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CA 022~81~8 1998-12-11
WO 98/00524 PCT/~R97/01107
PROCEDE DE PRODUCTION D'ADENOVIRUS RECOMBINANTS
La présente invention concerne un nouveau procédé pour la production
d'adénovirus recombinants. Elle concerne également les p~al~lions virales purifiées
produites selon ce procédé.
Les adénovirus présentent certaines propriétés particulièrement av~nt~euses
pour une utilisation comme vecteur de transfert de gènes en thérapie génique.
Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules
quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été
associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adénovirus ont
o ainsi été utilisés pour transférer des gènes d'intérêt dans le muscle (Ragot et al., Nature
361 (1993) 647), le foie (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), le système
nerveux (Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224), etc.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36
(kilobases) kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée
répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'~nc~pc~ ion (Psi), des gènes
précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les
régions E1, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El
notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont
contenus dans les régions L1 à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement
séquencé et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260).De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Adl2,
etc) ont également été séquencées.
Pour leur utili.~ti-)n en thérapie génique, différents vecteurs dérivés des
adénovirus ont été préparés, incorporant dif~é~nt~ gènes therapeutiques. Dans
chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre
incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans
l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région E1, essentielle à la réplication
virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero
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et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Par
ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres
délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation
ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant ts125, permettant d'inactiver
la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres
vecteurs comprennent une deletion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou
à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliql-ée dans la
régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires
tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans
O l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les
régions E1 et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une
expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont ete decrits pas exemple
dans les demandes WO94/28152, W095/02697, PCT/FR96/00088). En outre, des
vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits
(WO96/10088).
Les adénovirus recombinants décrits dans la littérature sont produits a partir de
différents sérotypes d'adénovirus. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus,
dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent uneorganisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adénovirus recombinants
peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine
humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier
les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Adl2). Parmi les différents
adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine
canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou
A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont
cités notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par référence.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus
recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, il
s'agit d'un adénovirus Ad2 ou Ad5.
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Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation,
- c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs
des fonctions defi~ient~-~ dans le génome adénoviral recombinant. L'une de ces lignées
est par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été
s intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires
hInn~in~os de rein conten~nt l'~ é gauche (environ 11-12 %) du génome de
l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encarsi~l~tion~ la
région E1, incluant Ela et Elb, la région codant pour la protéine pIX et une partie de
la région codant pour la protéine pIVa2. Cette lignée est capable de trans-
complémenter des adénovirus recomhin~nts défectifs pour la région E1, c'est-à-dire
dépourvus de tout ou partie de la région E1, et de produire des stocks viraux ayant des
titres élevés. Cette lignée est ég~Iem-qnt capable de produire, à température permissive
(32~C), des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible.
D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région E1 ont été décrites,
s basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A54g(WO94/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par
ailleurs, des lignées capables de trans-complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus
ont ég;lI~ment été décrites. En particulier, on peut citer des lignées complémentant les
régions E1 et E4 (Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322
; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant les
régions E1 et E2 (WO94/28152, W095/02697, WO95/27071).
Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de
l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une Iyse des cellules après environ 2
ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures). Après la Iyse des
cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par centrifugation en gradient
de chlorure de césium.
Pour la mise en oeuvre du procédé, I'ADN viral introduit peut être le génome
viral recombinant complet, eventuellement construit dans une bacterie (W096/25506)
ou dans une levure (W095/03400), transfecté dans les cellules. Il peut égalements'agir d'un virus recombinant utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN
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viral peut aussi être introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du
génome viral recombinant et une zone d'homologie permettant, après introduction
dans la cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome viral rec-)mhin~nt par
recombinaison homologue entre les différents fragments. Un procédé classique de
5 production d'adénovirus comprend ainsi les étapes suivantes: Les cellules (parexemple les cellules 293) sont infectées en boite de culture avec un préstock viral à
raison de 3 à 5 particules virales par cellule (Multiplicity of Infection (MOI) = 3 à S),
ou transfectées avec l'ADN viral. L'incubation dure ensuite de 40 à 72 heures. Le virus
est alors libéré du noyau par lyse des cellules, généralement par plusieurs cycles de
10 décongélation successifs. Le Iysat cellulaire obtenu est ensuite centrifugé à basse
vitesse (2000 à 4000 rpm) et le surnageant (Iysat cellulaire clarifié) est ensuite purifié
par centrifugation en présence de chlorure de cesium en deux étapes:
- - Une première centrifugation rapide de 1,5 heure sur deux couches de chlorure
de césium de densités 1,25 et 1,40 encadrant la densité du virus (1,34) de fa,con à
5 séparer le virus des protéines du milieu;
- Une deuxième centrifugation en gradient plus longue (de 10 à 40 heures selon
le rotor utilisé), qui constitue la véritable et unique étape de purification du virus.
Généralement, après la seconde étape de centrifugation, la bande du virus est
majoritaire. On observe néanmoins deux bandes moins denses, fines, dont l'observation
20 en microscopie électronique a montré qu'il s'agissait de particules virales vides ou
cassées pour la bande la plus dense, et de sous unités virales (pentons, hexons) pour la
bande la moins dense. Après cette étape, le virus est récolté par ponction à l'aiguille
dans le tube de centrifugation et le césium est éliminé par dialyse ou ~iess~lage.
Bien que les niveaux de pureté obtenus soient satisfaisants, ce type de procédé
25 présente cependant certains inconvenients. En particulier, il est basé sur l'emploi de
chlorure de césium, qui est un réactif incompatible avec une utilisation thérapeutique
chez l'homme. De ce fait, il est impératif d'éliminer le chlorure de césium à l'issue de la
purification. Ce procédé présente en outre certains autres inconvénients mentionnés
plus loin, limitant son utilisation à une échelle industrielle.
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Pour remédier a ces problèmes, il a été proposé de purifier le virus obtenu
après la Iyse, non pas par gradient de chlorure de cesium, mais par chromatographie.
Ainsi, l'article de Huyghe et al. (Hum. Gen. Ther. 6 (1996) 1403) décrit une étude de
dirrer~ types de chromatographies appliquée a la purification d'adénovirus
5 recombin~ntc. Cet article décrit not~mm~nt une étude de purification d'adénovirus
recomhin~nt.s utiIieDrlt une chromatographie d'échange d'anions faible (DEAE). Des
travaux antérieurs décrivaient déjà l'utilisation de ce type de chromatographie dans ce
but (Klemperer et al., Virology 9 (1959) 536; Philipson L., Virology 10 (1960) 459;
Haruna et al., Virology 13 (1961) 264). Les résultats présentés dans l'article de
o Huyghe et al. montrent une efficacité assez médiocre du protocole de chromatographie
par échange d'ions préconisé. Ainsi, la résolution obtenue est moyenne, les auteurs
indiquant que des particules de virus sont présentes dans plusieurs pics
chromatographiques; le rendement est faible (rendement en particules virales: 67 ~o;
rendement en particules infectieuses: 49 ~o); et la préparation virale obtenue à la suite
l5 de cette étape chromatographique est impure. En outre, un prétraitement du virus par
differentes enzymes/protéines est n~ocç~s~ire. Ce même article décrit par ailleurs une
étude de l'utilisation de la chromatographie de perméation de gel, démontrant une très
mauvaise résolution et des rendements très faibles (15-20 %).
La présente invention décrit un nouveau procédé de production d'adénovirus
20 recombinants. Le procédé selon l'invention résulte de modifications des procédés
anterieurs au niveau de la phase de production et/ou au niveau de la phase de
purification. Le procédé selon l'invention permet maintenant d'obtenir de manière très
rapide et industrialisable, des stocks de virus en quantité et de qualité très élevées.
L'un des premiers aspects de l'invention concerne plus particulierement un
25 procédé de pr~paldtion d'adénovirus recombinants dans lequel les virus sont récoltés à
partir du surnageant de culture. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de
préparation d'adénovirus comprenant une étape d'ultrafiltration. Selon un autre aspect,
I'invention concerne également un procédé de purification d'adénovirus recombinants
coll-~renant une étape de chromatographie d'échange d'anions. La présente invention
30 décrit également un procédé amélioré de purification utiIi.e.~nt une chromatographie de
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perméation de gel, éventuellement couplée à une chromatographie d'échange d'anions.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des virus de qualité élevée, en terme de
pureté, de stabilité, de morphologie, et d'infectivité, avec des rendements très élevés et
dans des conditions production entièrement compatibles avec les exigences
5 industrielles et avec la réglementation concemant la production de molécules
thérapeutiques.
En particulier, en terme d'industrialisation, le procédé de l'invention utilise des
méthodes de traitement de sumageants de cultures éprouvées à large échelle pour des
protéines recombinantes, telles que la microfiltration ou filtration profondeur, et
lo l'ultrafiltration tangentielle. Par ailleurs, du fait de la stabilité du virus à 37~C, ce
procédé permet une meilleure organisation au stade industriel dans la mesure où,con~rai~el-lent à la méthode intracellulaire, le temps de récolte n'a pas besoin d'être
précis à la demijoumée près. De plus, il garantit une récolte maximum du virus, ce qui
est particulierement important dans le cas des virus défectifs dans plusieurs régions.
5 D'autre part, le procede de l'invention permet un suivi plus facile et plus précis de la
cinetique de production, directement sur des échantillons homogénes de sumageant,
sans pretraitement, ce qui perrnet une meilleure reproducti~ilité des productions. Le
procédé selon l'invention permet aussi de s'affranchir de l'étape de Iyse des cellules. La
Iyse des cellules presente plusieurs inconvenients. Ainsi, il peut être difficile d'envisager
20 de casser des cellules par des cycles de congélation -décongélation au niveauindustriel. Par ailleurs, les méthodes alternatives de Iyse (Dounce, X-press, sonication,
cisaillement mecanique, etc) presentent des inconvenients: elles sont potentiellement
génératrices d'aerosols difficiles à confiner pour des virus L2 ou L3 (niveau deconfinement des virus, dependant de leur pathogenicite ou de leur mode de
25 dissemination), ces virus ayant par ailleurs tendance à être infectieux par voie
aerienne; elles engendrent des forces de cisaillement et/ou une liberation de chaleur
difficiles a controler, et diminuant l'activite des preparation. La solution d'utiliser des
détergents pour lyser les cellules demanderait à être validee et nécessiterait en outre
une validation de l'élimin~tion du detergent. Enfin, la Iyse cellulaire conduit à la
30 présence dans le milieu de nombreux débris cellulaires, qui rendent plus delicate la
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purification. En terme de qualité de virus, le procédé de l'invention permet
potentiellement une m~iIIeIlre maturation du virus conduisant à une population plus
homogène. En particulier, dans la mesure où l'empaquetage de l'ADN viral est la
dernière étape du cycle viral, la lyse prématurée des cellules libère potentiellement des
5 particules vides qui, bien que non réplicatives, sont a priori infectieuses et à même de
participer à l'effet toxique propre du virus et d'augm~nt~r le ratio d'activité spécifique
des prepardlions obtenues. Le ratio d'infectivité spécifique d'une préparation est defini
comme le rapport du nombre total de particules virales, mesuré par des méthodes
biochimiques (DO260nm, CLHP, PCR, méthodes imuno-enzymatiques, etc) sur le
0 nombre de particules virales génerant un effet biologique (formation de plages de Iyse
sur cellules en culture en milieu solide, transduction de cellules). En pratique, pour une
plép~lion purifiée, ce ratio est déterminé en faisant le rapport de la concentration des
particules mesurée par DO à 260nm sur la concentration d'unités formant plage de la
préparation. Ce ratio doit etre inférieur à 100.
