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LIPASES PANCRÉATIQUES ET/OU COLIPASI~S RECOML31NANTES ET
POLYPEPTIDES DÉRIVES PRODUITS PAR LES PLANTES, LEURS
PROCÉDÉS D'OBTENTION ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet la production par les plantes de lipases
pancréatiques et colipases recombinantes, notamment de la lipase pancréatique
humaine recombinante (LPH) et/ou de la colipase pancréati<lue humaine (COLPI-
I),
de façon combinée ou séparée, et autres dérivés <le ces derniéres possédant
une
activité lipasique ou une activité de cofacteur de lipase le cas échéant,
ainsi que
leurs utilisations, notamment en tant qu'aliments fonctionnels, que
compositions
pharmaceutiques, ou dans des formulàtions enzymatiques à applications agro-
alimentaires ou industrielles.
On connaît dans l'art antérieur te brevet ~~1~0 9300426 qui concerne une
f0 lipase pancréatique de mammifère et ses variantes. La description est basée
sur le
clonage et le séquençage de la lipase pancréatique de cobaye et Ve mode de
production décrit est /'expression dans le champignon filamenteux Aspergillus
oryzae. Cependant aucune indication n'est donnée dans V~~O 9300426 pour
surmonter les particularités et difficultés imprévisibles propres à la
transgénèse et à
une telle production dans les plantes, par exemple dans le tabac, le maïs ou
le
colza.
L'action concertée de la lipase pancréatique et de la colipase permet
l'hydrolyse des graisses dans le duodénum. En effet, le substrat naturel de la
lipase
pancréatique consiste en des triglycérides à chaînes longues dispersés dans la
solution des sels biliaires micellaires. Cependant la fipase est fortement
inhibée par
les sels biliaires. Lorsque la lipase et la colipase sont présentes, cette
inhibition esi
surmontée. Dans l'intestin, le complexe lipase pancréatique-colipase
pancréatique
est formé, catalysé par des acides gras à longues chaines qui augmentent la
liaison
d'un facteur 100. Bien que fa stoechiométrie lipase:colipase soit de l:l, le
ratio de
concentration lipase-colipase est variable selon l'espèce considéré (Erlanson-
Albertson, 1992). Chez le rat, le ratio lipase-colipase est inférieur à 1
(0,48) tandis
que chez l'homme, il en est proche {1,05). Cette observation pourrait
s'expliquer
par le rôle potentiel de la colipase dans la régulation du poids de l'animal
via son
peptide d'activation, l'entérostatine.
La lipase pancréatique humaine (LPH) est une glycoprotéine de 449 acides
aminés (AA) d'une masse moléculaire apparente d'environ 50 kilodaltons (kDa)
synthétisée sous forme d'un précurseur de 465 AA contenant un peptide signal
de
i6 AA à l'extrémité N-terminale (Lowe et al , 19S9). Des lipases (protéines ou
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ADNc) pancréatiques ont été purifiées à partir de tissus ou organes de
mammifères
tels que le cheval, le porc, le lapin, le rat ou le
cobaye. Les séquences en acides aminés présentent entre elles un pourcentage
d'homologie d'au moins 80%, notamment d'au moins 80,6% à environ 84,6
(tableau I). Les séquences nucléotidiques présentent entre elles un
pourcentage
d'homologie d'au moins 79%, notamment d'au moins 79,3 % à environ 87%
(tableau 1).
Tableau 1
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cheval 84,6 87,0
porc 83,7 85,0
lapin 8I,2 82,8
rat 80,6 79,3
Les caractéristiques des lipases pancréatiques sont les suivantes : elles sont
activées par les interfaces lipides-eau (activation interfaciale) ; elles sont
inhibées
par les sels biliaires mais réactivées par la colipase (protéine activatrice)
; elles
n'hydrolysent pas significativement les phospholipides.
La lipase pancréatique (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3)) joue un
rôle clé dans l'absorption des graisses alimentaires par l'hydrolyse des
triglycérides
en diglycérides, puis en monoglycérides et en acides gras libres. L'hydrolyse
des
triglycérides par la lipase pancréatique est inhibée par des concentrations
physiologiques d'acides biliaires. Cette inhibition est surmontée par
l'addition de
colipase qui se fixe à la lipase et aux micelles lipidiques. La structure
tridimensionnelle de la lipase pancréatique humaine a été déterminée par
cristallographie aux rayons X (Winkler et al 1990). Elle a permis d'identifier
le
résidu catalytique Ser 152 appartenant à la triade Asp-His-Ser qui est
chimiquement analogue mais structurellement différente des protéases à sérine.
Ce
site catalytique est couvert. par une boucle de surface, et par conséquent
inaccessible au solvant. L'activation interfaciale, propriété caractéristique
des
enrymes lipolytiques agissant sur des substrats insolubles dans l'eau aux
interfaces
eau-lipide, nécessite probablement une réorientation. La lipase pancréatique
humaine est constituée de deux domaines, un domaine N-terminal comprenant les
résidus 1 à 335, et un domaine C-terminal. Le domaine N-terminal contient le
site
actif, un site de glycosylation (Asn l66), un site de fixation de Cap; , et
probablement un site liant l'héparine intestinale Le domaine C-terminal
contient le
site de liaison de la colipase.
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La colipase pancréatique est sécrétée à partir du pancréas sous forme d'un
précurseur, la procolipase (B~r~str~m et al 1979) Elfe facilite l'hydrolyse
des
lipides interfaciaux catalysée par la lipase pancréatique La colipase
pancréatique,
de masse moléculaire apparente de IOkDa, confère une activité catalytique à la
lipase pancréatique dans les conditions physiologiques (hautes concentrations
en
sels biliaires). La procolipase est constituée de I 12 AA dont 17
correspondent au
peptide signal. Les séquences en acides aminés et nucléotidique, de la
colipase
pancréatique humaine sont connues ( Erlanson et al 1974 et Lowe et al. /990).
Des colipases pancréatiques ont été isolées à partir de mammifères. Par
1o exemple, la colipase pancréatique de lapin présente 82,7% d'homologie de
séquence en AA avec la colipase humaine. L'étude cristallographique de la
structure de la colipase et son interaction avec la lipase pancréatique ont
été
étudiées (Eglof~ et al., 1990 : La surface de la colipase peut étre divisée en
une
partie relativement hydrophile interagissant avec la lipase et une partie plus
ls hydrophobe aux extrémités de boucles protéiques. L'interaction entre la
colipase et
le domaine C-terminal de la lipase est stabilisée par S liaisons hydrogène et
environ
80 contacts de Van der Wraals. Lorsque la boucle de surface (ou le
«couvercle»)
couvrant le site catalytique libère l'accès à celui-ci. ~ liaisons hydrogènes
et
environ 28 contacts de Van der Waals supplémentaires apparaissent, expliquant
la
20 haute affinité apparente en présence d'une interface lipides/eau.
In vitro, dans certaines conditions, on peut mettre en évidence une synergie
d'action entre les lipases gastrique et pancréatique sur l'hydrolyse de
triglycérides à
chaînes longues (Gargouri, Y. en crl., 1989).
On connaît plusieurs situations pathologiques (mucoviscidose, insuffisance
25 pancréatique exocrine) où ies patients sont totalement ou partiellement
dépourvus
de sécrétion pancréatique exocrine et donc des enzymes nécessaires à
l'hydrolyse
des aliments (amylases, lipases, protéases). La non-absorption des graisses au
niveau intestinal, et notamment des triglycérides à longues chaînes, se
traduit par
une augmentation très importante de la stéatorrhée chez ces patients et, en
3o particulier dans les cas de la mucoviscidose, par un ralentissement très
sensible de
la prise de poids chez les jeunes malades. Pour corriV~er cela on administre à
ces
sujets des extraits pancréatiques de porc au moment des repas. L'efficacité
thérapeutique de ces extraits pourrait être nettement améliorée par la
prescription
de LPH Grâce à sa spécificité d'action sur les triglycérides à longues
chaînes).
35 Les cellules de mammifères sont, a priori, plus adaptées à l'expression de
gènes de mammifères. Leur utilisation pose cependant des problèmes de
maturation
des protéines. L'équipement enzymatique qui réalise la maturation post-
traductionnelle est différent d'un tissu, d'un ornane nu d'une espèce à
l'autre. Par
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exemple, il a été rapporté que la maturation post-traductionnelle d'une
protéine
plasmatique peut être différente lorsqu'elle est obtenue à partir du sang
humain ou
bien lorsqu'elle est produite par une cellule recombinante comme les cellules
d'ovaires de hamster chinois ou dans le lait d'un animal transgénique. Par
ailleurs,
les faibles niveaux d'expression obtenus avec les cellules des mammifères
impliquent la mise en oeuvre de cultures in vitro en très grands volumes à des
coûts élevés. La production de protéines recombinantes dans le lait des
animaux
transgéniques (souris, brebis et vaches) permet de diminuer les coûts de
production
et de surmonter les problèmes de niveau d'expression. Cependant, il reste des
lo problèmes d'éthique et de contaminations virales et subvirales (prions).
Pour ces raisons, la transgénèse de gènes de mammifères dans une cellule
végétale pourrait offrir une voie de production en grandes quantités de
protéines
recombinantes nouvelles, à un coût de production réduit et sans risque de
contaminations virales ou subvirales .
En 1983, plusieurs laboratoires ont découvert qu'il était possible de
transférer
un gène hétérologue dans le génome d'une cellule végétale et de régénérer des
plantes transgéniques à partir de ces cellules génétiquement modifiées. Toutes
les
cellules de la plante possèdent alors le caractère génétiquement modifié qui
est
transmis à la descendance par fécondation sexuée.
2o Grâce à ces travaux, diverses équipes se sont intéressées à la production
de
protéines recombinantes de mammifères dans les cellules végétales ou dans des
plantes transgéniques (Barta c~~ al., 198G). L'un des premiers résultats
vraiment
significatif dans ce domaine a été la production d'anticorps dans les plantes
de
tabac transgéniques.
Pour exprimer une protéine hétérologue dans la gaine, lieu de stockage des
protéines chez les végétaux, l'équipe de Vandekerckhove a fusionné la séquence
codant pour la leu-enképhaline au gène codant pour l'albumine 2S d'Arabidopsis
thaliana. Avec cette construction, des colza transgéniques ont été produits
qui
expriment spécifiquement la leu-enképhaline dans les graines à des niveaux
3o d'expression de l'ordre de 0, i% des protéines totales. En 1990, le gène de
la sérum
albumine humaine a été transféré dans des cellules de tabac et de pomme de
terre.
Quelle que soit l'origine des peptides signaux (humaine ou végétale), des taux
de
sérum albumine humaine de l'ordre de 0,02% des protéines totales ont été
obtenus
dans les feuilles, les tiges et les tubercules de pomme de terre.
D'autres protéines recombinantes de mammifères ont été aussi produites dans
les plantes: l'antigène de surface de l'hépatite B, les interférons, un
anticorps de
souris anti-Slrep~ococcrna mulcnns, agent de la carie, des fragments
d'anticorps anti-
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cellules cancéreuses, un anticorps anti-Herpès, la to~cine du choléra et le
facteur de
croissance de l'épiderme humain (E.G.F).
L'ensemble de ces recherches a permis de montrer que la production de
protéines recombinantes de mammifères dans les cellules vé<,étales est
possible et
que les mécanismes de la synthèse des protéines à partir des séquences d'ADN
sont
similaires chez les cellules animales et fes cellules végétales. De nombreuses
différences existent néanmoins entre les cellules végétales et animales,
notamment
au niveau de la maturation des glycannes poiymannosidiques en glycannes
complexes, ou encore au niveau des sites de clivage des peptides signaux, ne
1o permettant pas ainsi de garantir l'obtention de protéines de mammifères
actives ou
suffisamment actives par transformation de cellules végétales.
Les inventeurs ont découvert que l'utilisation de cellules végétales
transformées par une séquence nucléotidique recombinante appropriée, permet
d'obtenir de la lipase pancréatique, notamment de la LPH, recombinante ou des
protéines ou polypeptides dérivés de ces dernières, présentant une activité
enzymatique suffisante pour être développés dans une application industrielle.
Le but de la présente invention est de fournir un nouveau procédé
d'obtention de lipases pancréatiques recombinantes de mammifères, et plus
particulièrement de LPH, par les plantes, ou de protéines ou polypeptides
dérivés
de ces dernières, présentant une activité enzymatique, et plus
particulièrement une
activité lipasique, telle que lesdites lipases recombinantes, ou leurs
polypeptides
dérivés puissent être utilisés industriellement.
Un autre but de la présente invention est de fournir les outils pour la mise
en
oeuvre d'un tel procédé, notamment de nouvelles séquences nucléotidiques
recombinantes, des cellules de plantes transformées génétiquement, des plantes
ou
parties de plantes (notamment feuilles, tiges, fruits, semences ou graines,
racines)
transformées génétiquement, et des fragments de ces plantes ou parties de
plantes
transformées génétiquement.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles) lipases
3o pancréatiques recombinante(s) de mammifères, notamment la LPH, ou toute
protéine ou polypeptide dérivé, enzymatiquement actifs et tels qu'obtenus à
partir
de cellules de plantes ou de plantes, transformées génétiquement.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions
enzymatiques susceptibles d'ëtre utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre
de
réactions enzymatiques, notamment à l'échelle industrielle.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions
pharmaceutiques, notamment dans le cadre du traitément de pathologies
associées
à un déficit de production de lipase dans l'organisme, telles que la
mucoviscidose
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ainsi que du traitement de pathologies associées à un désordre alimentaire,
telle
que l'obésité.
Un autre but de la présente invention est de fournir de nouveaux carburants,
encore désignés biocarburants, présentant l'avantage d'être moins polluants
que les
carburants dérivés du pétrole, et d'être d'un coût de revient moins élevé.
DESCRIPTION DÉTAILLE DE L'INVENTION:
La présente invention a pour objet. l'utilisation d'une séquence nucléotidique
recombinante contenant, d'une part, un ADNc codant pour une lipase
pancréatique
de mammifères ou pour une protéine ou un polypeptide dérivé, et d'autre part,
les
lo éléments permettant à une cellule végétale de produire la lipase
pancréatique, ou la
protéine ou le polypeptide dérivé, codé par ledit ADNc, notamment un promoteur
et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie
transcriptionnelle des
cellules végétales, pour la transformation de cellules de plantes en vue de
l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir de ces
dernières,
d'une lipase pancréatique recombinante de mammifères, ou d'une protéine ou
polypeptide dérivé.
En particulier, la présente invention a pour opjet l'utilisation d'une
séquence
nucléotidique recombinante contenant, d'une part, un ADNc codant pour toute
lipase pancréatique de mammifères ou pour une protéine ou un polypeptide
dérivé,
à savoir les protéines ou les polypeptides dont les séquences nucléotidiques
codant
pour ces dernières présentent em~rc~ elles un pourcentage d'homologie d'au
moins
environ 75%, notamment d'arr m~inc environ 77% à environ S5%, et dont les
séquences en acides aminés présentent emn'c~ c~lle.s un pourcentage
d'homologie d'au
moins environ 75%, notamment d'nrr nu~irr.~~ environ SO% à environ 90%, et
présentent une activité lipasique de type pancréatique. notamment un ADNc
codant
pour toute lipase pancréatique de mammifères. ou un ADNc codant pour toute
protéine ou polypeptide dérivé des lipases pancréatiques susmentionnées par
addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acides)
aminé(s),
cette protéine ou ce polypeptide dérivé possédant une activité lipasique de
type
3o pancréatique, et, d'autre part, les éléments permettant à une cellule
végétale de
produire fa lipase pancréatique, ou la protéine ou le polypeptide dérivé, codé
par
ledit ADNc, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus
par ta machinerie transcriptionnelle des cellules vé<,étales, pour la
transformation
de cellules de plantes en vue de l'obtention. à partir de ces cellules, ou de
plantes
obtenues à partir de ces dernières, d'une üpase pancréatique recombinante de
mammifères, ou d'une protéine ou polypeptide dérivé.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une
séquence nucléotidique recombinante contenant d'une part, l'ADNc codant pour
la
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LPH (Lowe M.E et al 1989), ou une séquence nucléotidique dérivée de cet ADNc,
notamment par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou
plusieurs)
nucléotide(s), ladite séquence dérivée étant susceptible de coder pour un
polypeptide dont la séquence en acides aminés est identique à celle de la LPH,
ou
S pour un polypeptide dérivé de la LPH par addition et/ou suppression et/ou
substitution d'un (ou plusieurs) acides) aminé(s), ce polypeptide dérivé
présentant
une activité lipase de type pancréatique, et d'autre part, les éléments
permettant à
une celiule végétale de produire le polypeptide codé par ledit ADNc ou par une
séquence dérivée susmentionnée, notamment un promoteur et un terminateur de
1o transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules
végétaies (et
plus particulièrement par les ARN polymérises de ces dernières), pour la
transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces
cellules,
ou des plantes obtenues à partir de ces dernières, de LPH recombinante sous
forme
d'enryme active, ou d'un (ou plusieurs) poiypeptide(s) dérivés) de cette
dernière
15 tells) que définis) ci-dessus.
