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~ARIANTS DE LA THYMIDINE KINASE, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES CORRESPON-
DANTES ET LEUR UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
La présente i.-venli~- conf ~?rne des séquences d'acides nucléiques codant pour
5 des enzymes dérivées de l'enzyme thymidine kinase sauvage, TK, et poeee~nt desfonctions améliorées en vue d'une ~rtilie~ti~m thérapeutique. Elle conc~rne plusparticulièrement des nouvelles enzymes p-.~eéc~nt une spécifi~ite de substrat et/ou
une efficacité améliorées par rapport à l'enzyme thymidine kinase de type sauvage.
Elle se rapporte e~l~m-?nt à des vecteurs Gnnten~nt ces séquences d'acides
10 nucléiques et à leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique.
La présente invention concerne plus particulièl~n~.,L le domaine de la thérapie
génique qui met en oeuvre des gènes sllici(1e-s en vue d'induire la mort cellulaire de
cellules spé~ifiqu~-e telles que des cellules infectées par un virus comme le virus de
type VIH (virus d'imm-lnodéficience hum~in), CMV (cytomegalovirus) ou VCR
15 (virus respiratoire syncytial). Ce type de tr;litement thérapeutique, consistant à faire
~rin,er au sein d'une cellule un gène suicide, est ég~l~m~nt appliqué pour le
traitement des cancers et de certaines m~ lies cardiovasculaires.
Comme gène suicide, on utilise p,erére..~i.?llement en thérapie génique des
gènes dont le produit d'expression confère à la cellule, une sensibilité a un agent
20 thérapeutique. Plus généralement, il s'agit de gènes codant pour des enzymes non
m,.,l,...ire~s et non toxiques qui, lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules de
lrères, transforment une prodrogue, initi~l~ment peu ou pas toxique, en un
agent hautement toxique. Un tel mé~ni~m~ d'activation de prodrogues est
avantageux a plusieurs titres: il permet d'o~Li,lliser l'indice thérapeutique en ajustant la
2~ concentration en prodrogue ou l'expression de l'enz~nne, d'intel,umpre la toxicité en
n'~lmini~trant plus la prodrogue et d'évaluer le taux de mortalité.
De nombreux gènes suicides sont décrits dans la littérature comme par
exempie les gènes codant pour la cytosine dés~min~ç, la purine nucléoside
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phosphorylase ou une thymidine kinase comme par exemple les thymidines kinases du
virus de la varicelle ou du virus de l'herpès simplex de type 1. Parmi ces gènes, le
gène codant pour la l~ylllidule kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 est tout
particuLièfe~ S~ sur le plan thérapeutique car, à la dirréf~.~ce des autres
5 gènes s~ çs, il génère une enzyme, la thymidine kinase, capable d'élin~iner
sp~cifiquement les cellules en cours de division. Cette enzyme a une spe~ificité de
substrat ~irr~ e de l'enzyme cellulaire, et on a montré qu'elle était la cible
d'analogues de g1-~nosin~ tels que l'acyclovir ou le ganciclovir (Moolten 1986 Cancer
Res. 46 p5276).
Dans le cas particulier du couple HSV1-TK / g~nri~lovir~ le m~ni~mç
d'action peut être s~h.?m~ti~é comme suit: les cellules de ~ s, mo~ifie~.s pour
exprimer l'enzyme HSVl-TK, effectuent la ~ iè~e étape de phl~sphorylation du
g~n~i~lovir pour conduire au ganciclovir monophosphate. Cette étape serait l;~
Ultérieurement, des kinases cellulaires permettent la métabolisation de ce ~n~ Qvir
15 monophosph~te sl~cc~ iv~:Illent en ~3irhosph~te puis triphosphate. Le ~nci~lQvir
triphosphate ainsi généré, produit alors des effets toxiques en s'incorporant à l'ADN
et inhibe en partie l'ADN polymérase alpha cellulaire ce qui provoque l'arrêt de la
synthèse d'ADN et donc conduit à la mort de la cellule (Moolten 1986 Cancer Res.46 p5276; Mullen 1994 Pharmac. Ther. 63 pl99).
Par ailleurs, un effet de toxicité propagée (effet "by stander") a été observé
lors de l'utilisation de la TK. Cet ef~et se manifeste par la destruction non se ~lem~nt
des cellules ayant incorporé le gène TK mais eg~ m~nt les oellules avu;.si.~ s Le
méc~ .le de ce processus peut s'expliquer de trois façons: i) la formation de
vésicules apoptotiques qui contiennçnt du ganciclovir phosphorylé ou la thymidine
kinase, provenant des cellules mortes, puis la phagocytose de ces vésicules par les
cellules voisines; ii) le passage de prodrogue métabolisée par la thymidine kinase, par
un processus de coopération métabolique des cellules contenant le gène suicide vers
les cellules ne le contenant pas et/ou iii) une réponse immunitaire liée à la régression
de la tumeur IMarini et coll. 1995 Gene Therapy 2 p655).
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Pour l'homme de l'art, l'~tili~ti-)n du gène suicide codant pour la ILylllidillelcinase du virus de l'herpès est très lalge"lt;,ll documentee. Ln part~culier, les
premières études in vivo sur des rats ayant un gliome mon~rent des régressions de
tumeurs lorsque le gène HSV1-TK est exprimé et que des doses de 150 mg/kg de
gan~ lovir sont injectées ~K. Culver et coll. 1992 Science 256 p1550~. Toutefois, ces
doses sont ha~lt~m~nt toxiques chez la souris {T. Osaki et coll. 1994 Cancer Research
54 p5258] et donc tot~lement proscrites en thérapie ~niflue chez l'h-)mm~
Un certain nombre d'essais thérapeutiques sont é~lem.?nt en cours chez
l'hl~mme, dans les~lue1c le gène TK est délivré aux cellules au moyen de ~1irr~
vecteurs tels que notamment des vecteurs rétroviraux ou adénoviraux. Dans les essais
cliniques de thérapie génique chez l'homme, ce sont des doses beaucoup plus faibles
qui doivent être ~rlmini.ctrées de l'ordre de 5 mg/kg et pour une durée du traitement
courte ~14 jour~) (E. Oldfield et coll. 1995 Human Gene Therapy 6 p55). Pour desdoses plus élevées ou des tr~i~ment~ plus prolongés dans le temps, on observe eneffet des effets secondaires indésirables.
Il serait donc particulièr~l"elll avantageux de disposer d'un gène suicide
ap~alelllé au gène codant pour la thymidine kinase sauvage, capable de générer un
variant de l'enzyme TK sauvage plus spécifique et/ou plus actif pour phosphoryler }e
ganciclovir. Avantageusement, un tel variant peut é~alem~nt être mis en oeuvre à une
dose ~i~nifi~tivement réduite col"pa~ali~ement à la dose en gène suicide sauvage, et
en outre permettre de réduire la dose de su~ dl qui lui est classiquement associée.
La présente invention a préci~ém~nt pour objet de proposer une séquence
dlacides nucléiques codant po~ un enzyme de type thyrnidine kinase ayant un
comportement activateur plus performant à l'égard du ganciclovir ou un analogue
nucléoside.
La séquence du gène codant pour l'enzyme thymidine kinase du virus de
~ l'herpes simplex de type 1 a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight
1980 Nucl. Acids Res. 8 p~949). Il en existe des variants naturels c<-n~ nt à des
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protéines ayant une activité el~yllla~ique co~l,p~ble sur la thymidine, ou le
~pnf jr~lnvir (M. Michael et coll. 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun 209 p966).De même, ont été décrits des dérivés obtenus par m~1t~ nèse dirigée au niveau dusite de liaison de l'enzyme avec le substrat. Toutefois, aucune ca~ e~ ti~n
5 biochimique précise sur les e}~ es pures n'a été réalisée et aucun test ce~ rei~ nt ces mut~nt~ n'a été publié (Black et coll., 1993 Riorh~mi~try 32 pll618).
En outre, l'expression in~luctihle d'un gène HSV1-TK, délété de ses 45 premiers
codons, a été réalisée dans des cellules eucaryotes mais les doses en prodrogue
t~tili~ s demeurent comparables à celles décrites dans tous les essais de la lilléraluLe
lB. Salomon et coll. 1995 Mol. Cell. Biol. 15 p5322). En conséquence, aucun des
variants décrits jusqu'ici ne présente une activité améliorée à l'égard ou vis à vis du
ganciclovir.
La pL~se~ invention décrit la construction de nouveaux variants de thymidine
kinase p~ é~l~nt des propriétés enzymatiques améliorées. La présente ~lem~n~l~ décrit
15 ég~lem~nt la construction de séquences d'acides nucléiques codant pour ces variants
ainsi que des vecteurs cn..~ lesdites séquences et perrnettant leur a~i.";n;~ Lion
in vivo et la production in vivo des mutants.
De manière in~ ?n(in~, la Dl?m~nA~resse a en effet préparé, isolé et caractériséune série de séquences d'acides nucléiques particulières codant pour des variants de la~Q thyrnidine kinase p~ ssé-l~nt le comportement activateur requis c'est à dire
ific~tivement améliorée co-llp~dliv~lnent à celui de la thymidine kinase sauvage.
La d~m~n~lPresse a en particulier mis en évidence que de nouveaux v~lianls de lathymidine kinase ayant des propriétés enzymatiques améliorées pouvaient être obtenus
not~mment par modification de la région de la protéine responsable de la liaison avec~5 l'ATP.
Ainsi un premier objet de l'invention réside dans une séquence d'acides
nucléiques codant pour une thymidine kinase caractérisée en ce qu'elle possede par
rapport à la séquence sauvage au moins une mutation dans la région correspondant au
-
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site de fixation de l'ATP associée à au moins une m--t~tion dans la région N-t~rnin~ie
etlou C-t~-rmin~le.
