la caracteristique selon laquelle un ou
plusieurs circuits ou conduits, eux-mêmes "sans issue"
peuvent communiquer avec ou se brancher sur le circuit
continu consideré.
Par "bouclé sur lui-même", on entend la
caractéristique selon laquelle le circuit continu de
circulation forme dans l'espace, c'est-à-dire dans le
volume du corps de la carte d'analyse, une boucle
complète, en sorte que tout volume de liquide présent dans
le conduit se trouve sensiblement en équi-pression des
deux côtés de la colonne de liquide ainsi formee. Une
telle caracteristique permet de deplacer cette même
colonne de liquide, sans aucune contrainte ou resistance,
puisque le volume gazeux pousse d'un c8te se trouve
recyclé ou renvoye de l'autre cote de la meme colonne.
Bien entendu, comme dit plus haut, ce conduit continu de
circulation, boucle sur lui-même communique par ailleurs
avec un ou plusieurs orifices d'introduction des
échantillons liquides, et un ou plusieurs orifices
d'évent, comme décrit ci-apres.
Par conséquent, selon l'invention, la circulation
des liquides s'effectue dans la carte d'analyse, par
simple gravité, s~ns résistance particuliere, resultant de
la dépression créée par l'écoulement ou la capillarité, et
ce uniquement en changeant l'orientation de la carte. Bien
entendu, pour obtenir un tel deplacement, il faut disposer
d'une hauteur de liquide suffisante, pour l'echantillon
liquide traite ; mais l'homme de metier est a même de
determiner cette hauteur minimum, en fonction notamment du
liquide traite et de ses caracteristiques, et de celles du
conduit continu de circulation, et ceci par des essais de
routine.
Preferentiellement, lorsque le corps de la carte
d'analyse a la forme d'une plaque, la ligne géometrique
décrite par le circuit continu de circulation comprend au
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moins un segment planaire, situe dans un plan, par exemple
parallèle ou confondu avec l'une des faces de la plaque;
et ce segment planaire decrit lui-même une ligne
regulière, par exemple selon au moins une portion
sensiblement circulaire, en sorte que la plaque etant
disposee verticalement, le changement d'orientation de la
carte, par exemple autour d'un axe perpendiculaire à la
plaque et passant sensiblement par le centre de ladite
portion circulaire, fait circuler le liquide d'une section
a une autre du circuit continu de circulation.
La portion consideree du segment planaire de
circulation peut être egalement de forme sinusoïdale.
La carte d'analyse precedemment de~inie presente
bien d'autres avantages.
La circulation du liquide sous simple gravite,
c'est-à-dire sans mettre en oeuvre ou en jeu des energies
importantes, permet d'eviter pratiquement toute formation
de bulles, par dissolution ou relargage des gaz, au sein
des liquides en circulation. Mieux encore, la circulation
d'un echantillon liquide au sein de la carte, presentant
lui-même au depart des bulles ou microbulles, permet
pratiquement en totalite d'eliminer ou degazer ces
dernières. Ceci constitue un avantage fondamental, compte
tenu en particulier de la taille, par exemple capillaire,
des veines liquides susceptibles de circuler dans de
telles cartes, etant entendu que la presence de bulles,
aussi petites soient telles, perturbe ou contrarie, non
seulement le regime d'ecoulement des liquides, mais aussi
la precision de leur deplacement et de leur observation,
par exemple par voie optique, et par consequent influence
la qualite de l'analyse.
Et le dispositif ou carte d'analyse selon
l'invention peut etre aisement manipulé ou traite, ce qui
veut dire que l'equipement correspondant est agencé avec
des mecanismes ou automatismes, notamment une robotique,
particulièrement simple.