Les résultats obtenus montrent que le procédé de l'invention permet d'obtenir
un virus d'une pureté au moins égale à son homologue purifié par centrifugation en
gradient de chlorure de césium, en une seule étape et sans traitement préalable, en
partant d'un surnageant viral concentré.
Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé de production
20 d'adénovirus recombinants caractérisé en ce que l'ADN viral est introduit dans une
culture de cellules d'~n~pci~tion et les virus produits sont récoltes après libération
dans le surn~nt de la culture. Co~ ilelllent aux procédés anterieurs dans lesquels
les virus sont récoltés suite à une lyse cellulaire prématurée effectuée de fa,con
mécanique ou chimique, dans le procédé de l'invention, les cellules ne sont pas lysées
25 par l'intervention d'un facteur extérieur. I,a culture est poursuivie pendant une durée
plus longue, et les virus sont recoltés directement dans le surnageant, apres libération
spont~nnee par les cellules d'encapsidation. Le virus selon l'invention est ainsi recupéré
dans le surn~ge~nt cellulaire, alors que dans les procédés anterieurs, il s'agit d'un virus
intracellulaire, plus particulièrement intranucléaire.
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La dem;ln-leresse a m~inten~nt montré que, malgré l'allongement de la durée de
la culture et malgré la mise en oeuvre de volumes plus grands, le procédé selon
l'invention permet de générer des particules virales en quantité élevée et de meilleure
qualité. En outre, comme indiqué ci-avant, ce procédé permet d'éviter les étapes de
5 lyse qui sont lourdes au niveau industriel et génèrent de nombreuses impuretés.
Le principe du procédé repose donc sur la récolte des virus libérés dans le
surnageant. Ce procédé peut impliquer un temps de culture supérieur à celui des
techniques antérieures basées sur la lyse des cellules. Comme indiqué ci-avant, le
temps de récolte n'a pas à être précis à la demijournée près. Il est essentiellement
o déterminé par la cinétique de libération des virus dans le surnageant de culture.
La cinétique de libération des virus peut être suivie de différentes manières. En
particulier, il est possible d'utiliser des méthodes d'analyses telles que la RP-HPLC, la
IE-HPLC, la PCR semi-quantitative (exemple 4.3), la coloration des cellules mortes au
bleu trypan, la mesure de la libération d'enzymes intracellulaires du type LDH, la
15 mesure des particules dans le surnageant par des appareils de type Coulter ou par
diffraction de la lumière, des méthodes immunologiques (ELISA, RIA, etc) ou
nephelometriques, la titration par aggrégation en présence d'anticorps, etc.
D'une manière préférée, la récolte est réalisée lorsque 50 % au moins des virus
ont été libérés dans le surnageant. Le temps ou 50 % des virus ont été libérés peut être
20 aisément déterminé en réalisant une cinétique selon les méthodes décrites ci-dessus.
Encore plus préferentiellement, la récolte est réalisée lorsque 70 % au moins des virus
ont été libérés dans le surnageant. Il est particulièrement préféré d'effectuer la récolte
lorsque 90 % au moins des virus ont été libérés dans le surnageant, c'est-à-dire lorsque
la cinetique atteint un plateau. La cinetique de libération du virus repose
2~ essentiellement sur le cycle de réplication de l'adénovirus, et peut être influencée par
certains facteurs. En particulier, elle peut varier selon le type de virus utilisé, et
notamment selon le type de deletion effectue dans le genome virai recombinant. En
particulier, la deletion de la region E3 semble retarder la liberation du virus. Ainsi, en
presence de la region E3, le virus peut etre recolte des 24-48 heures post infection. En
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revanche, en l'absence de la region E3, un temps de culture supérieur semble
necessaire. A cet egard, la clems~ndçresse a effectué des expérience de cinétique de
libération d'un adenovirus deficient pour les regions E1 et E3 dans le surn~nt des
c~ lç.s, et montré que la libération débute 4 a 5 jours environ post-infection, et dure
5 jusqu'au jour 14 environ. La liberation atteint generalement un plateau entre le jour 8
et le jour 14, et le titre reste stable au moins 20 jours post-infection.
P~e~r.~n~;~llçm.ont, dans le procédé de l'invention, les cellules sont cultivéespendant une période comprise entre 2 et 14 jours. Par ailleurs, la liberation du virus
peut etre induite par expression dans la cellule d'encapsidation d'une proteine, par
0 exemple virale, impliquee dans la liberation du virus. Ainsi, dans le cas de l'adenovirus,
la liberation peut etre modulee par expression de la proteine Death codee par la region
E3 de l'adenovirus (proteine E3-1 1,6K), eventuellement exprimee sous controle d'un
promoteur in~ ctihle. De ce fait, il est possible de reduire le temps de liberation des
virus et de recolter dans le surnageant de culture, plus de 50% des virus 24-48 heures
15 post-infection.
Pour recupérer les particules virales, le surnageant de culture est
avantageusement préalablement filtré. L'adénovirus ayant une taille de 0,1~m environ
(120nm), la filtration est réalisée au moyen de membranes ayant une porosité
sl-ffi~mment importante pour laisser passer le virus, mais s~ mment fine pour
20 retenir les co."~;n~n~s. De préférence, la filtration est réalisée au moyen de
membranes ayant une porosite supérieure a 0,2~m. Selon un mode de mise en oeuvreparticulièrement avantageux, la filtration est réalisée par filtrations successives sur des
membranes de porosité décroissante. Des résultats particulièrement bons ont été
obtenus en réalisant la filtration sur des filtres profondeur de porosité décroissante
10~um, 1,0!1m puis 0,8-0,2~m. Selon une autre variante préférée, la filtration est
réalisée par microfiltration tangentielle sur membranes planes ou fibres creuses. On
peut utiliser plus particulièrement des membranes planes Millipore ou des fibrescreuses ayant une porosité comprise entre 0,2 et 0,6~1m. Les résultats présentés dans
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les exemples montrent que cette étape de filtration a un rendement de 100 ~o (aucune
perte de virus n'a été observée par retention sur le filtre ayant la plus faible porosité).
Selon un autre aspect de l'invention, la demanderesse a maintenant mis au point
un procédé permettant de récolter et purifier le virus a partir du surnageant. A cet
effet, le surnageant ainsi filtré (ou clarifié) est soumis à une ultrafiltration. Cette
ultrafiltration perrnet (i) de concentrer le surnageant, les volumes impli~ués étant
important, (ii) d'effectuer une première purification du virus et (iii) d'ajuster le tampon
de la preparation aux etapes ulterieures de preparation. Selon un mode de réalisation
préféré, le surnageant est soumis a une ultrafiltration tangentielle. L'ultrafiltration
lo tangentielle consiste a concentrer et fractionner une solution entre deux
compartiments, rétentat et filtrat, séparés par des membranes de seuils de coupure
déterminés, en realisant un flux dans le compartiment retentat du dispositif et en
appliquant une pression transmenbranaire entre ce compartiment et le compartiment
filtrat. Le flux est generalement realise au moyen d'une pompe dans le compartiment
retentat du dispositif et la pression transmenbranaire est controlée au moyen d'une
vanne sur la veine liquide du circuit retentat ou d'une pompe à debit variable sur la
veine liquide du circuit filtrat. La vitesse du flux et la pression transmembranaire sont
choisis de facon à generer peu de forces de cisaillement (nombre de reynolds inférieur
à 5000 sec~', preferentiellement inferieur à 3000 sec~l, pression inferieure à 1.0 bar)
20 tout en evitant le colmatage des membranes. Differents systemes peuvent etre utilises
pour realiser l'ultrafiltration, comme par exemple des membranes spirales (Millipore,
Amicon), membranes planes ou fibres creuses (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF,
Sepracor) . L'adénovirus ayant une masse de l O00 kDa environ, on utilise
avantageusement dans le cadre de l'invention des membranes ayant un seuil de coupure
25 inferieur a 1000 kDa, de preference compris entre 100 kDa et 1000 kDa. L'utilisation
de membranes ayant un seuil de coupure de 1000 kDa ou supérieur entraine en effet
une perte importante de virus à cette étape. Préférentiellement, on utilise des
membranes ayant un seuil de coupure compris entre 200 et 600 kDa, encore plus
préférentiellement, entre 300 et ~00 kDa. Les expériences présentées dans les
30 exemples montrent que l'emploi d'une membrane ayant un seuil de coupure à 300 kDa
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permet la rétention de plus de 90~o des particules virales tout en Pl;.~.;n~.ll des
c-~nt~min~ntc du milieu (ADN, protéines du milieu, protéines cellulaires, etc.).L'utilisation d'un seuil de coupure de 500 kDa offre les mêmes avantages.
Les résultats présentés dans les exemples montrent que cette étape permet de
S c-ncçntrer des volumes de surn~nt importants, sans perte de virus (rendement de
90~o), et qu'elle génère un virus de meilleure qualité. En particulier, des facteurs de
concentration de 20 à 100 fois peuvent être obtenus aisément.