Plus préc~ m~nt, la présente invention a pour premier objet une séquen~e
d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle dérive de la séquence d'acides m~ ;q~
codant pour une thvmidine kinase sauvage, ladite séquence d'acides nucléiques
pos~ nt au moins une mutation dans la région correspondant au site de fixation de
l'ATP et au moins une mutation dans la région N-t~rmin~le et/ou C-terminale.
Au sens de la présente invention, le terme mutation, couvre toute substitution,
délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus de la séquence d'acides
nucléiques considérée. Il est ~nt~n~lll que la séquence d'acides nucléiques revendiquée
peut co,l~ rendre d'autres mutations, loc~ ePc ou non, dans les régions telles que
~finies ci-dessus.
Selon un mode préféré de Pinvention, la séquence d'acides nucléiques dérive
de la séquence codant pour la TK du virus herpès simplex de type I.
P~er~re.-liell~ment~ la m~ ti-)n dans la région correspondant au site de fixation de
l'ATP y est représentée par au moins une snhstihltion d'une guanine en position 180
par une adénine ~G180A~ .
En ce qui concerne la mtlt~tion présente dans la partie N-t~nin~le de la TK, il
peut s'agir d'une suhstih~tion de la guanine en position 16 par une adénine (G16A~ ou
d'une double substitution des guanines en position 28 et 30 par des ~enines (G28A et
&30A).
Selon un mode préféré de l'invention, les séquences nucléiques revendiquées
portent outre une mutation dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP
au moins une mutation dans la partie C terrninale et plus particulièrement localisée
entre les positions 990 et 1030. Selon un autre mode de l'invention, cette mutation
présente dans la partie C-terminale est en outre associée à une mutation localisée dans
la partie N-terminale de la TK telle que définie ci-dessus.
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A titre représ~nt~if d'une telle séquence on peut citer la séquence d'acides
nucléiques co-J~ nant au moins une substitution d'une guanine en position 180 par
une adénine (G180A), au moins une double s~bstitl~ti~n des ~ nine en position 28 et
30 par des ~ inf~ (G28A et G30A) une double substih~tion des cy~ e;~s en
5position 591 et 892 par des Illyl~ es (C591T et C 892T) et une double substitution
des guanines en position 1010 et 1011 par des a-1enin~s (GlQlOA et GlOllA).
La séquence d'acides nucléiques codant pour un variant de la thyrnidine kinase
est avantageu~çment choisie parmi:
(a) la séquence SEQ ID n~ 3 ou une partie de celle ci portant la mutation
10(G18QA) ou un de leur brin complçm~nt~ire,
(b~ les séquences SEQ ID n~ 6 et SEQ ID n~ 7 ou une partie de celles-ciportant la mutation (G180A) et respectivement la mutation G16A et la double
mutation (G28A; G30A) ou un de leur brin complement~ire,
(c) la séquence SEQ ID n~ 8 ou une partie de celle-ci portant la mutation
1~(G180A) la double mutation (G28A; G30A), et la quadruple mutation (C591T;
C892T; GlOlOA; G101 lA) ou un de leur brin complémentaire
(d) toute séquence hybridant avec les séquences (a), (b) et/ou (c) codant pour
un variant de la thymidine kinase et conforme à la présente invention.
(e~ les variants de (a~, (b), (c) et(d) résultant de la dégénérescence du code
20 génétique.
La séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut être d'origine eucaryote
bactérienne, virale, synthétique ou semi-synthétique.
D'une manière générale, les séquences d'acides nucléiques de l'invention
peuvent être préparées selon toute technique connue de l'homme du métier. A titre
25 illustratif de ces techniques on peut notamment mentionner:
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- la synthèse ~,L.I-;que, en tlfili~nt les séquences pr~-s~ntées dans la ~em~n~eet par exemple un synmpti~llr d'acides nucléiques,
- le f~rihl~ e de banques au moyen de sondes spécifiques, not~mment telles que
~ ~i~t~teS dans la ~em~n(l~ ou encore
- les techniques mixtes in~ nt la modification chimique (élongation, délétion,
stsbstitl-tion, etc) de ~équ~nces criblées à partir de banques.
Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuv~ égal~ment être
obtenues par mut~gPn~-se(s), dirigée(s) ou non, d'une séquence d'acides nucléiques,
natureIle ou déjà mutée, codant respectivement pour une thymidine kinase sauvage ou
un de ses variants. De nombreuses méthodes permettant de réaliser la mutagénèse
dirigée ou au hasard sont connues de l'homme de l'art et on peut citer la mutagénèse
dirigée par PCR ou par oligonucléotide, la mllt~nèse au hasard in vitro par des
agents çhimitllles comme par exemple l'hydroylamine ou in vivo dans des souches de
E. coli mutatrices (Miller "A short course in bacterial g~nf~t~ Cold Spring Harbor
1~ Labol~oLy, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992).
La présente invention s'étend ainsi à toute séquence d'acides nucléiques
codant pour un variant d'une thymidine kinase sauvage et susceptible d'etre obtenue à
partir d'une séquence dlacides nucléiques telle que revendiquée en mettant en oeuvre
l'une des techniques de modifications préc~emm~nt citées et plus ~)~e~ Liellement
la mutagénèse, dirigée ou non.
Avantageusement, les produits des séquences revendiquées selon la présente
invention ~'~v~ L plus perfo,-nall~ que l'enzyme naturelle dont ils dérivent parmodification(s) structurale(s~. Exprimés dans des cellules cibles, ils présentent une
activité enzymatique améliorée par rapport à l'enzyme naturelle vis à vis du
~5 ganciclovir ou un analogue de nucléoside. Ee comportement dit "plus activateur" ou
"L'activité enzymatique améliorée" des variants selon l'invention s'apprécie
co~ u~dlivement à celui de l'enz~vme sauvage, selon les protocoles décrits en déta;ls
dans les exemples ci-après.
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Au sens de la présente invention on entend couvrir par analogue nucléoside
des composés de type acyclovir, trifluorothymidine, 1-[2-deoxy, 2-fluoro, beta-D-
arabino furanosyl]-5-iodouracil, ara-A, araT, 1-beta-D-ara'~inor~dllosyl thymidine, 5-
éthyl-2'-déoxyuridine, iodouridine, AZT, AIU, didéoxycytidine et AraC. A titre
5 d'analogue préféré dans le cadre de la présente invention, on peut plus
particulièrement citer les BVDU, ganciclovir et penciclovir.
La présente invention a ég~lement pour objet des v~;a ll~. de thymidine 'kinase
sauvages susceptibles d'être exprimés à partir d'une séquence d'acides nucléiques
revendiquée.
Plus particulièrement, l'invention s'étend à tout variant d'une thymidine kinasecaractérisé en ce qu'il comprend au moins une mutation au niveau de son site de
fixation à l'ATP associée à au moins une mutation dans la région N-terminale et/ou C-
tçrmin,.le.
La lc~ tic.n de ce site de fixation de l'ATP, au sein de la séquence
1~. peptidique de la t'nymidine kinase varie selon l'origine virale de celle-ci. C'est ainsi
que, selon que l'on c~.n~id~re la thymidine kinase du virus de la varicelle, du virus de
l'herpès simplex, de type 1 ou non, cette région est po~itionn~e en des régions
différentes. Toutefois, de manière générale, elle y figure sous le c-n~f~n~llc
GXXXXGK(TIS) ~SEQ ID N~l) avec X représ~nt~nt un acide aminé quelconque et
20 dans le cas particulier de la thymidine kinase de l'Herpès simplex virus de type 1, sous
la séquence spécifique suiva~ GPHGMGKT (SEQ ID N~2).
En conséquence, la présente invention vise tout variant d'une tnymidine kinase
sauvage conforme à l'invention et comprenant au niveau de sa région peptidique
suivante GXXXXGK(T/S) au moins une mutation.
Selon un mode préféré de la présente invention, la séquence possédant au
moins une mutation est celle représentée par GPHGMGKT (SEQ ID N~2). Dans ce
cas particulier, la mutation y est plus préférentiellement représentée par au moins une
su~stitution en position 60 d'une Métnionine par une Isoleucine.
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A titre reples~ if de ce type de mutant, on peut plus particuliè.e.~..L citer
le mutant 1537:E4 décrit dans les ~xemr~les ci-après.
En ce qui c-~nc~rne plus particlulièrement la mutation dans la région N-
t~-min~l~. Elle est ~nliellem~nt loc~ ée dans les acides aminés numérotés de 1 à5 20. Plus ~ ~L~ ement ladite mutation est lo~li~e dans les acides aminés
numérotés de 1 à 15. Encore plus pLc~çé~ ell~m~nt ladite mutation est loc~ ée dans
les acides arninés n~.ner.~lés de 1 à 10. Selon un mode de ré~ tion préféré ladite
mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 5 à 10.
Selon un mode préféré, la présente invention vise un variant de la thymidine
10 kinase du virus de l'herpès simplex de type I comprenant au moins une mutation
représentée par une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine et
par une s-lhstitl tion en position 10 d'une Alanine par une Thréonine.
A titre ~ ~sp~ f de ce type de mutant, on peut plus particulièLe.llenl citer
le mutant 2-865:HlZ décrit dans les exemples ci-après.
Selon un autre mode tout particulièrement préféré de la présente invention, il
s'agit d'un variant de la thymidine kinase du virus herpès simplex de type I
co~ renant au moins une mut~ti-)n représentée par une sl-hstihltion en position 60
d'une Méthionine une Isoleucine et une substitution en position 6 d'une Glycine par
une Sérine.
A titre repr~sent~tif de ce type de mutant, on peut plus particulièrement citer
mutant 2-3361:D3 décrit dans les exemples ci-après.
En ce qui concerne la mutation en region C-terrninale, elle est de pl~re. ce
localisée dans les acides aminés numérotés de 320 à 350. Plus préférentiellementladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 325 à 345 Encore
plus ~ n~iellement ladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés
de 330 à 343. Selon un mode de réalisation préféré, ladite mutation est localisée dans
les acides aminés numérotés de 335 à 340.