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La presente invention est maintenant decrite par
référence au dessin annexé, dans lequel :
- la Figure 1 représente en perspective, et avec
arrachement partiel, une carte d'analyse selon un premier
~ 5 mode d'execution de l'invention
- les Figures 2 et 3 representent des coupes
partielles verticales respectivement selon les lignes II-
II et III-III de la Figure 1
- les Figures 4, 5 et 6 representent des vues
schematiques de la carte d'analyse representée a la Figure
1, pour trois phases de manipulation de la carte d'analyse
respectivement differentes
- les Figures 7 a 9 representent de maniere
schématique trois modes respectivement diff~rents du moyen
d'arrêt du liquide, represente schématiquement a la Figure
1 sous la réference 18
- la Figure 10 représente en vue de face une carte
d'analyse selon un deuxième mode d'exécution de
l'invention
20- la Figure 11 représente une vue en coupe
verticale partielle de la carte d'analyse selon Figure 10
- les Figues 12 a 15 représentent trois modes
d'execution différents du moyen d'obturation définitive
d'un orifice d'évent, et/ou d'un orifice d'introduction,
portant la référence numérique 9 sur toutes les figures.
- la Figure 16 représente de maniere schématique
une carte d'analyse, vue de face, selon un troisieme mode
d'exécution de l'invention
- la Figure 17 représente, toujours we de face,
une carte d'analyse selon l'invention, selon un quatrieme
mode d'exécution
- la Figure 18 représente une vue en coupe
verticale, selon la ligne XVIII-XVIII de la Figure 17, de
~ la carte d'analyse montrée a la Figure 17
35- les Figures 19 et 20 representent, de maniere
schematique, la carte d'analyse representee a la Figure
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17, dans deux positions respectivement differentes
correspondant à deux phases de manipulation différentes de
la carte d'analyse
- la Figure 21 représente un mode d'execution d'un
dispositif selon l'invention, tel qu'utilisé pour l'essai
décrit à l'exemple ~.
Il doit ~tre prealablement entendu que les
représentations des dessins ne sont pas à l'échelle
réelle, et qu'en particulier la dimension du ou des
conduits de circulation a éte volontairement exagérée, aux
fins de l'explication de la présente invention.
D'un point de vue fluidique, la carte d'analyse l
représentee a la Figure 1 comprend un circuit 5 continu de
circulation de liquide, intégré ou dispose au moins pour
partie dans le corps 2 ayant la forme d'une plaque, de la
carte d'analyse l.
Comme le montre la Figure 1, et toujours sous
l'angle fluidi~ue, le circuit 5 continu de circulation
rassemble selon une boucle :
- une enceinte operatoire 6, qui peut être
materialisee ou non, notamment par la présence interne de
réactif;
- un conduit de transfert 7 communiquant par une
voie en dérivation avec un orifice 3 d'introduction d'un
échantillon liquide de départ;
- un conduit 61 de retour vers le conduit de
transfert 7, communiquant par une derivation avec un
orifice d'évent 8;
- une cuve d'observation 17.
Par "enceinte opératoire", on entend toute
enceinte, quelle que soit sa forme materielle, permettant
d'effectuer toute operation ou traitement de l'echantillon
liquide traite, dans le laps de temps pendant lequel ledit
échantillon séjourne dans ladite enceinte. L'opération
considerée peut être de nature physique, mécanique,
chimique, biochimique, ou biologique. A cette fin,
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l'enceinte considérée peut contenir, préalablement (par
exemple sous forme seche et/ou liquide), ou au moment de
l'opération ou traitement, tous réactifs ou moyens
matériels aidant ladite opération.
~ 5 Par "cuve d'observation", on entend tout moyen
ménagé ou disposé dans le corps, permettant d'obtenir une
information qualitative et/ou quantitative a partir d'un
ou plusieurs paramètres ou caractéristiques, observés
directement ou indirectement dans tout liquide présent
dans ladite cuve 17. A titre d'exemple, et pour une
analyse biologique, la cuve d'observation, qui communique
avec et est comprise dans le circuit 5, est agencée,
notamment avec des parois transparentes, pour détecter ou
mesurer un parametre, notamment optique, par exemple une
fluorescence, pour obtenir un signal représentatif de la
présence et/ou de la quantité d'un analyte biologique, par
exemple un anticorps, un acide nucléique ou analogue.
Il résulte de la description précédente, que mis à
part les dérivations ou branchements vers l'orifice
d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8, le circuit 5 est
bouclé sur lui-même, au sens où un échantillon liquide y
circulant à partir d'un point donné peut être recyclé vers
ce point.