L'invention concerne aussi une séquence nucléotidique recombinante,
caractérisée en ce qu'elle contient d'une part la séquence codante pour une
lipase
pancréatique ou une protéine ou polypeptide dérivé et d'autre part, les
éléments
permettant à une cellule végétale de produire une lipase pancréatique
pancréatique
20 ou une protéine ou polypeptide dérivé codé par ladite séquence, notamment
un
promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie
transcriptionnelle des cellules végétales,
-une séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient
d'une part la séquence codante pour une colipase ou une protéine ou
polypeptide
25 dérivé et d'autre part, les éléments permettant à une cellule véjétale de
produire
une colipase pancréatique ou une protéine ou polypeptide dérivé codé par
ladite
séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus
par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales,
-et une séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle
3o contient d'une part les séquences codantes pour une lipase pancréatique et
une
colipase ou les protéines ou polypeptides dérivés et d'autre part, les
éléments
permettant à une cellule végétale de produire une lipase pancréatique et une
colipase ou les protéines ou poiypeptides dérivés codés par ladite séquence,
notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la
35 machinerie transcriptionnelle des cellules végétales.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante
telle que décrite ci-dessus, notamment celle contenant à titre d'ADNc, celui
de la
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LPH ou une séquence nucléotidique dérivée de ce dernier telle que définie ci-
dessus.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes selon
(invention contiennent une (ou plusieurs) séquences) codant pour un peptide
responsable de l'adressage des polypeptides recombinants de l'invention (à
savoir
de la LPH recombinante ou des polypeptides dérivés susmentionnés) dans un
compartiment déterminé de la cellule végétale, notamment dans le réticulum
endoplasmique ou dans les vacuoles, ou bien même à l'extérieur de la cellule,
dans
la paroi pectoceliulosique ou dans l'espace extracelluiaire aussi appelé
apoplasme.
lo Parmi les terminateurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour
la
transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention,
on peut
citer le terminateur polyA 35S du viras de la mosaîque du chou-fleur (CaMV),
ou
le terminateur polyA NOS, qui correspond à ia région en 3' non codante du gène
de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Alrnhucnerirrrn urme~facieus souche à
nopaline .
A ce titre, l'invention a pour objet toute séquence nucléotidique
recombinante telle que décrite ci-dessus contenant en aval dudit ADNc ou de sa
séquence dérivée, le terminateur polyA 3SS du CaMV, ou le terminateur pofyA
NOS d'Agr-ohacterirrm Irrme~~rcicm.s.
Parmi les promoteurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour la
transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention,
on peut
citer:
- le promoteur 35S (P35S), ou avanta~euse~rent le promoteur constitutif
double 35S (Pd35S) du CaMV, ces promoteurs permettant l'expression des
polypeptides recombinants de l'invention dans l'ensemble de la plante obtenue
à
partir de cellules transformées selon l'invention, et sont décrits dans
l'article de Kay
et al., 1987,
- le promoteur PCRU du gène de la cniciférine de radis permettant
l'expression des polypeptides recombinants de l'invention uniquement dans les
3o semences (ou graines) de la plante obtenue à partir de cellules
transformées selon
(invention, et décrit dans l'article de Depigny-This e~ nl., 1992,
- les promoteurs PGEA 1 et PGEA6 correspondant à la réâion 5' non codante
des gènes de la protéine de réserve de gaines, GEA 1 et GEA6, respectivement,
d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), et permettant une expression
spécifique dans les graines,
ie promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., 1995),
constitué de la fusion d'une triple répétition d'un élément activateur
transcriptionnel
du promoteur du gène de l'octopine synthase d'A~robacterium tumefaciens, d'un
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élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase
et du promoteur mannopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens,
- le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu
dans le plasmide pAct 1-F4 décrit par McElroy et al. ( I 991 ),
- le promoteur HMGW (High Molecnlar Wc~igl~~ GhNe»i»e) d'orge
(A»derso» O.D. et al, 199),
- le promoteur du gène de yzéine de maïs (Pyzéine) contenu dans le plasmide
py63 décrit dans Reina c~~ al. ( 1990), et permettant l'expression dans
l'albumen des
semences de maïs.
1o A ce titre, l'invention a pour objet toute séquence nucléotidique
recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant en amont dudit ADNc ou de
sa
séquence dérivée, le promoteur constitutif double _~iS (Pd35S) du CaMV, ou le
promoteur PCRU du gène de la cnrciférine de radis, ou les promoteurs PGEA1 ou
PGEA6 d'Arahidopsis thcrlia»a, ou le super-promoteur PSP d'Agrobacterirrm
inmefacie»s, ou le promoteur PAR-IAR du riz, le promoteur HMGW d'orge ou le
promoteur pyzéine du maïs.
Les séquences codant pour un peptide d'adreàsa'=e utilisées dans le cadre de
la présente invention, peuvent être d'origine végétale, humaine ou animale.
Parmi les séquences codant pour un peptide d'adressage d'origine végétale,
on peut citer:
- ia séquence nucléotidique de G9 nucléotides (indiquée dans les exemples qui
suivent) codant pour le prépeptide (peptide signal) de 23 acides aminés de la
sporamine A chez la patate douce, ce peptide si~,;nal permettant l'entrée des
polypeptides recombinants de l'invention dans le système de sécrétion des
cellules
végétales transformées selon l'invention (à savoir principalement dans le
réticulum
endoplasmique),
- la séquence nucléotidique de 42 nucléotides (indiquée dans les exemples qui
suivent) codant pour le propeptide N-terminal d'adressage vacuolaire de 14
acides
aminés de la sporamine A chez la patate douce, permettant l'accumulation des
polypeptides recombinants de l'invention dans les vacuoles des cellules
végétales
transformées selon l'invention,
- la séquence nucléotidique de I I I nucléotides (indiquée dans les exemples
qui suivent) codant pour le prépropeptide de 37 acides aminés de la sporamine
A
' constitué depuis l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale des 23
acides
aminés du peptide signal susmentionné suivis par- les 14 acides aminés du
propeptide susmentionné, ce prépropeptide permettant l'entrée de polypeptides
reeombinants de l'invention dans le système de sécrétion et leur accumulation
dans
les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention,
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WO 98/17807 ~ PCT/FIt97/01862
les trois séquences susmentionnées étant décrites dans les articles de
Murakami et
al., 1986, et Matsuoka et al, 1991,
- le propeptide carboxyterrninal de la lectine d'orbe décrit notamment dans
les articles de Schroeder e~ a/., 1993, et de Bednarek et al, 1991
- et le PRS (Pathogenesis Related Protein, Cornelissen et al. 1986)
permettant la sécrétion.
Parmi les séquences codant pour un peptide d'adressage d'origine humaine ou
animale, on peut citer celle codant pour le peptide signal de la lipase
pancréatique
humaine (LPH) tel que décrit dans Lowe M.E. et al. 1989, ou pour celui de la
lo lipase gastrique de lapin (LGL) tel que décrit dans la demande de brevet
européen
EP 542629, dont la séquence est indiquée dans les exemples qui suivent, ou
pour
celui de 1a üpase gastrique de chien (LGC).
On peut égaiement citer, parmi les séquences codant pour un peptide
d'adressage, celle codant pour les peptides KDEL, SEKDEL et HDEL et
i5 permettant un adressage dans le réticulum endoplasmique.
A ce titre, l'invention a pour objet toute séquence nuciéotidique
recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant une séquence codant pour
tout
ou partie d'un peptide signal tel que celui de la sporamine A de la patate
douce, ou
celui de la LPH, ou de la LGL, ou de la LGC, cette séquence codant pour un
Zo peptide signal étant située, dans ladite séquence nucléotidique
recombinante, en
amont dudit ADNc ou de sa séquence dérivée et en aval du promoteur utilisé, de
telle sorte que le dernier acide aminé C-terminal du peptide signal soit lié
au
premier acide aminé N-terminal du polypeptide codé par ledit ADNc ou sa
séquence dérivée, dans la protéine codée par ladite séquence nucléotidique
25 recombinante.
L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique
recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant une séquence codant pour
tout
ou partie d'un peptide d'adressage vacuolaire, notamment celui de la sporamine
A
de la patate douce, cette séquence codant pour un peptide d'adressage
vacuolaire
3o étant située, dans ladite séquence nucléotidique recombinante, entre la
séquence
codant pour un peptide signal et celle codant pour ledit ADNc ou sa séquence
dérivée, de telle sorte que le premier acide aminé N-terminal du peptide
d'adressage vacuolaire soit lié au dernier acide aminé C-terminal du peptide
sijnal,
et que le dernier acide aminé C-terminal dudit peptide d'adressage soit lié au
3s premier acide aminé N-terminal du polypeptide codé par ledit ADNc ou sa
séquence dérivée, dans la protéine codée par ladite séquence nucléotidique
recombinante.
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L'invention a égaiement pour objet toute séquence nucléotidique
recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant une séquence codant pour
tout
ou partie d'un peptide d'adressage vacuolaire, notamment celui de la lectine
d'orge,
cette séquence codant pour un peptide d'adressage vacuolaire étant située,
dans
ladite séquence nucléotidique recombinante, en aval de la séquence codant pour
ledit ADNc ou sa séquence dérivée, de telle sorte que le premier acide aminé N-
terminal du peptide d'adressage vacuolaire soit lié au dernier acide aminé C-
terminal du polypeptide codé par ledit ADNc ou sa séquence dérivée, dans la
protêine codée par ladite séquence nucléotidique recombinante. .
l0 L'invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques
recombinantes suivantes:
- celle (désignée Pd35S-PS-LPH) contenant dans fe sens 5' ~ 3' le
promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signa) de la
sporamine A, cette dernière étant immédiatement suivie par 1a séquence
nucléotidique codant pour la LPH mature, luis le terminateur polyA 35S du
CaMV,
- celle (désignée Pd3SS-PPS- LPH) contenant dans le sens 5' --~ 3' le
promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le prépropeptide de la
sporamine A, cette dernière étant immédiatement suivie par ia séquence
nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du
CaMV,
- celle (désignée Pd35S-PSLPH- LPH) contenant dans le sens 5' -~ 3' le
promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signal de la LPH
(ou PSLPH) (à savoir pour une séquence constituée des 16 acides aminés décrits
dans Lowe M.E. et al. 1989), cette dernière étant immédiatement suivie par la
séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, luis le terminateur polyA
35S
du CaMV,
- celle (désignée Pd35S-PSLGL- LPH) contenant dans le sens S' -~ 3' le
promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signal de la
lipase
3o gastrique de lapin (ou PSLGL), cette dernière étant immédiatement suivie
par la
séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA
35S
du CaMV,
- celle (désignée Pd35S-PRS- LPH) contenant dans le sens 5' --~ 3' le
promoteur Pd35S du CaMV, la séquence codant pour le peptide signal de la
Pathogenesis Related Protein, cette dernière étant immédiatement suivie par la
séquence nucléotidique codant pour la LPH mature, luis le terminateur poiyA
35S
du CaMV,
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WO 98/17807 A ~r PCT/FR97/01862
- celle (désignée PCRU-PS- LPH) contenant dans le sens 5' -~ 3' le
promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant pour le peptide signal de
la
sporamine A, cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence
nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 3SS du
CaMV,
- celle (désignée PCRU-PPS- LPH) contenant dans le sens 5' -a 3' le
promoteur PCRU de fa cruciférine, la séquence codant pour le prépropeptide de
la
sporamine Ay cette dernière étant immédiatement suivie par la séquence
nucléotidique codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 3SS du
l0 CaMV,
- celle (désignée PCRU- PSLPH - LPH) contenant dans le sens S' --~ 3' le
promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant le peptide signal de la
LPH
(telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par
fADNc
codant pour la LPH mature puis le terminateur polyA 3SS du CaMV,
ts - celle (désignée PCRU- PSLGL - LPH) contenant dans le sens S' --~ 3' le
promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant le peptide signal de la
LGL
(telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par
fADNc
codant pour la LPH mature puis le terminateur poly.A 3SS du CaMV,
- celle (désignée PCRU- PRS- LPH) contenant dans le sens S' -~ 3' le
20 promoteur PCRU de la cruciférine, la séquence codant le peptide signal de
Pathogenesis Related Protein, cette dernière étant immédiatement suivie par
fADNc codant pour la LPH mature puis le terminateur polyA 3SS du CaMV,
- celle (désignée PGEAI- PSLPH - LPH) contenant dans le sens S' ~ 3' le
promoteur PGEA1 d'Ar-nhidr~p.vi.c rhcrlicrrrcr, la séquence codant le peptide
signal de
25 la LPH {telle que décrit ci-dessus}, cette dernière étant immédiatement
suivie par
fADNc codant pour la LPH mature. puis le terminateur polyA 3SS du CaMV,
- celle (désignée PGEA1- PSLGL - LPH) contenant dans le sens S' -~ 3' le
promoteur PGEAI d'Ar~crbidnp.si.s rhulicrrrn, la séquence codant le peptide
signal de
la LGL (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie
par
30 fADNc codant pour la LPH mature, puis le terrninateur polyA 3SS du CaMV,
- celle (désignée PGEA6- PSLPH - LPH) contenant dans le sens S' --~ 3' le
promoteur PGEA6 d'Ar~crhidnpci.s ~frcrliorra, la séquence codant le peptide
signal de
la LPH, cette dernière étant immédiatement suivie par codant pour la LPH
mature
ou son précurseur, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
35 - celle (désignée PGEA6- PSLGL - LPH) contenant dans le sens S' -~ 3' le
promoteur PGEA1 d'Arabidopsi.c rlurliorrcr. la séquence codant le peptide
signal de
la LGL (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie
par
fADNc codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV,
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- celle (désignée PAR-tAR- PSLPH - LPH) contenant dans le sens 5' -~ 3' le
promoteur PAR-IAR du riz, la séquence codant pour le peptide signal de la LPH
(telle que décrite ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par
l'ADNc
codant pour la LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV, ou le
terminateur polyA NOS d'Agrohcrclerirnn mmefcrcien.c,
- celle (désignée PAR-IAR- PSLGL - LPH) contenant dans le sens 5' -a 3' le
promoteur PAR-IAR du riz, la séquence codant pour le peptide signal de la LGL
(telle que décrite ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par
l'ADNc
codant pour ia LPH mature, puis le terminateur polyA 35S du CaMV, ou le
terminateur polyA NOS d'A~~rohac~erium mnuc~~c~cicm.:,
- celle (désignée Pyzéine- PSLPH - LPH) contenant dans le sens 5' -> 3' le
promoteur pyzéine du maïs, la séquence codant pour le peptide signal de la LPH
(telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par
1'ADNc
codant pour la LPH mature, ou son précurseur, puis le terminateur polyA 35S du
CaMV,
- celle (désignée Pyzéine- PSLGL - l_l'I-1) contenant dans le sens 5' -> 3' le
promoteur pyzéine du maïs, la séquence codant heur le peptide signal de la LGL
(telle que décrite ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie par
fADNc
codant pour la LPH mature, ou son précurseur, puis le terminateur polyA 35S du
2o CaMV,
- celle (désignée Pyzéine- PSLPH - LPH -KDEL) contenant dans le sens 5'
-a 3' le promoteur pyzéine du maïs, la séquence codant pour le peptide signal
de la
LPH (telle que décrit ci-dessus), cette dernière étant immédiatement suivie
par
l'ADNc codant pour la LPH mature puis la séquence codant pour le tétrapeptide
KDEL, puis le terminateur polyA 35S du CaMV.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention
contiennent également une séquence nucléotidique utilisable en tant que
marqueur
desdites séquences recombinantes, notamment cour différencier (et ainsi
3o sélectionner) celles des cellules de plantes qui sont transformées par
lesdites
séquences recombinantes de celles qui ne le sont pas.
De préférence, une telle séquence nucléotidique utilisable en tant que
marqueur desdites séquences recombinantes, est choisie parmi les gènes de
résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à la kanamycine.
L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmidique,
contenant une séquence nucléotidique recombinante selon l'invention, insérée
en un
site non essentiel pour sa réplication.
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L'invention concerne également tout hôte cellulaire, notamment toute
bactérie telle que Ayobaclc~rium lnrnc~f~rcie~r.s, transformé par un vecteur
tel que
défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi un procédé d'ohtention de lipase pancréatique
recombiname, ou d'une protéine ou un polypeptide dérivé, caractérisé en ce
qu'il
comprend:
- la transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte
cellulaire selon l'invention, lui-même transformé par un vecteur l'invention,
de
manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante
selon
l0 l'invention
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules
transformées susmentionnées,
- la récupération de la lipase pancréatique recombinante ou de la protéine ou
polypeptide dérivé produit dans lesdites cellules ou plantes transformées
i5 susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une
purification.
Par exemple, ia présente invention a pour objet tout procédé d'obtention
d'une lipase pancréatique humaine, recomhinante sous forme d'enzyme active,
et/ou d'un (ou plusieurs) polypeptide(s) dérivés) de cette dernière, notamment
par
20 addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acides)
aminé(s),
ce {ou ces) polypeptide(s) dérivés) présentant une activité lipasique,
caractérisé en
ce qu'il comprend:
- la transformation de cellules végétales, de manière à intégrer, dans le
génome de ces cellules, une (ou plusieurs) séquence{s) nucléotidique{s)
25 recombinante(s) selon l'invention,
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules
transformées susmentionnées,
- la récupération de la lipase pancréatique humaine recombinante et/ou du
(ou des) polypeptide(s) dérivés) susmentionnés) produit{s) dans lesdites
cellules
30 ou plantes transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie,
le cas
échéant, par une purifccation.
