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PEPTIDES CAPABLES D'INHIBER L'ENDOCYTOSE DE L'APP ET
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CORRESPONDANTES
La presente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et
nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement) la
présente
invention concerne de nouveaux peptides capables d'inhiber au moins
partiellement le
phénomène d'endocytose de l'APP.
Le peptide (3 amyloïde) le constituant majeur de la plaque amyloïde, est un
peptide d'environ 40 acides aminés de 4kDa) issu du clivage de fAPP
(Précurseur du
Peptide Amyloïde). Il s'accumule de façon importante dans le cerveau, non
seulement
dans la maladie d'Alzheimer mais aussi dans le syndrôme de Down plus
communëment
appelé trisomie 21.
L'APP est une protéine glycosylée de 100 à 140kDa, possédant plusieurs
domaines dont une région transmembranaire~, un domaine extracellulaire et un
domaine
cytoplasmique. La région de la molécoe plus spécifiquement concernée par
l'expression du peptide (3 amyloïde chevauche en partie le domaine
transmembranaire
et s'étend d'autre part au sein du domaine extracellulaire. Trois formes
majoritaires de
l' APP, rêsultant d'un épissage alternatif, ont été caractérisées. Le gène de
l'APP est
localisé sur le chromosome 21 et des mutations y ont été identifiées dans 3 à
5% des
patients atteints des formes familiales de la maladie d'Alzheimer.
Le rôle physiologique de fAPP n'est, à ce jour) pas complètement élucidé ;
toutefois, on pense qû il est impliqué dans l~e contact synaptique, agit à
titre de facteur
de régulation de croissance) et est neuroprotectif.
Des données récentes de la lifté rature ont montré le rôle important de
l'endocytose de fAPP pour la production du peptide (3 amyloïde, et ont permis
d'identifier des éléments de séquence, au sein de la région cytoplasmique)
utilisés
comme signaux d'endocytose. C'est ainsi que des cellules transfectées avec une
construction d'ADNc délétée du domaine C: terminal cytosolique de fAPP)
permettent
uniquement la production de la forme soluble de fAPP et ne produisent pas le
peptide
(3 amyloïde. Toutefois, in vi vo, on ne c;onnait pas encore la nature précise
des
événements responsables de l'activation de l'endocytose de fAPP ni de la
transduction
des signaux qui lui sont associés.
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L'élucidation du rôle exact de ces ;>ignaux d'endocytose dans les cellules, de
leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un
enjeu
majeur pour la compréhension et (approche thérapeutique de la maladie
d'Alzheimer et
plus généralement des maladies neurodégénératives.
La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse que
la protéine FE65 ne constitue pas uniquement un activateur transcriptionnel
dans le
cerveau mais qu'elle interagit également au niveau de la region cytoplasmique
de l'APP
en intervenant dans la modulation de l'endocytose de l'APP.
La présente invention résulte plus particulièrement de l'identification et de
la
caractérisation de régions particulières (dites régions effectrices) de la
protéine FE65)
impliquées dans la transduction des signaux d'activation de fendocytose de
fAPP. La
mise en évidence de l'existence de telles régions permet d' envisager la
préparation de
nouveaux peptides utilisables pharmaceutiqu.ement.
Au sens de la presente invention) la dénomination protéine FE65 couvre la
protéine en soit ainsi que toutes ses formes homologues. Par forme homologue
on
entend désigner toute protéine équivalente à la protéine considérée) d'origine
cellulaire
diverse et notamment issue de cellules d'origine humaine, ou d'autres
organismes, et
possédant une activité de même type. De pelles séquences homologues peuvent
être
obtenues par des expériences d'hybridation. Au sens de l'invention, il suffit
qu'une
séquence de ce type présente un pourcentage d'identité significatif pour
conduire à un
comportement physiologique assimilable â celui de la protéine FE 65 tel que
revendiqué.
Un premier objet de l'invention concerne donc des peptides capables
d' interférer au moins partiellement au niveau de Yinteraction de la protéine
FE65) ou
de l'une de ses formes homologues) avec la région cytoplasmique de l'APP.
Cette interférence d' un peptide selon l' invention peut se manifester sous
différents aspects. Le peptide revendiqué peut ralentir) inhiber ou stimuler
au moins
partiellement l' interaction entre la protéine FE65 ou l' une de ses formes
homologues
avec la région cytoplasmique de l' APP. Die tels peptides sont
préférentiellement des
peptides capables ~''~ntagoniser au moins partiellement cette interaction.
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Selon un mode particulier de (invention, les peptides sont capables de se lier
au niveau du domaine d'interaction entre I~a protéine FE65 ou l'une de ses
formes
homologues et la région cytoplasmique de fAPP.
Plus préférentiellement, les peptides de (invention comprennent tout ou partie
de la sëquence peptidique codant pbur la protéine FE65 présentée en SEQ ID
N~l)
SEQ ID N~2 ou un de ses dérivés.
Au sens de la présente invention) le terme dérivé désigne toute séquence
différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code
génétique)
obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique,
ainsi
que toute séquence hybridant avec ces séduences ou des fragments de celles-ci
et
conservant la capacité d' interagir au niveau ~de l' interaction entre la
protéine FE65) ou
l' un de ses homologues, et la region cytoplasmique de l' APP. Par
modification de
nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation,
substitution,
délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Ix terme
dêr~ivé
comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues
d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou
d'autres
organismes) et possédant une activité de même type. De telles séquences
homologues
peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations
peuvent être
réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la
séquence
native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation
(Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire?.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que
notamment celui d'augmenter leur efficacitë thérapeutique ou de réduire leurs
effets
secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés
pharmacocinétiques
et/ou biologiques.
En tant que peptide dérivé de la protéine FE65 et des formes homologues, on
peut citer notamment tout peptide capable d'interagir avec la région
cytoplasmique de
fAPP) mais portant une région effectrice rendue non fonctionnelle. De tels
peptides
peuvent être obtenus par délétion, mutation ou disruption de cette région
effectrice sur
la protéine FE65 et des formes homologues. De telles modifications peuvent
être
effectuées par exemple par mutagénèse. in vitro, par introduction d'éléments
additionnels ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des
substitutions
des élêments originels. Lorsqu'un dérivé tel que défini ci-dessus est réalisé,
son activité
d'inhibiteur partiel de la fixation de la protéine FE65 et des formes
homologues sur son
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site de fixation sur fAPP peut être mise en évidence. Toute technique connue
de
l'homme de l'art peut bien évidemment être utilisée à cet effet.