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Selon un mode tout particulièrement préféré de la présente invention, il s'agit
d'un variant de la thymidine kinase du vims herpès simplex de type I co,~"e,l~nl au
moins une stlhstitl1tion en position 60 d'une Méthionine par une Isole~ in~, unes~lh.stih~tion en position 10 d'une Alanine par une Thréonine et une sllhstitlltion en
position 337 d'une Arginine par une Glut~min~.
A titre r~p,~sP~ ir de ce type de mutant, on peut plus particuli~ "~nl citer
le mutant 3-4216:H2 décrit dans les exemples ci-après.
Avantagell~.ment, les variants selon l'invention pré~nt~nt des performances
améliorées au niveau de l'une ou plusieurs des caractéristiques el~yl.-a~iques
10 suivantes:
- inhibition par le substrat: une inhibition par le g;~n~ k~vir à forte
concentration est génér~lement observée avec l'enzyme sauvage; celle-ci est ~imim-.?e
voire supprimée avec les variants selon l'invention.
-Vitesse de I)hosph~nylation du ~n~ick)vir ou d'un autre analogue de
15 n~ o.~ . les variants selon l'invention po~sèciçnt av~nt~ usçmçnt une plus grande
vitesse de phosphorylation du ganciclovir ou d'un autre analogue;
- Vitesse de phosphorylation de la thyrnidine: celle ci est l~r~ré.~llliellementin~h~n~ee ou f1imim1çe avec les variants de l'invention ce qui leur confère une plus
grande sélectivité vis à vis du ganciclovir ou de l'analogue de nucléoside. Cette vitesse
~0 de phosphorylation de la thymidine sera définie dans ce qui suit à kavers sa con~t~nte
de spécificit~. Kcat/Km. Il s'agit d'une c-~nst~nte de vitesse apparente de second ordre
familière à l'homme de l'art. Elle permet de décrire les propriétés et les réactions de
l'enzyme libre et du substrat libre. Pour des substrats en compétition, elle d~ .ine la
spécificité de l'enzyme vis à vis de ces subskats. ( A. Fersht, Enzyme Structure and
25 Me~.h~ni~m lg85, W.H. Freeman, London ).
E~Ler~ tiellement, les variants selon l'invention et en particulier le variant
1537:E4, manifestent avantageusement, les propriétés cinétiques suivantes:
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- une ~1imimltion s~h~nti~lle voir totale d'inhi}~itic~n de ractivité de
phc~srh~ ation du ~n~içl~vir co~ a~elllent à l'enzyme sauvage pour laquelle
l'inhibition est très nette à partir de 15,uM;
- une ~ nt~tion au moins d'un facteur de 2 à 2,5 de la vitesse initiale de
5 phosphorylation du GCV à partir de 15-20~M par rapport à l'enzyme sauvage,
- et un rapport Kcat/Km de la thvmidine réduite au moins d'un facteur de 1 à 6
par rapport à celui de l'enzyme sauvage et de préférence d'au moins de 2.
Préfér~n~iellement~ les variants selon l'invention et plus particulièrement les
variants 2-865:H12 et 2-3361 :D3 présentent au moins l'une des performances
1~) cinétiques suivantes:
- une ~liminlltion significative de l'inhibition de la phosphorylation du
~n~içlt~vir ou de l'analogue de nucléoside à des concen~r~tion~ élevées en g~n~içlovir
ou en analogue de nucléoside,
- une vitesse de phosphorylation du ~nri~lovir ou de l'analogue de nucléoside
15 au moins triplée etlou
- un rapport Kcat/Km de la thymidine soit inchangé comme pour le mutant 2-
865: Hl2 soit réduit d'un facteur au moins égal à 5 comme pour le mutant 2~
3361:D3 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
Plus p-~rél~ iellement, le variant 3-4216:H2 selon l'invention présente au
2û moins l'une des performances cinétiques suivantes:
- une absence d'inhibition de la phosphorylation du g~n~içlovir ou de
l'analogue de nucléoside à des concentrations élevées en g~nçiçlovir ou en analogue
de nucléoside,
- une augmentation d'un facteur supérieur à 3,5 de la vitesse initiale de
25 phosphorvlation du GCV à partir de 15-20 ~M par rapport a l'enz~~me sauvage et/ou
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- un rapport KcattKm de la thymidine ~limiml~ d'un facteur 4 par rapport à
celui de l'enzyme sauvage.
De ces (10nnf~s, il ressort que le variant 3-4216:H2 mani~feste un
comportement particuliè~ e,l~ avantageux selon l'invention.
De telles qualités sont particuliè~l-le-lt av:mt~ ~s sur le plan thérapeutique
puisqu'elles permettent d'envisager une réduction ~ignifi~tive des doses d'lltili~tion
en enzymes etlou en analogue de nucléoside pour une efficacité au moins équivalente
voire supérieure. L'innocuité est privilégiée sans pour autant porter pré~udice à
l'efficacité.
Au sens de l'invention, on entend également rie~ign~r par variant selon la
présente invention toute enzyme obtenue par mo~lific~tion, à l'aide des techniques du
génie génétique, de la séquence d'acides nucléiques codant pour une th.,vmidine kinase
sauvage et po~éc~nt le comportement défini ci-dessus au regard du ~n~i~lnvir et/ou
un analogue de nucléoside. (Par mo lif~ tion, on doit entendre toute mutation,
15 sl~hstitl~tiQn, délétion, addition ou motlific~tion de nature génétique et/ou chimique~.
Bien ent~nflll, ces dérivés selon l'invention, ~~p~hle~ d'induire via l'activation
du ~nl~iel~vir ou un de ses analogues, la destruction rles-lites cellules peuvent
avantageu~emPnt être exprimés in vivo directement à partir des séquences d'acides
nuciéiques revendiquées.
A cet effet, la présente invention concerne ég~lement toute cassette
d'expression comprenant une séquence d'acides nucléiques telle que définie ci-avant,
un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la
transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs
fonct~onnels dans les cellules n.~ irères, de pl~ ce hllm~in~ Plus
pré~érenti~ ment, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'une séquence
d'acides nucléiques dans une cellule }-y~lpL.)liférative (cancéreuse, resténose, etc). A
cet égard, d~fférents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir par exemple du
propre promoteur du gène TK de l'herpès simplex de type I. Il peut également s'agir
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de séquences d'origine dirri:~lLe (responsables de l't~ ssion d'autres gènes, oumême synthétiques). Il peut ain~si s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée
~tim~ nt OU ~ 1 la transcription d'un gène de façon spécifique ou non,
in~llctihle ou non, forte ou faible. On peut citer n-t~mment les séquences promotrices
5 de gènes eucaryotes ou viraux. Par eY~ml-let il peut s'agir de séquences promotrices
issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser
en particulier de promoteurs ubic~ ir~ (promoteur des gènes HPRT, PGK, alpha-
actine, tubuline, DHFR etc), de promoteurs des fil~m~nt.~ intermédiaires (promoteur
des gènes GFAP, ~1~.5min~, Vimf~ntin~, neurofil~m.ont~, kératine, etc), de promoteurs
10 de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur
VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate
kinase, villine, protéine int~in~le de liaison des acides gras, alpha-actine du muscle
lisse, etc), des promoteurs cellules spécifiques de type cellules en division comme les
cellules cancéreuses ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des
15 hormones stéroides, récepteur de l'acide rétinoïque, récepteur de ~ cocorticoides,
etc) ou dits infhlctihl~ De meme, il peut s'agir de séquences promotrices issues du
génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes ElA et MLP
d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du
RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent etre modifiées par addition de
20 séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique
ou majoritaire.
La présente invention fournit m~int~nz~nt de nouveaux agents thérapeutiques
permettant d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cell-ll~ires. Dans ce but,
les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent etre injecté(e)s tel(le)s
25 quel~le~s au niveau du site à traiter, ou incubé(e)s directement avec les cellules à
détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les séquences d'acides nucléiques nu(e~s
pouva}ent pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanrnoins, on préfère
dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'~irnini~tration, permettant
d'améliorer (i) l'efflcacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage liii) la stabilité
30 extra- et intracellulaires.
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Dans un mode de mise en oeuvre particulièn~lllent préféré de la présente
invention, la séquence d'acides nucléiques ou la c~sette est incorporée dans un
vecteur. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique, biochimique ou virale.
Par vecteur chimique, on entend couvrir au sens de l'invention, tout agent non
5 viral capable de promouvoir le transfert et l'expression de séquences d'acidesnucléiques dans des cellules eucaryotes. Ces vecteurs ~~himiq~1es ou hioçhimiques,
synthétiques ou naturels, représ~ntent une ~lte~ ive illLi~s~i~ulL~ aux virus naturels
en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'~hs~nre
de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs
10 synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide n~lcleique à transfecter
et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage a travers la membraneplasmique et, le cas é~he~nt, les deux ,llel,-b,anes nucléaires. Pour pallier à la nature
polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des
charges polycationiques. A titre représent~tif de ce type de techniques de transfection
15 non virales, achlçllement développées pour l'introduction d'une information génetique,
on peut ainsi mentionner celles impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran
~Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et
al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides ~Felgner et al., PNAS 84 (1987)
7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemm~nt, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes
est apparu comme une ~lt~rn~tive prome~te-l~e à ces techniques physiques de
transfection. A cet égard, dir~ virus ont été testés pour leur capacité à infecter
certaines populations cellulaires. l~n particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS,
etc~, le virus HSV, les virus adéno-associés, et }es adénovirus.
La séquence d'acides nucléiques ou le vecteur utilisé dans la présente inventionpeut etre formulé(e) en vue d'adrninistrations par voie topique, orale, parentérale,
intranasale, intraveineuse, intramuscu}aire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique,
etc. De préférence, la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur est utilisé(e) sous
une forme injectal}le. Ils peuvent donc etre mélangés à tout véhicule
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ph~ ce7 tiquement ~ccept~hle pour une form~ tion injectable"lul~m.~ nt pour une
injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions
stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mrn~nt lyophili~s, qui, par
a(l~ition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la5 con~titl1tion de solutés inject~ s. Une injection directe de la séquence d'acides
nucléiques dans la tumeur du patient est ~llé~e~s~ll~ car elle permet de concentrer
l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses en séql~ences d'acides
nucléiques lltili~ees peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et
not~rnment en fonction du vecteur, du mode d'a~ . d~ion utilisé, de la pathologie
10 concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne é~lem~nt toute composition pharln~ceutirlue
co~ )lellanl au moins une séquence d'acides nucléiques telle que définie ci-avant.