Cette étape d'ultrafiltration constitue ainsi une purification supplçm~ont~ire par
rapport au schéma classique dans la mesure où les cont~min~nt~ de masse inférieure au
o seuil de coupure (300 ou 500 kDa) sont élimin~ au moins en partie. L'amélioration de
la qualité de la p,epala~ion virale est nette lorsque l'on compare l'aspect de la
séparation après la première étape d'ultracentrifugation selon les deux procédés. Dans
le procédé classique impliquant une Iyse, le tube de la pl~pala~ion virale présente un
aspect trouble avec un coagulum (lipides, protéines) venant parfois toucher la bande
15 de virus, alors que dans le procédé de l'invention, la préparation après libération et
ultrafiltration présente une bande déjà bien résolue des cont:~min~nt.s du milieu qui
persistent dans la phase supérieure. L'amelioration de la qualité est aussi demontrée
lorsque l'on compare les profils sur chromatographie d'échange d'ion d'un virus
obtenu par Iyse cellulaire par rapport au virus obtenu par ultrafiltration comme decrit
20 dans la présente invention. Par ailleurs, il est possible d'améliorer encore la qualite en
poursuivant l'ultrafiltration par une diafiltration du concentrat. Cette diafiltration est
realisee sur le même principe que l'ultrafiltration tangentielle, et permet d'eliminer plus
completement les cont~min~nt~ de taille superieure au seuil de coupure de la
membrane, tout en realisant l'equilibration du concentrat dans le tampon de
25 purification.
Par ailleurs, la demanderesse a également montré que cette ultrafiltration
permettait ensuite de purifier le virus directement par chromatographie sur colonne
échangeuse d'ions ou par chromatographie de perméation de gel, permettant d'obtenir
une excellente résolution du pic de particules virales sans avoir besoin de traitement de
30 la préparation préalable à la chromatographie. Ceci est particulièrement in~tendu et
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avantageux. En effet, comme indiqué dans l'article de Hyughe et al. précité, la
purification par chromatographie de préparations virales donne des résultats médiocres
et nécessite de plus un prétraitement de la suspension virale par de la Benzonase et des
cyclodextrines .
s Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est donc caracterisé en ce
que les virus sont récoltes par ultrafiltration.
Comme indiqué ci-avant, le concentrat résultant est utilisable directement pour
une purification du virus. Cette purification peut être réalisée par les techniques
classiques antérieures, telles que la centrifugation en gradient de chlorure de césium ou
o autre milieu d'ultracentrifugation permettant de separer les particules selon leur taille,
densité ou coefficient de sedimentation. Les résultats présentés dans l'exemple 4
montrent en effet que le virus ainsi obtenu présente des caractéristiques remarquables.
En particulier, selon l'invention, il est possible de remplacer le chlorure de cesium par
une solution de iodixanol,5,5'-[(2-hydroxy-1-3propanediyl)-bis(acetylamino)]
bis[N,N'-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6-triodo-1,3-benzenecarboxamide] dans laquelle
le virus sedimente à l'equilibre à une densité relative comprise entre 1,16 et 1,24.
L'utilisation de cette solution est avantageuse car, contrairement au chlorure de
cesium, elle n'est pas toxique. Par ailleurs, la demanderesse a également montré que,
de manière avantageuse, le concentrat obtenu permettait aussi de purifier le virus
directement par un mécanisme d'échangeuse d'ions ou par perméation de gel, et
d'obtenir une excellente résolution du pic chromatographique de particules virales,
sans avoir besoin de prétraitement.
Selon un mode de réalisation préféré, les virus sont donc récoltés et purifiés par
chromatographie d'échange d'anions.
2s Pour la chromatographie d'échange d'anions, différents types de supports
peuvent être employés, tels que la cellulose, I'agarose (gels Sepharose), le dextran
(gels Sephadex), l'acrylamide (gels Sephacryl, gels Trisacryl), la silice (gels l'SK-gel
SW), le poly~styrène-divinylbenzène] (gels Source ou gels Poros), le copolymère
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éthylène glycol-méthacrylate (gels Toyopearl HW et TSK-gel PW), ou des m~l~ng~
(agarose-dextran: gel Superdex). Par ailleurs, pour améliorer la résolution
chromatographique, il est préférable dans le cadre de l'invention d'utiliser de supports
sous forme de billes, ayant les caractéristiques suivantes:
- le plus sphérique possible,
- de diamètre calibré (billes toutes identiques ou le plus homogènes possible),
sans imperfections ni cassures,
- de diamètre le plus petit possible: des billes de 10 ~lm ont été décrites
(MonoBeads de Ph~ ci~ ou TSK-gel de TosoHaas, par exemple). Cette valeur
lo semble constituer la limite inférieure pour le diamètre de billes dont la porosité doit par
ailleurs être très élevée pour perrnettre la pénétration des objets à chromatographier à
l'intérieur des billes (voir ci-dessous).
- tout en restant rigides pour résister à la pression.
Par ailleurs, pour chromatographier les adénovirus qui constituent des objets
de taille très importante (diamètre > 100 nm), il est important de mettre en oeuvre des
gels ayant une lirnite supérieure de porosité élevée, voire la plus élevée possible, pour
permettre l'accès des particules virales aux groupements fonctionnels avec lesquels
elles sont appelées à interagir.
Avantageusement, le support est choisi parmi l'agarose, le dextran,
I'acrylamide, la silice, le poly[styrène-divinylbenzène], le copolymère éthylène glycol-
méth~crylate, seuls ou en mélange.
Pour la chromatographie d'échange d'anions, le support utilisé doit être
fonctionalisé, par greffage d'un groupement susceptible d'interagir avec une molécule
anionique. Le plus généralement, le groupement est constitué d'une amine qui peut être
ternaire ou qu~tçrn~ire. En ut~ nt une amine ternaire, telle que le DEAE par
exemple, on obtient un échangeur d'anions faible. En utili.~nt une amine quaternaire,
on obtient un échangeur d'anions fort.
Dans la cadre de la présente invention, il est particulièrement avantageux
d'utiliser un échangeur d'anions fort. Ainsi, on utilise préférentiellement selon
l'invention un support de chromatographie tel qu'indiqué ci-dessus, fonctionnalisé par
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des amines quat~ res. Parmi les supports fonctionnalisés par des amines
quaternaires, on peut citer comme exemples les résines Sowce Q, Mono Q, Q
Sepharose, Poros HQ et Poros QE, les résines de type Fractogel TMAE, et les résines
Toyopearl Super Q.
Des exemples préférés de résines utilisables dans le cadre de l'invention sont le
Source, notamment Source Q, tel que 15 Q (Pharmacia), les MonoBeads, tel que Q
(Pharmacia), les résines de type Poros HQ et Poros QE. Le support MonoBeads
(diamètre des billes 10 + 0,5 ,um) est disponible commercialement depuis plus de 10
ans et les résines de type Source (15 ~m) ou Poros (10 ~lm ou 20 ~m) depuis 5 ans
environ. Ces deux derniers supports présentent l'avantage d'avoir une distribution des
pores internes très large (ils vont de 20 nm à 1 !lm), permettant ainsi le passage de très
gros objets à travers les billes. De plus ils offrent très peu de résistance à la circulation
de liquide à travers le gel (donc très peu de pression) et sont très rigides. Le transport
des solutés vers les groupements fonctionnels avec lesquels ils vont entrer en
interaction est donc très rapide. La demanderesse a montré que ces paramètres sont
particulièrement importants dans le cas de l'adénovirus, dont la diffusion est lente en
raison de sa taille.
I,es résultats présentés dans les exemples montrent que l'adénovirus peut être
purifié à partir du concentrat en une seule étape de chromatographie d'échange
d'anions, que le rendement de la purification est excellent (140% en terme de tdu,
comparé à la valeur de 49~o rapportée par Huyghes et al.) et que la résolution est
excellente. En outre, les résultats présentés montrent que l'adénovirus obtenu présente
une infectivité élevée, et possède donc les caractéristiques requises pour une utilisation
thérapeutique~ Des résultats particulièrement avantageux ont été obtenus avec unéchangeur d'anions fort, c'est-a-dire fonctionnalisé par des amines quaternaires, et
notamment avec la résine Source Q. La résine Source Q15 est particulièrement
préférée.
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A cet égard, un autre objet de l'invention conceme un procédé de purification
d'adénovirus recombinants à partir d'un milieu biologique caractérisé en ce qu'il
comprend une étape de purification par chromatographie d'echange d'anions fort.
Selon cette variante, le milieu biologique peut être un surnageant de cellules
5 d'~nc~r~ tion productrices dudit virus, un Iysat de cellules d'encapsi~lation
productrices dudit virus, ou une solution pl~pl,ririçe dudit virus.
Préférenti~lIement, la chromatographie est effectuée sur un support
fonctionnalisé avec une amine qu~tçrn~ire. Toujours selon un mode préféré, le support
est choisi parmi l'agarose, le dextran, I'acrylamide, la silice, le poly[styrène-
o divinylbenzène], le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, seul ou en mélange.
Un mode de réalisation particulièrement avantageux est caractérisé en ce que la
chromatographie est effectuée sur une résine Source Q, de préférence Q15.
Par ailleurs, le procédé décrit ci-dessus est avantageusement réalisé à partir
d'un surnageant de cellules productrices, et comprend une étape préalable
5 d'ultrafiltration. Cette étape est avantageusement réalisée dans les conditions définies
ci-avant, et not~mm~nt, il s'agit d'une ultrafiltration tangentielle sur membrane ayant un
seuil de coupure compris entre 300 et 500 kDa.
Selon un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, les virus sont
récoltes et purifiés par chromatographie de perméation de gel.
La perméation de gel peut être réalisée directement sur le surnageant, sur le
concentrat, ou sur le virus issu de la chromatographie d'échange d'anions. Les supports
mentionnés pour la chromatographie d'échange d'anions peuvent être utilisés danscette étape, mais sans fonctionn~ ation.
A cet égard, les supports préférés sont l'agarose (gels Sepharose), le dextran
(gels Sephadex), I'acrylamide (gels Sephacryl, gels Trisacryl), la silice (gels TSK-gel
SW), le copolymère éthylene glycol-méthacrylate (gels Toyopearl HW et TSK-gel
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PW), ou des mélanges (agarose-dextran: gel Superdex). Des supports particulierement
préférés sont:
- le Superdex 200HR (Pharmacia)
- le Sephacryl S-500HR, S-lOOOHR ou S-2000 (Pharmacia)
- le TSK G6000 PW (TosoHaas).
Un procédé préféré selon l'invention comprend donc une ultrafiltration suivie
d'une chromatographie d'échange d'anions.
Un autre procédé préféré comprend une ultrafiltration suivie d'une
chromatographie d'échange d'anions, suivie d'une chromatographie de perrnéation de
~ gel.