Il peut ëgalement s'agir de fragmf:nts des séquences indiquées ci-dessus. De
tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils
peuvent
être synthétisés par voie chimique) sur la base des séquences données dans la
présente
demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de (homme du
métier. Ils
peuvent également être synthétisés par voie génétique) par expression dans un
hôte
cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans
ce cas,
la séquence nucléotidique peut être préparêc~ chimiquement en utilisant un
synthétiseur
d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la
présente
demande et du code génétique. La séquence nucléotidique peut également être
préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures
enzymatiques, ligature, clonage, etc) selon les techniques connues de (homme
du
métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de
ces
séquences.
Par ailleurs, les peptides de (invention à savoir capables de ralentir ou
d'inhiber au moins partiellement (interaction entre Ia protéine FE65 et des
formes
homologues et la région cytoplasmique de fAPP peuvent également être des
peptides
ayant une sêquence correspondant au site d'interaction de la protéine FE65 et
des
formes homologues sur la rëgion cytoplasmique de 1'APP.
D'autres peptides selon l'invention sont les peptides capables d'entrer en
compétition avec les peptides définis ci-dessus pour l'interaction avec leur
cible
cellulaire. De tels peptides peuvent être synthétisés notamment sur la base de
la
séquence du peptide considéré, et leur capacité à entrer en compétition avec
les
peptides définis ci-dessus peut être déterminée.
Un autre objet de (invention réside dans des anticorps ou fragments
d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un peptide tel que
défini
ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de
(homme
du métier. En particulier) ces anticorps peuvent être prêparés par
immunisation d'un
animal contre un peptide de (invention, prélèvement du sang, et isolement des
anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation
d'hybridomes
selon les techniques connues de (homme de: !'art.
Plus préférentiellement, les anticorps ou fragments d'anticorps de (invention
présentent la capacité d'inhiber au moites partiellement (interaction des
peptides
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revendiqués avec la région cytoplasmique de f APP. Ils peuvent ainsi être
utilisés pour
moduler fendocytose de l'APP.
Par ailleurs, ces anticorps peuvent également être utilisés pour détecter
et/ou
doser l'expression ou la surexpression de fAP'P dans des échantillons
biologiques) et de
5 ce fait, pour renseigner sur son état d'activation.
L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non
exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. Il est en effet
possible, à
partir des motifs protéiques actifs décrits dms la présente demande, de
réaliser des
molécules inhibitrices de la voie de signalisation dépendante de la protéine
FE65 non
exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique.
La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique
codant pour un peptide selon l'invention. Il peut s'agir en particulier d'une
séquence
comprenant tout ou partie de la séquence présentée en SEQ ID N~1, SEQ ID N~2
ou
une de leurs dérivés. Par séquence dérivée) on entend au sens de la présente
invention
toute séquence hybridant avec la séquence présentée en SEQ ID N~1 ou en SEQ ID
N~2 ou avec un fragment de celles-ci et codant pour un peptide selon
l'invention, ainsi
que les séquences resultant de ces dernières par dégénérescence du code
génétique.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine
artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques) d'ADNc, d'ARN, de
séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces
séquences
peuvent être obtenues soit par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc,
banque
d'ADN génomique), soit par synthèse chimique, soit par des méthodes mixtes
incluant
la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de
banques.
De telles séquences nucléotidiques peuvent être utilisées pour la production
des peptides de l'invention. La présente demande concerne ainsi un procédé de
préparation d'un tel peptide selon lequel on cultive une cellule contenant une
séquence
nuclêotidique selon (invention, dans des conditions d'expression de ladite
séquence et
on récupère le peptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit
peptide est
généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans
un
hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs) sequence
"leader"
de sécrétion, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par
ailleurs, les
séquences nucléotidiques de (invention peuvent faire partie d'un vecteur qui
peut être
à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à
réplication
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autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à rêplication
autonome
chez l'hôte choisi. S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être
preparés par
exemple en utilisant des séquences homologues à certaines regians du génome de
(hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de
l'invention
par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes.
Parmi les
hôtes eucaryotes qui conviennent) on peut citer les cellules animales, Ies
levures) ou les
champignons. En particulier, s'agissant de levures) on peut citer les levures
du genre
Saccharomyces) Kluyveromyces) Pichia, Sohwanniomyces) ou Hansenula. S'agissant
de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO) C127, etc. Parmi
les
champignons, on peut citer plus particulière~~nent Aspergillus ssp. ou
Trichoderma ssp.
Comme hôtes procaryotes, on préfère utili~~er les bactéries suivantes E.coli)
Bacillus)
ou Streptomyces.
Les séquences d'acides nucléiques ,<>elon l'invention peuvent également servir
à
la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques
utilisables comme
agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de
petite
taille, complémentaire du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables
d'hybrider
spécifiquement avec l'ARNm transcrit) inhibant sa traduction en protéine.
L'invention a
ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins
partiellement
l'interaction des protéines FE65 sur la n~gion cytoplasmique de l'APP. De
telles
séquences peuvent être constituées par 'tout ou partie des séquences
nucléiques
définies ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fragments de
séquences
complémentaires de sêquences codant pour des peptides interagissant avec la
région
cytoplasmique de fAPP. De tels oliganucléotides peuvent être obtenus par
fragmentation, etc, ou par synthèse chimique.
Les séquences revendiquées peuvent être utilisées dans le cadre de thérapies
géniques, pour le transfert et l'expression in vivo de séquences antisens ou
de peptides
capables de moduler (interaction des protéines FE65 avec la région
cytoplasmique de
fAPP. A cet égard) les séquences peuvent être incorporées dans des vecteurs
viraux
ou non viraux , permettant leur administration in vi vo (Médecine et Sciences
7 ( 1991 )
705). A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout
particulièrement
citer les vecteurs de type adénovirus) rétrovirus, virus adéno-associé ou
virus de
(herpès. La présente demande a également pour objet des virus recombinants
défectifs
comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon
I'invention.