Elle concerne ég~lem~nt toute composition pharm~celltitlue comprenant au
moins un vecteur tel que défini ci-avant.
Elle concerne aussi toute composition pharm~celltique comprenant au moins
un variant de la thymidine kinase tel que défini ci-avant.
En raison de leurs propriétés antiproliri~l ~liv~s, les compositions
ph~rm~ceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le
traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la
20 resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace
pour la destruction de cellules, not~mm~nt de cellules hy~e~ liré~dliv~s. E}le est
ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse
de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement al)~r~ fiée au
traitement des cancers. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon,
25 les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les le~lcémi~s myéloïdes, les
cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers
gastriques, les cancers de l'oesophage, les l~vmphômes B, les cancers ovariens, les
cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la
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peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, les cancers du
larynx, les cancers tête et cou, les cancers ano-génitaux HPV positifs, les cancers du
nasopharynx EBV positifs, etc.
Elle peut être utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle con.ei~t~ e~ntiell.omf?nt
5 à incuber les cellules en présence d'une séquence d'acides nucléiques (ou d'un vecteur,
ou ~ ette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à a~mini~trer à
l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une c~sette) selon l'invention, de
~L~.ence directement au niveau du site à traiter (tumeur not~mm~nt~, préalablement,
simlllt~nf~m~?nt et/ou après l'injection de la prodrogue considérée c'est à dire le
10 ganciclovir ou un analogue nucléoside. A cet égard, l'invention a ég~ ment pour objet
une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise encontact c~çs~ites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec une sequence d'acides
nucléiques ou un variant de la thymidine kinase tels que définis ci-avant.
En conséquence, la présente invention propose une enzyme TK mutée de telle
15 sorte que la ph~sph/~rylation du ~n~ielovir ou de l'analogue nucléoside mis en
oeuvre, soit très ~ig.~;r;~ iv~."e"l augmentée. Avantageusement, on peut ainsi, selon
l'invention, utiliser dans des tests cellulaires et cliniques un séquence d'acides
nucléiques TK mutée à des doses de prodrogue i) significativement plus faibles; ii~ ou
sl~ceptihles de provoquer un effet "by-stander" plus prononcé; iii) ou bien ne
20 confl~ nt pas à une toxicité cellulaire qui pourrait se produire lorsque la thymidine
Idnase sauvage est s~e~pL i"~ée.
La présente invention sera plus complètem~nt décrite à l'aide des exemples et
figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limit~tif~
L~pende des fi~ures:
Figure 1: Plasmide d'expression pXL2645
Figure 2 :Vitesses initiales de phosphorylation (activité spécifique en
nmolJmin/mg) en fonction de la concentration en thymidine (,uM) pour les enzyrnes
HSVl-TK sauvage et mutantes 1537:E4, 2-865:H12, 2-3361:D3 et 3-4216:H2.
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Figure 3. La courbe représente les vitesses de phosphorylation (activité
spécifique en nmolfmin~mg) en fonction de la concentration en ganciclovir en ~M
pour les enzymes HSVl-TK sauvage et .. ~ PS (1537:E4, 2-865:H12, 2-3361:D3
et 3 ~1216:H2).
Figure 4: Repf~ l;on s~ ue des pl~ es pcDNA3-TK, pXL 3022
et pXL3037. Le tableau 1 ci-après résume les con~t~nt~s cinétiques de ces elL~ylnes
vis-a-vis du g~nf~ick~vir et de la thymidine.
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U~
O O O O O +
._, ;~
~;
C~
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o o o o ~
E'.
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E o c~
~-- C-~! +l +l +l +l +l
, ~ C U~ o ~ oo
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-- +~ +l +l +l +l
~ _ O ~ ~r
c o o a
Y-- U~ X -- ~.
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Le GCV ne pre~nt~nt pas des con~l~nles cinétiques classiques rnic~h~ .nn~s (saufavec le mutant 3~216:H2) les valeurs sont exprimées à l'aide de S0.5 (i.e.
concentration en substrat con~l~i.e~nt à la moitié de la vitesse maximale observée)
5 MATERIELS ET METHODES
Ab~eviations
ACV: acyclovir
GCV:~an~ Ovir
~SV1-TK: thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1.
10 Techniques ~énérales de biolo~ie moléculaire
Les méthodes classiquement lltili~ en biologie moléculaire telles que les
extraçtions pl~p~Lives d'ADN r~ miAi~lue, la centrifugation d'ADN pl~mi~lique enlient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la
purification de frslgm~nt.c d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au
15 phénol-chlo,vr~ .e, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de
l'i~u~ ~anol, la transformation dans Esçheriçhia ÇQli sont bien connues de l'homme de
métier et sont abondamment décrites dans la littérature (Sambrook et coll. "Molecular
Cloning, a LaboLdl~Jl y Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.Y., 198~; Ausubel et coll. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &
20 Sons, New York, 1987).
Les pl~mi(les de type pUC et les phages de la série M13 sont d'origine
commerciale (Bethesda Research Laboratories), les pl~micles pBSK ou pBKS
proviennent de Stratagen.
L'a~nplification enzyrnatique de fragments d'ADN par la techni~ue dite de PCR
25 ~oivmerase-catalyzed Chain Reaction] peut être effectuée en utilisant un "DNA~hermal cvcler" ~Perkin Elmer Cetus) selon les recomm~n~tions du fabricant.
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L'éle~ tion d'ADN pls~ ue dans des cellules de E. ~i peut-être
réalisée à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad) selon les rec-)mm~n-l7tions du
fournisseur.
La vérifiç~ti-~n des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la me~ho~l~
développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. IJSA, 74 (1977) 5463-5467] en
lltili.c~nt le kit distribué par ~mer~h~m ou celui ~ trihlle par Applied Bio~y~le-lls.
I~:XEMPLE l: CRIBLAGE BIOCHIMIQUE DE MUTANTS HSVl-TK.
1-1 Plasmide d'expression procarvote du ~ène HSVI-TK.
Plusieurs systèmes d'expression du gène HSV1-TK chez E. coli sont décrits
d~ns la littérature ~Colbère et coll. 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 p3755; Kit et
coll. 1981 Gene 16 p287; Waldman et coll. 1983 J. Biol. Chem, 258 pll571; Fetzeret coll. 1992 Pharm. Pharmacd. Lett. 2 pl 12; Brown et coll. 1995 Nature Structural
Biology 2 p876). Celui qui est décrit çi-dessous permet une production très régulée et
elevée de la protéine HSV1-TK sous sa forme native (non fusionnée, non tronquée).
Le pl~mi~l~ d'expression procaryote pXL2638 a été construit à partir du
~]~ pHSV-106 (Gibco-BRL) et du vecteur d'expression pETlla (provenant de
Novagen) de la fac,on suiv~llL~. Après avoir rendu les extrémités franches, l'insert
~II-NcoI de 1,5 kb provenant de pHSV-106 et c~ntf?n~nt le gène HSV1-TK, dont la
sé~uence est publiée par McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5949, a été cloné au site
SmaI du pBSK pou} former le p1asmide pBTK1. Un site NdeI a été introduit par
m~lt~ nese dirigée à partir de la position -3 de la séquence codante du gène HSV1-
TK. Pour cela un fragment de 500 bp cnnten~nt la partie 5' du gène a été amplifié par
PCR en tltili~nt pBTK1 comme matrice et les oligonucléotides sens 5'(TTA TGA
ATT CAT ATG GCT TCG TAC CCC GGC)3' SEQ ID N~4 et ~nti~en~ 5'(TTA TTT
CTA GAG GTC GAA GAT GAG GGT)3' SEQ ID N~5 comme amorces; ce
fragment a été cloné dans M13mp19 puis séquencé. Ce fragment digéré par EcoRI etstI génère un insert de 460 pb qui a été co-cloné avec l'insert SstI-Xbal de 1 kb du
pBTEC~ contenant la partie 3' du gène HSV1-TK dans le plasmide pUC19 digéré par
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EcoRI et XbaI; ce r~ pUCTK contient le gène HSV1-TK sous forme de
c~ette NdeI-~ HI qui a été clonée entre les sites NdeI et BamHI du pETlla pour
créer le ~ micle pXL2638. Ce pl~mi~l~ permet d'~ll~er le gène HSV1-TK sous le
contrôle du promoteur du gène 10 du bactériophage T7; ce promoteur étant induit
lorsque l'ARN polymérase du bactériophage T7 est synth~ti~Pe comme par exemple
dans la souche de _. cQli BL21, l~mh~T)E3 (Studier et coll. 1990 Methods Enzymol.
185 p89).
1-2 Préparation des e~traits acellulaires.