Selon un mode de réalisation du procédé susmentionné de l'invention, la
transformation de cellules végétales peut être réalisée par transfert de la
séquence
nucléotidique recombinante de l'invention dans les protoplastes, notamment
après
35 incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylène glycol (PEG)
en
présence de cations divalents (Caf+).
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par
électroporation.
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La transformation des cellules végétales peut également ëtre réalisée par
utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse,
de
particules métalliques recouvertes de séquences nucléotidiques recombinantes
selon l'invention, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau
cellulaire.
Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la
micro-injection cytoplasmique ou nucléaire.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé
susmentionné de l'invention, les cellules végétales sont transformées par mise
en
présence de ces dernières avec un hôte cellulaire transformé par un vecteur
selon
lo l'invention, tel que décrit ci-dessus, ledit hôte cellulaire étant
susceptible d'infecter
lesdites cellules végétales en pernettant Pinté<~ration dans le génome de ces
dernières, des séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention
initialement
contenues dans le génome du vecteur susmentionné.
Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterirlm
trrmefaciens~, notamment selon les méthodes décrites clans les articles de
Bevan,
1984 et d'An et al., 1986, ou encore A~rnlmovrl'lllll! l'hI_c)~rc'7IC'.s,
notamment selon
la méthode décrite dans l'article de Jouanin ~r cll., 1987.
Parmi les cellules végétales susceptibles d'être transformées dans le cadre de
la présente invention, on peut citer celles du colza, tabac, maïs, pois,
tomate,
2o carotte, blé, orge, pomme de terre, soja, tournesol, laitue, riz et
luzerne.
Selon un mode de réalisation du procédé susmentionné de l'invention, les
cellules végétales transformées selon l'invention, sont cultivées in oi~ro,
notamment
en bioréacteurs, en milieu liquide, ou sous forme immobilisées, ou encore par
culture de racines transformées in vi~rw.
Les milieux des cultures in vilrw susmentionnés sont ensuite récupérés pour
en extraire, et le cas échéant purifier, notamment par chromatographie, la
lipase
pancréatique, notamment la LPH. recombinante et/ou les protéines ou
polypeptide(s) dérivés) définis ci-dessus. produits par lesdites cellules
transformées cultivées in vitro.
3o Seton un mode de réalisâtion préféré du procédé susmentionné d'obtention
de la lipase pancréatique, notamment de la LPH, recombinante et/ou des
protéines
ou polypeptide(s) dérivés) selon l'invention, la transformation de cellules
végétales
est suivie par une étape d'obtention de plantes transformées par mise en
culture
desdites cellules transformées dans un milieu approprié. La lipase
pancréatique,
notamment la LPH, recombinante et/ou le (ou les) protéines ou polypeptide(s)
dérivé(s), produits) dans les cellules des plantes entières ainsi obtenues,
sont
récupérés par extraction réalisée à partir des plantes entières, ou de parties
de ces
plantes (notamment à partir des feuilles ou des ti~_es ou des fruits), ou
encore à
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partir de semences issues de ces plantes, cette extraction étant le cas
échéant suivie
par une étape de purification de la lipase pancréatique, notamment de la LPH,
recombinante et/ou de la protéine ou du (ou des) polypeptide(s) dérivé(s).
Les plantes transformées utilisées pour la récupération de la lipase
pancréatique, notamment de la LPH, recombinante et/ou de la (ou des) protéine
(s)
ou polypeptide(s) dérivés) dans le cadre du procédé susmentionné, sont celles
de
la génération T0, à savoir celles obtenues à partir de culture de cellules
transformées de l'invention sur un milieu approprié, ou avantageusement celles
des
générations suivantes (T1, T2 etc.) obtenues, par exemple par autofécondation
des
to plantes de la génération précédente et dans lesquelles les séquences
nucléotidiques
recombinantes de l'invention se reproduisent selon les lois de Mendel.
L'invention vise plus particulièrement un procédé d'obtention tel que décrit
ci-dessus de la LPH recombinante, caractérisé en ce qu'il comprend:
- la transformation de cellules d'expiants de feuilles d'une plante, par mise
en
présence de ces derniéres avec une souche d'A; rrnhcrccerium lrm~efaciens
transformée par un plasmide tel que décrit ci-dessus contenant ia séquence
nucléotidique recombinante choisie dans la liste suivante : Pd35S-PS-LPH,
Pd35S
PPS-LPH, Pd35S-PSLGL-LPH et PdsSS-fSLfH- LPH susmentionnée, sur un
milieu de culture approprié,
2o - sélection des expiants transformés sur un milieu contenant de la
kanamycine,
- obtention de plantes transformées à partir des expiants transformés
susmentionnés par culture de ces derniers sur des milieux appropriés,
- extraction de la LPH recombinante notamment par broyage des feuilles
etlou des graines et/ou des fruits des plantes transformées susmentionnées
dans un
tampon approprié, centrifugation et récupération du surnageant constituant
l'extrait
végétal à activité enzymatique,
- le cas échéant purification de la LPH recombinante à partir de l'extrait
obtenu lors de l'étape précédente, notamment par chromatographie réalisée à
partir
3t) du surnageant, ce qui conduit à l'obtention de LPH recombinante sous forme
essentiellement pure.
Les cellules végétales transformées dans les procédés décrits ci-dessus sont
avantageusement choisies parmi celles de tabac, colza, maïs, pois, tomate,
carotte,
blé, orge, pomme de terre, soja, tournesol, laitue, riz et luzerne.
L'invention vise plus particulièrement un procédé d'obtention de LPH
recombinante, caractérisé en ce qu'il comprend
- la transformation de cellules de cals de maïs, par bombardement de ces
dernières à l'aide d'un canon à particules, avec des plasmides contenant la
séquence
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nucléotidique recombinante PAR-lAR-PSLPH- LPH et/ou la séquence pyzéine-
PSLGL- LPH et/ou la séquence Pyzéine- PSLPH -LPH-KDEL,
- sélection des cals transformés sur un milieu contenant un agent sélectif tel
que la kanamycine,
- obtention de plantes de maïs transformées à partir des cals transformés
susmentionnés par culture de ces derniers sur des milieux appropriés,
- extraction de la LPH recombinante~, natamment par broyage, dans un
tampon approprié, des semences issues des, plantes transformées
susmentionnées,
centrifugation et récupération du surnageant canstituant l'extrait végétal à
activité
l0 enzymatique,
- le cas échéant, purification de la LPH à partir de l'extrait obtenu lors de
l'étape précédente, notamment par chromato';raphie réalisée à partir du
surnageant,
ce qui conduit à l'obtention de la LPH, sous farine essentiellement pure.
L'invention a également paur objet toute cellule végétale transformée
génétiquement, contenant une (ou plusieurs) séquences) nucléotidique(s)
recombinante(s) selon l'invention, inté~,;rée(s) de tàGon stable dans leur
génome.
L'invention concerne également toute cellule végétale transgénique telle que
décrite ci-dessus, contenant une (ou plusieurs) pratéine(s) ou polypeptide(s)
recombinant(s) selon l'invention, tels que la LfH. ladite cellule végétale
étant
encore désignée cellule végétale à activité enzymatique, et plus
particulièrement à
activité lipasique telle due définie ci-après.
L'invention a également pour objet des semences transformées
génétiquement contenant une (ou plusieur s) séduence(s) nucléotidique(s)
reeombinante(s) telles) que décrites) cndessus, selon l'invention, intégrées)
de
façon stable dans leur génome.
L'invention concerne également les semences transgéniques décrites ci
dessus, et contenant une (ou plusieurs) protéines) ou polypeptide(s)
recombinant(s) selon l'invention, tels que la LPH ~~~.~~«~~r~>n~r»~r~..
lesdites semences
étant encore désignées semences à activité enzymatique, et plus
particulièrement à
activité telle que définie ci-après.
Les semences transformées selon l'invention sont celles récoltées à partir de
plantes transformées génétiquement selon l'invention, ces plantes transformées
étant soit celles de la génération TO susmentionnée et obtenues par mise en
culture
de cellules transformées selon l'invention, soit celles des générations
suivantes (T1,
T2 etc...) obtenues par exemple par autofécondation au par croisement des
plantes
des générations précédentes (comme indiqué ci-dessus).
L'invention a également pour objet les plantes ou parties de plantes
(notamment expiants, tues, feuilles, fruits, racines, semences, pollen,
etc...)
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transformé(e)s génétiquement, caractérisé(e)s en ce qu'elles (ils) contiennent
une
(ou plusieurs) séquences) nucléotidique(s) recombinante(s) selon l'invention,
intégrées) de façon stable dans leur génome.
L'invention concerne également les plantes ou parties de plantes
transgéniques décrits ci-dessus, contenant une (ou plusieurs) protéines) ou
polypeptide(s) recombinant(s) selon l'invention, tels que la LPH, lesdit(e)s
plantes
ou parties de plantes étant encore désigné(e)s plantes ou parties de plantes à
activité enzymatique, et plus particulièrement à activité lipasique telle due
définie
ci-après.
l0 L'invention a plus particulièrement pour objet, les plantes transformées
susmentionnées, telles qu'obtenues par mise en culture de cellules ou de
semences
telles que décrites ci-dessus, selon l'invention.
Les plantes, ou parties de plantes, transformées selon l'invention sont
avantageusement choisis parmi le colza, le tabac, le mais, le pois, la tomate,
la
carotte, le blé, l'orge, la pomme de terre. le soja, le tournesol, le riz, la
laitue, la
luzerne et la betterave, ou les parties de ces plantes.
La présente invention a pour objet tout ewrait végétal à activité enzymatique,
et par exemple à activité lipasique déFmie ci-après, tel qu'obtenu par mise en
oeuvre
de fun des procédés décrits ci-dessus de l'invention, contenant de la lipase
pancréatique recombinante et/ou de la colipase recombinante ou les protéines
ou
polypeptides dérivés.
L'activité lipasique (ou lipolytique) des plantes ou parties de plantes, et
des
extraits végétaux à activité enzymatique de l'invention, peut ëtre mesurée
notamment selon la méthode de Duan R. et al. 1991 utilisant un triglycéride à
chaîne courte (tel que la tributyrine) comme substrat ou par ia méthode de
Egloff
M.P. et al. 1995. L'activité enzymatique est rapportée en unités U, une unité
U
correspondant à la quantité d'enzyme nécessaire pour libérer une pmole
d'acides
gras libres par minute à 37°C dans les conditions optimales de pH.
Les extraits végétaux à activité enzymatique de l'invention sont
avantageusement tels que le pourcentage en poids de polypeptides recombinants
enzymatiquement actifs, représente environ 0.1°~é à 20%, notamment
environ I% à
environ I S%, par rapport au poids total de protéines présentes dans ces
extraits.
L'invention a plus particulièrement pour objet les ewraits végétaux à activité
enzymatique suivants:
- les extraits de feuilles et/ou de fruits el/ou de graines de plantes, tels
qu'obtenus par transformation des cellules d'expiants de ces plantes avec la
sequence Pd35S-PSLPH- LPH, ou la séquence Pd;SS-PS- LPH, ou la séquence
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Pd35S-PPS- LPH, ou la séquence Pd35S-PSLGL- LPH, selon l'un des procédés
décrits ci-dessus, et contenant la LPH recombinante.
- l'extrait de feuilles de tabac, tel qu'obtenu par transformation de cellules
d'expiants de feuilles de tabac avec la séquence Pd_s5S-PS- LPH, ou la
séquence
Pd35S-PPS- LPH, selon le procédé décrit ci-dessus,
- l'extrait de feuilles de tabac, tel qu'obtenu par transformation de cellules
d'expiants de feuilles de tabac avec la séquence Pd35S-PSLGL- LPH ou la
séquence Pd35S-PSLPH- LPH, selon le procédé décrit ci-dessus,
- l'extrait de graines de tabac, tel qu'obtenu par transformation .de cellules
1o d'expiants de feuilles de tabac avec la séquence Pd35S-PS-LPH, ou la
séquence
Pd35S-PPS-LPH, selon le procédé décrit ci-dessus,
- les extraits de jraines de plantes tels qu'obtenus par transformation de
cellules d'expiants de ces plantes avec la séquence PCRU-PS- LPH, ou la
séquence
PCRU-PPS-LPH, ou la séquence PGEAI-PSLGI_- I_PH, ou la séquence PGEA6-
PSLPH - LPH, selon l'un des procédés décrits ci-dessus, et contenant la LPH
recombinante:
- l'extrait de graines de colza, tel qu'obtenu par transformation de cellules
d'expiants de feuilles de colza avec la séquence PCRU-PS-LPH, ou la séquence
PCRU-PPS-LPH, ou la séquence PGEA I- PSLPH -LPI-l, ou la séquence PGEA6-
PSLPH -LPH, selon le procédé décrit ci-dessus.
- les extraits de semences de plantes tels qu'obtenus par transformation de
cellules d'expiants de ces plantes avec la séquence PAR-lAR- PSLPH -LPH et/ou
la séquence . Pyzéine- PSLPH -LPH et/ou la séquence Pyzéine- PSLPH -LPH
KDEL, selon l'un des procédés décrits ci-dessus, et contenant la LPH
recombinante
- l'extrait de semences de maïs, tel qu'obtenu par transformation de cellules
de maïs (notamment de cals de maïs) avec la séquence PAR-IAR- PSLPH -LPH
et/ou la séquence Pyzéine-PSLGL-LPH et/ou la séquence Pyzéine- PSLPH -LPH-
KDEL, selon le procédé décrit ci-dessus.
3o La présente invention a pour objet une lipase pancréatique recombinante ou
protéine ou polypeptide dérivé caractérisé en ce qu'elle est obtenu selon le
procédé
selon l'invention.
La présente invention a notamment pour objet toute lipase pancréatique
recombinante enzymatiquement active, notamment la LPH, ou protéines ou
polypeptides dérivés, notamment par addition et/ou suppression et/ou
substitution
d'un (ou plusieurs) acides) aminé(s), ces pol~~leptides dérivés présentant une
activité lipasique, tels qu'obtenus sous forme essentiellement pure par mise
en
oeuvre d'un des procédés décrits ci-dessus de l'invention, ces procédés
comprenant
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une étape de purification des polypeptides recombinants de l'invention,
notamment
par chromatographie réalisée à partir des extraits enzymatiques décrits ci-
dessus.
Par lipase pancréatique recombinante enzymatiquement active, ou
polypeptides dérivés présentant une activité lipasique, selon l'invention, on
entend
tout polypeptide recombinant susceptible de présenter une activité lipasique
de
type pancréatique par exemple telle que mesurée selon la méthode de Duan ou la
méthode de Egloff.
L'invention concerne plus particulièrement la LPH recombinante telle
qu'obtenue par purification de l'extrait enzymatique de feuilles ou de graines
de
1o tabac, ces feuilles ou graines provenant de plantes de tabac transformées,
elles
mêmes obtenues à partir de cellules de tabac transformées avec la séquence
Pd35S-
PSLGL-LPH ou séquence Pd35S-l'SLPH-LPH selon le procédé décrit ci-dessus,
ladite LPH recombinante présentant une activité lipasique telle que décrite ci-
dessus.
L'invention concerne les anticorps dirigés contre les polypeptides
recombinants de l'invention, et plus particulièrement ceux dirigés contre la
LPH
recombinante selon l'invention.
De tels anticorps peuvent être obtenus par imnmnisation d'un animal avec ces
polypeptides suivie de la récupération des anticorps formés.
2o II va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps
polyclonaux.
Elle s'applique encore à tout anticorps monoclonal produit par tout
hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des
cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés
contre
l'un des polypeptides purifiés de l'invention d'une part, et des cellules d'un
myélome
approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des
anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide susmentionné initialement
mis
en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'invention concerne également l'utilisation de plantes, parties de plantes,
cellules de plantes, ou semences transformés selon l'invention, pour
l'obtention
d'une {ou plusieurs) protéines ou polypeptide(s) recombinant(s) selon
l'invention,
tels que la LPH recombinante, ou ses polypeptides dérivés tels que définis ci-
dessus, notamment par mise en oeuvre d'un des procédés susmentionnés de
l'invention, lesdits polypeptides recombinants étant sous forme
essentiellement pure
ou contenus dans des extraits vé~,étaux à activité enzymatique tels que
définis ci-
dessus.