Une autre variante de l'invention concerne un procede de purification
d'adenovirus a partir d'un milieu biologique comprenant une premiere etape
d'ultracentrifugation, une deuxieme etape de dilution ou dialyse, et une troisieme etape
de chromatographie d'echange d'anions. Preferentiellement, selon cette variante, la
5 premiere etape est realisee par ultracentrifugation rapide sur gradient de chlorure de
cesium. Le terme rapide signifie une ultracentrifugation allant de 0,5 a 4 heures
environ. Au cours de la deuxieme etape, le virus est dilue ou dialyse contre du tampon,
pour faciliter son injection sur le gel de chromatographie, et l'elimination du milieu
d'ultracentrifugation. La troisieme etape est realisee en utilisant une chromatographie
20 d'echange d'anions telle que decrite ci-avant, de preference d'anions forts. Dans une
experience typique, a partir du virus récolté dans le surnageant (ou éventuellement
intracellulaire), une lère ultracentrifugation rapide est effectuee avec chlorure de
césium (comme dans l'exemple 3). Ensuite, après une simple dilution de l'é h~ntillon
(par exemple par 10 volumes de tampon) ou après une simple dialyse dans du tampon,
25 I'échantillon est chromatographié en échange d'ions (comme dans l'exemple 5.1.).
L'avantage de cette variante du procede de l'invention, provient du fait qu'elle met en
oeuvre 2 modes totalement différents de séparation du virus (densité et charge de
surface), pouvant amener éventuellement le virus à un niveau de qualité combinant les
performances des 2 méthodes. En outre, I'etape de chromatographie permet
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simult~nement d'eliminer le milieu utilise pour l'ultracentrifugation (chlorure de
césium par exemple, ou tout autre milieu equivalent cite plus haut).
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de iodixanol,5,5'-[(2-
hydroxy-1-3propanediyl)-bis(acetylamino)]bis~N,N '-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6-
5 triodo-],3-ben7enec~rboxamide] pour la purification d'adenovirus.
Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, differentes cellules
d'encapsidation des adénovirus peuvent etre utilisées. En particulier, les cellules
d'~n~p~id~tion peuvent être préparées à partir de différentes cellules
pharmacel~tiquement utilisables, c'est-à-dire cultivables dans des conditions
O industriellement acceptables et n'ayant pas de caractère pathogène reconnu. Il peut
s'agir de lignées cellulaires établies ou de cultures primaires et notamment de
rétinoblastes humains, de cellules de carcinome de poumon h~-m~in, ou de cellules
embryonnaires de rein. Il s'agit av~n~g~u~ement de cellules d'origine humaine,
infectables par un adénovirus. A cet égard, on peut citer les cellules KB, Hela, 293,
15 Vero, gmDBP6, HER, A549, HER, etc.
Les cellules de la lignée KB sont issues d'un carcinome épidermique humain.
Elles sont acces~ibles à l'ATCC (ref. CCL17) ainsi que les conditions permettant leur
culture. La lignée de cellules humaines llela est issue d'un carcinome de l'épithelium
h~ in Elle est ég~lem~nt accessible à l'ATCC (ref. CCL2) ainsi que les conditions
20 permettant sa culture. Les cellules de la lignée 293 sont des cellules de rein
embryonnaire humain ~Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée
contient notamm~nt, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de
l'adénovirus humain Ad5 (12 ~o). La lignée de cellules gm DBP6 (Brough et al.,
Virology 190 (1992) 624) est constituée de cellules Hela portant le gène E2
25 d'adénovirus sous le controle du LTR de MMTV.
Il peut s'agir également de cellules d'origine canine (BHK, MDCK, etc). A cet
égard, les cellules de la lignée canines MDCK sont préférées. L es conditions de culture
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des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al., Science 44 (1988)
9.
Differentes lignées de cellules d'encapsidation ont été décrites dans la litterature
et sont mentionnées dans les exemples. Il s'agit avantageusement de cellules trans-
s complémentant la fonction E1 de l'adénovirus. Encore plus préférentiçll-?m~nt, il s'agit
de cellules trans-complémentant les fonctions E1 et E4 ou E1 et E2a de l'adénovirus.
Ces cellules sont pr~ére~lliellement derivées de cellules embryonnaires hllnn~ines de
rein ou de la rétine, ou de carcinornes humains de poumon.
L'invention fournit ainsi un procédé de production d'adénovirus recombinants
o particulièrement avantageux. Ce procédé est adapté à la production de virus
recombinants défectifs pour une ou plusieurs régions, et en particulier, de virus
défectifs pour la région E1, ou pour les régions E1 et E4. Par ailleurs, il est applicable
à la production d'adénovirus de sérotypes differents, tels qu'indiqués ci-avant.
Selon un mode particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est utilisépour la production d'adénovirus recombinants dans lesquels la région E1 est inactivée
par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328,
sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et
également sur base de données (voir notamment Genebank n~ M73260). Dans un autremode de réalisation préféré, la région E1 est inactivée par délétion d'un fragment
HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. Dans un mode particulier,
le procédé permet la production de vecteurs comprenant une délétion de la totalité de
la région E4. Ceci peut etre réalisé par excision d'un fragment MaeII-MscI
correspondant aux nucléotides 35835-32720. Dans un autre mode particulier, seuleune partie fonctionnelle de E4 est délétée. Cette partie comprend au moins les phases
ORF3 et ORF6. A titre d'exemple, ces phases codantes peuvent être délétées du
génome sous forme de fragments PvuII-AluI et BglII-PvuII respectivement,
correspondant aux nucléotides 34801-34329 et 34115-33126 respectivement. Les
délétions de la région E4 du virus Ad2 dl808 ou des virus Ad5 dllO04, Ad5 dllO07,
Ad5 dllO11 ou Ad5 dllO14 peuvent également être utili~é~.~ dans le cadre de
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I'invention. A cet égard, les cellules de l'invention sont particulièrement avantageuses
~ pour la production de virus comprenant une région El inactive et une délétion dans la
région E4 du type de celle présente dans le génome de Ad5 dllO14, c'est-à-dire de
virus E4- conservant la phase de lecture ORF4.
Comme indiqué ci-avant, la délétion dans la région El couvre avantageucement
tout ou partie des régions ElA et ElB. Cette délétion doit être ~.,r~i~An~e pour rendre
le virus incapable de réplication autonome dans une cellule. La partie de la région El
délétée dans les adénovirus selon l'invention couvre avantageusement les nucléotides
454-3328 ou 382-3446.
0 Les positions données ci-dessus font référence à la séquence de l'adénovirus
Ad5 sauvage telle que publiée et accessible sur base de donnée. Bien que des
variations mineures puissent exister entre les différents sérotypes d'adénovirus, ces
positions sont génér~lçm~nt applicables à la construction d'adénovirus recombinants
selon l'invention à partir de tout sérotype, et notamment des adénovirus Ad2 et Ad7.
Par ailleurs, les adénovirus produits peuvent posséder d'autres altérations au
niveau de leur génome. En particulier, d'autres régions peuvent être délétées pour
augmenter la capacité du virus et réduire ses effets secondaires liés à l'expression de
gènes viraux. Ainsi, tout ou partie de la région E3 ou IVa2 notamment peut être
délétée. Concernant la région E3, il peut cependant être particulièrement avantageux
de conserver la partie codant pour la protéine gpl9K. Cette protéine permet en effet
d'éviter que le vecteur adénoviral fasse l'objet d'une réaction imm1lnit~ire qui (i)
limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables. Selon un
mode particulier, la région E3 est délétée et la séquence codant pour la protéine gpl9k
est réintroduite sous controle d'un promoteur hétérologue.
Comme indiqué avant, les adénovirus constituent des vecteurs de transfert de
gènes très efficaces pour des applications de thérapie génique et cellulaire. Pour cela,
une séquence d'acides nucléiques hétérologue dont le transfert et/ou l'expression dans
une cellule, un organe ou un org~nisme est recherché peut être insérée dans leur
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génome. Cette séquence peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques, telsqu'un gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible
génèrent des produits ayant un effet thérapeutique. Parmi les produits thérapeutiques,
on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les
lymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de
croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les
facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc;
les apolipoprotéines: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (W094/25073), la dystrophine ou
une minidystrophine (W093/06223), les gènes suppresseurs de tumeurs: p53, Rb,
o RaplA, DCC, k-rev, etc (W094/24297), les gènes codant pour des facteurs impliqués
dans la coagulation: Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides: thymidine kinase,
cytosine des~min~e, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou
artificielle (Fab, ScFv, etc, W094/29446), etc. Le gène thérapeutique peut également
être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de
contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles
séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN
complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon
la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le gène thérapeutique peut peut aussi
être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une
20 réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de
peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de
l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de
tumeurs (EP 259 212).
Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend
25 également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule
infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de
fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces élémentsconstitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une
région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque
30 celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir
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de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou
même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes
eucaryotes ou viraux ou de toute séquence promotrice ou dérivée, stimulant ou
réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon in-luctihle
5 ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de
la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les
promoteurs des gènes ElA, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc.
Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires
(HPRT, vimentine, o~-actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires
o (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes
thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques detissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine int~stin:~le de liaison des
acides gras, promoteur de l'actine c~ des cellules du muscle lisse, promoteurs
spécifiques pour le foie; Apo AI, Apo AII, Albumine hurn~ine etc) ou encore les
5 promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de
l'acide rétinoique, etc,). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées
par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression
tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique inséré ne
comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus
20 défectif en aval d'une telle séquence.
Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également
comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal
dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule
cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit
25 thérapeutique, mais il peut é~ m~nt s'agir de toute autre séquence signal
fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
La c~sette d'expression du gène thérapeutique peut être insérée en cliffére"~
sites du génome de l'adénovirus recombinant, selon les techniques décrites dans l'art
antérieur. Elle peut tout d'abord etre insérée au niveau de la délétion E1. Elle peut
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également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de
séquences. Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 délétée.
La présente invention concerne également les pn~pal~ions virales purifiées
obtenues selon le procédé de l'invention, ainsi que toute composition pharmaceutique
5 comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs préparés selon ceprocédé. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être forrnulées en
vue d'une ~rlmini.stration par voie topique, orale, parentérale, intranasale,
intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules
lo pharrnaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en
particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de
sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles,
isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition
selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de
15 solutés injectables. D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple un
hydrogel. Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro)
bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été décrits dans
la ~lem~nd~ W093/08845. Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à
partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux. Les doses de virus
20 utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et
notamment en fonction du mode d'~-lrnini~tration utilisé, de la pathologie concernée,
du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière
générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont forrnulés et administrés
sous forrne de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à ]o10
25 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une
solution d'adénovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire applul:,liée,
et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les
techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées
dans la littérature.
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Selon 1e gène thérapeutique, les virus ainsi produits peuvent être utilisés pourle traitement ou la pl~vel~lion de nombreuses pathologies, incluant les maladiesgénétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les m~ s neurodégénératives
(Alzheimer, Parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la
5 co~gu1~tion ou aux dyslipo~r )~inémies, les pathologies liées aux infections virales
(hépatites, SIDA, etc), etc.