Les extraits ~c~ ires de souche de E. coli surproduisant la protéine HSV1-
10 TK peuvent être ~ alés de clivel~es façons, parmi lesquelles on peut citer, la Iyse au
lysv~y~l~e en présence d'EDTA, l'utilisation d'appareils de broyage de type Menton-
Golin, French Press, X-Press, ou l'action des ultrasons. Plus particulièrement, les
extraits ~ ires de la souche de E. coli BL21, l~m~xl~nE3 (Novagen Inc)
pXL2638 ont été pr~ar~s de la façon ~uiv~Le:
La souche E. coli BL21, l~mh~l~nE3 pXL2638 est cultivée en milieu LB
(Luria-Bertani) + ~mI~icilline (50 mgll) à 37 ~C jusqu'à une absorbance à 600 nm de
0,7; la production de la protéine HSV1-TK est induite par l'ajout de 1 mM IPTG
~isopl~p~lLhio-beta-D-galactoside) et s'effectue en poursuivant la croissance des
cellules pendant 3 heures à 30 ~C. Après centrifugation (5000 x g; 20 min~, les cellules
20 o~tenues à partir de 1 l de culture sont resuspendues dans 10 ml de tampon Tris/HCl
50 mM pH 7.8, contenant 5 mM DTT, 4 mM MgCl2, et 10 ~o glycérol (v/v), et
soniquées durant 4 min à 4~C. Après centrifugation (50 000 x g; 1 h), le surn~ nt est
injecté sur une colonne de Source 15Q (50 ml de gel; Pharmacia) équilibrée dans le
tampon c~i-dessus. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de 0 à 400 mM
25 NaCl dans le tampon A. Les fractions contenant l'activité TK sont regroupées, amenées à une concentration finale de 1,1 M de sulfate d'ammonium et
chromatographiées sur une colonne de Phenyl-Superose HR 10/10 (Phamlacia) éluée
avec un gra~ient linéaire décroissant de 1,1 à 0 M de sulfate d'ammonium. Les
fractions contenant l'activité TK sont regroupées. Après cette étape, la ~a~a~ion
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présente une seule bande visible en SDS-PAGE, après révélation au Bleu de
Clo~ m~cie~ et cette bande migre avec un poids mnléc~ ire a~ar~l~t de 41 000
environ.
1-3 D--~pe de l'activité TK.
On peut ~létect~r l'activité ATP-dé~en-l~nte de phosphorylation de nucléosides
en procédant par exemple de la façon suivanle:
un extrait enzymatique contenant environ 0.1 unité de TK est incubé durant 15
rnin à 37~C dans 100 ,ul de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 cont~n:~nt 1 mg~ml BSA
(~lhl-minf~ bovine sérique), 5 mM ATP, 4 mM MgC12, 12 mM KCl, 2 mM DTT, 600
~M EDTA et 100 IlM [8-3H]-GCV (40 nCi/nrnol) La réaction est arretée par l'ajoutde 10 ~11 de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 cnnt~n~nt lmM thymidine non
radioactive. Les espèces phosphorylées sont fixées sur une colonne de DEAE-
Sephadex (400 ~1 de gel), puis, après lavage de la colonne, ces espèces sont éluées par
2 ml de 1 M HC}. La radioactivité dans l'é-h~ntilinn est ensuite comptée par
~inrill~tinn liquide.
Le dosage de l'activité TK en utilisant la thymidine comme substrat est effectuéde la meme fac~on en mettant en jeu 0,002 unité de TK et 1 ,uM (méthyl-l4C) thymidine
(~6nCi/nmole~.
L'unité d'activité TK est définie comme la quantité d'enzyme nec~ ire pour
phosphoryler 1 nmol de substrat par min dans les con~7itiC)n~ ci-dessus.
Pour le calcul des cnn~t~nte~ cinétiques, la quantité de TK introduite dans la réaction
enzymatique est ajustée de facon à transformer au maximum 5 ~o du substrat introduit
au départ, et l'activité spécifique de ce substrat est augmentée en conséquence. Les
courbes de Michaelis sont ajustées aux points expériment~llx à l'aide du logiciel
Enzfitter ~Sigma).
Puisque le GCV ne présente pas des constantes cinétiques classiques mi~h~éli~nnes
~sauf avec le mutant 3-4216:H2) les valeurs sont exprimées à l'aide de S0.5 (i.e.
concentration en substrat con~ nt à la moitié de la vitesse maximale observée)
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1-4 Plasmide pXL2645 permettant un cribl~pe biochimique.
Les systèmes d'e~ s~ion hétérologue chez E. coli sont nombreux et bien
connus de l'ho~r~ne du métier. L'e~ ion du gène HSV1-TK s'est avérée être la
m~illellre pour le criblage biochimique lorsque le gène est exprimé à l'aide du
5 promoteur lly~o~llane pTryp à un nombre de copies élevé sur le rl~cmirl~ pXL2645.
L'insert NdeI-XbaI de 1,4 kb du pUCl'K est co-cloné avec les inserts NdeI-EcoRI de
120 bp et E~2RI-XkaI de 3,1 kb du pXL694 ~Jung et coll. 1988 Ann. Inst.
Pasteur/Microbiol. 139 pl29) pour générer le rl~cmi~ie pXL2619. Les inserts suivant
du pXL2619: EcoRI-XbaI de 1,5 kb (cont~n~nt le gène HSV1-TK et pTryp: }a
10 région promoteur/opérateur de l'opéron tryptophane de E. coli suivie du RBS (site de
fixation des ribosomes) du gène _II de l~mhfl~ et XbaI-~amHI de 530 bp contenant la
région termln~tel1r TrrnB de l'opéron ribosomal de E. coli sont co-clonés dans le
vecteur pBSK+ pour créer le plasmide pXL2645.
1-5 I~ t~pénese du plasmide.
De nombreuses méthofi~,c permettant de réaliser la mllt~g~ne,se dirigée ou au
hasard sur plasmide sont connues de l'homme de l'art et on peut citer la mutagénèse
dirigée par PCR-ou par oligonucléotide en suivant les recomm~n~tions du folmliccellr
Arnersham, la mutagénèse au hasard in vitro par des agents chimiques ou in vivo dans
des souches de E. coli mutatrices (Mi11er "A short course in bacterial genetics", Cold
Spring Harbor Laborator,v, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992~. Le pl~mi~le pXL2645 a
été mutagénéisé à l'hydroxylamine selon un protocole déjà décrit et qui conduit à des
transitions GC en AT au hasard sur le ~l~cmi(l~ (H~ y~ et coll. 1976 Mol. Gen.
Genet. 145 plO1). C~inq ,ug d'ADN plasmidique, dissous dans un tampon phosphate
0,2 M pH6 et contenant 0,4 M d'hydroxylamine, sont incubés à 80~C ou 86 ~C
2~ pendant 30 min puis refroidis à tel~lpe-a~llre ambiante pendant 20 min, la solution est
ensuite dialysée puis précipitée. L'ADN est alors redissous dans 50 Ill d'eau. Si l'ADN
mi~ ue est pC~1110 (provenant de Pharmacia~ et portant le gène lacZ) des
mutants ~ç~~ sont obtenus à une fréquence de 2,4% (resp. 7,6~o) lorsque le plasmide
est chauffé à 80~C (resp. 86~C) en presence d'hydroxylamine.
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~4
1-6 (~ bla~e de mutants p~ ,1ant une TK modifiée.
Le pl~mir1e pXL2645 m-It~ n~isé à l'hydroxylamine à 80 ~C est introduit par
éle~ o~?oIdlion dans la souche de E. coli tk- ME8025 (~rov~i1anl du National Tn~tit~te
of Genetics, ~i.~him~, ~hi~uok~, Ken, Japon). Les électroporants sont ~n~....~~ indivi(l~ ~ll.?m~nt dans les puits de plaque de micr.~ lion cont~n~nt 100 ,ul de milieu
M9 suppl~m~nte avec 0,4 ~o de c~min~.aci~l~ et 50 mg/l d'~mpi~illin~ Les
cu~tures sont in~ à 37 ~C sous agitation pendant 17 heures. Quinze ,ul de la
culture diluée au 1/25ième dans le tampon TrisfHCl 50 mM pH 7.8 sont incubés
pendant 20 min à 37~C dans un volume de 250 ~1 de tampon Tris/HCI 50 mM pH 7.8
conten~nt 2 mgfml Iy~o~y-~,e de blanc d'oeuf, 5 mM ATF', 4 mM MgC12, 12 mM KCI,
2 mM DTT, 600 ,uM EDTA, 16 ,uM [8-3H]-GCV (60 nCi/nmol) et 1 ,uM [methyl -
14C~-thymidine (56 nCi/nmol). La réaction est arrêtée par l'ajout de 25 ,ul de tampon
Tris~ICl 50 mM pH 7.8 contenant lmM thymidine non radioactive. Les espèces
phosphorylées sont fixées sur une colonne de DEAE-Sephadex (400 !11 de gel), puis,
15 après laYage de la colonne, ces espèces sont éluées par 2 ml de 1 M HCI. La
r~lioactivité (3H et 14C) dans l'échantillon est ensuite comptée par s~intil~tion liquide
en lltili~nt un programme de double marquage, et le ratio 3Hfl4C est calculé pour
chaque é-~h~ntill~ n
Pour chaque plaque de microIil~Lion de 96 puits, sont calculés la moyenne des
20 ratios 3H/14C de l'ensemble des clones (M) et l'écart-type (c~) de la distribution des
ratios 3Hfl4C. De plus la quantité de protéines présente dans chacun des puits de la
plaque 96 puits est mesurée à l'aide du réactif de Bradford (Coomassie Plus Protein
Assay ~e~ent, Pierce) à partir d'une fraction aliquote de la dilution au 1/25ième
préparée c,i-dessus. Tout clone prés~nt~nt une teneur en protéines inférieure au quart
25 de la moyenne des clones de la boite est éliminé définitivement.
Le ratio 3H/14C obtenu pour chaque clone d'une boite 96 puits est comparé à
la moyenne M. Les clones présentant un ratio supérieur à la somme M+3~ tout en
pr~Cpnt~nt une activité de phosphorylation de la thymidine supérieure à M'/2, M' étant
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la moyenne des activités de phospholylation de la ~ymidineJ sont retenus pour
co.~ a~ion et étude.
Le tableau 2 résume les resultats obtenus après ~rib~ e de 4129 clones
~v~nal~l de la m1lt~énese à l'~lydl~kylamine du pXL2645 à 80~C. Dans ce criblage,
5 pour l'enzyme sauvage, I'activité TK est rappor~ée à 100~o et le rapport GC~V/I~y est
de 1.
A l'issue de cetté étude, il est mis en évidence un mutant dit 1537
~~lanire~ un comportement plus a~-~ivaleu~~ vis à vis du ganciclovir.