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L'invention permet également lai realisation de sondes nucléotidiques,
synthétiques ou non) capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques
définies
ci-avant) utilisables dans le cadre d'une thérapie génique. De telies sondes
peuvent être
utilisées in vitro comme outil de diagnostic) pour la détection de
l'expression ou
surexpression de fAPP, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies
génétiques
(mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes
peuvent
également être utilisées pour la mise en évidence et (isolement de séquences
d'acides
nucléiques homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment,
à
partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules
d'origines humaines.
Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases) et elles
peuvent
par exemple comporter jusqli à (intégralité d'une des séquences précitées ou
de leur
brin complémentaire. Préférentiellement) ces sondes sont, préalablement à leur
utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du
métier
peuvent être employées (marquage radioactif) enzymatique) etc).
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique
comprenant comme principe actif au moins un peptide tel que défini ci-avant.
Elle a aussi pour objet toute compK~sition pharmaceutique comprenant comme
principe actif au moins un anticorps et/ou un fragment d'anticorps tel que
défini cl-
avant, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe
actif
au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans
lesquelles les peptides) anticorps et séquence nucléotidique définis ci-avant
sont
associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées
pour moduler l'activation des protéines APl' et de ce fait pour moduler son
endocytose
et la production de peptides (3 amyloïdE;. Plus particulièrement) ces
compositions
pharmaceutiques sont destinées à moduler (interaction entre les protéines FE65
et la
région cytoplasmique de fAPP. Plus I>référentiellement, ces compositions sont
destinées à ralentir ou inhiber au moins partiellement (interaction des
protéines FE65
avec la région cytoplasmique de fAI'P. Il s'agit plus préférentiellement de
compositions pharmaceutiques destinëes au traitement de maladies
neurodégénératives
comme par exemple la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21.
L'invention a encore pour objet (utilisation des molécules décrites ci-avant
pour moduler (activation de fendocytose de fAPP ou le typage de maladies
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neurodëgénératives. En particulier, (invention concerne (utilisation de ces
molécules
pour inhiber au moins partiellement l'activation de l'endocytose de l'APP.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des
exemples et figures qui suivent) qui doivent être considérés comme
illustratifs et non
limitatifs.
Légendes des fig,rres
Figure l: Représentation du vecteur pGAL4DB-CAPP
Figure 2: Représentation d'ADNs plasmidiques sur gels obtenus selon l'exemple
3.
Figure 3: Comparaison de fragments nucléotidiques de FE65 d'origines diverses
MATERIELS ET TECHNIQUES MIS EN OEUVRE
1) Les souches de levures.utilisée5 sont:
La souche YCM du genre S.cerevisiae (M.9Ta, ura3-52, his3-200, ade2-10l, lys2-
8D1, trpl -901, leu2-3,1l2, canr, gal4-:i42) ga180-538) URA3: : GALIl10-IacZ,
LYS:: GALIl10-HIS3) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de
fusion de
cerveau par le système deu,r hybrides.
La souche L40 du genre S.cerevisiae (Mata, his3D200, trpl-901, leu2-3,112,
ade2,
LYS2:: (IexAop)4-HIS3, URA3:: (IexAop)8-hacZ, GALA) a été utilisée pour
vérifier les
interactions protéine-protéine quand l'un des partenaires protéiques est
fusionné à la
protëine LexA. Cette dernière est capable de reconnaître l'élément de réponse
LexA
contrôlant l'expression des gènes rapporteurs LacZ et His3.
Elles ont été cultivées sur les milieux de culture suivants:.
Milieu YPD complet: -Extrait de levures (10g/1) (Difco)
-Bactopeptone (20g/1) (Difco)
-Glucose (20g/1) (Merck)
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ç~
Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
Milieu YNB minimum:-Yeast Nitrogen Bas~~ (sans acides aminés) (6,7g/i) (Difco)
- Glucose (20g/1) (Merck)
Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
Pour permettre la croissance des levures auxotrophes sur ce milieu) iI est
nëcessaire
d'y ajouter les acides aminés ou les bases azotées, pour lesquelles elles sont
dépendantes à 50mg/ml. 100 Ng/ml d' ampicilline sont aj outés au milieu afin
d' éviter
les contaminations bactêriennes.
2) La souche de bactérig utilisée est :.
La souche TG1 d'Escherichia colt de génotype supE, hsd~5, thi, 0(lac-proAB),
F'[tra
D36 pro A+B+ IacIq lacZ~,M 15] . Elle a été employée comme moyen d'
amplification et
d'isolement de plasmides recombinants utilisés.
Elle a été cultivée sur
Milieu LB: -NaCI (5g/1) (Difco)
-Bactotryptone (lOg,n) (Difco)
-Extrait de levure (5g/1) (Difco)
Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
L'ampicilline a étë utilisée à 100~g/ml) cet antibiotique sert à sélectionner
les bactéries
ayant reçu les plasmides portant comme marqueur le gène de résistance à cet
antibiotique.
3) Les~lasmides mis en oeuvre sont:.
Le vecteur pGBTlO. (Clontech),un plasmide navette de 5,4kb qui possède une
origine
réplication bactérienne et de levure lui pE~rmettant de se répliquer à haut
nombre de
copies chez ces deux micro-organismes. Ce plasmide contient un site multiple
de
clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l'
ADN de
GALA et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. Il
contient
également le gène TRP1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures
de
génotype trpl afin de les sélectionner sir un milieu minimum ne contenant pas
de
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tryptophane. Ce vecteur porte le gène de résistance à l' ampicilline qui
permet de
sélectionner les bactéries le possédant sur un milieu contenant de l'
ampicilline.
Le vectew pGADlO. fourni par Clonte~ch et qui permet l'expression chez la
levure de
protéines de fusion entre le domaine transactivatew de GAL4 et une protéine
codée
5 par l' ADNc provenant d' une banque de cerveau) inséré au niveau d' un site
EcoRI.