Selon l'invention, le circuit continu 5 de
circulation décrit dans deux dimensions de la carte 1, une
ligne géométrique déterminée, en l'occurrence circulaire,
en sorte que tout changement d'orientation de la carte,
disposée verticalement, comme montré a la Figure 4, par
rapport à un référentiel tridimensionnel comportant une
dimension verticale de référence, fait circuler le liquide
présent dans le circuit, uniquement par gravité d'une
section à une autre, par exemple d'un côté ou de l'autre
de l'enceinte opératoire 6, et ceci de manière contrôlée
en fonction de l'amplitude du changement d'orientation par
rapport au référentiel précité.
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En pratique, comme montré a la Figure 1, le corps
2 ayant la forme d'une plaque, la ligne géométrique
decrite par le circuit 5 comprend un segment planaire 51,
confondu avec la face 2a de la plaque, et ce segment
planaire 51 comprend ou est constitué par une portion
sensiblement circulaire, formant ainsi une ligne
réguliere. De cette maniere, la carte d'analyse 1 étant
disposée verticalement, tout changement d'orientation de
la carte dans le plan vertical autour d'un axe 77
perpendiculaire a la plaque 2, et passant de préférence
sensiblement par le centre de la portion circulaire
définie par le segment planaire 51, fait circuler le
liquide d'une section a une autre du circuit 5, par
exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte
opératoire 6.
Il doit être entendu que la ligne géométrique
décrite par le segment planaire 51 peut être réguliere ou
brisée, et que ce même segment peut comprendre aussi bien
une portion sensiblement circulaire qu'une portion
sensiblement sinuso~dale. Mais cette ligne géom~trique
demeure continue, au sens de la définition énoncée
précedemment.
Comme le montre la Figure 1, l'orifice d'évent 8
communi~ue avec le circuit 5 en un point de jonction
différent du point de jonction de l'orifice d'introduction
3 avec le circuit 5.
De maniere non représentée, mais comme il sera
décrit ci-apres par référence aux Figures 11 a 15,
l'orifice d'évent 8 et l'orifice d'introduction 3
comportent ou sont associés a des moyens d'obturation
dé~initive, par exemple scellement.
Une cuve de décantation 15 est disposée ou menag~e
dans le corps 2, en aval de l'orifice d'introduction 3,
dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, et
le circuit 5 peut être bouclé soit sur la cuve 15 de
décantation, soit en aval de cette dernière.
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L'enceinte operatoire 6 est delimit~e dans le
circuit 5 continu de circulation, dans le sens
d'introduction de l'échantillon liquide, par au moins un
moyen d'arrêt 18 du liquide introduit, choisi ou agencé
~ 5 pour libérer le passage dudit liquide sous l'effet d'une
charge hydrostatique minimum. A cette fin, différents
moyens représentés aux Figures 7 a 9 peuvent être
utilisés:
- le moyen d'arrêt 18 est un agencement local du
circuit 5 continu de circulation, générant une perte de
charge, par exemple par un etranglement 19 montré a la
Figure 9, ou une chicane 20 montr~e a la Figure 8 ; cette
chicane 20 est obtenue, en passant de la face superieure
2a a la face inférieure 2b du corps 2 par un premier
conduit vertical traversant, en circulant sur la face
inferieure 2b, puis en remontant vers la face superieure
2a, par un deuxième conduit traversant;
- de maniere non representée, le moyen d'arrêt 18
peut être constitue par un revêtement local et ponctuel,
hydrophobe, du circuit 5, par conséquent a faible
mouillage, contrariant, en l'absence d'une charge minimum,
la circulation du liquide;
- de maniere plus particuliere, et comme
représenté a la ~igure 7, le moyen d'arrêt 18 est
constitué par deux encoches, disposées l'une en face de
l'autre, de part et d'autre du conduit 5, et formant avec
lui une zone locale de rétention du liquide.