L'invention concerne notamment
-l'utilisation -de plantes, ou pur~ie.o de plantes selon l'invention et/ou des
extraits de plantes selon l'invention, et/ou de lr~téines ou de polypeptides
ou
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d'association de ceux-ci selon l'invention, pour l'obtention de médicaments
destinés au traitement de pathologies associées à un déficit de production de
lipase
dans l'organisme, telies que la mucoviscidose ou dans le cadre du traitement
de
désordre alimentaire, telle que l'obésité,
-!'utilisation de plantes, ou pnrlic~.s de plantes selon l'invention, et/ou
des
extraits de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides
ou
d'association de ceux-ci selon l'invention, pour l'obtention d'aliments
destinés à
l'alimentation hrrnraine orr curinurle, notamment d'aliments fonctionnels plus
particulièrement destinés à faciliter l'absorption des graisses animales ou
végétales
lo ingérées par un individu sain ou atteint d'une ou plusieurs pathologies
affectant ou
non le taux de production de lipase gastrique et/ou pancréatique,
-et l'utilisation de plantes, onr harlic~.c de plantes selon l'invention,
et/ou des
extraits de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides
ou
d'association de ceux-ci selon l'invention, pour la mise en oeuvre de
réactions
enzymatiques dans le domaine industriel, agro-alimentaire ou agro-
industrielle,
notamment dans l'industrie des corps gras, de la lipochimie et !'industrie
laitière.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation en tant qu'aliments
des
plantes, ou parties de plantes. notamment des feuilles, des fniits, des
semences à
activité enzymatique selon l'invention.
2o A ce titre l'invention a plus particulièrement pour objet tout aliment
fonctionnel constitué d'une plante à activité enzymatique telle que décrite ci-
dessus,
ou de parties de cette plante, notamment de feuilles ou fruits ou encore de
semences issues de cette dernière, et susceptibles) de présenter un caractère
comestible chez l'Homme, ou l'animal.
L'invention vise également tout aliment fonctionnel contenant une (ou
plusieurs) plantes) à activité enzymatique telles) que décrites) ci-dessus,
et/ou
des parties de cette (ces) plante(s), notamment des feuilles et/ou des
semences
et/ou des fruits de cette (ces) plante(s), et/ou un (ou plusieurs) extraits)
végétal
(végétaux) à activité enzymatique tells) que décrits) ci-dessus, et/ou une (ou
3o plusieurs) protéines ou polypeptide(s) recombinant(s) de l'invention, le
cas échéant
en association avec un (ou plusieurs) autres) composés) comestible(s).
Par exemple, l'invention a plus particulièrement pour objet toute composition
alimentaire susmentionnée contenant de la LPH recombinante obtenue selon
l'invention sous forme essentiellement pure ou partiellement pure ou sous
forme de
plantes et/ou d'extraits enzymatiques tels que décrits ci-dessus
éventuellement
associée à une ou plusieurs autres activités enzymatiques utiles pour la
digestion,
de préférence une activité enzymatique de type amylase, protéase (notamment
trypsine et chymotrypsine et/ou élastase)
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Avantageusement, les plantes ou parties de plantes, contenus dans la
composition alimentaire susmentionnée, se présentent sous forme de broyats.
Les aliments selon l'invention, encore dési';nés aliments fonctionnels, ou les
compositions alimentaires selon l'invention sont plus particulièrement
destinés à
s faciliter l'absorption des graisses animales ou végétales ingérées par un
individu
sain ou atteint d'une ou plusieurs pathologies af~èctant ou non le taux de
production de lipase gastrique et/ou pancréatique. A ce titre, les aliments ou
compositions alimentaires de l'invention, sont avantageusement utilisés en
tant que
compléments nutritionnels.
1o L'invention a également pour objet l'utilisation de plantes, ou de parties
de
plantes, notamment de feuilles et/ou fruits et/ou semences. ou de cellules
végétales
à activité enzymatique selon l'invention, ou d'extraits végétaux à activité
enzymatique tels que définis ci-dessus, ou encore de polypeptides recombinants
selon l'invention, tels que la LPH recombinante, ou ses polypeptides dérivés
tels
15 que définis ci-dessus, pour l'obtention de médicaments (ou compositions
pharmaceutiques) destinés à faciliter l'absorption des graisses animales ou
végétales
ingérées par un individu sain ou atteint d'une ou piwieurs pathologies
affectant ou
non le taux de production de lipase gastrique et/ou pancréatique ou à corriger
un
désordre alimentaire, notamment l'obésité.
2o Notamment, de telles compositions pharmaceutiques sont avantajeusement
utilisées chez les individus subissant un traitement médical altérant le
mécanisme
d'absorption des graisses, ou encore chez les personnes àgées.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont aussi plus
particulièrement destinées au traitement des pathologies liées à
l'insuffisance de
25 lipases (notamment de lipase(s) gastrique et/ou pancréatique) dans
l'organisme, et
plus particulièrement de pathologies telles que la mucoviscidose,
l'insuffisance
pancréatique exocrine, et l'obésité.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition
pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des plantes, ou parties de
3o plantes selon l'invention, etlou des extraits de plantes selon l'invention,
et/ou de
protéines ou de polypeptides ou d'association de ceux-ci selon l'invention, le
cas
échéant en association avec un ou plusieur, véhicules ou excipients
pharmaceutiquement acceptables.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition
35 pharmaceutique susmentionnée contenant de la LPH recombinante sous forme
éssentiellement pure ou sous forme d'extraits enzymatiques tels que décrits ci
dessus.
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Par exemple, l'invention a plus particulièrement pour objet toute composition
pharmaceutique susmentionnée contenant de la LPH recombinante sous forme
essentiellement pure ou partiellement pure ou sous forme d'extraits
enzymatiques
tels que décrits ci-dessus associée à une ou plusieurs autres activités
enzymatiques
utiles pour la digestion, de préférence une activité enzymatique de type
amylase,
protéase (notamment trypsine et chymotrypsine et/ou élastase).
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont de préférence
administrables par voie orale, et se présentent notamment sous forme de
gélules, de
comprimés ou de poudres à diluer.
to La posologie journalière chez l'homme est avantageusement d'environ 200
mg à environ 1000 mg, répartis de préférence au moment des repas principaux,
lorsque lesdites compositions pharmaceutiques contiennent des extraits
enzymatiques tels que décrits ci-dessus, et d'environ 100 mg à environ 500 mg,
lorsque lesdites compositions pharmaceutidues contiennent des polypeptides
~5 recombinants selon l'invention sous forme essentiellement pure.
L'invention a également pour objet l'utilisation de plantes, ou de parties de
plantes, notamment de feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules
végétales
à activité enzymatique selon l'invention, ou d'extraits végétaux à activité
enzymatique tels que définis ci-dessus, ou encore de polypeptides recombinants
20 selon l'invention, tels due la LPH recombinante, ou ses polypeptides
dérivés tels
que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre de réactions enzymatiques dans
le
domaine industriel, afro-alimentaire ou agro-industriel, notamment dans
l'industrie
des corps gras, de la lipochimie et l'industrie laitière.
A ce titre, l'invention concerne tout procédé, notamment de bioconversion
25 enzymatique, ou de biocatalyse, par mise en oeuvre d'une ou plusieurs
réactions
enzymatiques dans le domaine industriel, agro-alimentaire ou agro-industriel,
notamment dans l'industrie des corps gras, de la lipochimie et l'industrie
laitière, ces
réactions enzymatiques étant effectuées au moyen de plantes, ou de parties de
plantes, notamment de feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules
végétales
30 à activité enzymatique selon . l'invention, ôu d'extraits végétaux à
activité
enzymatique tels que définis ci-dessus, ou encore de polypeptides recombinants
selon l'invention, tels que la LPH recombinante, ou ses polypeptides dérivés
tels
que définis ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet des préparations enzymatiques
35 à destination industrielle, agro-alimentaire ou afro-industrielle,
susceptibles d'être
utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-
dessus, et
comprenant des plantes, ~n por~ie.v de plantes selon l'invention, et/ou des
extraits
de plantes selon l'invention, et/ou de protéines ou de polypeptides ou
d'association
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de ceux-ci selon l'invention le cas échéant en association avec un (ou
plusieurs)
additi f s) ou autres) enzymes) susceptibles) d'être utilisés) dans le cadre
de
l'application industrielle susmentionnée.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation de plantes, ou de
parties de plantes, notamment de feuilles et/ou fruits etlou semences, ou de
cellules
végétales à activité enzymatique selon l'invention, pour la mise en oeuvre, à
l'échelle industrielle, de réactions de bioconversions enzymatiques, ou de
biocatalyses, telles que hydrolyses, ou trans-estérifications enzymatiques.
Avantageusement, les plantes à activité enzymatique, ou parties de ces
1o plantes, notamment les feuilles et/ou fruits et/ou semences, ou de cellules
végétales, selon l'invention, sont utilisées à la fois en tant que source
enzymatique
et substrat réactionnel.
L'invention a également pour objet tout procédé de biocatalyse utilisant des
plantes, ou parties de plantes, notamment des feuilles et/ou fmits etlou
semences,
ou de cellules ve~~élale~.s à activité enzymatique selon l'invention, et plus
particulièrement des plantes contenant la LPH. lesdites plantes, ou parties de
plantes, étant utilisées à la fois en tant que source enzymatique et substrat
réactionnel.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation des plantes à
activité
enzymatique, ou de parties de ces plantes, selon l'invention, pour l'obtention
de
biocarburants.
A ce titre, la présente invention a pour objet tout procédé d'obtention de
biocarburant par addition d'alcool, notamment de méthanol ou d'éthanol, à un
broyat de tout ou partie de plantes transformées selon l'invention,
avantageusement
à un broyat de jraines de colza, de tournesol ou de soja, transformées selon
l'invention, et récupération de biocarburant, notamment par filtration.
L'invention concerne également les esters d'acides gras végétaux tels
qu'obtenus par mise en oeuvre du procédé susmentionné, notamment le méthyl
ester d'acide oléique.
L'invention a également pour objet tout biocarburant tel qu'obtenu par mise
en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus, et plus particulièrement tout
biocarburant susmentionné comprenant des esters d'acides gras végétaux.
L'invention vise plus particulièrement tout biocarburant tel qu'obtenu par
mise en oeuvre du procédé susmentionné à partir de graines de colza, et
comprenant un méthylester d'acide oléique.
L'invention vise également l'utilisation des anticorps susmentionnés dirigés
contre les polypeptides recombinants de l'invention, pour la mise en oeuvre
d'une
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méthode de détection ou de dosage de la LPH dans un échantillon biologique
susceptible de la contenir.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation de ces anticorps pour
la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in wir~~ de pathologies liées à
la
surproduction, ou à l'inverse, à l'insuffisance, voire l'absence de production
de
lipase dans l'organisme.
Cette méthode de diagnostic in vimu, réalisée à partir d'un échantillon
biologique prélevé chez un patient, comprend une étape de mise en présence de
cet
échantillon avec un ou plusieurs anticorps selon l'invention, suivie d'une
étape de
l0 détection des éventuels complexes anticorps-LPH formés lors de l'étape
précédente.
A ce titre l'invention concerne également un kit pour la mise en oeuvre d'une
méthode de détection ou de diagnostic in ni~rm susmentionnée, comprenant:
- des anticorps tels que décrits ci-dessus, avantageusement marqués de
i5 manière radioactive ou enzymatique. ainsi que les réactifs pour la
constitution d'un
milieu propice à ia réalisation de la réaction imm~n~logique entre ces
anticorps et
la LPH,
- les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés
entre ces anticorps et la LPH.
20 L'invention concerne également l'association de l'activité lipasique de
type
pancréatique obtenue selon l'invention avec une activité de type colipase et
l'utilisation du produit de cette association notamment dans le cadre du
traitement
de pathologies associées à un déficit de production de lipase dans
l'organisme,
telles que ia mucoviscidose ou dans le cadre du traitement de désordre
alimentaire,
25 telle que l'obésité.
L'activité de type colipase peut provenir d'extraits de plantes exprimant une
colipase recombinante (par exemple la colipase humaine) ou un dérivé de cette
colipase, un dérivé étant toute protéine ou polypeptide dérivé de la colipase
susmentionnée par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou
plusieurs)
3o acides) aminé(s), cette protéine.ou ce polypeptide dérivé possédant une
activité de
type colipase. Plus particulièrement, l'activité de type colipase peut
provenir d'une
colipase ou d'un dérivé de celle-ci purifié ou partiellement purifié à partir
de
plantes ou d'extraits de plantes exprimant une colipase recombinante (par
exemple
la colipase pancréatique humaine) ou un dérivé de cette colipase. L'activité
de type
35 colipase , par exemple la colipase humaine peut donc ëtre produite à partir
d'une
plante transgènique selon les méthodes décrites ci-dessus pour la production
de la
lipase pancréatique. La colipase peut notamment ëtre co-exprimée dans la même
plante transgénique que la lipase pancréatique. Flle peut également être
exprimée
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dans une plante différente et associée ensuite. L'activité de type colipase
peut
également provenir d'extraits d'origine animale.
L'invention concerne donc également, le cas échéant de façon analogue à ce
qui est décrit pour l'activité lipase pancréatique selon l'invention
l'utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant, d'une part,
un ADNc codant pour une colipase de mam~niféres ou pour une protéine ou un
polypeptide dérivé, et d'autre pan, les éléments permettant à une cellule
végétale
de produire la colipase, ou la protéine ou le pol~~peptide dérivé, codé par
ledit
ADNc, notamment un promoteur et un terminateur cie transcription reconnus par
la
1o machinerie transcriptionnelle des cellules végétales, pour la
transformation de
cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de
plantes
obtenues à partir de ces dernières, d'une colipase recombinante de mammifères,
ou
d'une protéine ou polypeptide dérivé,
l'utilisation des séquences pour la co-transformation de cellules de plantes
en
vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou de plantes obtenues à partir
de ces
dernières, d'une lipase pancréatidue et d'une co-lipase recombinantes de
mammifères, ou de leur dérivés,
- la séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'eue contient
d'une part la séquence codante pour une colipase ou une protéine ou
polypeptide
2o dérivé et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de
produire
une colipase pancréatique ou une protéine ou polypepticle dérivé codé par
ladite
séquence, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus
par la machinerie transcriptionnelle des cellules vé~,;étales,
- ia séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient
d'une part les séquences codantes pour une lipase pancréatique et une colipase
ou
les protéines ou polypeptides dérivés et d'autre part, les éléments permettant
à une
cellule végétale de produire une lipase pancréatique et une colipase ou les
protéines
ou polypeptides dérivés codés par ladite séquence, notamment un promoteur et
un
terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des
3o cellules végétales.
-un vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique telle
que définie ci-dessus, insérée en un site non essentiel pour sa réplication
-un hôte cellulaire, notamment toute bactérie telle que Agrobacterium
tumefaciens, transformé par un vecteur tel que défini ci-dessus,
-un procédé d'obtention de colipase recombinante, ou d'une protéine ou un
polypeptide dérivé, caractérisé en ce qu'il comprend:
- 1a transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte
cellulaire selon l'invention, lui-même transformé par un vecteur selon
l'invention,
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de manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante
selon l'invention
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules
transformées susmentionnées,
- la récupération de la colipase recombinante ou de la protéine ou
polypeptide dérivé produit dans lesdites cellules ou plantes transformées
susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas échéant, par une
purification.
-un procédé de co-obtention de lipase pancréatique et de colipase
l0 recombinantes, ou de protéine ou polypeptides dérivés, caractérisé en ce
qu'il
comprend:
- la transformation de cellules végétales, notamment à l'aide d'un hôte
cellulaire selon l'invention, lui-même transformé par un vecteur selon
l'invention,
de manière à intégrer dans le génome de ces cellules une séquence recombinante
selon l'invention
- le cas échéant, l'obtention de plantes transformées à partir des cellules
transformées susmentionnées,
- la récupération de la lipase pancréatique et de la colipase recombinantes ou
des protéines ou polypeptides dérivés produit dans lesdites cellules ou
plantes
2o transformées susmentionnées, notamment par extraction, suivie, le cas
échéant, par
une purification.
-les plantes, onr /~nrlic~.c de plantes, rr~mrrurrrc~rN .~nrillc~.~~ c~I:wrr
frrrils etlon
semences ellnrr cellules de plantes, transformés génétiquement, caractérisés
en ce
qu'elles contiennent une (ou plusieurs) séquences) nucléotidique(s)
recombinante(s) selon l'invention, intégrées) de façon stable dans leur génome
ces
plantes étant choisies notamment parmi le colza, le tabac, le maïs, le pois,
la
tomate, la carotte, le blé, l'orge, la pomme de terre, le soja, le tournesol,
la laitue, le
riz; la luzerne, er la bellernvc~.
-la colipase recombinante ou protéine ou polypeptide dérivé caractérisé en ce
3o qu'elle est obtenue selon l'invention.
-l'association de lipase pancréatique et de colipase recombinantes ou
protéine ou polypeptide dérivés caractérisé en ce qu'elle est obtenu selon le
procédé de l'invention,
-l'extrait végétal à activité enzymatique tel qu'obtenu par mise en oeuvre
d'un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il contient de la lipase
pancréatique recombinante et/ou de la colipase recombinante ou les protéines
ou
polypeptides dérivés,
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- les compositions pharmaceutiques, caractérisée en ce qu'elles comprennent
une activité de type colipase pancréatique (par exemple la colipase
pancréatique
humaine), ou de ses dérivés, éventuellement associée à une activité de type
lipase
pancréatique (par exemple LPH), le cas échéant en association avec un véhicule
pharmaceutiquement acceptable.