Le vectew pL.~x9 (pBTMII6) (Bartel et aI D.A Hartley Ed) Oxford University
press
page 153) de 5kb homologue au pGBTlO qui contient un site multiple de clonage
situé en aval de la séquence codant pow le~ répressew bactérien LexA et en
amont
d'un terminatew pow former une protéine de fusion.
10 4) les olig_onucléotides~le synthèse employés sont:.
CAA GTC GAC CTA GTT CTG CAT CTG CTC (SEQ ID N~3)
CAA GAA TTC AAG AAA CAG TAC ACA TCC (SEQ ID N~4)
Oligonucléotides qui ont permis d'obtenir le fragment PCR correspondant au
CAPP
avec les sites EcoRI et SaII.
Les oligonucléatides sont synthétisés sw l' appareil Applied System ABI 394-
08. Ils
sont décrochés de la matrice de synthèse par de l'ammoniac et précipités deux
fois par
10 volumes de n-butanol puis repris dans de l' eau. La quantification est
effectuée par
meswe de la densité optique (1D0 correspond à 30pg/ml).
Préparation des ADN plasmidiques.
Les grandes quantités d' ADN sont préparées en utilisant le Kit de préparation
rapide
d'ADN de Proméga.
Les petites quantités d' ADN sont préparées de la manière suivante: les
bactéries
contenant le plasmide sont cultivées pendant au moins 4 heures dans 2m1 de
milieu LB
dans un shaker à agitation. Elles sont ensuite centrifugées pendant 2 minutes
à 14000
rpm dans des tubes Ependorf, puis le culot est remis en suspension dans 100p1
de la
solution I (50mM de glucose, 25mM de tarnpon Tris HCl pHB, lOmM EDTA pH8))
lysées par 200p1 de la solution II (0.2M de NaOH) 1% de SDS). La solution de
lyse
est ensuite neutralisée par 150p1 de la solution III (3M d'acétate de
potassium) 1l.5%
(v/v) d'acide acétique glacial). Après agitation des tubes jusqu'à obtenir un
précipité
floconneux, 150pI u un mélange de phénol/Chloroforme (50% de phénol et 50% de
chloroforme saturés en eau) sont ajoutës, et l'ensemble est agité 30 secondes.
La
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phase acqueuse contenant l' ADN est recupérée après centrifugation pendant 2
minutes
à 14000 rpm. L'ADN est ensuite précipité par addition de 0,5 volume
d'isopropanol
puis centrifugé 5 minutes à 14000 rprn et séché à l' air pour enfin être
repris dans 20p.1
de TE RNAse (solution de Tris-HCI lOm,M et d'EDTA 1mM avec 50~g/mt de
RNAse).
G) Amplification enzy~nati e d' ADN ou PC~R (Polymerase Chain Reaction).
Les réactions de PCR sont effectuées dans wn volume final de 100A en presence
de la
matrice d'ADN, de dNTP (0,2mM), de tampon PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM,
MgCl2 lmM, KCl 5 mM) gélatine 0,01%)) de 0,5 Elg de chacun des
oligonucléotides et
de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymérase (Perkin Elmer) avec ou sans formamide
(5%). Le mélange est recouvert de 2 g<>unes d'huile de paraffine pour limiter
l'évaporation de l'échantillon. L'appareil utilisé est le "Crocodile II"
d'Appligene.
Nous avons utilisé une température de dénaturation de la matrice de 90~C, une
température d'hybridation des ohgonucléotides à la matrice infèrieure de 5 à
10 degrés
à la température de séparation des oligonucléotides et une température
d'élongation
par l'enzyme à 72~C.
7) Les ligatures.
Toutes les réactions de ligation sont effectuées à +14~C pendant une nuit dans
un
volume final de 10 ~1 en présence de l00 à 200 ng de vecteur, 0.5 à 2 pg d'
insert, 40
UI d'enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) et ur~ tampon de ligation (Tris-HCl 50 mM
pH
7,8; MgCI~ 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 rnM). Le témoin négatif est constitué par
la
ligation du vecteur en l'absence d'insert.
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1 c.
$) La tranformation des bactéries par un ln asmidg est effectuée selon le
protocole
iv
La totalité du volume de ligatàon ( 10p1) est utilisée pour transformer les
bactéries TG 1
rendues compétentes par la méthode de Chl;ntg et al) ( PNAS,1988 86) 2172-
2175).
Les bactéries TG 1 sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant
quelques
heures dans une étuve à agitation à 37~C) jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à
600nm. Le
milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont
rendues
compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB +
l00
g/1 de PEG 4000, 5% de DMSO) 10 mM de lvIgCl2) 10 mM de MgS04) correspondant
à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 4~C
pendant 30 à
60 minutes, 200p.1 de bactéries sont mises a,u contact des produits de
ligation pendant
minutes sur la glace. Après addition de 200p1 de LB) les bactéries sont
incubées 30
mn à 37~C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.
9) Les séparation et extr~ct~n des ADN sont effectuées comme suit:
15 La séparation des ADN est realisée en fonction de leur taille par
électrophorèse. Pour
ce faire; différents gels sont utilisés en fonction de la taille des fragments
à séparer:
-gels de polyacrylamides précoulés (Novex) à 6%, 10% et 20% pour la
séparation des petits fragments d'ADN (75 à 500pb)
-gel d'agarose à 1% (Gibco BR.L) dans un tampon TBE (Tris base 90mM;
Borate 90mM; EDTA 2mM) pour la séparation de grands fragments d'ADN
(supérieurs à 500pdb)
-gel d'agarose NuSieve à 2% (FMC Bioproducts) dans un tampon TBE
pour la séparation de petits fragments (infèrieurs à 500 pdb).
Toute migration sur gel d'agarose ou sur gel de polyacrylamide est réalisée
dans un
tampon TBE et en présence d'un marqueta- de poids moléculaire (1Kb ladder,
Gibco
BRL). L'ADN est mélangé avec 1/10 du volume du bleu de dépôt (200g/1 de
Ficoll)
0,5g/1 de bleu de bromophénol) 50mM d'EDTA) avant d'être déposé sur gel. Après
migration à 100 Volts et coloration au bromure d'éthydium (concentration
0.5pg/ml
de gel), les bandes sont visualisées sous la lampe à UV.