En termes de réalisation, la carte d'analyse 2 est
obtenue pour l'essentiel, par moulage de précision d'une
matiere plastique technique, compatible avec les liquides
traités. De cette maniere, directement obtenu par moulage,
le circuit 5 est formé au moins pour partie par un canal
25, menagé au moins pour partie a la surface de l'une 2a
et/ou l'autre face 2b, étant entendu que, comme le montre
la combinaison des Figures 1 et 8, le circuit 5 s'étend
sur l'une 2a et/ou l'autre face 2b du corps, parallales
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l'une a l'autre, en traversant éventuellement de part en
part le corps 2, localement, a un ou plusieurs endroits du
circuit continu de circulation 5.
De manière à assurer l'étanchéité du circuit 5 par
rapport à d'autres circuits ou conduits présents sur le
corps 2, mais aussi par rapport à l'extérieur, les deux
faces 2a et 2b du corps 2 sont revetues de manière
étanche, par deux feuilles ou films, par exemple en
matière plastique transparente, 22.
Compte tenu du processus d'analyse à effectuer au
sein de la carte 1, l'enceinte opératoire 6 comprend, de
manière libre ou fixée par rapport au corps, un ou
plusieurs réactifs. Cette fixation peut consister aussi
bien dans une liaison chimique covalente du réactif sur la
paroi du circuit 5, que dans une liaison faible, par
exemple par adsorption ou absorption du réactif sur cette
même paroi.
Le fonctionnement de la carte d'analyse 1 peut
être expliqué par référence aux Figures 4 à 5, la carte
d'analyse 1 étant disposée verticalement.
Par référence à la Figure 4, l'orifice
d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8 sont ouverts. on
introduit l'échantillon liquide à analyser, associé ou non
~ un réactif, par l'orifice 3, moyennant quoi il forme une
colonne liquide 62 au bas du circuit 5 en equilibre, et au
contact du réactif contenu dans l'enceinte opératoire 6.
Puis les orifices 8 et 3 sont scellés hermétiquement, de
telle sorte que la carte se trouve isolee par rapport a
l'exterieur.
Par rotation angulaire de la carte 5, de plus ou
moins 45~ (selon le sens trigonométrique), on fait
circuler l'échantillon liquide, dans un sens puis dans
l'autre, au contact du réactif, de telle sorte qu'une
reaction se développe entre l'échantillon liquide et le
reactif.
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Dans la position angulaire représentee a la Figure
5, la colonne de liquide s'est deplacee dans la cuve
d'observation 17. Egalement par rotation de part et
d'autre de la position angulaire representee a la Figure
~ 5 5, on peut faire circuler, dans un sens puis dans l'autre,
le liquide au travers de la cuve 17. Ainsi, il est
possible de détecter et/ou mesurer l'analyte présent dans
la cuve 17.
Une fois la mesure effectuée, on revient a la
position initiale, representee a la Figure 6, et la carte
d'analyse utilisee peut être jetee.
La carte d'analyse selon le deuxieme mode
d'execution (conferer Figure 10), differe du premier mode
d'exécution, par les points suivants:
- une enceinte 21 est disposée et ménag~e a plat,
sensiblement au centre du corps 2, et forme une fois
scellée une chambre comprise dans le circuit 5 continu de
circulation du liquide ; cette enceinte est scellée et
obturée par une membrane qui, par enfoncement et
relâchement successifs, permet d'aspirer l'échantillon
liquide par l'orifice d'introduction 3;
- l'orifice d'introduction 3 de l'echantillon
liquide débouche dans une cuve 15 de decantation, avant de
communiquer avec le circuit 5 proprement dit ; la cuve 15
de decantation est pourvue d'au moins un event 81 et/ou 82
qui est ferme quand la cavité 21 est utilisée pour aspirer
le liquide et le faire cheminer dans le conduit 5;
- a la sortie de l'enceinte 21, le circuit 5 est
bouclé sur la cuve 15 de décantation, par un conduit
traversant, passant de la face 2a à la face 2b du corps 2.
L'enceinte 21 a une autre utilite : elle permet en
pratique d'absorber les variations de pression, au sein de
la carte d'analyse.