- le procédé, notamment de bioconversion enzymatique, ou de biocatalyse,
par mise en oeuvre d'une ou plusieurs réactions enzymatiques dans le domaine
industriel, afro-alimentaire ou agro-industriel, notamment dans l'industrie
des
corps gras, de la lipochimie et l'industrie laitière, ces réactions
enzymatiques étant
effectuées au moyen de plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles
et/ou
fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement,
selon
l'invention, d'une activité de type colipase pancréatique (par exemple la
colipase
pancréatique humaine), ou des polypeptides dérivés éventuellement associée à
une
activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH),
- les préparations enzymatiques à destination industrielle, agro-alimentaire
ou
agro-industrielle comprenant un (ou I)ILI~IeIIrS~ extraits} végétal (végétaux)
à
activité enzymatique selon l'invention, et/ou une colipase pancréatique
purifiée ou
partiellement purifiée (par exemple la colipase pancréatique humaine), ou des
polypeptides dérivés éventuellement associée à une activité de type üpase
pancréatique (par exemple LPH),
- l'utilisation de plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et/ou
fruits
et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement, selon
l'invention et exprimant une activité de type colilaase pancréatique (par
exemple la
colipase pancréatique humaine), ou des polypeptides dérivés éventuellement
associée à une activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH), pour la
mise
en oeuvre, à l'échelle industrielle, de réactions de bioconversions
enzymatiques, ou
de biocatalyses, telles que hydrolyses, ou trans-estérifications enzymatiques,
- le procédé de biocatalyse utilisant des plantes, ou parties de plantes,
notamment feuilles et/ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes,
transformés génétiquement, selon l'invention. lesdites plantes, ou fragments,
ou
cellules, ou semences, étant utilisées à la fois en tant que source d'une
activité de
type colipase pancréatique (par exemple la colipase pancréatique humaine
éventuellement associée à une activité de type lipase pancréatique (par
exemple
LPI3) et substrat réactionnel.
- l'utilisation de plantes, ou parties de plantes, notamment feuilles et/ou
fruits
et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement, selon
l'invention et exprimant une activité de type colipase pancréatique (par
exemple la
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cotrpase pancreatrque humaine éventuellement associée a une actrvrte ae type
trpase
pancréatique (par exemple LPH), pour l'obtention de biocarburants.
- le procédé d'obtention de biocarburant par addition d'alcool, notamment de
méthanol ou d'éthanol, à un broyas de tout ou partie de plantes, transformées
génétiquement selon la l'invention et/ou d'une activité de type colipase
pancréatique (par exemple la colipase pancréatique humaine) éventuellement
associée à une activité de type lipase pancréatique (par exemple LPH), et
récupération de biocarburant, notamment par filtration.
EXEMPLES
lo I. CONSTRUCT10N DE GENES CH1MERIQUES CODANT LA LIPASE
PANCRÉATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (LPH) ET PERMETTANT
UNE EXPRESSION DANS LES FEUILLES ET GRAINES DE SOLANACEES.
LI. CONSTRUCTION DE GENES CHIMÉRIQUES CODANT LA
LPH RECOMB1NANTE ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LE
TABAC
L'expression dans les feuilles et les graines de ubac du gène codant pour la
lipase pancréatique humaine (LPH) a nécessité les séquences régulatrices
suivantes:
1. le promoteur constitutif double 35S (Pcl ~sS) du CaMV (virus de la
mosaïque du chou-fleur).
2o Il correspond à une duplication des séquences activant la transcription
situées
en amont de l'élément TATA du promoteur 35S naturel (Kay cu ul., 1987);
2. la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA 355, qui
correspond à la région 3' non codante de fa séquence du virus à ADN
bicaténaire
circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S .
Les constructions des différents plasmides via l'utilisation de techniques
d'ADN recombinani dérivent de pBIOC4. Ce plasmide binaire dérive de pGA492
(An et al, 1986) qui contient entre les bordures droite et gauche; issues du
plasmide pTiT37 d'Agr~ohacle~rirmt ~rrrncyircim.,~, sur son ADN de transfert,
les
séquences suivantes:
3o le promoteur constitutif du gène NOS de la nopaline synthase, la séquence
codante du gène nptIl codant pour la néomycine phosphotransférase II délétée
de
la région des 8 premiers codons dont le codon initiateur méthionine ATG et
fusionnée à la séquence des 14 premiers codons de la séquence codante du gène
nos, la séquence codante du gène nos dépourvue de la région des 14 premiers
codons, ie terminateur nos, une région contenant des sites multiples de
clonage
(encore désiJnée polylinker) (HindII1-Xba1-Sacl-Hpal-Kpn1-CIaI-BgIII)
précédant
1e gène cat codant pour la chloramphénicol et les séquences terminatrices du
gène
6 du plasmide pTiA6 d'Afirnhcrclerirrnr mmyfncic~n.v (Liu e! al., 1993). Pour
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éliminer la quasi-totalité de la séquence codante du gène cat, le plasmide
pGA492 a
été doublement digéré par SacI (site de restriction du polylinker) et par ScaI
(site
de restriction présent dans la séquence du gène cat) puis soumis à l'action de
(enzyme T4 DNA polymérise (New England Biolahs) selon les recommandations
du fabricant. La ligation du plasmide modifié (20 n~.:) a été réalisée dans un
milieu
réactionnel de 10 p1 contenant 1 pl du tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham);
2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les
bactéries Escherichia coli DHSoc rendues préalablement compétentes, ont été
transformées (Hanahan et al., 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus,
l0 sélectionnés sur 12 pg/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de
la lyse
alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction.
Puis,
le site de restriction Hind111 de l'ADN plasmidique du clone retenu a été
modifié en
un site de restriction EcoRI à l'aide d'un adaptateur HindIII-EcoRI
phosphorylé
(Stratagene Clonin~ Systems). Pour réaliser cette modification, 500 ng d'ADN
plasmidique du clone retenu ont été digérés par 1-iindlll, déphosphorylés par
l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Roehrin~,er Mannheim) selon
les
recommandations du fabricant et coprécipités en présence de 1500 ng d'ADN
adaptateur HindIII-EcoRI, 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5
volumes d'éthanol absolu à -SO°C pendant 30 min. .Après centrifugation
à 12000 g
pendant 30 min., l'ADN précipité a été lavé à l'éthanol 70%, séché, repris
dans 8 ltl
d'eau, porté à 65°C pendant 10 min., puis ligué en présence de I p) de
tampon T4
DNA ügase x 10 (Amersham) et ?,â U d'enzyme T~I DNA ligase (Amersham) à
14°C pendant 16 heures. Après inactivation de la T~4 DNA ligase à
65°C pendant
10 min., le mélange réactionnel de ligation a été digéré par EcoRI, purifié
par
2S électrophorèse sur gel d'agarose O,S%, précipité en présence de 1/10 de
volume de
3M acétate de sodium pH 4,S et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C
pendant
min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70%, séché, puis
ligué comme décrit ci-dessus. Les bactéries l:cohc~richia coli DHSac rendues
prëalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN
30 plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur I? yg/ml tétracycline, a
été extrait
selon la méthode de la lyse alcaline et analysé. par digestion enzymatique par
HindIII et EcoRI notamment. Le plasmide binaire résultant, qui ne possède plus
que les 9 derniers codons de la séquence codante du gène cat et dont le site
EcoRI
est unique, a été appelé pBIOC4.
La cassette d'expression, constituée du promoteur Pd35S et du terminateur
polyA 35S, a été isolée à partir du plasmide p.llT 1630. Le plasmide p1IT1630
dérive du plasmide pJITl63 qui dérive lui-méme du plasmide p1IT60 (Guerineau
et
Mullineaux, 1993). Le plasmide pJITl6s possède un codon ATG entre les sites
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HindIII et SaII du polylinker. Pour supprimer cet ATG et obtenir le plasmide
pJIT1630, l'ADN plasmidique pJIT163 a été digéré doublement par HindIII et
SaII, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose O,S%, électroélué,
précipité en
présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes
d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min., centritùgé à 12000 g pendant
30 min.,
lavé à féthanol 70%, séché, soumis à l'action de l'enzyme Klenow (New England
Biolabs) selon les recommandations du fabricant, déprotéinisé par extraction
avec
1 volume de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25:24:1 ) puis I volume
de
chloroforme: alcool isoamylique (24:1), précipité en présence de 1/10 volume
de
lo 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,S volumes d'éthanol absolu à -
80°C pendant
30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70%, séché, et
enfin, ligué en présence de 1 ttl du tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et
2,S
U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les
bactéries
Escherichia coli DHSa rendues préalablement compétentes, ont été transformées
1s (Hanahan, 1953). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur SO
ltg/ml ampicilline a été extrait selon la méthode de la lyse et analysé par
digestion
enzymatique par des enzymes de restriction. Pour isoler la cassette
d'expression
constituée du promoteur Pd3SS et du terminateur polyA 35S (fragment SacI-
XhoI), l'ADN plasmidique du clone pJ IT 16 3~ retenu a été digéré par SacI et
XhoI.
20 Le fragment SacI-XhoI, portant la cassette d'expression a été purifié par
électrophorèse sur gel d'agarose O,S%, électroélué . précipité en présence de
1/10
de volume de 3M acétate de sodium pH 4,S et de 2,s volumes d'éthanol absolu à -
80°C pendant 30 min., centrifu!,é à 13000 ~, pendant _,0 min., lavé à
l'éthanol 70%,
séché, puis soumis à l'action de l'enzyme Muni; Bean Nuclease (New England
25 Biolabs) selon les recommandations du fabricant. Cet insert purifié (200
ng) a été
cloné dans l'ADN plasmidique de pB10C4 (20 n~) digéré par EcoRI, traité par
(enzyme Mung Bean Nuclease et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline
d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du
fabricant.
La réaction de ligation a été effectuée dans 20 Erl en présence de 2 pl de
tampon T4
3o DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 Erl de SO% polyéthylène glycol 8000 et de
S U
d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les
bactéries
Escherichia eoli DHSoe rendues préalablement compétentes, ont été transformées
(Hanahan, 1953). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12
ul/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse et analysé par
digestion
35 enzymatique par des enzymes de restriction. Le plasmide résultant a été
appelé
pBIÖC21.
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La Iipase pancréatique humaine (LPH) est naturellement synthétisée sous
forme d'un précurseur de 465 acides aminés. La protéine mature LPH est
constituée de 449 acides aminés.
L1.1. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE CONTENANT PS-
LPH.
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la LPH a été digéré
afin de supprimer ia séquence codant le peptide signal de la LPH constitué de
16
acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide
signal PS de la sporamine A de patate douce (Murakami e.>> nl., 1986; Matsukoa
et
t0 Nakamura, 1991} de 23 acides aminés (A7C AAA (~('(' 7%(.' AC:A C7C GCT CTC
TTC TTA GCT C7 l' 7CC.' (.'7(..' 7AT C7C.' C.'7(: ('('(' AA7' (:.'(.:A GCC CAT
TCC)
en suivant le protocole d'amplification fCR décrit ci-dessus dans le
paragraphe I.
Après digestion enzymatique, les fi-a~ments d'ADN issus de l'amplification
PCR ont été purifiés par électrophorèse sur ~,el d'agarose 2%, électroélués ,
précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de
2,5 volumes d'éthanol absolu à -SO°C pendant 30 min., centrifugés à
12000 g
pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%. séchés, puis ligués à l'ADN
plasmidique
digéré, purifié par électrophorèse sur gel d'a~arose O,S%, électroélué
(Sambrook et
aL, 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par
l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau ((3oehcinger Mannheim) selon
les
recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée selon le procedé
décrit
dans à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries f,.~'L'I7C'l'leJ7lC! roll
DHSa rendues
préalablement compétentes, ont été transformée, (Hanahan, 1983). L'ADN
plasmidique des clones obtenus, a été extrait selon la méthode de la lyse
alcaline et
analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN
plasmidique de certains clones retenus a été vérifiée par séquençage à l'aide
du kit
de séquençage T7T~'1 commercialisé par Pharmacie selon la méthode des
didésoxynucféotides.
Les séquences du PS et de LPH mature ont été clonées en maintenant leurs
phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences du PS et
de
LPH mature est Sec-Lys. A partir du plasmide résultant, le fragment portant la
séquence de PS-LPH a été isolé par digestion enzymatique, purifié par
électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué , précipité à alcool,
séché. Puis,
ce fragment d'ADN traité a été ligué à l'ADN plasmidique.de pBIOC21 digéré,
traité et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau
(Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation, la
transformation des bactéries E.cchc~ric%ia c«li DHSa rendues préalablement
compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus et la séquence
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nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante PS-LPH ont été
réalisées comme décrit précédemment. L'ADN plasmidique du vecteur binaire a
été
introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Abn-obacterinm
trmrefaciens selon le procédé de Holsters cml. ( 197S).
L1.2. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE CONTENANT PPS-
LPH.
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la LPH a été digéré
afin de supprimer la séquence codant le peptide signal de la LPH constitué de
16
acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide
1o signal PPS de la sporamine A de patate douce (Murakami cl ol., 1986;
Matsukoa
et Nakamura, 1991) de 37 acides aminés (ATG ,4:9:4 G(.'(' T'l(' ACA CTC GCT
CTC TTC TTA GCT C'7%' 7(:.'(' C'7(' 7A7' (.'l(' ('7(~ ('(.'(' AAT C.'CA GCC
CAT
TCCAGG TTCAATC(,CA7('(.'(:(.'(.'7('('('(.'A('('A(:'A C.'A(.'GAA CCCGCC)
en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le
paragraphe I.
Les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR om été traités de façon
similaire à celle décrite en I. I .1.
Les séquences du PPS et de LPH mature ont été clonées en maintenant leurs
phases de lecture ouvertes. La séquence de cliva!,e entre les deux séquences
est
Ala-Lys. Le plasmide résultant est traité comme décrit en I. 1. I.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation
directe dans la souche LBA4404 d'A~,~rnhuwerimn nrmr~«cimro selon le procédé
de
Holsters et al. ( 1978).
L1.3. CONSTRUCTION DU PLASI\41DE BINAIRE CONTENANT
PSLGL-LPH.
La lipase gastrique de lapin est synthétisée sous forme d'un précurseur
composé d'un peptide signal de 22 acides aminés. situé à l'extrémité NH2-
terminale
et précédant la séquence polypeptidique de la lipase mature, ie clone pJ0101
contenant fADNc complet codant pour la lipase gastrique de lapin est décrit
dans
la demande de brevet européen EP542629
Le plasmide contenant lé cDNA complet codant pour la LPH a été digéré
afin de supprimer la séquence codant pour le peptide signal de la LPH
constitué de
16 acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le
peptide
signal de la lipase gastrique de lapin constituée ciel 22 acides aminés
suivants:
MWVLFMVAALLSALGTTHGLFG (A7(: 7(~(~ 1~7~(~ ('7%' 7'7CAlG GTG GCA
GCT TTG CTA TCT GC:A C.'7T (~Ga A(w A(.'A (',~7~ GG7~ C7T T'l'T GGA) en
suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe
I.
Les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été traités de façon
similaire à celle décrite en I.1.1.
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Les séquences du PSLGL et de la LPH mature ont été clonées en
maintenant leurs phases de lecture ouvertes (c'est-à-dire, de telle sorte
qu'elles
constituent une phase ouverte de lecture unique). La séquence de clivage entre
les
séquences PSLGL et LPH mature est Gly-Lys. Le plasmide résultant est traité
comme décrit en LA.a.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation
directe dans la souche LBA4404 d'Agnobacleri~rm »nnrfacien.s selon le procédé
de
Holsters et al. (1978).
L1.4. CONSTRUCTION DU PLASMIDE B1NA1RE CONTENANT
lo PSLPH-LPH.
Le plasmide contenant' le cDNA complet codant pour la LPH (465 acides
aminés) comprend le peptide signal PSLPH de IG acides aminés (A7G GTG CCA
CTTTGG ACTCTr ~~C:a Cic Cvc, cvc~ ~~~,A ~;oa c; ta GC:A GGA).
Le fragment d'ADN portant le cDNA complet codant pour la LPH a été
traité de façon similaire à celle décrite en 1.1.1.
La séquence de clivage entre les deux séquences codant pour PSLPH et
LPH est GLy-Lys.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation
directe dans la souche LBA4404 d'A,~~rohowc~rimr mruyfuciem.,~ selon le
procédé de
2o Holsters el al. ( I 978).
L2. CONSTRUCTION DE GENES CHIf~1ERIQUES CODANT POUR
LA LPH RECOMB1NANTE ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS
LA TOMATE.
Les constructions utilisées sont les mêmes que celles citées pour la
transformation jénétique du tabac.
II. CONSTRUCTION DE GENES CH1~IERlQUES CODANT POUR LA
PROTEïNE RECOMBINANTE DE COLIPASE PANCREAT1QUE HUMAINE
(COLPH) ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES FEUILLES ET
GRAINES DE SOLANACEES.
3o IL1. CONSTRUCTION DE GENES CHI~~(ER1QUES CODANT POUR
LA COLPH RECOMBINANTE ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS
LE TABAC
L'expression dans les feuilles et les gaines de tabac du gène codant pour la
colipase pancréatique humaine (COLPH) a nécessité les séquences régulatrices
décrites dans le cas de la lipase pancréatique humaine en l.l.