L'extraction de l'ADN de la bande d'un ~;el d'agarose est réalisée par
électroélution
comme suit: Le morceau de gel contenant le fragment d' ADN est découpé au
scalpel
et mis dans un boudin de dialyse fermé par deux pinces et contenant de 100 à
SOOpI de
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TBE. L'ensemble est mis dans une cuve à électrophorèse où il subit un champ
électrique de 100 Volts. L' ADN, après être sorti du gel, est ensuite purifié
par deux
extractions au phénol/chloroforme suivies de deux extractions au chloroforme,
puis
précipité en présence d'acétate de sodium 1),3M et de 2,5 volume d'éthanol
absolu.
Après centrifugation (5 mn à 14000 rpm) le culot d' ADN est séché puis repris
dans
20p1 l'eau.
10) Séauença~e fluorescent des ADN plasmi;dic~ues.
Le séquençage est fait suivant le méthode de Sanger en utilisant 4
didéoxyribonucléotides possédant un marqueur fluorescent différent. L'
incorporation
de l'un de ces didéoxyribonucléotides produit un arrêt dans la réplication par
la Taq
polymérase de l' ADN à séquencer. Cette réaction donnera des fragments d' ADN
de
tailles différentes) tous terminés en 3' par un des 4 didéoxyribonuclëotides.
Un pg d'un plasmide et 4 picomoles d'un primer sont ajoutés à 9,5p1 d'un
"prénwc"
fourni par Applied Biosystems sous le nom de Prisme. Le volume final doit être
de
20p1 pour effectuer une PCR pendant 25 cycles se décomposant en une étape de
dénaturation à 96~C pendant 30 secondes,une étape d'hybridation à 50~C pendant
15
secondes et une étape d'élongation à 60~C Fendant 4 minutes.
Les fragments d'ADN, obtenus après ;amplification, sont purifiés sur colonne
d'exclusion (Chromaspin-30 de Clontech); et sont ensuite séchés au Speed Vac.
L'ensemble est repris par 5N.1 d'un mélange formé de 24p1 d'EDTA (50mM) et
120p1
de formamide désionisée. Après dénaturation à 96~C pendant 3 minutes, 3 à 5p1
sont
déposés sur un gel d'électropharèse. Les différents fragments d'ADN sont
séparés
suivant leur taille et vont passer successivement devant un lecteur laser de
l'Appareil
370 DNA sequencer (Applied Biosystems) où les différentes fluorescentes vont
être
détectées.
11) Préparation de plasmides de la banque de cerveau (Clontech~).
La banque de fusion d' ADNc de cerveau est vendue sous forme de bactéries. Ces
dernières contiennent un plasmide pGADlO renfermant un insert correspondant à
un
ADNc de cerveau humain. Les ADNc de cette banque sont constitués grâce à la
technique des oligodT et la technique d.es oligonucléotides dégénérés qui
permet
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14
d' avoir les parties 5' des ARNm qui sont difficiles à obtenir par la première
technique.
Ces cDNA sont clonés dans le vecteur pGAI)IO au niveau du site EcoRI.
Après vérification du titre de la banque) 21g1 de bactéries de la banque de
fusion de
cerveau, mises au préalablement dans 8 m1 de LB, sont étalées de façon non
confluente
sur un milieu solide afin de garder la représentativité de cette banque. Nous
avons ainsi
étalé 16 boites de 770 cm2 contenant un milieu LB+ampicilline. Les colonies
apparues
sont reprises pour chacune des boites avec 30m1 de LB+ampicilline liquide. Les
suspensions obtenues sont ensuite mises dans un Erlen et mises à incuber dans
un
shaker à 37~C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par
la
technique de la Maxiprep. La concentration ~en ADN sera determinée à 260nm.
12) Transformation de la levure par un ~lasnnide.
Les levures préalablement cultivées dans 100m1 de milieu liquide sont
récoltées après
centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes et mises en suspension dans 1m1
d'eau
stérile. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes le culot cellulaire
est remis
en suspension dans 1 m1 d'eau stérile puis centrifugé à nouveau. Cette
opération est
répétée une nouvelle fois afin d'ëliminer toute trace du milieu de culture.
Les levures
sont ensuite reprises par 1 m1 de la solution I de transformation (LiAc 0.1M)
Tris-HCl
pH 7,5 lOmM, EDTA 1mM). puis centrifugées à 3000 rpm pendant 3 minutes. Le
culot cellulaire est repris à nouveau dans 1 ml de la solution I de
transformation. 501
de cette suspension de levures sont mis en présence de 50pg d'ADN de sperme de
saumon et de 1 à 5 ~g d' ADN plasmidique. 300A d' une solutïon II de
transformation
(LiAc 0.1M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDT,~ 1mM dans du PEG4ooo 40%) sont ensuite
ajoutés, puis l'ensemble est mis à incubf:r à 28~C pendant 30 minutes. Un choc
thermique est ensuite appliqué sur le mélange de transformation dans un bain-
marie à
40~C pendant 15 minutes puis l'ensemble est centrifugé à 15000 rpm pendant 1
mn
afin de récolter le culot cellulaire. Ce culot est repris dans 200.I d'eau
puis étalé sur
un milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant aux
marqueurs apportés par le plasmide transformant. Les levures sont ensuite
mises à
cultiver pendant 72 heures à 28~C.
Dans le cas particulier de la tranfor-rnaticm de la levure par la banque d'
ADNc de
cerveau, on procède comme suit:
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La levure utilisée contient le plasmide pGAL4DB-CAPP codant pour la partie C-
terminale de l'APP fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Elle est
cultivée dans 250m1 de milieu minimum YNB+His+Lys+Ad+Leu à 28~C sous
agitation jusqu' à une densité de 10' celh~les/ml. L.es cellules sont
récoltées par
5 centrifugation à 3000rpm pendant 10 minutes et reprises dans 250m1 d'eau.