Comme montre par les Figures 2 a 14, le moyen
d'obturation définitive de l'orifice 3 ou 16 (cf Figure
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14
17) et des events 81,82, peut etre choisi parmi les moyens
suivants:
- conformément à la Figure 12, ce moyen est un
opercule 10 d'obturation definitive;
- conformement aux Figures 13 et 14, ce moyen
d'obturation associe le conduit d'introduction 11 de
l'échantillon liquide, dont l'extremité active lla peut
prendre deux positions par rapport au corps 2, fi savoir
une position rétractée (Figure 13) communiquant de manière
étanche avec une cavite d'introduction 12 du liquide, et
une position avancee (Figure 14), penétrant de maniere
étanche dans un orifice ~orgne 13 calibré, menage dans le
corps 2; dans cette derniere position, le conduit
d'introduction 11 est scelle;
- et une bande adhesive 14 qui est rapportee, de
maniere etanche, et adhesive sur l'orifice 3, cf
Figure 15.
La carte d'analyse selon le troisième mode
d'execution (cf Figure 16), differe du premier mode
d'execution par le fait que le segment planaire 51 du
circuit 5 décrit une ligne constituée par au moins deux
portions 511 et 512 sensiblement circulaires,
concentriques, reliées entre elles en série, par un
conduit traversant de part en part le corps 2.
Bien entendu, comme non decrit specifiquement par
reférence a des figures, mais de maniere parfaitement
compréhensible pour l'homme de métier, les variantes
suivantes peuvent etre apportées :
- plusieurs enceintes opératoires 6 peuvent être
ménagées et disposées dans le corps 2, en étant comprises
en série dans le circuit 5 continu de circulation, de
telle sorte ~ue le changement d'orientation contrôl~e de
la carte 2, permet de ~aire circuler de maniere adaptée
l'échantillon liquide dans l'une et/ou l'autre enceinte
opératoire;
-
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- plusieurs circuits 5 continus de circulation de
liquide peuvent ~tre disposés ou ménagés dans le corps 2,
et être relies entre eux, en serie et/ou en parallèle.
A cet egard, les circuits 5 différents peuvent
communiquer avec le même orifice d'introduction 3 ou 16,
ou respectivement avec deux orifices distincts 3 et 16,
pour deux echantillons liquides respectivement. A cet
~gard, les circuits 5 peuvent communiquer avec la m~me
cuve d'observation 17, ou respectivement chacun avec une
cuve 17 d'observation distincte pour chaque échantillon
traité.
La carte d'analyse selon le quatrième mode
d'exécution de l'invention ~conférer Figures 17 à 20),
diff~re du premier mode d'exécution par les
caracteristiques suivantes.
Comme pour la Figure 16, le circuit 5 comporte un
segment planaire 51, constitue par deux portions
sensiblement circulaires 511 et 512, et concentriques,
reliees entre elles en serie, et ceci en passant au-
dessous de la portion 511, comme montre a la Figure 18,sur sa partie droite.
Il existe deux orifices d'introduction de liquide
ou reactif, s~par~s, à savoir 3 et 16.
Un circuit annexe 23 est dispose ou menag~ dans le
corps 2 sur la face 2a de la plaque correspondante, et
comprend:
- une cavité 24, ménagée sur la face 2a, reliee
par un conduit d'évacuation 67 au circuit continu de
circulation 5, et par un conduit 67 a l'event 8;
- un conduit de transfert 65, dispose ou menage
sur la face inférieure 2b, reliant, d'un côte l'orifice
d'introduction 16, et de l'autre côte la cavite 24, en son
centre.
Il résulte de la description precedente que le
circuit annexe 23 communique d'un côte avec le circuit 5,
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et ne comporte de l'autre côte aucune issue ou sortie,
autre que l'évent 8.
Il résulte aussi de la géométrie du circuit annexe
23, et en particulier de la disposition de la cavite 24,
5 montrees à la Figure 17, que : -
- tout changement d'orientation de la carte dans
un sens de rotation négatif (par rapport au sens
trigonometrique), selon une amplitude limitee, interdit
l'introduction de tout liquide contenu dans la cavite
annexe 24, dans le circuit 5;
- et inversement, tout changement d'orientation
dans l'autre sens de rotation, c'est-à-dire dans le sens
positif, permet dlintroduire tout liquide contenu dans la
cavité 24 dans le circuit 5 principal.