La présente invention sera plus complètem~n1 décrite à l'aide des exemples qui
suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
L~pende des fpures
Figure 1: Etude de la stabilite de l'adenovirus purifie selon l'exemple 4.
Fi ure 2: Analyse en HPLC (phase inverse) de l'adenovirus purifie selon
l'exemple 4. Comparaison avec l'adenovirus de l'exemple 3.
Figure 3: Cinetique de liberation de l'adenovirus Ad-~3Gal dans le surnageant
de cellules 293, mesuree par PCR semi-quantitative et Plaque Assay.
Figure 4: Profil d'elution sur Source Q15 d'un surnageant d'adenovirus
ultrafiltre (exemple 5.1).
Figure 5: Analyse en CLHP Ressource Q du pic de virus recolte par
chromatographie sur résine Source Q15 d'un surnageant d'adenovirus ultrafiltre
(exemple 5.1).
Figure 6: (A) Profil d'elution sur résine Source Q15 d'un surnageant
d'adenovirus Ad-APOAl ultrafiltre (exemple 5.3); et (B) Analyse en CLHP
(Resource Q~ du pic de virus recolte.
Fi~ure 7: (A) Profil d'elution sur Source Q15 d'un surn~ge~nt d'adenovirus
Ad-TK ultrafiltre (exemple 5.3). Analyse en CLHP (Resource Q) des differentes
2~ fractions (debut et fin de pic) de virus recoltees: (B) Fraction F2, rnilieu du pic; (C)
Fraction F3, borne du pic; (D) Fraction F4, fin du pic.
Figure 8: Profil d'elution sur résine Mono Q d'un surnageant concentre de
culture de cellules productrices d'adenovirus (exemple 5.4). BG25F1: Virus
surnageant concentre et purifie sur cesium. BG25C: Surnageant infecte, concentre.
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24
Fi~ure 9: Profil d'elution sur gel POROS HQ d'un surnageant concentre de
culture de cellules productrices d'adenovirus (exemple 5.4). BG25F~: Virus
surnageant concentre et purifie sur cesium. BG25C: Surnageant infecte, concentre.
Fi~ure 10 A et B: Profil de purification par permeation de gel sur Sephacryl
S1000HRlSuperdex 200H:R d un surnageant d'adenovirus ultrafiltre (exemple 6).
Fi~ure 11: Analyse en microscopie électronique d'un stock d'adénovirus purifié
selon l'invention.
Fi~ure 12: Ana}yse en microscopie électronique de la bande de virus de densité
I .27.
Techniques ~énerales de biolo~ie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les
extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en
gradient de chlorure de césium, I'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la
purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au
phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de
l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien
connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature
[Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual'l, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current
20 Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série ~I13 sont
d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les
fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels
d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme,
2~ précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs)
selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5'
proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I
d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des
~xllén~ilés 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage
~UILLE DE REMPl-9CEMENT (REGLE 26)
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T4 (Biolabs) utilisée selon les rec~ mm~n~ ions du fabricant. La destruction dese~ es 5' proémin~ntes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mllt~Een~se dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut
être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13
(1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'ampLtfication
enzymatique de fr~gment.~ d'ADN par la technique dite de PCR [~olymérase-catalyzed
Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et
Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en t~tili~nt un
"DNA therrnal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La
vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode
développée par Sanger et al. ~Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en
utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple l ~ nees cellulaires d'encapsidation
Les cellules d'encapsidation utilisées dans le cadre de l'invention peuvent
provenir de toute lignée cellulaire infectable par un adénovirus, compatible avec une
utilisation à des fins therapeutiques. Il s'agit plus préférentiellement d'une cellule
choisie parmi les lignées suivantes:
- Les cellules de la lignée 293:
La lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires de rein humaines
contenant l'extrémité gauche (environ 11-125~o) du génome de l'adénovirus sérotype 5
(Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région E1, incluant Ela,
Elb, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la
protéine pIVa2 (Graharn et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée est capable
2s de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région E1, c'est-
à-dire dépourvus de tout ou partie de la région E1, et de produire des stocks viraux
ayant des titres élevés
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26
- Les cellules de la lignee A549
Des cellules complémentant la région E1 de l'adénovirus ont été construites à
partir des cellules A549 (Imler et al., Gene Ther. (1996) 75). Ces cellules contiennent
un fragment restreint de la région E1, dépourvue de l'ITR gauche, placée sous lecontrole d'un promoteur inductible.
- Les cellules de la lignée I~ER
Le cellules embryonnaires de la rétine hllm~ine (HER) peuvent etre infectées
par un adénovirus (Byrd et al., Oncogene 2 (1988) 477). Des cellules d'encapsidation
d'adénovirus preparées à partir de ces cellules ont été décrites par exemple dans la
demande WO94/28152 ou dans l'article de Fallaux et al. (Hum.Gene Ther. (1996)
215). On peut citer plus particulierement la lignée 911 comprenant la région E1 du
génome de l'adénovirus Ad5, du nucléotide 79 au nucléotide 5789 intégrée dans legénome de cellules HER. Cette lignée de cellules permet la production de virus
défectifs pour la région E1.
- Les cellules IGRP2
Les cellules IGRP2 sont des cellules obtenues a partir de cellules 293, par
intégration d'une unité fonctionnelle de la région E4 sous contrôle d'un promoteur
inductible. Ces cellules permettent la production de virus défectifs pour les régions E1
et E4 (Yeh et al., J. Virol (1996) 70).
- Les cellules VK
Les cellules VK (VK2-20 et VK10-9) sont des cellules obtenues a partir de
cellules 293, par intégration de l'intégralite de la région E4 sous contrôle d'un
promoteur inductible, et de la région codant pour la protéine pIX. Ces cellules
permettent la production de virus défectifs pour les régions E1 et E4 (Krougliak et al.,
Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1575).
- Les cellules 293E4
Les cellules 293E4 sont des cellules obtenues a partir de cellules 293, par
intégration de l'intégralité de la région E4. Ces cellules permettent la production de
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virus défectifs pour les régions E1 et E4 (W095/02~97; Cancer Gene Ther. (1995)
~ 322).
Exemple 2: Virus utilises
Les virus produits dans le cadre des exemples qui suivent sont un adenovirus
contenant le gene marqueur LacZ de E.coli (Ad-~Gal), un adenovirus contenant le
gene codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpes type I (Ad-TK), un
adenovirus contenant le gene codant pour la protéine suppresseur de tumeur p53
humaine et un virus codant pour l'apolipoproteine A1 (Ad-apoAI). Ces virus sont
0 dérivés du serotype Ad5 et possedent la structure suivante:
- Une deletion dans la region E1 recouvrant par exemple les nucleotides 382
(site HinfI) à 3446 (site Sau3a).
- Une cassette d'expression du gene, sous controle du promoteur RSV ou
CMV, inserée au niveau de ladite deletion.
- Une deletion de la region E3.
La construction de ces virus a ete decrite dans la litterature (W094/25073,
WO95/14102, FR 95.01632, Stratford-Perricaudet et al. J. Clin. Invest (1992) p626).
Il est entendu que toute autre construction peut etre produite selon le procede de
l'invention, et notamment des virus portant d'autres genes heterologues et/ou d'autres
20 deletions (E1/E4 ou E1/E2 par exemple).
Exemple 3: Production de virus par Iyse des cellules
Cet exemple reproduit la technique anterieure de production de virus,
cnn.~i~t~nt a Iyser les cellules d'encapsidation pour recuperer les virus produits.
Les cellules 293 sont infectées à 80-90Yo de confluence en boite de culture
2s avec un préstock de virus Ad-13Gal ou Ad-TK (exemple 2) à raison de 3 à 5 virus par
cellule (Multiplicity of Infection MOI = 3 à 5). L'incubation dure de 40 à 72 heures, le
timing de récolte etant jugé par l'observation au microscope des cellules qui
.
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WO 98/00524 PCT/FRs7/0l107
s'arrondissent, deviennent plus réfringentes et adherent de plus en plus faiblement au
support de culture. Dans la litterature la cinetique du cycle viral dure de 24 à 36
heures.
Au niveau d'une production de labo il est important de récolter les cellules
avant qu'elles ne se détachent afin d'eliminer le milieu d'infection au moment de la
récolte sans perdre de cellules puis de les reprendre dans un volume rninimllm (le
facteur de concentration est selon la taille de la culture de l'ordre de 10 à 100 fois).
Le virus est alors libéré du noyau par 3 à 6 cycles de décongélation s~lcce-s.cif.s
(ethanol carboglace à -70~C, bain-marie à 37~C)
0 Le Iysat cellulaire obtenu est ensuite centrifugé a basse vitesse (2000 à 4000
rpm) et le surnageant (Iysat cellulaire clarifié) est ensuite purifié par ultracentrifugation
en gradient de chlorure de cesium en deux étapes:
- Une premiére ultracentrifugation (step) rapide de 1,5 heure 35000 rpm rotor
sw 41, sur deux couches de césium 1.25 et 1.40 encadrant la densité du virus (1.34) de
facon a separer le virus des proteines du milieu; les rotors peuvent etre des rotors
'swinging'(Sw28,Sw41Beckman ) ou angle fixe (Ti 45, Ti 70,Ti 70.1 Beckman) selonles volumes à traiter;
- Une deuxiéme ultracentrifugation en gradient plus longue (de 10 à 40 heures
selon le rotor utilisé), par exemple 18 heures à 35000 rpm en rotor sw 41 qui constitue
la veritable et unique purification du virus. Le virus se retrouve dans un gradient
linéaire a l'equilibre à une densité de 1.34.
Generalement, a cette etape, la bande du virus est majoritaire. On observe
néanmoins parfois deux bandes moins denses, fines dont l'observation en microscopie
electronique a montré qu'il s'agissait de virus vides ou cassés et pour la bande la moins
dense de sous unités virales (pentons, hexons). Aprés cette etapes le virus est récolté
dans le tube par ponction a l'aiguille et le cesium est éliminé par dialyse ou ~e~ ge
sur G25.
Exemple 4: Production de virus dans le surn~eant
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Cet exemple decrit une experience de production de virus par recuperation
apres liberation sponlalmee. Le virus est ensuite recolte par ulkafiltration~ puis purifie
par chlorure de cesium.