Activité TK ~o~TK<% Nombre Noms des Frequence
Mutants ~
EleYée 233 <TK<320 2 3841:D2 0,05
3841:F3
F ible 5<TK~10 17 0,4
~ ulle TK<5 99 2,4
Nullesur eGCVmais 1 2881:C8 0,02
in~h~n~ée sur la
~hyrnidine
Elevée sur le GCV GCV/Thy: 2 0,05
mais in~h~n~ée sur la1,76 (~: 0,11) 1537:E4
~Iy~niline 1,70 ~ 0,19~ 1921H:12
TA}3LEAU 2
EXEMPLE 2 : STRUCTURE PRIMAIRE ET CARACTERISATION
BlOCHlMlQUE DU MUTANT 1537:E4.
2-1 Séquence du ~ène HSVl-TK du mutant 1537:E4.
Le gène HSV-TK exprimé à partir du mutant 1537:E4 a été séquencé sur les deux
15 brins et une seule mutation G180A a été observée. Cette mutation correspond à une
substitution Met60Ile. Il est à noter que ce résidu est situé dans la région c--n~n~ du site
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de fix~tion de l'Al'P. Un travail co~ able a été réalisé avec le mutant 1921:H12 et la
même substitution (Met60Ile~ a été observée.
2-2 Clon~*e du ~ène HSVl-TK du mutant 1537~ 4 dans un vecteur procarvote
d'expression élevée.
L'insert ~I-~HI de 1,~ l~b codant pour le gène HSV1-TK du mutant ~537:E4
a été cloné dans le vecteur d'e~ ion pETlla pour générer le pET:E4. C'est à partir de
ce plasmide pET:E4 ~ue l'enzyme HSV1-TK du mutant 1537:E4 a été produite chez _.coli BL21, l~mhl1~nE3 dans les con-~iti-~n~ décrites en 1-2.
2-3 Donnees biochimiques.
Les c~n~t~nt~ cinétiques pour la TK mllt~nte 1537:E4 et la TK sauvage prise en
référence sont obtenues dans les conditions de dosage enzyrnatiques décrites au
paragraphe 1-3.
Les 2 TK (sauvage et mutant 1537:E4) ne présçntçnt pas un comportement
~ h~éTi~n avec le Ganciclovir et l'Acyclovir (inhibition à forte concentration). Ceci
interdit donc le calcul d'une valeur de Km avec ces 2 subskats. Seule peut être donnée la
concentration So 5 correspondant à concentration en subskat ~mn~nt une vitesse initiale
égale à la moitié de la vitesse maximale observée. Vmax et Vmax obs y sont exprimées en
nmole~min~mg de protéine.
La courbe de la figure 2 montre les vitesses initiales de phosphorylation en fonction
de la concentration de GCV pour les deux enzyrnes 1537:E4 et sauvage. Elle fait
appaldil~ en particulier l'absence presque totale d'inhibition de l'activité de
phosphorylation du GCV par la TK mutante 1537:E4, co~ direl"ent à l'enzyme sauvage
pour laquelle l'inhibition est très nette à partir de 15 ,uM. Cette courbe montre de plus une
augmentation d'un facteur 2 à 2,5 de la vitesse initiale de phosphorylation du GCV à partir
de 15-20 ~M avec l'enzyme mutante 1537:E4 par rapport à l'enzyme sauvage. L'enzyme
mutante 1537:E4 y présente un rapport Kcat/Km de la thymidine réduit d'un facteur 2 par
rapport à l'enzyme sauvage.
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EXEMPLE 3 : OBTENTION, STRUCTURE PRIMAIRE EI'
C~ARACTERISATION BIOCHIMQUE DES MUTANTS 2-865:H12 ET 2-
3361:D3.
3.1 Obtention des mutants 2-865:H12 ET 2-3361:D3.
Le rl~ e pXL2838, issu du mutant 1537:E4 porte, sous le controle du
promoteur pTryp, le gène HSV1-TK dont la protéine TK est ~i~réL~ e de la protéine
sauvage par la mtlt~tion M60I. Ce p~mi-le est mutagénéisé à l'}lyd~xyl~lline à 86~C
puis introduit par électroporation dans la souche E. coli tk- ME8025. Un total de
4992 électroporants sont analysés pour leur ~r~cite à rh~ph~ryler le ~nric~k~vir et
la ~ymidine comme cela est décrit dans l'exemple 1-6. Les résultats de ce criblage
sont résumés dans le tableau 3 où l'activité TK est rapportée à 100% et le rapport
GCV/I'hy est de 1 pour l'enzyme sauvage. Deux mutants 2-865:H12 et 2-3361:D3
prf~sen~nt un comportement plus a~livaleul vis à vis du ganciclovir.
Activité TK %~TK<% Nombre Noms des Fréquence %
Mutants
Nulle TKc5 227 4,5
Faible 5cTK<10 55 1,1
Elevée sur le GCV mais GCV/I~y: 2 0,04
int~h~ngée sur la thymidine 4,95 +/- 0,66 2-865:H12
3,99 +/- 0,53 2-3361:D3
TABLEAU 3
3-2 Séquence du ~ène HSVl-TK des mutants 2-865:Hl2 et 2-3361:D3.
Le gène HSV1-TK exprimé à partir des mutants 2-86~:H12 et 2-3361:D3 a
été séquencé sur les deux brins et les mutations suivantes ont été observées. Avec le
mutant 2-865:H12, les mutations sont G28A, G30A et G180A ce qui correspond aux
substitutions AlalOThr et Met6QIle. Alors qu'avec le mutant 2-3361:D3 les mutations
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sont G16A, G180A, C306T et C308T ce qui correspond aux sl1~tih~tions Gly6Ser,
Met60Ile et Thr103Ile.
3-3 Importance de la mutation localisée dans la N-terminale de la TK.
Les enzymes des .l",~ 2-865:H12 et 2-3361:D3 portent toutes deux une
5 mutation dans la partie N-terminale de la thymidine kinase position 10 ou 6. Puisque
l'enzyrne co-Lesl~olldant au mutant 2-3361:D3 comporte aussi une m~lt~tinn en
position 103, des rl~miAPc, comportant les m~tt~til n~ en position 6 et 60 (pXL2964)
ou en position 60 et 103 (pXL2963) ou en position 103 (pXL2965) ou en position 6seulement (pXL2966) ont été construits de la façon suivante. L'insert SnaBI-~EI de
400 bp du plasmide pXL2840 (pl~micle extrait du mutant 2-3361:D3) a été cloné soit
dans le rl~micle pXL2645 digéré par SnaBI-~2EI pour générer pXL2965, ou soit
dans le pl~micle pXL2838 digéré par SnaBI-~2EI pour générer pXL2963. Le
pl~mi~P pXL2964 correspond à la ligature de l'insert MluI-Xn~I de 2,9 kb du
pXL2838 avec le fragment XmnI- MluI de 2,1 kb du pXL2840. Le plasmide
pXL2966 correspond à la ligature de l'insert MluI-XmnI de 2,9 kb du pXL2645 avecle fragment XmnI-MluI de 2,1 kb du pXL2840. Ces pl~ ont été transformés
dans la souche de E. coli ME8025 et l'activité thymidine kinase sur la ~Iyl~lidille et le
ganciclovir est déterminée comme dans l'exemple 1-6, les rapports GCV/Thy figurent
dans le tableau 4.
Pi~ le (Mutant) Mutation de l'enzyme GCV~rhy
TK
pXL2645 TKsauvage 1,00 +/- 0,08
pXL2838 (1537:E4) M60I 1,60 +/- 0,17
pXL2840 (2-3361:D3) G6S, M60I, T103I 3,10 +/- 0,26
pXL2963 M60I, T103I 1,60 +/- 0,18
pXL2964 G6S, M60I 2,80 +/- 0,40
pXL2965 T103I 1,00 +/- 0,18
pXL2966 G6S 1,40 +/- 0,20
TABLEAU 4
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Seul le rapport GCV/Thy obtenu avec le pl~micle pXL2964 est co,l,p~ble à
celui obtenu avec le pl~cmi~ pXL2840. Et l'f~n~mhle des resultats montrent que ce
n'est pas la mutation en position 103 mais la mllt~tic~n en position 6 qui conduit à une
amélioration de l'activité TK sur le GCV du mutant 2-3361:D3 par rapport au mutant
1537:E4. D'autre part la mutation en position 6 seule conduit à une ~meli~tion de
l'activité TK. L'effet de cette mutation est donc additif à l'effet de la mutation en
position 60 pour améliorer l'activité TK sur le GCV. De plus l'amélioration obtenue
en combinant ces deux mutations Gly6Ser et Met60Ile peut aussi être obtenue en
comhin~nt avec la mutation Met60Ile une autre mutation située dans la partie N-
terrninale de la thyrnidine kinase par exemple la mutation Ala 10Thr.
3-4 Glonzlpe du pène HSVl-TK des mutants 2-865:H12 et 2-3361:D3 dans un
vecteur procarvote d'expression élevée.
L'insert NdeI-BamHI codant pour le gène HSV1-TK provenant du mutant 2-
865:H12 (respe~;Live,nent 2-3361:D3) a été cloné dans le vecteur d'expression
pETlla pour former le pl~mic~e pXL2843 (leslJe~;~iv~ ,ent pXL2841). Ces pl~mit~cont été l~ o-l-,és dans E. coli BL21met~1amWaDE3 afin de produire les enz~nnes
de ces deux m~lt~nt~
3-5 Données, biochimiques.
Les enzymes 'I'K issues des cultures _. coli BL21met~1amWaDE3, pXL2843
et E. çoli BL21met~1~m~1)E3, pXL2841 ont été purifiées jusqu'à homogénélté. Les
con~t~ntes cinétiques pour la TK des m11t~ntS 2-865:H12 et 2-3361:D3 ont été
déterrninées et comparées à celles de la TK sauvage et du mutant 1537:E4.