La caractéristique précédente est évidemment
utile, pour stocker provisoirement un réactif, et
l'introduire de maniere contrôlée dans le circuit 5, a
tout moment du processus d'analyse.
C'est ce que montre en particulier le changement
d'orientation entre les Figures 19 et 20, permettant
d'introduire le réactif dans la boucle principale.
Par ailleurs, par référence aux figures 17 a 20,
le liquide (réactif par exemple) est injecté au niveau de
l'orifice d'introduction 16, et gr~ce au conduit 65
remplit la cavité 24, par un orifice de sortie emergeant
au sommet d'un teton, situe sensiblement au centre et aux
deux tiers de la hauteur de la cavite 24. Une fois la
cavité 24 remplie, lors de la rotation de la carte dans le
sens de rotation négatif, le liquide reste confin~ dans
cette cavité, puis par une nouvelle rotation, toujours
dans le sens negatif, le liquide demeure dans cette meme
cavité, a la condition que la quantité de liquide soit
predeterminee pour ne pas ressortir par l'orifice de
sortie, situe aux deux tiers de la hauteur de la cavite
24.
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~ :~LL
Un exemple de mise en oeuvre d'un dispositif
dianalyse conforme a la Figure 16 est maintenant décrit.
L'utilisation de ce dispositif pour l'entra~nement
automatisé et confiné d'étapes biologiques a été validee
dans le cadre de la réalisation d'un test de détection de
l'agent de la tuberculose : la bactérie Mycobacterium
tuberculoses.
Pour ce faire, des composants de la trousse de
diagnostic "MTD-2" disponible auprès de la société Gen-
Probe (San Diego, Californie), ont été utilisés. Le
principe de ce test repose sur l'amplification sélective
in vitro d' acides nucleiques cibles (ARN ribosomique 16S)
par la technique "Transcription-Mediated Amplification"
(TMA), suivie de la detection luminescente des produits
d'amplification par la technique homogene "Hybridization
Protection Assay " (HPA).
Le test d'amplification "MTD-2" a été réalisé
selon le protocole manuel du fournisseur avec quelques
modifications. Brièvement, la réaction a été assemblée en
combinant 25 ~l d'un contrôle positif (~o exp 6 copies
d'une molécule d'ARNr 16S synthétisée in vitro,
correspondant environ a 100 cellules bactériennes) ou
25 ~l d'un contrôle négatif (eau ultrapure, de résistivité
supérieure ou égale a 18 MegaOhms), a 12,5 ~l de réactif
d'amplification reconstitué, dans un tube 12 x 75 mm de 5
ml tpolypropylene) et l'ensemble est recouvert de 200 ~l
d'huile minérale. Le tube est chauffé pendant 5 minutes a
95OC, refroidi a 42~C pendant 5 minutes (bains secs
thermostatés), puis 12,5 ~l de reactif enzymatique sont
ajouties et mélangés par agitation douce. La réaction est
incubée pendant une heure a 42~C (bain marie), puis
disposée sur glace en attendant d'etre soumise à l'étape
de détection par HPA.
La détection HPA a été réalisée dans un tube
séparé sur 10 ~l de mélange réactionnel (1/5 de réaction)
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complétés par 90 ~l d'eau, auxquels sont ajoutés 100 ~l de
sonde ester d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15
minutes à 60~C (bain marie) pour réaliser l'hybridation de
la sonde, et une ~tape de sélection est réalisée par
300 ~l de réactif de sélection. Chaque tube est alors
incubé 15 minutes a 600C. Les réactions sont ensuite
refroidies a température ambiante (5 minutes)~ puis
directement lues sur le luminomètre Gen-Probe pendant 3
secondes.
Les résultats de luminescence obtenus (en Unités
de Luminescence Relative, RLU) sont de 4 319 456 RLU pour
le contrôle positif et de 1 282 RLU pour le contrôle
négatif, le seuil de positivité indiqué par le fabricant
étant de 30 oOO RLU.