Le plasmide binaire pBIOC21 décrit en I I . est également utilisé.
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La coüpase pancréatique humaine (COLPH) est naturellement synthétisée
sous forme d'un précurseur de 1 12 acides aminés. La protéine mature COLPH est
constituée de 95 acides aminés.
IL1.1. CONSTRUCTION DU PLAS1~11DE BINAIRE CONTENANT
PSLGL-COLPH.
La lipase gastrique de lapin est synthétisée sous forme d'un précurseur
composé d'un peptide signal de 22 acides aminés, situé à l'extrémité NH2-
terminale
et précédant la séquence polypeptidique de la lipase mature, le clone pJ0101
contenant l'ADNc complet codant pour fa lipase gastrique de lapin est décrit
dans
1o la demande de brevet européen EP542629
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la COLPH a été
digéré afin de supprimer la séquence codant le peptide signal de la COLPH
constitué de 17 acides aminés. Cette séquence a été remplacée par celle codant
pour le peptide signal de la lipase gastrique de lapin constituée des 22
acides
aminés suivants: MWVLFMVAALLSALGTT'hlGl_FG (~17(~ 7(~G G7G C7T rrC
ATG GTG GCA GCT 7%C ('7A 7l.'I' (~( ;4 ('7'7' l ~(~,a ~l (.'7',~C.'A C:A7' GGT
CTT'
TTT GGA) en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le
paragraphe I.
Les fragments d'ADN issus de l'amplificati~o PCR ont été traités de façon
2o similaire à celle décrite en 1. I .1.
Les séquences du PSLGL et de la COLP~I mature ont été clonées en
maintenant leurs phases de lecture ouvertes (c'est-à-dire, de telle sorte
qu'elles
constituent une phase ouverte de lecture unique). I_a séquence de clivage
entre les
séquences PSLGL et COLPN mature est Gly-Ala. Le plasmide résultant est traité
comme décrit en L 1.1.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation
directe dans la souche LBA4404 d'A~~rnhncvemimu nnncyc~cion.v selon le procédé
de
Holsters et al. ( 1978).
II.1.2. CONSTRUCTION DU fLAS>\~IIDE BINAIRE CONTENANT
3o PSCOLPH-COLPH.
Le plasmide contenant le cDNA complet codant pour la COLPH ( 1 I2 acides
aminés) comprend le peptide signal PSCOLPH de 17 acides aminés (ATG GAG
AAGATCCTGATCC7C C7(s C'7'7'(~7<'C;(.'l:(.'Jl' 7('7'(~7C~ GCC TATGCA).
Le fragment d'ADN portant le cDNA complet codant pour la COLPH a été
traité de façon similaire à celle décrite en 1. I .1.
La séquence de clivage entre les deux séquences codant pour PSCOLPH et
COLPH est Ala-Lys.
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L'ADN plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation
directe dans ia souche LBA4404 d'A~,~robuc~crinrn nnuc~fircic~n.~~ selon le
procédé de
Holsters e! al. ( 1978).
III. CONSTRUCTION DE GENES CH1'\1ER1QUES CODANT LA
LIPASE PANCRÉATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (LPH) ET
PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES GRATNES DE COLZA.
IIL1.1. CONSTRUCTION DU PLAS~~IIDE BINAIRE CONTENANT
LE PROMOTEUR PCRU.
La production dans les gaines de colza de la lipase pancréatique humaine
(LPH) a nécessité l'insertion de l'ADNc codant pour la LPH entre les séquences
régulatrices suivantes:
1. le promoteur PCRU correspondant à la ré~_ion S' non codante du gène de
la protéine de réserve de graines, la CRUCIFERIf~E A de radis (Depigny-This et
al., 1992) et permettant une expression spécifique dans les graines:
2. la séquence terminatrice de transcription- terminateur polyA 3SS, qui
correspond à la région 3' non codante de la séquence du viras à ADN
bicaténaire
circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 3SS .
Pour obtenir un plasmide binaire similaire à pBIOC21 mais dont 1e
promoteur Pd3SS a été remplacé par le promoteur PCRU, ie fragment "EcoRI
traité à la Klenow-BamHI", contenant le promoteur PCRU a été isolé à partir du
plasmide pBI221-CRURSP dérivant de pB1221 (commercialisé par Clontech) par
remplacement du promoteur 3SS par ie promoteur PCRU.
Le fragment "EcoRI traité à la Klenow-Baml-11" portant le promoteur PCRU
a été purifié par électrophorèse sur ';el d'aga rose O,S°~é,
électroélué (Sambrook et
al., 1989), soumis à !a précipitation alcoolique, séché et ligué à l'ADN
plasmidique
de p1IT163 (décrit dans le paragraphe 1.), digéré par Kpnl, traité à la T4 DNA
Polymérase (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant, puis
digéré par BamHI, purifié par électrophorèse sur ~_el d'agarose 0,8%,
électroélué
(Sambrook vt al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et
déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer
Mannheim) selon les recommandations du fiabricant. La libation â été réalisée
avec
20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et ?00 ng de fragments d'ADN
"EcoRI traité à la Klenow-BamHI" dans un milieu réactionnel de 20 pl en
présence
de 2 ~tl de tampon T4 DNA ligase x l0 (Amersham), de 2 pl de SO% polyéthylène
glycol 8000 et de S U d'enzyme T4 DNA li~ase (Amersham) à 14°C pendant
16
heures. Les bactéries E.rcher-ichiu cnli DHSa rendues préalablement
compétentes,
ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN lla~midique des clones obtenus,
sélectionnés sur un milieu contenant 50 Ey,/ml d'ampicilline, a été extrait
selon la
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méthode de la lyse et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de
restriction. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC?7.
La cassette d'expression, constituée du promoteur PCRU et du terminateur
polyA 35S a été isolée à partir de pBIOC27 par di~,estion totale XhoI suivie
d'une
digestion partielle EcoRI. Elle a été purifiée par électrophorèse sur gel
d'agarose
0,8%, électroéluée, soumise à la précipitation alcoolique, séchée, . traitée à
la
Klenow (New England Biolabs) selon les reconurandations du fabricant et liguée
à
l'ADN plasmidique de pBIOC4 au site EcoRI traité à la Klenow et déphosphorylé
par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim)
selon
les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 20 ng du
vecteur
déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN XhoI-EcoRI décrits
ci-dessus dans un milieu réactionnel de ?() hl en présence de 2 Itl de tampon
T4
DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 hl de >0% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U
d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les
bactéries
Escherichin coü DHSa rendues préalablement compétentes, ont été transformées
(Hanahan, 1983). L'ADN plasmiclique des clones obtenus, sélectionnés sur un
milieu contenant 12 h~= ml de tétrac~~cline, a été ewrait selon la méthode de
la lyse
alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction
appropriés. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC28.
2o IIL1.2. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE CONTENANT
PSLPH-LPH.
Le fragment portant la séquence PSLI'H-LPI-I a été ligué à l'ADN
plasmidique de pBIOC28 di;Téré, traité et déphosphorylé par l'enzyme
phosphatase
alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du
fabricant.
La ligation, la transformation des bactéries I:.vcherichiu c~li DHSa rendues
préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus
et
ia séquence nucléotidique du tra~,ment codant pour la protéine recombinante
PSLPH-LPH ont été réalisées comme décrit précédemment. L'ADN plasmidique
du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans la souche
LBA4404 d'Afirohcrclerirrr» Imney~rcien.~~ selon le procédé de Holsters e~I
al. (1978).
IV. CONSTRUCTION DE GENES CHIMÉRIQUES CODANT LA
COLIPASE PANCRÉATIQUE RECOMB1NANTE HUMAINE (COLPH) ET
PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES GRAINES DE COLZA.
3~ IV.1.1. CONSTRUCTION DU PLAS1~91DE BINAIRE CONTENANT
PSCOLPH-COLPH SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR PCRU.
Le fragment portant la séquence PSCOLPH-COLPH a été ligué à l'ADN
plasmidique de pBIOC28 digéré, traité et déphosphorylé par l'enzyme
phosphatase
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alcaline d'intestin de veau (Boehrin~er MOannheim) selon les recommandations
du
fabricant.
La tigation, la transformation des bactéries I:.~chc~richicr cnli DHSoe
rendues
préalablement compétentes, !'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus
et
la séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante
PSCOLPH-COLPH ont été réalisées comme décrit précédemment. L'ADN
plasmidique du vecteur binaire a été introduit par transformation directe dans
la
souche LBA4404 d'Al,~rohaclerirmn irrruc~facicm.s selon le procédé de Holsters
et al.
(1978).
1o V. CONSTRUCTION DE GENES CH1~~1ER1QUES CODANT LA
LIPASE PANCREATIQUE RECOMBINANTE HUMAINE (LPH) ET
PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES SE1~1ENCES DE MAIS.
V.1.1. CONSTRUCTION DE PLAS~~11DES CONTENANT PSLPH-
LPH ET PERMETTANT UNE EXPRESSION CONSTITUTIVE DANS LES
1s SEMENCES DE MAIS.
L'expression constitutive dans les semences de maïs de la séquence
nucléotidique animale codant pour la lipase pancréatique humaine (LPH) a
nécessité les séquences régulatrices suivantes
1. un des deux promoteurs permettant une expression constitutive
20 - promoteur active de riz suivi de l'intron active de riz (PAR-IAR) contenu
dans le plasmide pAct l-F4 décrit par McElroy cn ul. ( 199 I ) ;
- promoteur constitutif double 3~S (Pd35S) du CaMV (virus de la mosaïque
du chou-fleur). Il correspond à une duplication des séquences activant la
transcription situées en amont de l'élément TATA du promoteur 35S naturel (Kay
25 et al., 1987);
2. un des deux terminateurs
- la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA 35S, qui
correspond à la région en 3' non codante de la séquence du virus à ADN
bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-Heur produisant le transcrit
355;
30 - la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA NOS, qui
correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du
plasmide Ti d'Agrobactcrirrm 111I7JC',CIC:Itll.v souche à nopaline .
Le plasmide où la séquence codant pour PSLPH-LPH est placée sous
contrôle de PAR-IAR a été obtenu par clonage du fragment portant la séquence
35 codant pour PSLPH-LPH dans pBSll-PAR-IAR-TNOS.
Le fragment portant la séquence collant pour PSLPH-LPH a été isolé par
digestion enzymatique, purifié par éiectrophorèse sur ~ei d'a~arose 0,8%,
électroélué, soumis à la précipitation alcoolique. séché, puis traité. Le
plasmide
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pBSII-PAR-IAR-tNOS a été digéré, purifié, traité et déphosphorylé par l'enzyme
phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations
des fabricants. La ligation, la transformation des bactéries E.schcrichia coli
DHSa
rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones
obtenus et la séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine
recombinante PSLPH-LPH ont été réalisées comme décrit précédemment.
Le plasmide pBSII-PAR-IAR-TNOS résulte du clonage aux sites "Eco0109I
traité à la Klenow et KpnI" de pBSII-TNOS du ti~a~,ment SnaB1-KpnI portant la
séquence correspondant à "PAR-1AR-début de la séquence codante pour le gène
l0 gus" isolé à partir du plasmide pActl-F4. La li«ation, la transformation
des
bactéries Escherichia coli DHSa rendues préalablement compétentes, l'analyse
de
l'ADN plasmidique des clones obtenus ont été réalisées comme décrit
précédemment.
Le plasmide pBSl1-TNOS a été obtenu har clonage au site EcoRV
déphosphorylé de pBSIISK+ commercialisé lar Stratagene, du fragment SacI
EcoRI portant la séquence TNOS isolé à partir de 181121 commercialisé par
Clontech par double digestion enzymatique par Sacl et EcoRV, soumis à une
purification par électrophorèse sur gel d'agarose à ?%, et traité à l'enzyme
T4 DNA
polymérase. La ligation, la transformation des bactéries l:.S'Chel'IChla COII
DHSa
rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones
obtenus ont été réalisées comme décrit précédemment.
Le plasmide où fa séquence codant pur fSLPH-LPH est placée sous
contrôle de Pd35S a été obtenu par clona~,e au.v sites "Kpn1 et BamHI" du
plasmide pBSII-T35S du fragment portant la séquence correspondant à "Pd35S-
PSLPH-LPH" isolé. La ligation, la transformation clos bactéries E.scherichia
coli
DHSa rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'.ADN plasmidique des
clones obtenus ont été réalisées comme décrit précédemment.
Le plasmide pBSII-T35S a été obtenu par clonage au site SpeI traité à la
Klenow, déphosphorylé du plasmide pBSIISK+ commercialisé par Stratagène, du
fragment SmaI-EcoRV portant la séquence T35S isolé à partir de p1IT163 (décrit
ci-dessus) par double digestion enzymatique par Sma1 et EcoRV, soumis à une
purification par électrophorèse sur gel d'agarose à 2%. La ligation, la
transformation des bactéries I~.ccherichim cwli DHSa rendues préalablement
compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus ont été
réalisées
comme décrit précédemment.
V.1.2. CONSTRUCTION DE PLAS>\11DES CONTENANT PSLPH-
LPH ET PSLPH-LPH-KDEL RESPECTtVE~IEi\T ET PERMETTANT UNE
EXPRESSION DANS L'ALBUMEN DES SEMENCES DE MAòS.
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L'expression dans l'albumen des semences de maïs du gène codant pour la
lipase pancréatique humaine (LPH) a nécessité les séquences régulatrices
suivantes
1. le promoteur du gène de zéine de maïs (Pvzéine) contenu dans le plasmide
p63 décrit dans Reina et al., 1990. Le plasmide p6s résulte du clonage de
Pyzéine
aux sites HindIII et XbaI d'un plasmide pUC 18 renfermant, entre ses sites
HindIII
et EcoRI, la cassette d'expression "P35S-gus-TNOS" de pBI221 commercialisé par
Clontech. II permet une expression dans l'albumen des semences de maïs.
2. la séquence terminatrice de transcription. terminateur polyA NOS, qui
lo correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du
plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline .
Le plasmide où la séquence codant pour PSLPH-LPH est placée sous
contrôle du Pyzéine, a été obtenu par clonage dans le plasmide p63 du fragment
portant la séquence codant pour PSLPH-LPH. La li~,ation, la transformation des
bactéries L.sche~richiu culi DHSa_ rendues prcalahlement compétentes,
l'analyse de
l'ADN plasmidique des clones obtenu. ont été réalisées comme décrit
précédemment.
Dans ce plasmide, la séquence codant pour le tétrapeptide KDEL a été
introduite en amont du codon STOP pour permettre un adressage dans le
réticulum
endoplasmique.
VI. CONSTRUCTION DE GENES CHIMÉRIQUES CODANT LA
COLIPASE PANCRÉATIQUE RECOMBINA\TE HUMAINE (COLPH) ET
PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES SE1~4ENCES DE MAIS.
VL1.1. CONSTRUCTION DE f1_.:~SMIDES CONTENANT
PSCOLPH-COLPH ET PER1VIET-GANT UNE E\l'RESSION CONSTITUTIVE
DANS LES SEMENCES DE MAIS.
L'expression constitutive dans les semences de maïs de l'ADNc codant
pour la colipase pancréatique humaine (COI_PI-1) a nécessité les séquences
régulatrices décrites en V.1. f .
3o Le plasmide où ia séquence codant pour PSCOLPH-COLPH est placée sous
contrôle de PAR-IAR a été obtenu par clona~,e du ti-a~,ment portant la
séquence
codant pour PSCOLPH-COLPH dans pBSll-fAR-I.AR-TNOS
Le fragment portant la séquence codant pour l'SCOLPH-COLPH a été isolé
par digestion enzymatique, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 2%,
éiectroélué, soumis à la précipitation alcoolique, séché, puis traité. Le
plasmide
pBSII-PAR-IAR-TNOS a été digéré, purifié, traité et déphosphorylé par l'enzyme
phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations
des fabricants. La ligation, la transformation des lactéries I:.~'G'hel'ICl7la
Coh DHSa
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rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones
obtenus et la séquence nucléotidique du fragment codant pour 1a protéine
recombinante PSCOLPH-COLPH ont été réalisées comme décrit précédemment.
Le plasmide pBSII-PAR-IAR-TNOS utilisé est décrit en V. I .1.
Le plasmide où la séquence codant pour PSCOLPH-COLPH est placée sous
contrôle de Pd35S a été obtenu par clonage aux sites "KpnI et BamHI" du
plasmide pBSII-T35S du fragment portant la séquence correspondant à "Pd35S-
PSLPH-LPH" isolé. La libation, la transformation vies bactéries E.rcherichia
coli
DHSoc rendues préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des
1o clones obtenus ont été réalisées comme décrit précédemment.
Le plasmide pBSII-T35S a été décrit en V. I . I .
VI.1.2. CONSTRUCTION DE P(_ASMIDES CONTENANT
PSCOLPH-COLPH ET PSCOLPH-COLPH-KDEL RESPECTIVEMENT ET
PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS L':11_BUMEN DES SEMENCES
DE MAòS.
L'expression dans l'albumen des semences de maïs de l'ADNc codant pour
la colipase pancréatique humaine (COLPI-I) a nécessité les séquences
régulatrices
décrites en V.1.2.