L'ensemble des valeurs est rapporté sur la figure 3. La courbe de la figure 3 montre
les vitesses de phosphorylation en fonction de la concentration en GCV pour les
- 25 quatre enzymes. Elle fait apparaître une levée partielle de l'inhibition par le GCV des
TK mutantes 1537:E4 2-865:H12 et 2-3361:D3 contrairement à l'enzyme sauvage
pour laquelle l'inhibition est nette au delà de 30 ,uM. Cette courbe montre aussi une
augmentation de la vitesse de phosphorylation du GCV d'un facteur 1,6 à 2,5 à 16
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,uM de GCV et de 4,3 à 4,9 à 100 ,uM de GCV par rapport à l'enzymfe sauvage. Le
tableau 1 de la figure 3 montre que l'en~yme du mutant 2-865:H12 possède Uf-'f
rapport Kcat/Kmf de la thy-midine inch~n~? par rapport à celui de l'enzymfe sauvage, et
que celle du mutant 2-3361:D3 ~~-&t~ife~l~ un rapport Kcat/Km réduit d'un facteur
5 supérieur ou égal à 5 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
~.XEMPLE 4: OBTENT ON, STRUCTURE PRIMAIRE DU MUTANT ET
CARACTEI~ISTION BIOCHIMIQUE DU MUTANT 3-4216:H2
4.1 Obtention du mutant 3-4216:H2.
Le pl~mifie pXL2842, issu du mutant 2-865:H12 porte, sous le contrôle du
lQ promoteur pTryp, le gène HSV1-TK dont la protéine TK est ~ir~f~ll~e de la protéine
sauvage par les mutations AlalOThr et Met60Ile. Ce pl~mi~ie est mutagénéisé à
l'hydroxyLffnifle à 86~C puis introduit par électroporation dans la souche E:. coli tk-
ME8025. Un total de 3900 éleckoporants sont analysés pour leur c~p~ite à
phosphoryler le g~n~ie,1Ovir et la thymidine comme cela est décrit dans l'exemple 1-6.
15 Les résultats de ce criblage sont résum~s dans le tableau 5 où l'activité TK est
rapportée à 1005~o et le rapport GCVII~y est de 1 pour l'enzyme sauvage. Un mutant
34216:H2 présente un comportement plus activateur vis à vis du ganciclovir.
Activité TK MUTANTS
~o<TK<~o nombre Noms Fréquence %
Nulle TK<5 121 3,2
Faible 5<TK<10 19 0,5
Nulle sur le GCV mais 1 3-2293:C4 0,025
inch~ngée sur la
thymidine
Elevée sur le GCV maGCV/I~y: 1 3-4216:H2 0,025
in-~h~ngée sur la 7,84+/- 1,09
thymidine
TABLEAU 5
4.2 Séquence du ~ène HSVI-TK du mutant 3-~216:H2.
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Le gène HSV1-TK exprimé à partir du mutant 3-4216:H2 a été séquencé sur les deuxbrins et les mllt~tinn~ ~wv~l~s ont été observées (G28A, G30A,G180A, C591T,
C892T, G1010A, et GlOllA). Ces mutations correspondent aux sllkstitlltion~
AlalOThr, Met60Ile et Arg337Gln.
4-3 Clon ~sJe du ~ène HSVl-TK du mutant 3-4216:H2 dans un vecteur
procaryote d'e~;on élevée.
L'insert NdeI-BamHI codant pour le gène HSVl-TK ~rovellant du mutant 3-4216:H2
a été cloné dans le vecteur d'expression pETlla pour former le plasmide pXL3129.Ce rl~mi~le a été transformé dans E. ~Qli BL21mç~ mh~1~T)E3 afin de produire
l'enzyme de ce mutant.
4-4 Données biochimiques.
L' enzyme TK issue de la culture E. coli BL21met~1ambdaDE3, pXL3129 a été
purifiée iusqu'à homogene;té. Les c~ t~ntes cinétiques pour la TK du mutant 3-
4216:H2 ont été (let~ormin~ et conlpa~ees à celles de la TK sauvage et des ~
1537:E4, 2-865:H12 et 2-3361:D3. L'ensemble des valeurs est rapporté sur la figure
3 et le tableau 1. L'enzyme du mutant 3-4216:H2 est remarquable par la levée totale
de l'inhihiti-~n par le substrat GCV et par l'~t1,~m~nt~ti-~n de la vitesse de
phosphorylation du GCV. La vitesse initiale de phosphorylation du GCV avec ce
mutant est ml1ltipliée par un facteur 7, par rapport à l'enzyme sauvage, et un facteur
2,8 par rapport au mutant 2-865:H12. De plus, le mutant 3-4216:H2 possède une
activité catalytique de phosphorylation de la thymidine plus faible que l'enzymesauvage et les autres m1~t~nt~ 1537:E4, 2-865:H12 et 2-3361:D3, comme l'indiquent
les valeurs Kcat/Km sur le tableaul.
EXEMPI_E S - CONSI RUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION DES
VARIANTS DE TK
Cet exemple décrit la construction de vecteurs utilisables pour le transfert desséquences d'acides nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo.
5.1 - Con~truction de vecteurs pla~.midiques
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Pour ce faire on peut mettre en oeuvre des vecteurs commerciaux tels que les
vecteurs pZeoSV, pSV2 pcDNA3...
- Le vecteur pSV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2,
D.M. Glover (Ed~ IRL Press, Oxford, W~chin~t-n DC, 1985. Ce vecteur est un
5 vecteur d'~ ssion eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les V~ TK ont
été inséres dans ce vecteur aux sites HpaI-EcoRV. Ils sont ainsi placés sous le
controle du promoteur de l'enh~n~çr du virus SV40.
- Le vecteur pCDNA3 (Invitrogen). Il s'agit eg~lement d'un vecteur
d'expression eucaryote. Les séquences d'acides nucléiques codant pour les variants
10 TK de l'invention sont ainsi pl~rées, dans ce vecteur, sous le En ce qui concerne les
gènes codant pour la HSV1-TK sauvage et controle du promoteur précoce du CMV.
Toutes les constructions décrites dans l'~x~mrle ont été introduites dans ce vecteur
entre les sites Hind III / Not I pour être testées dans les di~rélen~ systèmes
d'évaluation in vitro.
En ce qui concerne le gène codant pour la HSV1-TK sauvage et celle du
mutant 2-865:H12, des constructions qui ont été réalisées avec le plasmide pXL2990.
Ce vecteur, dérivé de pBSK (Stratagene) comporte le promoteur/enhz~n-~el-r du CMV
amplifié par PCR à partir du pl~mide pGCN (Tanaka et coll. 1990 Cell 60 p375). Le
gène HSV1-TK a été amplifié par PCR à l'aide du plasmide pBTK1 (voir exemple
20 1.1~ en créant les sites NcoI et AvrII aux codons ATG et TGA respectivement. Ce
gène a alors été cloné en aval du promoteur CMV du pXL2990 et en amont de la
séquence de polyadénylation tardive de SV40 (amplifiée par PCR à l'aide du plasmide
pGL3basic (Promega)) pour générer le plasmide pXL3022. De façon comparable le
gène HSV1-TK issu du mutant 2-865:H12 a été ~mplifié par PCR à l'aide du
plasmide pXL2843 (voir exemple 3.4) puis cloné en aval du promoteur CMV du
pXL2990 et en amont de la séquence de polyadénylation tardive de SV40 pour
générer le plasmide pXL3037, voir Figure 4.
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5.2 - Construction de vecteurs viraux
Selon un mode particulier, l'i.lv~n~ioll réside dans la construction et l'l~tili~c~ti~n
de vecteurs viraux permettant le ~ ~rell et l'~.e~ion in vivo des acides mlrlei~u~-c
tels que définis ci-avant.
S'~gi.c.c~nt plus particulii~-cl~ d'adénovirus, dirr~ cl.L~ sérotypes, dont la
structure et les propriétés varient quelque peu, ont été car~ct~ri.cés Parmi cessé-~)~y~es, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus
hllm~inc de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir~em~n~le W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale 1ltilic~hles dans le
10 cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine,
murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire
ou encore cimienne (exemple: SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animaleest un adénovirus canin, plus ~l~re.~l-tiellement un adénovirus CAV2 ~souche
m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans
15 le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
E~r~.~"liellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR,
une séquence permettant l'~nç~psi~tion et un acide nucléique selon l'invention.
Encore plus ~ ré-~nLif~ me~t, dans le génome des adénovirus de l'invention, la
région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral conci(3eré peut être rendu non
20 fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et not~mment parsuppression totale, sllhstit~1tion, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurc bases
dans le ou les gènes considérés. De telles n~o lific~tions ~uv~ être obtenues in vitro
(sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie
génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions
25 peuvent également être modifiées, et not~mm~nt la région E3 (W095/02697), E2
(W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5
(W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon
l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de
réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont
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inserés la région E4 et la séquence d'acides m~rl~ ~ de l'invention (Cf FR94
13355). Dans les virus de l'invention, !a délétion dans la région E1 s'étend
Çé~l.Liellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombin~nt.e défectifs selon l'illvenlion peuvent être préparés
par toute techniq-l.o connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)
195, EP 185 573; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils ~euv~llL être
e~)a~s par recombinaison h~)mologue entre un adénovirus et un pl~smi~1~ portant
entre autre la séquence d'acides nucléiques revendiquée. La recormbinaison homologue
se produit après co-transfection desdits adénovirus et pl~.smic~e dans une lignée
ce~ ire approp, iée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être
transformable par lesdits élem~-nt.c, et (ii), comporter les séquences capables de
complement~r la partie du génome de l'adénovirus défectif, de ~L~ré~nce sous forme
intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut
mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 ~Graham et al., J. Gen. Virol.