L'automatisation des etapes d'amplification a été
réalisee avec une carte ou dispositif 1 selon la Figure
21, obtenue dans un corps 2, usiné dans une plaque carrée
de 10 cm de coté et 3 mm d'épaisseur. La carte est rendue
fonctionnelle par apposition d'un film adhesif 22
transparent de type BOPP sur le corps, afin de réaliser la
fermeture etanche du circuit de circulation 5. Au
prealable, une bille solide de reactif enzymatique est
déposée et contenue dans une mini-cuvette prévue à cet
effet, en position "R2" du circuit de circulation. Cette
bille de 2 mm de diametre est obtenue par lyophilisation
de gouttelettes d'une solution de trehalose (20%~
contenant l'équivalent d'une dose unitaire d'enzyme
necessaire a la réalisation d'une reaction d'amplification
TMA. Une telle forme de réactif présente 1'avantage d'etre
stable pendant des mois a temperature ambiante et de se
dissoudre instantanément au contact d'une solution
aqueuse. La carte ainsi constituée est considérée comme le
dispositif d'analyse au sein duquel les étapes
d'amplification a partir d'un échantillon sont réalisées
de maniere automatique.
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L'essai au sein du dispositif debute par une phase
d'introduction initiale unique de reactifs par le
manipulateur ou un appareil de distribution de liquides.
150 ~l de tampon de lavage (PBS lX, Tween-20 0,5%) sont
introduits dans le segment circulaire externe de la carte,
par l'orifice 81 communiquant avec le circuit 5, au
dessous de la position selon le segment circulaire interne
"Rl". L'echantillon a tester est compose de 25 ~1 contrôle
positif ou negatif comme précédemment décrit, additionnes
de 12,5 ~l de tampon de dilution d'enzyme (Enzyme Dilution
Buffer, Gen-Probe) et 12,5 ~l de réactif d'amplification
reconstitué. L'ensemble est injecté par l'orifice 8 en
position "Rl" de la carte.
Le dispositif est inséré verticalement dans un
automate piloté par ordinateur, dont un programme permet
le contrôle simultané des étapes de rotation de la carte
autour de son axe central (vitesse, amplitude,
acceleration, polarite, encha~nements) et de la
température des liquides contenus dans les segments
circulaires externe et interne de la carte, par le biais
d'un patin chauffant. Ce patin chauffant est en contact
direct avec le film adhesif du dispositif, la faible
epaisseur de celui-ci assurant un parfait échange
thermique pour le contrôle de la température a l'intérieur
du segment liquide situé à son niveau. Le patin recouvre
les segments circulaires sur une amplitude angulaire de
450 de part et d'autre de la position inferieure du
dispositif (aplomb de la position "Rl"), position o~ se
trouvent en permanence les liquides, quelle ~ue soit la
rotation du dispositif, du fait de l'effet combiné de la
gravité et du piston liquide, propre a la presente
invention. Le patin chauffant est regulé par une sonde
thermocouple; son chauffage est actif, tandis que son
refroidissement est passif, sous l'action d'un flux d'air
a temperature ambiante (20-25~C) vehicule par une pompe
sous une pression de 0,5 bar.
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Le programme de traitement du dispositif ou carte
6' effectue comme suit : la carte venant d'être remplie
avec le tampon de lavage et l'echantillon, comme
precédemment decrit, est inserée dans l'automate dont la
consigne de temperature est de 65~C (pr~chauffage
effectue). La position initiale de la carte est celle ou
l'échantillon et le tampon de lavage sont centrés sur la
position Rl. L'echantillon est homogénéisé par 30
oscillations continues d'amplitude + 30~, centrées sur la
position "Rl" (60it une amplitude totale maximum de 60O
par oscillation), et incube simultanement pendant 5
minutes a 65~C. La temperature est ensuite stabilisee a
420C pendant 2 minutes, la carte ~tant alors immobile, en
position initiale. La temperature du patin restant a 42~C,
une rotation de 140~C (sens inverse des aiguilles d'une
montre) est effectuee, ce qui permet a la fraction de
liquide d'~tre centree sur la position "R2". 6
oscillations continues d'amplitude ~ 45~ centree sur la
position "R2" (soit une amplitude totale maximum de 90~)
assurent la parfaite dissolution de la bille de reactif
enzymatique, puis une rotation de 140~ (sens des aiguilles
d'une montre) est effectuee afin de repositionner le
milieu reactionnel au niveau de "Rl". La carte est incubee
~ 42~C en position fixe pendant une heure.