Le plasmide où la séquence codant pour PSCOLPH-COLPH est placée sous
contrôle du Pyzéine, a été obtenu par clona~,e clans le plasmide p63 du
fragment
portant la séquence codant pour PSCOLfH-C.'ULI'1-I. La li,~ation, la
transformation
des bactéries l~sche~richüi soli DHSCC rendues préalablement compétentes,
l'analyse
de l'ADN plasmidique des clones obtenua ont été réalisées comme décrit
précédemment.
Dans ce plasmide, la séquence codant pour le tétrapeptide KDEL a été
introduite en amont du codon STOP pour permettre un adressage dans le
réticulum
endoplasmique.
VII. CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE BINAIRE COEXPRIMANT
LES GENES CHIMÉRIQUES CODANT LA LIPASE PANCRÉATIQUE
3o HUMAINE (LPH) ET DE 'LA COLIPASE P..\NCREATIQUE HUMAINE
(COLPH) RECOMBINANTES ET PERMETTANT UNE E\'PRESSION DANS
LES FEUILLES ET GRATNES DE SOLANACEES.
VIL 1. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE DE
COEXPRESSION pB10C43.
Le plasmide binaire de coexpression permet une expression de deux gènes
dans le même vecteur binaire.
Le plasmide binaire de coexpression dérive de pB10C21. Ii contient deux
cassettes d'expression constituées chacune d'un promoteur Pd3SS et d'un
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term~nateur polyA 355 mais qui différent par le polylinker séparant fe
promoteur
du terminateur. L'une des cassettes d'expression est celle de pBIOC21 déjà
décrite
en I. L'autre cassette d'expression a été obtenue en remplaçant le polylinker
HindIII-BamHI-Smat-EcoRI de pJITIG3D par un adaptateur HindIII-EcoRI
portant les sites de restriction Pacl, Ascl, Mlul et Hpal. Cet adaptateur a
été
obtenu par renaturation des 2 oligodésoxynucléotides 5' AGC TGA TTA ATT
AAG GCG CGC CAC GCG TTA AC 3' et 5' AAT TGT TAA CGC GTG GCG
CGC CTT AAT TAA TC 3' qui sont complémentaires pour leurs 28 nucléotides 3'
terminaux. Cent moles de chacun de ces deux oligodésoxynucléotides ont été
1o préalablement phosphorylés par action de IOU d'enzyme T4 polynucléotide
kinase
(New England Biolabs) dans un volume réactionnel total de 10 E~I contenant 1
wl de
tampon T4 polynucléotide kinase x 10 (New En gland Biolabs) et de 3 ul d'ATP
(95mM). Les deux mélanges réactionnels ont été incubés à 37°C pendant 1
heure,
puis à 65°C pendant 20 min. lls ont été ensuite rassemblés et leur
volume a été
complété à S00 uf. Après extraction avec un volume de
phénol:chloroforme:alcool
isoamylique (25:24:1) et 1 volume de chloroforme:alcool isoamylique (24:1), 50
~l
de 3M acétate de sodium pH6.0 ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été
incubé à 80°C pendant 10 min;, puis rel?oidi lentement à température
ambiante.
L'ADN a ensuite été précipité en présence de ?,~ volumes d'éthanol absolu à -
80°C
pendant 30 min., centrifugé à 140008 à 4°C pendant I heure, lavé à
féthanol 70%,
centrifugé à 140008 à 4°C pendant 1 U min., séché, repris dans I 0 tel
de H20. Le
fragment d'ADN Hindllt-EcoRl a ensuite été cloné aux sites HindIII-EcoRI de
l'ADN plasmidique pJITIG3D préalablement déphosphorylé par l'enzyme
phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) selon les
recommandations du fabricant. La réaction de libation a été effectuée dans un
volume réactionnel de 20 yl en présence de I U de T4 DNA ligase {Gibco-BRL)
pour une concentration totale d'ADN de S,S nM avec un rapport molaire
vecteur/insert de 1 et de 4 E~I de tampon T4 DNA ligase x 5 (Gibco-BRL) à
25°C
pendant 16 heures. Les bactéries, rendues préalablement compétentes, ont été
3o transformées . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 100
~g /ml
ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par
digestion
enzymatique. Le clone résultant a été appelé pBIOC42. Sa validité a été
vérifiée
par séquençage à l'aide du kit "Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing"
commercialisé par United States Biochemical (USB) selon la méthode des
didésoxynucléotides .Les conditions réactionnelles suivent les indications du
fabricant excepté pour la dénaturation et l'hybridation. Le milieu réactionnel
contenant l'ADN plasmidique (0,5 à I pmoles), l'amorce oligonucléotidique (2
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pmoles), lU% de UM50 et le tampon réactionnel x I (US(i), est incubé à
100°C
pendant 10 min., puis refroidi brutalement à - 80°C dans la carboglace.
A partir de pBIOC42, le fragment codant peur la cassette d'expression
constituée du promoteur Pd3SS et du terminateur poly 3SS a été isolé par
double
digestion par SacI et XhoI. Il a été purifié par électrophorèse sur gel
d'agarose
0,75%, puis soumis à l'action du kit "Geneclean I i" commercialisé par BIO 101
selon les indications du fabricant. La libation a été réalisée dans un volume
réactionnel de 20 ~l en présence de 1 U de T4 DNA ligase (Gibco-BRL) pour une
concentration totale d'ADN de 8,S nM avec un rapport molaire vecteur/insert de
1
l0 et de 4 ul de tampon T4 DNA li~ase x S (Gibco-BRL) à 2S°C pendant 16
heures.
Les bactéries, E. coli DHS ~x rendues préalablement compétentes, ont été
transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 30 wg /
ml
de chloramphénicol, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et
analysé par
digestion enzymatique. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC7S.
A partir de pBIOC75, le ti-agment d'ADN portant la cassette d'expression
constituée du promoteur Pd ~SS et du terminateur polyA 3SS a été isolée par
digestion par Kpnl. I1 a été purifié par électrophorèse sur gel d'a~arose
0,75%, puis
soumis à l'action du kit "Geneclean Il" commercialisé par BIO101 selon les
indications du fabricant. Puis, ce fi~a~ment d'ADN a été ligué à l'ADN
plasmidique
de pBIOC21 digéré par Kpn1 et déphosphoiylé har l'enzyme phosphatase alcaline
d'intestin de veau (New England Biolabs) selon les recommandations du
fabricant.
La ligation a été réalisée dans un volume réactionnel de 20 tel en présence de
1 U
de T4 DNA ligase (Gibco-BRL) pour une concentration totale d'ADN de 8,S nM
avec un rapport molaire vecteur/insert de I et 4 tel de tampon T4 DNA ligase x
S
(Gibco-BRL) à 2S°C pendant f 6 heures. Les bactéries, E. coli DHS a
rendues
préalablement compétentes, ont été transformées . L'ADN plasmidique des clones
obtenus, sélectionnés sur 12 tag /ml de tétracycline. a été extrait selon la
méthode
de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatidue. Le plasmide
résultant a été
appelé pBIOC43.
VII.2. CONSTRUCTION DU PLAS~~IDE BINAIRE COEXPRIMANT
LES GENES CHIMER1QUES CODANT LA L1PASE PANCREATIQUE
HUMAINE (LPH) ET DE LA COLIPASE PANCREATIQUE HUMAINE
(COLPH) RECOMBINANTES
Les ADNc codant pour les séquences "PSLPH-LPH" et "PSCOLPH
3s COLPH" ont été clonées chacune sons contrôle du promoteur constitutif Pd3SS
et
du tecminateur 3SS dans le vecteur de coexpressi~n pB10C43.
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La ligation, la transformation des bactéries ls.vchc~richia coli DHSoc rendues
préalablement compétentes, l'analyse de l'ADN plasmidique des clones obtenus
ont
été réalisées comme décrit précédemment.
VIII. EXEMPLE D'OBTENTION DE PLANTS DE COLZA
TRANSGENIQUES.
Les graines de colza de printemps (Brcrcxicn rurprr.s cv WESTAR ou lignées
Limagrain) sont désinfectées pendant 40 minutes dans une solution de Domestos
(marque déposée) à 15%. Après 4 rinçages à l'eau stérile, les graines sont
mises à
germer, à raison de 20 graines par pot de 7 cm de diamètre et 10 cm de haut,
sur
lo du milieu minéral de Murashige et Skoog (Sigma M 5519) avec 30g/l de
saccharose et solidifié avec de l'a~argel à Sg/l. Ces pots sont placés dans
une
chambre de culture à 26°C avec une photopériode de I6h/Sh et sous une
intensité
lumineuse de l'ordre de 80 p E Ill-~ S-1.
Après 5 jours de germination, les cotylédons sont prélevés stérilement en
coupant chaque pétiole environ I mm au-dessus du noeud cotylédonaire.
Parallèlement une préculture d'AZ~rohac~e~rirrm ~rrmcfaciens souche
LBA4404, contenant les plasmides, à savoir, le plasmide pGAZE dans lequel a
été
inséré la séquence codant pour la lipase pancréatique humaine fusionnée à
celle
codant pour un signai d'adressage (PS, fPS, PSLGL, PSPI-IP) sous contrôle du
promoteur PCRU (ou Pd35S), est réalisée en erlenmeyer de 50 ml, pendant 36 h à
28°C dans 10 ml de milieu bactérien ?YT complémenté avec les
antibiotiques utiles
à la sélection de la souche utilisée.
Cette préculture sert à ensemencer à I % une nouvelle culture bactérienne
effectuée dans les mêmes conditions. Au bout de 14 h la culture est
centrifugée 15
min à 3000 g et les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de
milieu de
germination liquide. Cette suspension est distribuée dans des boîtes de pétri
de 5
cm de diamètre à raison de 5 ml/boïte.
L'extrémité sectionnée du pétiole est immer«ée quelques secondes dans la
solution d'agrobactéries ainsi préparées, puis le pétiole est enfoncé de
quelques
3o millimètres dans le milieu de régénération. Ce milieu a la même composition
de
base que le milieu de germination avec en plus 4 m~= I de benzyl-amino-purine
(BAP), phytohormone favorisant fa néoformation de bourgeons. Dix expiants
(cotylédon avec pétiole) sont mis en culture par boîte de pétri de 9 cm de
diamètre
(Greiner référence 664102).
Après 2 jours de coculture dans les mêmes conditions environnementales que
les germinations, les expiants sont repiqués dans des boïtes phytatray (Sigma,
référence P 1552) contenant le milieu précédent complémenté avec un agent
sélectif: 45 m~/I de sulfate de kanamycine (Sigma, référence K4000) et un
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bactériostatique: mélange de 1/6 (en poids) de sel de potassium d'acide
clawlanique et de 5/6 sel de sodium d'amoxicilline (Augmentin injectable) à
raison
de 600 mg/I.
Deux fois de suite, à 3 semaines d'intervalle, les expiants sont repiqués
stérilement sur du milieu neuf dans les mêmes conditions.
Les bourgeons verts apparus à la fin du deuxième ou du troisième repiquage
sont séparés de l'expiant et mis en culture individuellement dans des pots
transparents de 5 cm de diamètre et de 10 cm de haut contenant un milieu
identique au précédent mais dépourw de BAP. Après 3 semaines de culture la
tige
1o du bourgeon transformé est sectionnée et le bourgeon est repiqué dans un
pot de
milieu frais. Au bout de trois à quatre semaines les racines sont assez
développées
pour permettre l'acclimatation de la plantule dans un phytotron. Les bourgeons
qui
ne sont pas verts ou enracinés sont éliminés. Ces plantules sont alors
transplantées
dans des godets de 7 cm de côté remplis de terreau (nonne NF U44551: 40%
tourbe brune, 30% bruyère tamisée et 30% sable) saturé en eau. Après deux
semaines d'acclimatation en phytotron (température 2 I °C, photopériode
16h/8h et
84% d'humidité relative), les plantules sont rempotées dans des pots de 12 cm
de
diamètre remplis du mëme terreau enrichi en engrais retard Osmocote (marque
déposée), à raison de 4 g/I de terreau puis transportées en serre (classe S2)
régulée
à 18°C, avec deux arrosages quotidien de 2 minutes à l'eau.
Dès l'apparition de fleurs celles-ci sont ensachées (Crispac, référence SM
570y 300 mm*700 mm) de façon à empêcher la fécondation croisée.
Lorsque les siliques sont arrivées à maturité, elles sont récoltées, séchées,
puis battues. Les graines obtenues servent au dosage de l'activité
biochimique. La
sélection de la descendance trans~énique se fait par germination sur un milieu
contenant du sulfate de kanamycine à raison de 100 à 150 mg/l (selon les
génotypes). Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites ci-
dessus à
ceci près que les germinations sont effectuées en tubes de verre avec une
seule
graine par tube. Seules les plantules développant des racines secondaires les
trois
premières semaines sont acclimatées en ph~~totron avant d'être passées en
serre.
IX. EXEMPLE D'OBTENT10N DE PLANTS DE SOLANACEES
TRAM S GÉNIQUE S .
IX.1. OBTENTION DE PLANTS DE TABAC TRANSGENIQUES
Les plants de tabac utilisés pour les expériences de transformation (Nicotiana
tabactmt var. Xanthi NC et PBD6) sont cultivés in >>i~rn sur le milieu de base
de
Murâshige et Skoog (1962) additionné des vitamines de Gamborg et al. (1968,
Sigma référence M0404) de saccharose à 20 g/l et d'agar (Merck) à 8 g/l. Le pH
du milieu est ajusté à 5,8 avec une solution de potasse avant autoclavage à
120°C
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pendant 20 min. Les plantules de tabac sont repiquées par bouture des entre-
noeuds tous les 30 jours sur ce milieu de multiplication MS20.
Toutes les cultures in ailro sont réalisées en enceinte climatisée, dans les
conditions définies ci-dessous:
- intensité lumineuse de 30 pE.m-2.s'1; photopériode de 16h;
- thermopériode de 26°C le jour, 24°C la nuit.
La technique de transformation utilisée est dérivée de celle de Horsch et al.
( 1985).
Une préeulture d'A~,~rvhcrclc~rium ~rrmefcrcicecs souche LBA4404 contenant les
plasmides est réalisée durant 48h à 28°C sous agitation, dans du milieu
LB
additionné des antibiotiques adéquats. La préculture est ensuite diluée au
50ème
dans le même milieu et cultivée dans les mêmes conditions. Après une nuit, la
culture est centrifugée ( 10 min., 3000 ~), les bactéries sont reprises dans
un
volume équivalent de milieu MS 30 (30 ~~/I saccharose) liquide et cette
suspension
est diluée au IOème.
Des expiants d'environ I cm2 sont découpés à partir des feuilles des plantules
décrites ci-dessus. Ils sont ensuite mis au contact de la suspension
bactérienne
pendant lh, puis séchés rapidement sur palier filtre et placés sur un milieu
de
coculture (MS30 solide).
Après 2 jours, les expiants sont transférés en boïtes de Pétri sur le milieu
de
régénération MS30, contenant un ment sélectif; la kanamycine (200 mg/I), un
antibiotique, l'augmentin (400 m~r I) et les hormones nécessaires à
l'induction de
bourgeons (BAP, 1 m« I et ANA, 0, l m~l I). Un repiquage des expiants est
effectué
sur le même milieu après 2 semaines de culture. Après ? semaines
supplémentaires,
les bourgeons sont repiqués en boîtes de Pétri sur le milieu de développement
composé du milieu MS20 additionné de kanam>>cine et d'au~mentin. Après 15
jours, les bourgeons sont repiqués de moitié. L'enracinement prend environ 20
jours, au terme desquels les plantules peuvent étre clonées par bouture
d'entre-
noeuds ou sorties en serre.
IX.2. OBTENTION DE PLANTS DE TOMATE TRANSGENIQUES.
Les graines de tomate cv. UC82B sont stérilisées au Domestos 10% 15 min.
et rincées 3 fois dans de l'eau stérile. Le dernier rinGa~e est effectué
pendant 10
mm. sous agttatton.
Les graines ainsi stérilisées sont mises à germer sur milieu MSSV/2 (milieu
de base de Murashige et Skoog additionné des vitamines de Nitsch (Thomas et
Pratf, 1981), de saccharose à 30 g/l, d'a~ar (Merck) à 8 <v/1, pH5,9, pendant
7 ou 8
jours en chambre climatisée (intensité lumineuse de 30 yE.m-2, s-I,
photopériode
de 16 h/8 h, 26°C).
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La technique de transformation utilisée est dérivée de celle de Fillatti e!
al.
( 1987).
Une préculture d'Agnohcrcicrirrm urnrcJacierr.v souche LBA4404 contenant les
plasmides est réalisée pendant 24 h à 28°C sous agitation dans du
milieu LB
s additionné des antibiotiques adéquats. La préculture est ensuite diluée au
SOème
dans le même milieu et cultivée dans les mêmes conditions pendant une nuit. La
DO à 600 nm est mesurée, les agrobactéries sont centrifugées ( 10 min, 3000 g)
et
repris dans du milieu KCMS liquide (décrit dans la publication de Fillatti et
al.,
1987) de manière à obtenir une DO à 600 nm de 0,8.
1o Des améliorations techniques ont été apportées à certaines étapes du
protocole de Fillatti et al. ( I 98?).