36 (1977) 59) qui contient not~mment intégrée dans son génome, la partie gauche du
génome d'un adénovirus Ad5 (12 %~ ou des lignées capables de complemen~Pr les
fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n~ W0 94/26914
et W095/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont mtlltipliés sont récupérés et purifiés selonles techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Plus particulièrement, les constructions adénovirales selon l'invention sont
obtenues conformément au protocole suivant:
Ils ont été construits selon la technologie décrite dans le brevet W096/25506
auquel on se réfèrera pour la description détaillée des pls3smi~i~.s ci-après cités. Pour
cela, le plasmide navette pACK3 a été utilisé, il dérive de ColE1 et contient i) le gène
qui confère la r~si~t~nce à la kanamycine, iil le gène sacB de B. s!lbtilis, iii) les
séquences lTR-Psi (position 1-386 de l'adénovirus Ad5) séparées des séquences
contenant le gène codant pour la protéine PIX (position 3447-4415 de l'adénovirus
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Ad5) par les sites de restrictions EcoRV et SalI. Les cassettes d'~p~ion
eucaryotes des p~mi~l~s pXL3022 et pXL3037 ont été clonés entre les sites E~oRV
et SalI du pl~mi~e navette pACK3 pour forrner les p~ s pXL3050 et 3051
respectivement, voir figure 4. Par double recombinaison homologue à l'aide du
pl~mi(~e adénoviral pXL2822 (décrit par J. Crouzet et coll. 1997 Proc. Natl. Acad.
Sci. 94 sous presse), les p~ s adénoviraux pXL3075 et 3076 respectivement ont
été générés. Ces p~ s ont été digérés par ~I et transfectés dans la lignée
cell'11~ire h1ln~in~ 293 afin de produire les virus ADV3Q75 et ADV3076. Ces virus
sont délétés dans les régions E1 et E3 et qui c-nti~nn~nt respectivement les ç~ssettes
d'expression des gènes HSV1-TK de l'enzyme sauvage et du mutant 2-865:H12.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille
relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de
manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de
cçll1l1~s, sans induire d'effet sur la cr )i~nce, la morphologie ou la différenciation
cell~ ires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez
l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il con~ d
environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR)
de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du
génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d~n~p~ tion: la
partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale
et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap
codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro etin vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO g1/18088; WO 93/09239;
US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes
constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés
et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur
cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.
CA 02245508 1998-08-05
WO 97/29196 PCT/FR97/00193
36
Les AAV rec-)n hin~nt.~ défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-
transfection, dans un lignée ce~ ire infectée par un virus auxiliaire humain (par
exemple tm adénovirus), d'un pl~Qmifie co,llenalll tme séquence d'acides m~4j~t~ de
l'invention d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un
5 rl~mi~e portant les gènes dt~nr~rQ;~tion (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée
cellulaire utili.~able~ est par exemple la lignée 293. Les AAV rec-~mhin~nt~ produits
sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les leLruvilus, la construction de vecteurs
recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir not~mm~nt Bre~kfiekl et
al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Ben-~tein et al. Genet. Eng.
7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les
rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils
c~)n~tittlent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des
rétrovirus colnpr~lld essentiellement deux LTR, une séquence d'-~nc~pa;~l~tion et trois
15 régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des
rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et
remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurspeuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le
MoMuLV ("murine moloney le1lk~mi~ virus"; encore désigné MoMLV), le MSV
20 ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV
("spleen necrosis virus"~; le RSV ("rous sarcoma virus"~ ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recomhin~nts selon l'invention comportant une
séguence d'acides nucléiques selon l'invention, un plasmide comportant notamment les
LTR, la séquence d'~nc~rsi~i~tion et ladite sé~uence d'acides nucléiques est construit,
25 puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'enc~rsi~l~tion, capable
d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le pl~mid~
Généralement, les lignées d'f~nc~rsi-l~tion sont donc capables d'exprimer les gènes
gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur,
et notamment la lignee PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (W090/02806) et la3Q lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants
CA 02245508 lsss-os-05
wo 971~9l96 PCT/FR97/00l93
37
peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité
transcriptinnn~lle, ainsi que des séquences d'çnr~p.~ tiQn ét~n(~ s, co~ x..~lL une
partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les ~~llovirlls
recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particuliè~me.~l
avantageux d'utiliser un adénovirus ou un ~~l-uvir~ls recomhin~nt défectif. Ces
vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intér~s~nt~ pour le
transfert de gènes suicides dans les cellules tumorales.
~.3 - Vecteurs chimi~ues
Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre del'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n,
polyéthylène imine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants.
Ils po~èclen~ la propriété de conrl~n~er l'ADN et de promouvoir son association avec
la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines
(lipofe~:lmine, transfectam, etc) difre~ lipides cationiques ou neukes (DOTMA,
DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de
la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le
principe de condenser l'ADN grâce au pol,vmère cationique tout en dirigeant la
fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère
cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du typecellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la L~dl~felli.le, à l'insuline ou
du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La
préparation d'un composition selon l'invention utili~nt un tel vecteur chimique est
réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple
mise en contact des différents composants.
CA 0224~08 1998-08-0~
WO 97/29196 PCT/FR97/00193
38
LISTE DE SEQUENCES
~1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 40.91.69.22
(H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.96
(ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX VARIANTS DE LA THYMIDINE
KINASE, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES CORRESPONDANTES ET LEUR
UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
( iii ) NOMBRE DE SEQUENCES: 8
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
~C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE:peptide
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRE INFORMATION: Les quatres premiers Xaa
representent un acide amine quelconque et le troisieme Xaa une
threonine ou une sérine.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO: 1:
Gly xaa xaa xaa Xaa Gly Lys xaa
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEOUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(D) CONFIGURATION: lin~aire
~ii) TYPE DE MOLECULE:peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
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W O 97/29196 PCTA~R97/00193
39
Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 1131 palres de bases
tB) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: liné~i re
~ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC GCG TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48
Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
20 Z5 30
CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 192
Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr
50 55 60
35 ACC ACG CAA CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240
Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr
65 70 75 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288
40 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 95
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384
Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432
Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly
130 135 140
55 GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
TTC GAC CGC CAT ..3C ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528
Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
CA 0224~08 l998-08-0~
WO 97/29196 PCT/FR97/00193
TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
180 185 190
CTC ATC CCG CCG ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624
Lea Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205
10 CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220
GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720
15 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG 768
Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg
245 250 255
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 270
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864
Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 285
30 TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 912
Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300
TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960
35 Tyr Asn val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC 1056
Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr Hls Val
340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACG TTT 1104
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365
50 GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131
Ala Arg Glu ~et Gly Glu Ala Asn
370 375
~2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
.
(i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
tD) CONFIGURATION: lin~alre
(ii~ TYPE ~E MOLECULE: ADNc
CA 02245508 l998-08-05
WO 97/29196 PCTn~R~7/00l93
41
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
5 TTATGAATTC ATATGGCTTC GTACCCCGGC 30
.
(2j INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE ~A SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
~B) TYPE: nucl~éotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TTATTTCTAG AGGTCGAAGA TGAGGGT 27
25 ~2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1131 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(c~ NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii~ TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
ATG GCT TCG TAC CCC AGC CAT CAA CAC GCG TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48
Met Ala Ser Tyr Pro Ser His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
GCG CGT TCT . CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96
Ala Arg Ser Arg Gly ~is Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
20 25 30
CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
~0 CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 192
Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr
50 55 ~ 60
ACC ACG CP~ CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240
55 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr
6~ 70 75 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288
V21 Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
CA 0224~08 l998-08-0~
WO 97/29196 PCT/FR97/00193
42
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384
Ser Ala Gly Asp Ala Ala val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432
Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly
130 135 140
15 GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528
20 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
180 185 lgo
CTC ATC CCG CCG ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624
Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205
CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220
~5 GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG 768
40 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg
z45 250 2ss
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 26s 270
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864
Giu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 285
TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 91 2
Phe Thr Leu Phe Arg Ala P~o Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300
55 TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
6~ Ser Met Hls Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
32s 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC : 1056
Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Me~ Val Gln Thr His Val
340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACG TTT 1104
CA 0224~08 l998-08-0~
WO 97129196 PCTAFR97/00193
43
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365
GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1 131
5 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn *
370 375
r
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
~i) CA~ACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 1131 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOM~3RE DE BRINS: simple
~5 (D) CONFIGURATION: 1 i n~A i re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNC
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC ACA TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48
Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Thr Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
20 25 30
30 CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 19 2
35 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr
50 55 60
ACC ACG CAA CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240
Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp ASp Ile Val Tyr
65 70 75 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288
Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 . 95
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110
~0 TCG GCC GGG GAC GCG GC5 GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384
Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432
55 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly
130 135 140
GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
TTC 5AC CGC CAT CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528
Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
CA 0224~08 l998-08-0~
WO g7/29196 PCT/FR97/00193
44
TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
180 185 190
CTC ATC CCG CCG ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624
Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205
CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220
GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG 768
Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg
245 ;~50 255
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 2~0
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864
Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 ~85
TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 912
Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300
TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC 1056
Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val
340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACG TTT 1104
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365
GCC CGG ~AG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131
Al2~ Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
370 375
~5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 1131 paires de bases
( B ) TYPE: nuc l éotide
(C) NOMLRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii~ TYPE DE MOLECULE: ADNc
6~
CA 0224~08 1998-08-0~
WO 97/29196 PCT/F~97/00193
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC ACA TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48
5 Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Thr Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
r
GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
0 20 25 30
CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
1~
CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 192
Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr
50 55 60
20 ACC ACG CAA CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240
Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr
65 70 75 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288
25 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 g0 95
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384
Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432
Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly
130 135 140
40 GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC~CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528
45 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
1 80 185 190
CTC ATC CCG CCG ACT TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624
Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205
5~;
CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220
60 GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG 768
6~ Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg
.
CA 0224~08 l998-08-0~
WO 97~29196 PCT~FR97/00193
46
245 250 255
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 270
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864
Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 285
TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG TTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 912
Phe Thr I.eu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300
15 TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
20 Ser Met ~is Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 .330 335
CAA GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC 10 56
~ln Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val
340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACG TTT 1 104
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365
GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1 131
Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn *
370 375