Afin de determiner l'efficacite du procéde
d'amplification TMA automatise au sein du dispositif a
usage unique de la presente invention, le milieu
reactionnel est preleve et dispose sur glace avant d'être
dosé selon la methode ~PA de réference. Pour des raisons
d'instrumentation propres à la methode de reference, le
processus de d~tection n'est pas realise ici a l'int~rieur
de la carte, mais l'incorporation durant le procede
d'amplification TM~ de marqueurs (par exemple
fluorescents) permet, par la presence de tampons de ~avage
au sein de la carte, de realiser la detection des produits
d'amplification par capture specifique sur des sondes
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immobilisées dans la cuve d'observations. La détection HPA
a ici été r~alisée dans un tube séparé sur 10 ~l de
melange réactionnel (1/5 de réaction) complétés par 90 ~l
d'eau, auxquels sont ajoutés 100 ~1 de sonde ester
d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15 minutes à 60~C
(bain marie~ pour réaliser l'hybridation de la sonde, et
une étape de sélection est r~alis~e par 300 ~1 de réactif
de sélection. Chaque tube est lors incubé 15 minutes à
60~C. Les réactions sont ensuite refroidies à température
ambiante (5 minutes), puis directement lues sur le
luminomètre Gen-Probe pendant 3 secondes, comme dans le
cadre des essais manuels, selon le protocole préconisé
pour l'utilisation de la trousse de diagnostic "MTD-2"
(Gen-Probe).
Les résultats de luminescence obtenus ~en Unités
de Luminescence Relative, RLU) sont, dans le cas du
processus precedemment decrit, de 3 822 510 RLU pour le
contrôle positif et de 2 357 RLU pour le contrôle négatif,
le seuil de positivité indiqué par le fabricant étant de
30 000 RLU. Ces résultats montrent donc que la détection
du contrôle positif s'effectue correctement, tandis que le
contrôle négatif ne génère aucun signal significatif.
L'analyse comparée des résultats du test "MTD-2",
dont la partie amplification TMA a été réalisee
manuellement, ou automatiquement selon l'invention,
démontre donc que la transposition d'un essai manuel vers
un dispositif selon l'invention est réalisable et que la
carte à usage unique selon invention permet de réaliser
l'ensemble des étapes biologiques d'un test réalisant,
comme en mode manuel et de manière aussi sensible, la
détection de l'equivalent de 100 bactéries.
L'intérêt d'un tel dispositif selon l'invention
est important, en particulier dans le domaine de la
biologie moléculaire, dont des techniques telles que la
TMA permettent de réaliser de manière sensible et rapide
la détection d'agents pathogenes. Néanmoins, ces
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techniques, étant données leurs performances, sont très
sensibles aux contaminations de l'environnement ou amenees
lors des manipulations pour la réalisation des étapes
intermédiaires d'addition ou de mélange de r~actifs,
conduisant alors à des essais faussement positifs. La
presente invention permet de réaliser les étapes
d'amplification de manière confinée et isolée, et de les
encha~ner éventuellement avec les étapes de detection, à
partir de l'introduction d'un echantillon au sein du
dispositif a usage unique. Ce dernier peut donc contenir
sous forme stabilisee des reactifs prêts a l'emploi, dont
le conditionnement et la preparation sont realisables dans
un environnement contrôle exempt de contaminations.
L'expérimentateur doit s'assurer simplement de l'absence
de contamination lors des étapes de preparation de
l'échantillon, préalablement a la réalisation du test et
lors de son introduction au sein de la carte. De manière
plus générale, lorsque les étapes de détection sont
également intégrees au sein de la carte, l'élimination et
destruction de la carte du laboratoire sans jamais ouvrir
cette dernière, autorisent la realisation de toutes les
etapes situees en amont d'un tel test d'amplification et
detection ; pretraitement des echantillons cliniques, lyse
des micro-organismes, extraction des acides nucléiques
peuvent s'effectuer dans un même environnement de travail,
sans risque de production de resultats erronés.