4.1. Protocole
Dans cette méthode, co~ ent a l'exemple 3, les cellules ne sont pas
récoltées 40 à 72 heures post-infection, mais l'in~ h~tion est prolongee entre 8 à 12
jours de façon à obtenir une Iyse totale des cellules sans avoir besoin de proceder aux
cycles de congélations décongélations. L,e virus se retrouve dans le surnageant.Le surnageant est alors clarifié par filtration sur des filtres profondeur de
0 porosité décroissante(10 ~un/1.0 ~un/0.8-0.2 ~lm).
Le virus a une taille de 0.1 !lm et à cette étape nous n'avons observé aucune
perte de virus par rétention sur le filtre a la plus faible porosité( 0.22 ~m)
Le surnageant une fois clarifié est ensuite concentré par ultrafiltration
tangentielle sur membrane spirale Millipore ayant un seuil de coupure de 300 kDa.
Dans les experiences rapportees dans la presente invention, le facteur de
concentration est dicté par le volume mort du systeme qui est de 100 ml. Des volumes
de surnageant de 4 à 20 litres ont ete concentrés avec ce systeme, permettant d'obtenir
des volumes de concentrat de 100 ml à 200 ml sans difficultes, ce qui correspond a un
facteur de concentration de 20 à 100 fois.
Le concentrat est ensuite filtré sur 0.22 ,um puis purifié par centrifugation sur
chlorure de cesium comme decrit dans l'exemple 3, suivi d'une étape de dialyse.
4.2. Resultats
Pureté
Alors que le tube de virus intracellulaire (exemple 3) presente un aspect trouble
avec un coagulum (lipides, proteines) venant parfois toucher la bande de virus, la
preparation virale obtenue apres la p e~Iliere etape de centrifugation sur chlorure de
cesium par le procede de l'invention presente une bande de virus déjà bien isolée des
co~ ;n~nt.~ du milieu qui persistent dans la phase supérieure. L'analyse en
. ~......... . .. .
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chromatographie liquide haute performance sur colonne Resource Q (cf exemple 5)
montre aussi ce gain en pureté du materiel de départ obtenu par ultrafiltration de
surn~ge~nt infecté avec une liimim1tion des contaminants acides nucleiques (ratio DO
260/280 superieur ou egal à 1,8) et proteiques (ratio DO 260/280 inférieur à 1).
Stabilité du virus dans un surna~eant à 37~C :
La stabilite du virus a ete determinée par titration par la methode de
plaque assay d'un surnageant de culture infectieux dont des aliquots ont été prelevées
à differents temps d'incubation à 37~C post -infection. Les resultats sont présentés ci-
dessous:
o Virus Ad-TK:
. titre 10 jours post-infection= 3.5 x 108 pfu/ml
. titre 20 jours post-infection= 3.3 x 108 pfu/ml
Virus Ad-~3Gal
. titre 8 jours post-infection= 5.8 x 108 pfu/ml
. titre 9 jours post-infection= 3.6 x lo8 pfu/ml
. titrelO jours post-infection= 3.5 x lO8 pfu/ml
. titre 13 jours post-infection= 4.1 x 108 pfu/ml
. titre 16 jours post-infection= 5.5 x lo8 pfu/ml
Les resultats obtenus montrent que, jusqu'a au moins 20 jours post-infection, le20 titre du surnageant est stable dans la 1imite de précision du dosage. Par ailleurs, la
Figure 1 montre que, dans le tampon d'elution, le virus est stable au moins 8 mois, a -
80 C comme a -20 C.
Infectivité specifique des préparations
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Ce parametre, correspondant au ratio du nombre de particules virales mesuré
par HPLC sur le nombre de pfu, rend compte du pouvoir infectieux des pl~pal~lions
virales. Selon les recomm~n~ations de la FDA, il doit etre inferieur à 100. Ce
parametre a ete mesure comme suit: Deux series de flacons de culture cr~ ena.,~ des
5 cellules 293 ont été infectées en parallele au même moment avec le même prestock
viral dans les mêmes conditions. Cette experience à été realisée pour un adenovirus
recombinant Ad-bgal, puis repetée pour un adenovirus Ad-TK. Pour chaque
adenovirus, une serie de flacons est récoltée 48 heures post-infection et est considérée
comme une production de virus intracellulaire purifié sur gradient de cesium aprés
lO congélation décongélation. L'autre serie est incubée 10 jours post-infection et le virus
est récolté dans le surnageant. Les preparations purifiées obtenues sont titrées par
plaque assay et la quantification du nombre de particules virales totales est determinée
par la mesure de la concentration en proteine PVII par CLHP de phase inverse sur une
colonne C4 Vydac 4.6xS0 mm aprés denaturation des échantillons en guanidine 6.4M.
15 La quantité de protéines PVII est correlée au nombre de particules virales considerant
720 copies de PVII par virus (Hor vitz,Virology,second edition (1990)). Cette
methode est correlée avec les mesures de particules virales sur preparations purifiées
par la methode densitometrique à 260 nm prenant pour coefficient d'extinction
spécifique 1.0 unité d'absorbance = 1.1 10l2 particules par ml
Les resultats obtenus montrent que, pour le virus Ad-~3Gal, ce ratio est de 16
pour le virus surnageant et de 45 pour le virus intracellulaire. Pour le virus Ad-TK, le
ratio est de 78 dans le cas de la recolte de virus dans la méthode surnageant et de 80
pour le virus récolté par la méthode intracellulaire.
Analyse en microscopie electronique:
CeKe methode permet de déceler la presence de particules vides ou sous unités
virales libres copurifiées, ainsi que d'apprécier une co--~a.--in~tion protéique des
préparations virales purifiées ou la présence d'aggregats non dissociables de particules
vlrales.
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Protocole: 20 !ll d'echantillon sont déposés sur une grille carbonée puis traités
pour l'observation en coloration negative par l'acetate d'uranyl à 1,5%. Pour
l'observation, on utilise un microscope électronique Jeol 1010 de 50kV à 100 kV.
Resultat: L'analyse effectuée sur un virus récolté dans le surnageane montre
5 une péparation propre, sans cont~min~nt~, sans aggrégats et sans particules virales
vides. Il est de plus possible de distinguer les fibres du virus ainsi que sa structure
géométrique réguliére. Ces resultats confirment la grande qualite des particules virales
obtenues selon l'invention.
Analyse du profil proteique en HPLC et SDS PAGE:
o Analyse en SDS PAGE:
20!11 d'échantillon est dilué dans le tampon de Laemmli ~Nature 227 (1970)
680-685), reduit 5 min à 95~c, puis chargé sur des gels Novex 1 mm x 10 puits
gradient 4-20~o. Aprés migration, les gels sont colorés au bleu de coomassie et
analysés sur sur Image Master VDS Pharmacia. L'analyse révéle un profil
15 electrophorétique pour le virus récolté dans le surnageant en accord avec les données
de la litterature (Lennart Philipson, 1984 H.S Ginsberg editors, Plenum press, 310-
338).
Analyse en HPLC reverse phase:
La figure 2 montre la superposition de 3 chromatogrammes obtenus à partir de
20 deux éçh~ntillons de virus récoltés en intracellulaire et un échantillon de virus purifié
par la méthode surnageant. Les conditions experimentales sont les suivantes: colonne
Vydac ref 254 Tp 5405, RPC4 4.6x50 mm, Solvant\A: H20 +TFAO.07~o; Solvant B:
CH3CN+TFA 0.07%, gradient lineaire: T=Omin YoB=25; T=50min ~oB=50%; Débit
=lml/min, detecteur =215 nm. Les chromatogrammes montrent une parfaite identité
25 entre les échantillons, sans différence dans les intPn~ite~ relative de chaque pic. La
nature de chaque pic a été déterminée par séquencage et met en evidence que les
proteines presentes sont toutes d'origine virale (Voir Tableau ci-dessous).
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PIC (Min) IDENTIFICATION
19-20 Precurseur PVII
21-22 Precurseur PVII; Precurseur PX 1 a 12
27-28 Precurseur PVI; Precurseur PX
32-33 Precurseur PX
34
35-36 PVII mature
37 PVII mature; PVIII precurseur
39-41 PVI mature
pX
46 pIX
Analyse in vitro de l'efficacité de transduction et de la cytotoxicité
L'analyse de la cytotoxicité est effectuée en infectant des cellules HCT116 en
plaques 24 puits pour des MOI croissantes et en determinant le pourcentage de
cellules vivantes par rapport à un temoin non infecté, 2 et 5 jours post-infection, à
5 l'aide de la technique de coloration au cristal violet.
Les resultats sont presentes dans le tableau ci-dessous:
Adenovirus MOI=3.0 MOI=10.0 MOI=30.0 MOI=100.0
Surnageant~J2 91~o 96~o 87~o 89~o
Surnageant,J5 97~o 90% 10~o <5~o
Analyse de l'efficacité de transduction
Pour un adenovirus AD-13Gal, l'éfficacité de transduction d'une préparation est
déterminée en infectant des cellules W162, non pelmissives à la réplication, cultivées
10 en plaques 24 puits, avec des concentrations croi~sAnt.?~ de particules virales. Pour une
même quantité de particules virales déposées, on dénombre, 48 heures post-infection,
les cellules ~ ant I activité bet~g~lActos~ ce aprés incuhation avec l'X-gal comme
substrat. Chaque cellule bleue est denombrée comme une unité de trAn~luction
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(TDU), le résultat est multiplié par la dilution de l'échantillon afin d'obtenir la
concentration en unité de transductions de l'é~h~ntillon. L efficacité de tr~n~ ction
est ensuite exprimée en faisant le rapport de la concentration en particules virales sur
la concentration en TDU. Les resultats obtenus montrent que les virus purifies
s presentent une bonne efficacite de tr~n~iuction in vitro.
Analyse de l'expression intracerebrale In vivo
Dans le but d'evaluer l'efficacite des adenovirus selon l'invention pour le
transfert et l'expression de genes in vivo, les adénovirus ont été injectés par voie
stéréotaxique dans le striatum de souris immunocompétentes OF1. Pour cela, des
0 volumes de 1,ul à 107 pfu de virus ont été injectés aux repères stéréotaxiques suivants
(pour la barre d'incisives à Omm): Antéro-postérieur: +0.5; Médio-latéral :2;
Profondeur: -3.5.
Les cerveaux ont été analysés 7 jours après l'injection. Les resultats obtenus
montrent que l'efficacité de transduction est grande: milliers de cellules transduites,
15 expression très intense dans le noyau et diffusion fréquente et intense dans le
cytoplasme.
4.3. Cinetique de liberation du virus
Cet exemple decrit une etude de la cinetique de liberation des adenovirus dans
le surnageant de culture des cellules d'encapsidation.