La préculture des explant.s et la coculture sont réalisées comme décrit par
Fillatti et al. (1987) excepté que le milieu KCMS est supplémenté en
acétosyringone (200 mM).
15 Le milieu de lavage 2Z diti~ère par l'addition de céfotaxime à 500 mgll au
lieu
de carbénicilline. Le milieu de développement utilisé est composé du milieu de
base
de Murashige et Skoog (Sigma 1~1SGS99) additionné des vitamines de Nitsch, de
saccharose à 20 g/l, de kanamycine à 50 m« I, d'auymentin à 200 mg/I, d'ANA à
1
mg/1 et de zéatine à 0,5 m~~ I.
2o X. OBTENTION DE PLANTS DE ~~IAIS TRANSGENIQUES.
X.1. OBTENTION ET UTILISATION DE CrIL DE MAIS COMME CIBLE
POUR LA TRANSFORMAT10N GENETIQUE.
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée
(électroporation; Agrohcrc~c~rimn, 1111cr011b1'eS, C1110n a particules),
requiert
25 généralement l'utilisation de cellules indif'tërenciées en divisions
rapides ayant
conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de
cellules
compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs.
Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype HI II ou
(A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (Malze
3o Handbook; (1994) M. Freelin3, V. Walbot Eds.; pp. G65-671). Les cals ainsi
obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze
jours
sur ie milieu d'initiation.
Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant
l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par
Vain et
35 al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent
être
croisées ou autofécondées.
X.2. UTILISATION DU CANON A PARTICULES POUR LA
TRANSFORMATION GENET1QUE DU >\~tAIS
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Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées
cellulaires nécessaires à la transformation : on décrit ici une méthode de
transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés
dans
le génome de la plante. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à
particules; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le
paragraphe
1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm'- ont été disposés, 4 h avant
bombardement, à raison de IG fragments par boite au centre d'un boite de petri
contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de
0,2 M
de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides portant les gènes à introduire
sont
lo purifiés sur colonne Qia~en~, en suivant les instructions du fabricant. Ils
sont
ensuite précipités sur des particules de tun';sten (M 10) en suivant le
protocole
décrit par Klein ( 19s7). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers
les
cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finer
(1992).
Les boites de cals ainsi bombardées sont ensuite sceiiées à l'aide de
Scellofrais0 puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage
a lieu 24 h
après, puis tous les quinze jours pendant ~ mais sur- milieu identique au
milieu
d'initiation additionné d'un ment sclectif dont la nature et la concentration
peuvent
varier selon le gène utilisé (voir paragraphe ~). I_es agents sélectifs
utilisables
consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (Basta~,
Round
up~) ou certains antibiotiques (Hy~romycine, Kanamycine...).
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est
pas inhibée par l'agent sélection, habituellement et majoritairement composés
de
cellules résultant de la division d'une cellule avant intégré dans son
patrimoine
génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence
d'obtention
de tels cals est d'environ 0,8 cal par boite bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à
régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules
non
transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture
contenant l'agent sélectif.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles
peuvent être croisées ou autofécondées.
XI. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE l_A LIPASE PANCREATIQLTE
HUMAINE (LPH) DANS LES PLANTES DE TAF3AC TRANSGENIQUES.
XI.1. PROTOCOLE.
Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles de tabac prélevées
sur des plantes en serre est le suivant: 1 g de feuilles (poids frais} est
broyé dans
l'azote liquide puis à 4°C dans 5 ml de tampon fris-HCI 50mM pH neutre,
additionné d'EDTA 1 mM et de (J-mercaptoéthanol I OmM, de Triton X-100 0,2%
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et de NaCI 50mM. Le broyat total est immédiatement centrifi~gé à 4°C
pendant 15
min à 10000 g.
Pour les graines de tabac, l'extraction est réalisée à partir de 0, I g de
graines
pour 4 ml de tampon.
L'activité lipasique est déterminée à l'aide d'un pH-STAT par la méthode
titrimétrique de Gargouri cu al. ( 1995) dans laquelle le substrat utilisé est
la
tributyrine. L'émulsion de tributyrine (I ml pour 30 ml d'émulsion} est
réalisée au
vortex dans un tampon Tris-HCI 2,SmM pH 8,0, NaCI 25mM, et CaCl2 SmM. Le
dosage consiste à neutraliser l'acide butyrique libéré sous l'action de la
lipase par
lo une solution de soude à un pH de consigne de S,0 et à 37°C. Une
unité lipase
correspond à la quantité d'enzyme qui provoque la libération d'une micromoie
d'acides gras en 1 min. à 37°C et dans les conditions optimales de pH
(8,0).
Sur le surnageant de centrifugation, un dosage des protéines totales solubles
est réalisé.
Un test ELISA en sandwich est également réalisé sur le surnageant de
centrifugation avec des anticorps polyclonaux anti-LPH naturelle.
XL2. EXPRESSION AVEC LES PEPTIDES SIGNAUX VEGETAUX ;
DOSAGES SUR LES FEUILLES ET LES GRAINES DE TABAC
TRANSFORMÉES ; TEST ELISA.
2o En utilisant les méthodes de dosages appropriées connues de l'homme du
métier, l'expression des protéines recombinantes dans les feuilles et les
graines de
tabac transformées est mesurée.
XL3. EXPRESSION AVEC LE l'EPT1DE SIGNAL DE LA LPH ;
DOSAGE DE L'ACTIVITÉ LIPASE SUR LES FEUILLES DE TABAC.
En utilisant les méthodes de dosages appropriées connues de l'homme du
métier, l'expression des protéines recombinantes dans les feuilles et les
graines de
tabac transformées est mesurée.
XII. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE LA LIPASE PANCRÉATIQUE
HUMAINE DANS LES PLANTES DE TOMATE TRANSGENIQUES.
XII.1. PROTOCOLE.
Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles et des fruits de
tomate est similaire à celui décrit pour les feuilles de tabac, excepté que 1
g de
matériel frais est repris dans 4 ml de tampon. L'activité lipasique est
déterminée
comme décrit pour les feuilles de tabac.
XIL2. DOSAGE DANS LES FRUITS DE TOMATE.
L'activité lipasique est déterminée comme décrit pour les feuilles de tabac.
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XIII. ANALYSE DE L'EXPRESS10N DE LA COLIPASE
PANCRÉATIQUE HUMAINE (COLPH) DANS LES PLANTS DE TABAC
TRANSGENIQUES.
XIII.1. PROTOCOLE.
Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles de tabac prélevées
sur des plantes en serre est le suivant: 1 ~ de feuilles (poids frais) est
broyé dans
l'azote liquide puis à 4°C dans 5 ml de tampon Tris-HCI SOmM pH7,5,
additionné
d'EDTA 1mM et de (3-mercaptoéthanol IOmM, de Triton X-100 0,2% et de NaCI
SOmM. Le broyat total est immédiatement centrifugé à 4°C pendant
15 min à
10000 g.
Pour les graines de tabac, l'extraction est réalisée de 0, I g de graines pour
4
ml de tampon.
L'activité lipasique est déterminée ~ /'aide d'un pH-STAT par la méthode de
Patton et crl. ( 197S). L'effet de ia colipase sur le retard de l'hydrolyse de
les
intralipides est déterminé comme suit : les intralipides (0,5 ml) sont dilués
dans 10
ml d'une solution composée de Tris-HCI 2mM pHS,O, NaCI 150mM,
taurodéoxycholate 4mM, CaCh I mM, à 40°C. La colipase est ajoutée, puis
après
1 min., le mélange est supplémenté en lipase pancréatique ( 10-5 M) à raison
de 10
~l.
2o L'activité de la colipase peut égaiement être mesurée selon ia méthode de
Ouaged et al. {1952). La lipase est dénaturée à pl-I ?, ce qui permet
cependant de
conserver ia colipase intacte. L'activité colipase est alors évaluée par la
capacité de
la préparation à restorer l'activité d'une préparation de lipase exempte de
colipase.
Pratiquement, l'échantillon à tester est ajouté au milieu réactionnel,
acidifié à pH 2
avec de l'HCl 1 N, et après une minute, amené à pH 9 avec du NaOH 1 M. Un
aliquot de lipase serai-purifiée d'activité potentielle connue est ajoutée. La
colipase
est mesurée d'après ie niveau d'activité lipase restorée à partir de la lipase
inactive.
XIV. IMMUNODETECTION DE TYPE "V~ESTERN" DE LA LPH
RECOMBINANTE.
3o XIV.1. LPH EXPR1MEE DANS LES FEUILLES ET GRAINES DE
TABAC ET DE COLZA TRANSGENIQUES.
XIV.1.1. EXPRESSION AVEC LES PEPTIDES SIGNAUX
VÉGÉTAUX ; IMMUNODETECTION DANS LES FEUILLES ET GRAINES
DE TABAC ET DE COLZA TRANSFORMÉES.
Des expériences d'immunodétection de type "western" ("western-blots") de
la LPH ont été réalisées sur les protéines de feuilles de tabac et de graines
de tabac
et de colza extraites avec le tampon (voir protocole d'extraction ci-dessus).
Pour la
réalisation de ces expériences, les protéines extraites (30 Erg protéines
totales par
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échantillon) sont tout d'abord séparées selon la taille sur gel de
polyacrylamide
dénaturant à 12,5% puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. On peut
également utiliser des gels dénaturants (urée) et séparer sur d'autres
critères que la
taille. Un anticorps polyclonal anti-lipase pancréatique humaine est utilisé
comme
sonde et la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps asti-IjG
approprié
couplé à la phosphatase alcaline.
La protéine témoin est la lipase pancréatique humaine naturelle qui migre
sous la forme d'une seule bande d'une masse moléculaire apparente d'environ 50
kDa.
1o Aucune bande n'est détectée dans les extraits protéiques de feuilles et de
graines de tabac et de colza non transformées.
XIV.1.2. EXPRESSION AVEC LE fEf'fIDE SIGNAL DE LA LPH ;
IMMUNODETECTION DANS LES FEUILLES E-f LES GRAINES DE TABAC
TRANSFORMÉES.
Des Western blots ont été réalisés sur les protéines de feuilles et de graines
de tabac extraites selon le protocole décrit précédemment. Les protéines
extraites
sont tout d'abord séparées sur bel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE)
puis
transférées sur une membrane de nitrocellulose. Un anticorps polyclonal anti-
LPH
est utilisé comme sonde et la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps
2o approprié couplé à la phosphatase alcaline.
La protéine témoin est la lipase pancréatique humaine qui mire sous la
forme d'une seule bande de masse moléculaire apparente d'environ SO kDa.
Aucune
bande n'est détectée dans les extraits protéiques de feuilles de tabac non
transformées (T).
XIV.1.3. LPH DANS UN EXTRAIT CONTENANT DES PROTÉINES
DE FEUILLES DE TABAC TRANSFORMÉES: EXPÉRIENCE DE
DEGLYCOSYLATION.
Le protocole d'extraction des protéines pour les expériences de
déglycosylation est le suivant: 0,5 ~ de feuilles (poids frais) sont broyés
dans !'azote
liquide puis à 4°C dans I ml~ de tampon de dénaturation (tampon
phosphate
100mM pH7,5, additionné de (3-mercaptoéthanol 1%, d'EDTA 25mM et de SDS
1%). Le broyat est centrifugé à 4°C pendant I s min à 100008. Le
surnageant est
incubé durant S min à 100°C afin de réaliser la dénaturation des
protéines puis
centrifugé 2 min à 10000 ~. Le surnageant est ensuite dilué au IOème dans le
tampon de déglycosylation (tampon phosphate 100mM pH7,5, additionné de /3-
mercaptoéthanol 1%, d'EDTA 25mM, de SDS 0.1% et d'octyl~lucoside 1%).
L'enzyme (N-glycosidase F, PNGase Boehringer) est ajoutée à raison de 1 U pour
100 pi de surnageant. Un témoin sans enzyme est réalisé pour chaque
échantillon.
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La déglycosylation de la protéine témoin (lipase pancréatique humaine) a lieu
dans
les mêmes conditions. Les difi~érents échantillons protéiques sont incubés à
température ambiante durant 8 heures. Les protéines sont ensuite séparées par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide et transférées sur membrane de
nitrocellulose comme décrit dans le paragraphe précédent.
XV. IMMUNODETECTION DE TYPE "WESTERN" DE LA COLPH
RECOMBINANTE.
Des expériences d'immunodétection de type "Western" ("Western-blots")
(Renart et Sandoval, 1984) de la COLPH ont été réalisées sur les protéines de
to feuilles de tabac et de graines de tabac et de colza extraites avec le
tampon (voir
protocole d'extraction ci-dessus). Pour la réalisation de ces expériences, les
protéines extraites (30 Etg protéines totales par échantillon) sont tout
d'abord
séparées sur jel de polyacrylamide dénaturant selon la méthode Tris-tricine
d'Okajima et al. ( 1993) puis transférés sur une membrane de nitrocellulose.
Un
t5 anticorps polyclonal anti-colipase pancréatique humaine est utilisé comme
sonde et
la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps anti-1gG approprié couplé
à la
phosphatase alcaline.
XVI. PURIFICATION DE LA L1PASE PANCRÉATIQUE HUMAINE A
PARTIR DE PLANTES.
2o XVI.1. PURIFICATION DE LA LPH A PARTIR DE FEUILLES DE
TABAC
La lipase pancréatique humaine recombinante est purifiée par
chromatojraphie d'échange d'ions sur colonne DEAE-Fast Flow (Pharmacia)
équilibrée dans du tampon Tris-acétate SOmM pH7,0. La colonne est lavée avec
le
25 même tampon jusqu'à ce que l'absorption ~ 280 nm soit inférieure à DO 0,05.
L'activité enzymatique fixée est éluée à l'aide d'un ,radient linéaire de sel
dans le
même tampon (0 à O,SM NaCI} en utilisant > volumes de colonne. Les fractions
contenant l'activité enzymatique sont rassemblées. Elles sont soumises à une
filtration sur Sephadex G-100.
3o XVII. PURIFICATION DE LA COLIPASE PANCRÉATIQUE HUMAINE
A PARTIR DE PLANTES.
La protéine est purifiée selon les procédés classiques de purification des
protéines bien connus de l'homme du métier.
XVIII. SYNTHESE D'ESTERS D'ACIDES GRAS.
35 Les essais ont été réalisés avec des gaines de colza non transformées, la
lipasé étant apportée:
- soit sous forme de préparation enzymatique immobilisée (lipozyme
(NOVO)) ou libre (lipase pancréatique humaine),
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- soit sous forme de graines de tabac transi~rmées avec te Bene cte Ia Itpase
pancréatique humaine.
Les réactions d'estérification sont conduites à _,7°C pendant 16
heures dans
des flacons de verre bouchés hermétiquement disposés sur une table d'agitation
(250 rpm). Le solvant organique utilisé est l'hexane dans lequel les acides
gras sont
solubles. Le méthanol est ajouté en proportion stoechiométrique à la quantité
théorique de triacylglycérol contenu dans les graines de colza.
Le composant majeur des acides iras de colza est l'acide oléique, aussi le
témoin de référence choisi est-il un ester méthylique de l'acide oléique. Le
suivi de
l0 synthèse se fait par chromatographie couche mince (CCM). Le solvant de
migration est un mélange d'hexane, diéthyléther, eau (70:10:1). La révélation
des
plaques se fait à chaud après pulvérisation d'acide sulfurique (5%) dans de
féthanol.
L'utilisation de la lipase pancréatique recombinante selon l'invention ermet
d'obtenir le produit attendu qui est l'ester de méthyle de l'acide oléique.
XIX. TEST D'ACTIVITÉ DE LA LIPASE PANCRÉATIQUE HUMAINE
Le test d'activité est réalisé à l'aide des réactifs Lipase - PSTMSigma
Diagnostics
(Méthode N°805) selon les recommandations du fabricant. La procédure
est basée sur
la méthode colorimétrique de Imamura et al. (Clin. Chem. 35: 1126, 1989). Le
1,2
diglycéride est hydrolysé en 2-monoglycéride et en acides gras. Le 2-
monoglycéride
est ensuite mesuré par réactions enzymatiques couplées catalysées par la
lipase
monoglycéride, la glycérol kinase, la glycérophosphate oxydase et la
peroxydase. Le
test est hautement sensible et spécifique pour la lipase pancréatique grâce à
la co-
lipase et au désoxycholate utilisés comme activateurs.
2 5 Des mesures ont été réalisées sur les échantillons suivants
- 2 extraits protéiques de feuilles de tabac transformées avec LBA4404
renfermant la plasmide binaire contenant PSLPH-LPH. Les plantes ont été
anlysées
après 3 semaines de sortie en serre.
- 1 extrait protéique de feuille de tabac non transformée (témoin négatif]
- 1 extrait protéique de feuille de tabac non transformée mélangé à de la
lipase
pancréatique humaine purifiée commercialisée par Sigma (référence : L9780) à
500
U/I (reconstruction)
Les valeurs obtenues sont les suivantes
- 270 U/1 pour le témoin négatif
3 5 - 874 U/L pour la reconstruction
- 1113 U/1 pour un des échantillons
- 1572 U/1 pour l'autre échantillon.
Ces résultats mettent en évidence la présence d'une activité lipasique chez
les
deux échantillons.
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