Après une
nouvelle centrifugation le culot cellulaire e;>t repris dans 100m1 d'eau et à
nouveau
centrifugé. Le culot est alors repris dans 1()inl de la solution I de
transformation et
incubé pendant 1 heure à 28~C sous agitation. Après centrifugation les
cellules sont à
nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 pl de
la banque
10 d'ADNc de cerveau et de 20 ml de la solution II de transformation, puis
incubées
pendant 1 heure à 28~C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce
mélange
de transformation à 42~C pendant 20 minutt~s. Une centrifugation (3000 rpm
pendant
5mn) est répétée 3 fois de suite) en reprenant à chaque fois le culot avec 10
ml d'eau
stérile. La troisième fois le culot est repris avec 2,5 ml de PBS. Ainsi le
PEG toxique
15 pour les cellules a été éliminé. 2,4 m1 de cette suspension sont utilisés
pour
ensemmencer 250 m1 de milieu minimum contenant les acides aminés His) Lys, Ad
et
cultivés durant une nuit dans un shaker à 28"C. Les 100 pl de cette suspension
restants
servent à vérifier l'efficacité de la transformation; pour cela des dilutions
de 102, 10-3
et 10~ de cette suspension ont été réalisées et étalëes sur un milieu minimum
contenant
les acides aminés His) Lys) Ad. Après cuuture à 28~C durant 2 jours les
colonies
obtenues ont été comptées et le taux de transformation est déterminé en
utilisant la
formule : "nombre de colonies x facteur de cGlution". La culture de nuit est
centrifugée
(3000 rpm pendant 5 mn) et lavée à l'eau stÉ~rile deux fois de suite. Le culot
est ensuite
repris dans 2,5 m1 d'eau. 2,4 ml, dont le volume est amené à 10m1 dans de
l'eau stérile)
sont utilisés pour ensemencer 10 boites de 435 cmz contenant un milieu
YNB+Lys+Ad
et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 pl restants sont utilisés pour
effectuer les
mëmes opérations que lors de la détermination du taux de transformation) afin
de
déterminer le taux d' amplification du nombre de colonies au cours d' une nuit
de
culture.
L' ADN (génomique et plasmidique) est extrait des levures de la manière
suivante:.
La valeur d' une anse moyenne d' un clône d~e levure est mise dans 200p 1 d'
une solution
TELT (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI l~DOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA 1mM), en
présence de 3g de billes de verre de 450 pm de diamètre et de 200p.1 de
phénol/chloroforme. Ce mélange est vortexé pendant 15 minutes, puis centrifugé
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pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la
galette
protéique et l' ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d'
éthanol
absolu. Après centrifugation pendant 2 mirmtes à 14000 rpm) le culot d' ADN
est
séché et repris dans 201 de TEI2NAse. Cette solution d' ADN, qui correspond à
un
mélange d' ADN génomique et plasmidique, sert directement à transformer des
bactéries. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les
bactéries et
peut être analysé par la technique de miniprel>.
13) Test d'activité de la f3$alactosidase.
Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri
contenant
les clones de levures individualisés. Grâce au phënomène d'adsorption on
obtiendra
une image fidèle de l'emplacement des clônes. Cette feuille est ensuite
plongée dans de
l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de
libërer ainsi
l'activité l3galactosidase. Après décongelation) la feuille de nitrocellulose
est déposée)
colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier
Whatman
préalablement imbibé de 1,5m1 de solution F'BS (NaZHP04 60mM) NaHZP04 40mM,
KCI lOmM, MgS04 lmM, pH7) et de 10 à 301 de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-
indoyl-(3-D-galactoside) à 50mg/ml de N,N.-diméthylformamide. La boite est
ensuite
placée dans une étuve à 37~C couvercle fern~ê pour éviter le dessèchement . Le
temps
d'apparition de la couleur bleue peut être tré;> variable, de quelques minutes
à plusieurs
heures. Ce test doit toujours se faire en présence d' un témoin positif dont
l' interaction
est connue et vire rapidement au bleu.
EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protêine
de fusion entre la partie C-terminale du précurseur du peptide amyloïde (CAPP)
et le domaine de liaison à l'ADN de GAL,4
Le criblage d' une banque utilisant le système double hybride nécessite que la
rëgion C-
terminale de l'APP (CAPP) soit fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de la
protéine transactivatrice GAL4. L'expression de cette protëine de fusion est
réalisée
grâce au vecteur pGBTIO (cf matériels et méthodes) ) dans lequel nous avons
introduit)
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li
dans ie même cadre de lecture que la séquence correspondant au domaine de
liaison à
l'ADN de GAL4 (GAL4DB)) la séquence codant pour le CAPP figurant dans la
sequence présentée en SEQ ID N~1.
Le fragment d' ADN de 138 pdb correspondant aux 46 derniers acides aminés de
l'APP a été obtenu par PCR à partir des oligonucléotides (SEQ ID N~3 et N~4)
qui
nous ont également permis d'introduire ies sites EcoRI et SaII aux extrémités
de la
séquence. Le fragment de PCR a été introdl;ût entre les sites EcoRI et SaII du
multisite
de clonage du plasmide pGBTlO en aval de la séquence correspondant au GAL4DB
pour donner le vecteur pGAL4DB-CAPP (fig.2).
La construction a été vérifiée par séquenyage de l'ADN. Cette vérification
nous a
permis de montrer que ce fragment ne présentait pas de mutations générées au
cours
de la réaction de PCR et qu' il était fusionné dans la même phase ouverte de
lecture
que celle du fragment correspondant au GAL4DB.
EXEMPLE 2: CRIBLAGE DE LA BANyUE DE FUSION DE CERVEAU.
Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant
des
protéines fusionnées au domaine transacti:vateur de GAL4, pouvant interagir
avec
notre protéine d' intérêt. Cette interaction permet de reconstituer un
transactivateur qui
va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs His3 et
LacZ dans la
souche YCM.
Pour effectuer ce criblage nous avons choisi une banque de fusion réalisée à
partir
d' ADNc provenant de cerveau humain. Comme cette banque nous a été fournie
sous
forme de bactéries, l' ADN plasmidique de l.a banque a tout d' abord été
purifié.
2.1) P~aration de l'ADN plasmidique d'une banaue de fusion..
L'ADN plasmidique de la banque d'AI)Nc de cerveau a été extrait suivant le
protocole Clontech~ (voir matériels et méthodes) ~ 11). Lors de cette
préparation ~1
était important de préserver la représentativité de la banque, c' est à dire,
conserver le
nombre de plasmides indépendants qui la constitue et qui sont au nombre de
1,2.106
plasmides.