Cette etude a ete realisee par PCR semi-quantitative au moyen
d'oligonucleotides complementaires de regions du genome de l'adenovirus. A cet
effet, l'ADN viral linearise (1-10 ng) a ete incube en presence de dXTP (2 ~l, 10mM),
d'un couple d'oligonucleotides specifiques et de Taq Polymerase (Cetus) dans un
tampon 10XPCR, et soumis a 30 cycles d'amplification sans les conditions suivantes:
2 min a 91C, 30 cycles (1 min 91C, 2 min a temperature d'~nn~ling, 3 min a 72C), 5
min 72C, puis 4C. Des experiences de PCR ont ete realisees avec les couples
d'oligonucleotides de sequence:
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- Couple 1:
TAATTACCTGGGCGGCGAGCACGAT (6368) - SEQ ID n~ 1
ACCTTGGATGGGACCGCTGGGAACA (6369) - SEQ ID n~ 2
-Couple 2:
TlTlTGATGCGl~CTTACC'I'CTGG (6362) - SEQ ID n~ 3
CAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGA (6363) - SEQ ID n~ 4
- Couple 3:
TGTTCCCAGCGGTCCCATCCAAGGT (6364) - SEQ ID n~ 5
AAGGACAAGCAGCCGAAGTAGAAGA (6365) - SEQ ID n~ 6
0 - Couple 4:
GGATGATATGGTTGGACGCTGGAAG (6366) - SEQ ID n~ 7
AGGGCGGATGCGACGACACTGACTT (6367) - SEQ ID n~ 8
La quantite d'adenovirus libere dans le surnageant a ete determinée sur un
surnageant de cellules 293 infectées par l'Ad-~Gal, a dir~ererl~ temps post-infection.
5 Les resultats obtenus sont presentes dans la figure 3. Ils montrent que la liberation
cellulaire debute à partir du 5 ou 6eme jour post infection.
Il est entendu que toute autre technique de determination de virus peut etre
utilisee dans le meme but, sur toute autre lignee d'encapsidation, et pour tout type
d' adenovirus.
Exemple 5: Purification du virus par ultrafiltration et échanpe
d'ions
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36
Cet exemple illustre comment l'adénovirus contenu dans le concentrat peut
être purifié directement et en une seule étape chromatographique d'échange d'ions,
avec des rendements très élevés.
5. 1. Protocole
Dans cette expérience, le matériel de départ est donc constitué du concentrat
(ou rétentat d'ultrafiltration) décrit dans l'exemple 4. Ce rétentat a une teneur en
protéines totales comprise entre 5 et 50 mg/ml, et plus préférentiellement entre 10 et
30 mg/ml, dans du tampon PBS (10 mM phosphate, pH 7,2 contenant 150 mM
NaCl).
o Le surnageant d'ultrafiltration obtenu à partir d'une préparation de virus est
injecté sur une colonne contenant du Source Q 15 (Pharmacia) équilibrée dans du
tampon Tris/HCl 50 mM pH 8,0 contenant 250 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, et 10 ~o
glycérol (tampon A). Après rinçage avec 10 volumes de colonne de tampon A, les
espèces adsorbées sont éluées avec un gradient linéaire de NaCl (250 mM à 1 M) sur
25 volumes de colonne à un débit linéaire de 60 à 300 cm/h, plus préférentiellement
12 cm/h. Le profil d'élution typique obtenu à 260 nm est présenté sur la figure 4. La
fraction contenant les particules virales est collectée. Elle correspond à un pic fin,
symétrique, dont le temps de rétention coincide avec le temps de rétention obtenu
avec une préparation de particules virales purifiées par ultracentrifugation. Il est
possible d'injecter dans les conditions décrites çi-dessus, au minimum 30 mg de
protéines totales par ml de résine Source Q 15 tout en conservant une résolutionexcellente du pic de particules virales.
Dans une expérience représentative effectuée à partir d'une prépalalion d'un
adénovirus ~-gal (Exemple 2), 12,6 mg de protéines totales ont été injectées sur une
colonne Resource Q (1 ml), soit 5 x 10'~ PFU et 1,6 x 10l~ TDU. Le pic de particules
virales collecté après chromatographie (3,2 ml; Fig. 5) contenait 173 ~g de protéines
et 3,2 x 10l~ PFU et 2,3 x 10'~ TDU. Les particules virales ont donc été purifiées 70
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fois (en terme de quantité de protéines) et le rendement de la purification est de 64%
en PFU et de 142 % en TDU (Voir Tableau ci-dessous).
EtapesConcentration Volumes Volumes RendementsFacteur de
e/~h~ntillon deposes recuperes Purification
SURNAGEANT 5000 ml 5000 ml 100 ~o
ULTRA-Proteines:6.3 mg/ml 5000 ml 200 ml 100 % 5
FILTRATIONPFU:2.5xlO'~'/ml
300 kdTDU:8.1x 109/ml
Particle 3.8 xlOl'/ml
Part/pfu ratio:16.0
Part/tdu ratio:47.0
PFU:l.Ox 10'~/ml Proteines=85%
PURIFICATION TDU:7.2xlO9/ml 2.0 ml de 3.0 ml PFU=64% 70
ECHANGE Palticle:2.0xlO"/ml concentrat elution TDU=140~o
IONS Particles=84~o
(une etape) Part/pfu Mtio=20
Part/tdu ratio=27 HPLC
Purete=98.4%
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PFU:l.OxlO~l/ml) 28.3 ml de QSP 4.1 PFU=66%
GRADIENT TDU:7.5x 10'~/ml concentrat rnl TDU=130% 70
CsCI Particle:2.2xlOI2/ml Particles=84~o
Part/pfu ratio=22 HPLC
par/~du ratio=29 purete=98.4 37O
5,2. Pureté
Après cette étape de purification, la fraction collectée présente une pureté 2
98% en particules virales (détection UV à 260 nm), lorsqu'elle est analysée par
chromatographie liquide haute performance (CLHP~ sur une colonne de Resouce Q
(1 ml) dans un système chromatographique suivant: 10 !ll de la fraction purifiée par
chromatographie comme décrit à l'exemple 5.1 sont injectés sur une colonne
Resource Q15 (lml de gel; Pharmacia) équilibrée dans du tampon Tris/HCl 50 mM
pH 8,0 (tampon B). Après rinçage avec 5 ml de tampon B, les espèces adsorbées sont
éluées avec un gradient linéaire de 30 ml de NaCI (0 à 1 M) dans le tampon B à un
débit de 1 ml/min. Les espèces éluées sont détectées à 260 nm. Cette analyse parCLHP (Figure 5) montre de plus que l'albumine sérique bovine résiduelle présentedans le rétentat d'ultrafiltration est totalement éliminée au cours de la
chromatographie préparative. Sa teneur dans la fraction purifiée est estimée être < 0,1
15 ~o. L'analyse en Western blot avec un anticorps polyclonal anti-BSA (avec révélation
LCL; Amersham) indique que la teneur en BSA dans la préparation
chromatographique est inférieure à 100 ng par mg de virus.
L'analyse en électrophorèse de la fraction adénovirale purifiée par
chromatographie est effectuée en gel de polyacrylamide (4-20 ~o) en conditions
20 dénaturantes (SDS). Les bandes de protéines sont ensuite révélées au nitrate d'argent.
Cette analyse montre que la préparation adénovirale obtenue par chromatographie a
un niveau de pureté au moins égal à celui de la préparation ontenue classiquement par
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ultracentrifugation puiqu'elle ne présente pas de bande de protéines supplémentaire
qui indiquerait une cont~min~tion de la prepa~dlion par des protéines non
adénovirales.
La prepa,dlion adénovirale obtenue par chromatographie présente un ratio
d'absorbance A 260 nm / A 280 ",~, égal à 1,30 + O.OS. Cette valeur, qui est identique à
celle obtenue pour les meilleures plé~al a~ion obtenues par ultracentrifugation,indique que la plepa.~lion est dépoulvue de protéines cont~min~ntes ou d'acides
nucléiques cont~min~nt~
L'analyse en microscopie électronique effectuée dans les conditions décrites
dans l'exemple 4.2 sur un virus Ad-~gal purifié par chromatographie montre une
préparation propre, sans cont~min~nt~, sans aggrégats et sans particules virales vides
(figure 11). De plus, l'ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium de cette
préparation révèle une seule bande de densité 1.30, ce qui confirme l'absence decont~min~tion des préparations chromatographiques par d'éventuelles particules
vides ou des fragments de capsides. Lors de la purification, le pic chromatographique
du virus est suivi d'un épaulement (ou pic secondaire) dans sa partie arrière, qui n'est
pas collecté avec le pic principal. L'ultracentrifugation en gradient de chlorure de
césium de cette fraction révèle une bande de densité 1.27, et l'analyse de la
composition de cette fraction montre qu'elle ne contient pas d'acides nucléiques.
L'analyse en microscopie électronique montre que cette fraction contient des
particules de forme irrégulière, présentant des perforations à la surface (figure 12). Il
s'agit donc de particules vides (dépowues d'ADN) et incomplètes. Ceci démontre
donc que la purification de l'adénovirus par chromatographie élimine les particules
vides présentes en faible quantité dans les préparations avant purification.
5.3. Purification d'adénovirus comportant un ~ène thérapeutique tel que les
~ènes codant pour les protéines ApoA1 ou thimidine kinase.
Cet exemple illustre comment des adénovirus comportant dans leurs génomes
des séquences d'acides nucléiques hétérologues codant pour des protéines
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thérapeutiques peuvent être purifiés directement et en une seule étape
chromatographqiue d'échange d'ions. Il montre aussi que le comportement
chromatographique de l'adénovirus est indépendant des séquences d'acides nucléiques
hétérologues qu'il porte, ce qui permet de mettre en oeuvre le meme procédé de
5 purification pour différents adénovirus porteurs de séquences d'acides nucléiques
hétérologues diverses.
Dans une expérience typique de purification, un adénovirus comportant dans
son génome une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour la protéine
ApoA~ (Exemple 2, W094/25073) est purifié en chromatographiant, dans le système
lo décrit à l'exemple 5.1, 18 ml (72 mg de protéines; 1,08 x 10'3 particules) de
surnageant concentré d'une culture cellulaire récoltée 10 jours post-infection (Figure
6A). Le pic de particules virales collecté après chromatographie (14 ml; 1,4 mg de
protéines) contenait 9,98 x 1012 particules, ce qui indique un rendement en particules
de 92% et un facteur de purification de 51. Après cette étape de purification, la
fraction collecté présentait (Figure 6B) une pureté supérieure à 98% en particules
virales lors de l'analyse chromatographique dans les conditions décrites en 5.2.L'analyse par électrophorèse de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie
effectuée dans les conditions décrites à l'exemple 5.2. a montré que cette préparation
avait un niveau de pureté au moins égal à celui de la préparation obtenue
classiquement par ultracentrifugation, et qu'elle est dépourvue de protéines
cont~min~ntes ou d'acides nucléiques contaminants.
Dans une autre expérience typique de purification, un adénovirus comportant
dans son génome une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour la
protéine thimidine kinase de herpès simplex de type 1 (Exemple 2, W095/14102) est
purifié en chromatographiant dans le système décrit à l'exemple 5.1. 36 ml (180 mg
de protéines; 4,69 x 10'3 particules) de surnageant concentré d'une culture cellulaire
(Figure 7A). Le pic de particules virales collecté après chromatographie (20 ml; 5,6
mg de protéines) contenait 4,28 x 10" particules, ce qui indique un rendement enparticules de 91~o et un facteur de purification de 32. Après cette étape de
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purification, la fraction collectée présentait (Figures 7B-D) une pureté supérieure à
99% en particules virales lors de l'analyse chromatographique dans les conditions
décrites à l'exemple 5.2. et un ratio d'absorbance de 1,29. L'analyse en électrophorèse
- de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie effectuée dans les conditions
décrites à l'exemple 5.2. a montré que cette préparation avait un niveau de pureté au
moins égal à celui de la l,le,)~dlion obtenue classiquement par ultracentrifugation, et
qu'elle est dépourvue de protéines cont~min~ntes Ou d'acides nucléiques
cont~minant~
5.4. Purification d'adénovirus intracellulaire par échan~e d'anion fort.
0 Cet exemple illustre comment un adénovirus comportant dans son génome
une séquence d'acide nucléique hétérologue peut être purifié directement en une
seule étape chromatographique d'échange d'ions a partir d'un Iysat de cellules
d'encapsidation productrices dudit virus.
Dans une expérience typique de purification, un adénovirus comportant dans
son génome une séquence d'acide nucléiques hétérologue codant pour la protéine ~-
gal est purifié en chromatographiant dans le système décrit à l'exemple 5.1 (colonne
FineLine Pilot 35, Pharmacia, 100 ml de résine Source 15Q), 450 ml (soit 2.5 x 1014
particules) de Iysat concentré d'une culture cellulaire récoltée 3 jours post-infection
par lyse chimique (l a~o Tween-20) . Le pic de particules virales collecté après20 chromatographie (1l0 ml) contenait 2.15 x 1014 particules, ce qui indique un
rendement en particules de 86%. Après cette étape de purification, la fraction
collectée présentait une pureté supérieure à 98~o en particules virales lors de l'analyse
chromatographique dans les conditions décrites en 5.2. L'analyse par électrophorèse
de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie effectuée dans les conditions
25 décrites à l'exemple 5.2 a montré que cette préparation avait un niveau de pureté au
moins égal a celui d'une prepa-~ion obtenue classiquement par ultracentrifugation, et
qu'elle est dépourvue de protéines contamin~ntes ou d'acides nucléiques
cont~min~nt~.
. _
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5.5. Purificaton du virus par ultrafiltration et chromatog.ra~hie d'échan~e
d'ions sur différentes colonnes.
Cet exemple illustre comment l'adénovirus contenu dans le concentrat peut
être purifié directement et en une seule étape chromatographique d'échange d'ions en
utilisant un gel différent du support Source 15 Q, tout en fonctionnant sur le même
principe de séparation, l'échange d'anions par interaction avec les groupements
aminés quaternaires de la matrice.
Dans une expérience typique de purification de l'adénovirus, différents
adénovirus recombinants (codant pour la ~3Gal, l'apolipoprotéine AI et la TK) ont été
o purifiés par chromatographie sur une colonne de gel Source Q30 en suivant le
protocole décrit à l'exemple 5.1. Les résultats obtenus montrent que le gel Source
Q30 perrnet d'obtenir des préparation virales d'une pureté de l'ordre de 85~o, avec un
rendement compris entre 70 et 100 ~o. En outre, les résultats obtenus montrent que
Q30 possède, pour la purification d'adénovirus, une efficacité (exprimée par le
nombre de plateux théoriques) de 1000 et une (quantité maximum de virus qui peutêtre chromatographiée sans que les pics ne s'altèrent) de 0,5 à 1 x 1012 pv par ml. Ces
résultats montrent que le gel Source Q30 peut donc convenir à la purification
d'adénovirus recombinants, même si ses propriétés demeurent inférieures à celles du
Source Q15 (pureté de l'ordre de 99~o, efficacité de l'ordre de 8000 et capacité de
20 l'ordre de 2,5 à 5 1012 pv par ml).
Dans une autre expérience typique de purification de l'adénovirus, un
adénovirus ~-Gal est purifié par chromatographie sur une colonne de MonoQ HR 5/5en suivant le protocole décrit à l'exemple 5.1. L'image chromatographique
correspondant au rétentat d'ultrafiltration et à la pl~pal~lion virale purifiée ainsi
25 obtenue est illustrée sur la Figure 8.
Dans une autre expérience typique de purification de l'adénovirus, un
adénovirus ~-Gal est purifié par chromatographie sur une colonne Poros HQtM en
suivant le protocole décrit à l'exemple 5.1. L'image chromatographique correspondant
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au rétentat d'ultrafiltration et à la prépa~alion virale purifiée ainsi obtenue est illustrée
sur la Figure 9.
Exemple 6: Purification du virus par ultrafiltration et permeation de ~el
Cet exemple illustre comment l'adénovirus contenu dans le concentrat
(rétentat d'ultrafi1tration) peut être purifié directemPnt par chromatographie de
perméation de gel, avec des rendements très élevés.
6.1. Protocole
200 ~11 du rétentat d'ultrafiltration obtenu dans l'exemple 4 (soit 1,3 mg de
protéines) sont injectés sur une colonne HR 10/30 (Pharmacia) remplie de Sephacryl
0 S-lOOOSF (Pharmacia) équilibrée par exemple dans du tampon PBS, pH 7,2
contenant 150 mM NaCI (tampon C). Les espèces sont fractionnées et éluées avec le
tampon C à un débit de 0,5 ml/min et détectées en sortie de la colonne en UV à 260
nm. Alternativement, on peut utiliser dans les même conditions de mise en oeuvre,
une colonne remplie de Sephacryl S-200(), qui permet une résolution meilleure que la
colonne Sephacryl S-lOOOHR pour des particules de 100 nm à 1000 nm.
La résolution des deux systèmes chromatographiques de perméation de gel
décrit çi-dessus peut être avantageusement améliorée en chromatographiant le
surnageant d'ultrafiltration (200 ,ul) sur un système de 2 colonnes HR 10/30
(Pharmacia) couplées en série (colonne de Sephacryl S-lOOOHR ou S-2000 suivie
d'une colonne de Superdex 200 HR) équilibrées dans le tampon C. Les espèces sontéluées avec le tampon C à un débit de 0,5 ml/min et détectées en UV à 260 nm. Dans
ce système, le pic de particules virales est très nettement mieux séparé des espèces de
plus faible poids moléculaire que dans le système comportant une colonne Sephacryl
S-1000 HR ou Sephacryl S-2000 seule.
Dans une expérience représentative, un rétentat d'ultrafiltration (200 ~11, 1.3mg
de proteines) a été chromatographié sur un système de 2 colonnes Sephacryl S-
1000HR-Superdex 200 HR 10/30 (Figure 10). Le pic chromatographique conten~nt
les particules virales a été collecté. Son temps de rétention coincide avec le temps de
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rétention obtenu avec une préparation de particules virales purifiées par
ultracentrifugation. Le pic de particules virales collecté après chromatographie (7 ml)
contennait 28 ,ug de protéines et 3.5 109 PFU. Son analyse par chromatographie
analytique d'échange d'ions dans les conditions décrites à l'exemple 5.2. montre la
5 présence d'un pic cont~min~nt plus fortement retenu sur la colonne d'analyse, dont la
surface représentre environ 25% de la surface du pic viral. Son ratio d'absorbance
260nm/280nm qui a une valeur de 1,86 indique que ce pic contaminant correspond àdes acides nucléiques. Les particules virales ont donc été purifiées environ 50 fois (en
terme de quantité de protéines) et le rendement de la purification est de 85~o en PFU.
Alternativement, il est possible de chromatographier les préparations de
particules virales (ultrafiltrats ou fractions en sortie de chromatographie d'échange
d'anions) sur une colonne TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm; TosoHaas) équilibrée
dans le tampon C. Les espèces sont éluées avec le tampon C à un débit de 0,5 ml/min
et détectées en UV à 260 nm. De même il peut être avantageux d'augmenter la
5 résolution dusystème chromatographique, en particulier d'augmenter la séparation du
pic de particules virales des espèces de plus faible poids moléculaire, en
chromatographiant le surnageant d'ultrafiltration (50 à 200 ~I) sur un système de 2
colonnes couplées en série [colonne de TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm) suivie d'une
colonne de Superdex 200 HR] équilibrées dans le tampon C. Les espèces sont éluées
avec le tampon C à un débit de 0,5 ml/min et détectées en UV à 260 nm.
Exemple 7: Purification du virus par Ultrafiltration. Echan~e
d'ions et Permeation de Gel
La fraction de particules virales issue de la chromatographie d'échange
d'anions (exemple 5) peut être avantageusement chromatographiée dans l'un des
2~ systèmes chromatographiques par perméation de gel décrit çi-dessus, par exemple
dans le but d'améliorer encore le niveau de pureté des particules virales, mais aussi
principalement dans le but de conditionner les particules virales dans un milieucompatible ou adapté aux utilisations ultérieures de la préparation virale
(injection,....).
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LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Rhone Poulenc Rorer SA
(B) RUE: 20, avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 920165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE PRODUCTION D'ADENOVIRUS
RECOMBINANTS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
~A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 ~OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TAATTACCTG GGCGGCGAGC ACGAT 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: si~nple
~D) CONFIGURATION: linéaire
~ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ACCTTGGATG GGACCGCTGG GAACA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(li) TYPE DE MOLECULE: ADN
. .
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(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
TTTTTGATGC GTTTCTTACC TCTGG 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(Xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGACAGCGA TGCGGAAGAG AGTGA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de hases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: llnéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TGTTCCCAGC GGTCCCATCC AAGGT 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUEN OE :
(A) LONGUEUR: 25 palres de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
AAGGACAAGC AGCCGAAGTA GAAGA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
CA 02258158 1998-12-11
W O 98100524 PCT~R97/01107
47
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GGATGATATG GTTGGACGCT GGAAG 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: si~ple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
AGGGCGGATG CGACGACACT GACTT 25