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Afin de nous préserver de la perte de plasmides de la banque au cours de cette
préparation) le lot d'ADN plasmidique que nous avons constitué a été obtenu à
partir
d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de
deux fois
la représentativité de la banque soit 4.106 colonies.
2.2) Transformation ~~n~ue de cerv<:au et sélection par le test d'activité
(~galactosidase.
Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque
plasmide
indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en
même
temps que le plasmide GAL4DB-CAPP. Pour préserver cette probabilité il est
important d' avoir une bonne efficacité de transformation de la levure. Pour
cela nous
avons choisi un protocole de transformation ~de la levure donnant une
efficacité de 105
cellules transformées par pg d'ADN. De plus comme la cotransformation de la
levure
par deux plasmides différents réduit cette efficacité, nous avons préféré
utiliser une
levure préalablement transformée par le plasmide pGAL4DB-CAPP. Cette souche
YCM-CAPP de phénotype His-, Lys-, Leu- a été transformée par 100pg d' ADN
plasmidique de la banque de fusion. Cette quantité d'ADN nous a permis
d'obtenir
après estimation (voir matériels et méthodes) 10' cellules transformées, ce
qui
correspond à un nombre légèrement supérieur au nombre de plasmides
indépendants
que constitue Ia banque. D'après ce résultat nous pouvons penser que la quasi
totalité
des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des
cellules
transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a
été faite
sur un milieu YNB+Lys+Ad.
A l' issu de cette sélection 1000 clones avec un phénotype His+ ont été
obtenus. Sur
ces transformants un test d' activité (3galact~osidase a été effectué afin de
valider par
l'expression de l'autre gène rapporteur) La~.Z, ce nombre de clones obtenus.
68 des
1000 clones obtenus présentaient le double phénotype His+) (3Ga1+ pouvant
correspondre à une interaction protéine-protéine.
EXEMPLE 3: ISOLEMENT DES PLASrVIIDES DE LA BANQUE
Afin d'identifier tes protéines pouvant interagir avec le CAPP) nous avons
extrait les
plasmides de la banque de fusion contenus dans les levures sélectionnées lors
du
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criblage double hybride. Pour pouvoir en obtenir en grande quantité) cet
isolement
nécessite au préalable une transformation d' E.coli par un extrait d' ADN des
souches
de levures positives. Comme le plasmide de: la banque contenu dans cet extrait
est un
plasmide navette levure/E.coli il pourra facilement se repliquer chez la
bactérie. Afin
d'éviter d'isoler le plasmide GAL4 DB - CAPP qui est lui aussi présent dans la
levure
nous avons travaillé sur des souches qui en sont dépourvues.
Les ADN plasmidiques des colonies bactériennes obtenues après transformation
par
des extraits d' ADN de levures ont été analysées par digestion avec des
enzymes de
restriction et séparation des fragments d' AI)N sur gel d' agarose. Nous avons
obtenu 3
profils de restriction différents sur les 5 clones analysés (7D) 3E) 9A, 3H,
3G) (fig 2}.
Ces résultats ont montré que 2 plasmides identiques sont au moins représentés
dans 2
clones de levures différents, les clones 7D, ainsi que les clones 3H et 3G.
L'ADN du
clone 3E est obtenu à partir de souches de phénotype His+ et (3GAL+.
EXEMPLE 4: DETERMINATION DE LA SEOUENCE DES INSERTS DES
PLASMIDES IDENTIFIES.
Le séquençage a été réalisé à partir de l'oligonucléotide (SEQ ID N~5)
complémentaire de la région de GAL4TA .à proximité du site d' insertion de la
banque
de cDNA de cerveau, à 52 pdb du site EcoRI.
La comparaison des 3 séquences avec les séquences contenues dans les banques
de
données GENBank et EMBL (European Molecular Biology Lab} a montré que les
séquences des ADNc qui étaient dans lca plasmides issus des souches 9A et 3H
présentent 87% d'homologie au niveau nucleïque avec le gène marin codant pour
la
protéine FE65, elles sont représentées en SEQ ID N~2) et que la séquence du
plasmide
issu de la souche 7D présente 60% d' homologie avec ce même gène ( voir figure
3).
L'analyse de la séquence des plasmides is:~us des souches 9A et 3H indique que
ceux-
ci contiennent deux régions chevauchantes correspondant à un même ARNm.
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20~
LISTE DE SEQUE1VCES
S
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC ROBER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY
IO (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TLPHONE: 40.91.69.22
(H) TLCOPIE: (1) 40.91.72.96
IS () TITRE DE L' INVENTION:
(iii) NOMBRE DE SQUENCES: 5
(iv) FORME DCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
2O (A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version
#1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SEÇiUENCE:
(A) LONGUEUR:1500
(B) TYPE: nuclëotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
4O (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR:1275
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linëa:ire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
SS CGG GAG GAG TCC CAG CTC ACC TGG ACA GGT TTT GCT CAT GGA GAA GGC 48
Arg Glu Glu Ser Gln Leu Thr Trp Thr Gly Phe Ala His Gly Glu Gly
1 5 10 15
TTT GAG GAT GGA GAA TTT TGG AAG GAT GAA CCC AGT GAT GAG GCC CCA 96
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21
Phe Glu Asp Gly Glu Phe Trp Lys Asp Glu Pro Ser Asp Glu Ala Pro
20 25 30
ATG GAG CTG GGA CTG AAG GAA CCT GAG GAG GGG ACG TTG ACC TTC CCA 144
Met Glu Leu Gly Leu Lys Glu Pro Glu Glu Gly Thr Leu Thr Phe Pro
35 40 45
GCT CAG AGC CTC AGC CCA GAG CCG TTG ~~CC CAA GAG GAG GAG AAG CTT 192
AIa GIn Ser Leu Ser Pro Glu Pro Leu Pro Gln Glu GIu Glu Lys Leu
1~ 50 55 60
CCC CCA CGG AAT ACC AAC CCA GGG ATC .AAG TGT TTC GCC GTG CGC TCC 240
Pro Pro Arg Asn Thr Asn Pro Gly Ile Lys Cys Phe Ala Val Arg Ser
65 70 75 80
CTA GGC TGG GTA GAG ATG ACC GAG GAG GAG CTG GCC CCT GGA CGC AGC 288
Leu Gly Trp Val Glu Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Pro Gly Arg Ser
85 90 95
2O AGT GTG GCA GTC AAC AAT TGC ATC CGT CAG CTC TCT TAC CAC AAA AAC 336
Ser Val Ala Val Asn Asn Cys Ile Arg Gln Leu Ser Tyr His Lys Asn
100 105 110
AAC CTG CAT GAC CCC ATG TCT GGG GGC TGG GGG GAA GGA AAG GAT CTG 384
Asn Leu His Asp Pro Met Ser Gly Gly Trp Gly Glu Gly Lys Asp Leu
115 120 125
CTA CTG CAG CTG GAG GAT GAG ACA CTA AAG CTA GTG GAG CCA CAG AGC 432
Leu Leu Gln Leu Glu Asp Glu Thr Leu Lys Leu Val Glu Pro Gln Ser
3~ 130 135 140
CAG GCA CTG CTG CAC GCC CAA CCC ATC ATC AGC ATC CGC GTG TGG GGC 480
Gln Ala Leu Leu His AIa Gln Pro Ile Ile Ser Ile Arg Val Trp Gly
145 150 155 160
GTC GGG CGG GAC AGT GGA AGA GAG AGG GAC TTT GCC TAC GTA GCT CGT 528
Val Gly Arg Asp Ser Gly Arg Glu Arg Asp Phe Ala Tyr Val Ala Arg
165 170 175
4O GAT AAG CTG ACC CAG ATG CTC AAG TGC CAC GTG TTT CGC TGT GAG GCA 576
Asp Lys Leu Thr Gln Met Leu Lys Cys His Val Phe Arg Cys Glu Ala
180 185 190
CCT GCC AAG AAC ATC GCC ACC AGC CTG CAT GAG ATC TGC TCT AAG ATC 624
Pro Ala Lys Asn Ile Ala Thr Ser Leu His Glu Ile Cys Ser Lys Ile
195 200 205
ATG GCC GAA CGG GGT AAT GCC CGC TGC TTG GTA AAT GGA CTC TCC CTG 672
Met Ala Glu Arg Gly Asn Ala Arg Cys Leu Val Asn Gly Leu Ser Leu
5~ 210 215 220
GAC CAC TCT AAA CTT GTG GAT GTC CCT TTC CAA GTG GAA TTC CCA GCG 720
Asp His Ser Lys Leu Val Asp Val Pro Phe Gln Val Glu Phe Pro Ala
225 230 235 240
CCT AAG AAT GAG TTG GTC CAG AAG TTC CAA GTC TAT TAC CTG GGG AAT 768
Pro Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Phe Gln Val Tyr Tyr Leu Gly Asn
245 250 255
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22
GTA CCT GTT GCT AAA CCT GTT GGG GTA GAT GTG ATT AAT GGG GCC CTC 816
Val Pro Val Ala Lys Pro Val Gly Val Asp Val Ile Asn Gly Ala Leu
260 265 270
GAG TCA GTC CTG TCC TCC AGC AGC CGT GAA CAA TGG ACC CCA AGT CAT 864
Glu Ser Val Leu Ser Ser Ser Ser Arg Glu Gln Trp Thr Pro Ser His
275 280 285
GTC AGT GTG GCC CCT GCT ACC CTC ACC ATC TTG CAC CAG CAG ACA GAG 912
1~ Val Ser Val Ala Pro Ala Thr Leu Thr Ile Leu His Gln Gln Thr Glu
290 295 300
GCA GTG CTG GGA GAG TGT CGG GTG CGT TTC CTC TCC TTC CTG GCC GTG 960
Ala Val Leu Gly Glu Cys Arg Val Arg Phe Leu Ser Phe Leu Ala Val
305 310 315 320
GGC AGA GAT GTC CAC ACG TTT GCA TTC ATC ATG GCT GCC GGC CCA GCC 1008
Gly Arg Asp Val His Thr Phe Ala Phe Ile Met Ala Ala Gly Pro Ala
325 330 335
TCC TTC TGC TGT CAC ATG TTC TGG TGC GAG CCC AAT GCT GCC AGC CTC 1056
Ser Phe Cys Cys His Met Phe Trp Cys Glu Pro Asn Ala Ala Ser Leu
340 345 350
TCA GAG GCT GTG CAG GCT GCG TGC ATG CTT CGC TAC CAG AAG TGT CTG 1104
Ser Glu Ala Val Gln Ala Ala Cys Met Leu Arg Tyr Gln Lys Cys Leu
355 360 365
GAT GCC CGT TCC CAG GCC TCC ACC TCC TGC CTC CCA GCA CCC CCT GCT 1152
Asp Ala Arg Ser Gln Ala Ser Thr Ser Cys Leu Pro Ala Pro Pro Ala
370 375 380
GAG TCT GTG GCA CGG GGT GTA GGG TGG ACT GTC CGC AGG GGT GTT CAG 1200
Glu Ser Val Ala Arg Gly Val Gly Trp Thr Val Arg Arg Gly Val Gln
385 390 395 400
45
TCG CTG TGG GGC TCC CTG AAG CCC AAA CGG GTG GGG GGC CAT ACC CCA 1248
Ser Leu Trp Gly Ser Leu Lys Pro Lys Arg Val Gly Gly His Thr Pro
405 410 415
TGA AGA AGC CCC ACC TTC CCT CCA CCT' 1275
* Arg Ser Pro Thr Phe Pro Pro Pro
420 425
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCIs: SEQ ID NO: 3:
CA 02268018 1999-04-08
WO 98/21327 PCT/FR96/01775
23
CAAGTCGACC TAGTTCTGCA TCTGCTC 27
S (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQtJENCE:
(A) LONGUEUR
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simp:Le
(D) CONFIGURATION: linéai:ce
(ü ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAAGAATTCA AGAAACAGTA CACATCC
2O (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQ1;.1ENCE:
(A) LONGUEUR:23
(B) TYPE: nucléotide
(c> NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 5:
CTATTCGATG ATGAAGATAC CCC 23
