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NOUVELLES CONSTRUCTIONS ET VECTEURS POUR L'EXPRESSION
CIBLEE ET INDUCTIBLE DE GENES
. La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en
particuler le domaine de la régulation de l'expression de gènes. Elle décrit
notamment de nouvelles constructions et de nouveaux vecteurs permettant
une expression ciblée et inductibe de gènes. La présente invention est
utilisable dans de nombreux domaines, et en particulier pour la production de
protéines recombinantes, pour la création de modèles animaux
transgéniques, pour la création de lignées cellulaires, pour la mise au point
de tests de criblage, ou encore en thérapie génique et cellulaire.
La possibilité de contrôler et de diriger l'expression de gènes
constitue un enjeu très important dans le développement des
biotechnologies. In vitro, elle permet d'améliorer les conditions de
production
de protéines recombinantes, en découplant par exernpie la phase de
croissance cellulaire et la phase de production. Toujours in vitro) elle
permet
encore de créer des lignées cellulaires capables de produire certaines
molécules à des périodes choisies. Ainsi, il est envisageable de construire
des lignées cellulaires produisant, de manière régulée, des protéines
transcomplementant des génomes viraux défectifs. Toujours in vitro, un
système d'expression régulé permet la mise au point de tests de criblages de
molécules agissant sur le controle de l'expression de gènes. Le controle de
l'expression de gènes est également très important pour des approches
thérapeutiques ex vivo ou in vivo, dans lesquelles la possibilité de controler
sélectivement la production d'une molécule thérapeutique est essentielle. En
effet, selon les applications, selon le gène à transférer, il est important de
pouvoir cibler certains tissus ou certaines parties seulement d'un organisme
afin de concentrer l'effet thérapeutique et de limiter la dissémination et les
effets secondaires.
' Ce ciblage peut être réalisé en utilisant des vecteurs présentant une
spécificité cellulaire donnée. Une autre approche consiste à utiliser des
signaux d'expression spécifiques de certains types cellulaires. A cet égard,
des promoteurs dits spécifiques ont été décrits dans la littérature, tels que
le
promoteur des gènes codant pour la pyruvate kinase, la villine, la GFAP, le
promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras. le promoteur
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de l'actine a des cellules du muscle lisse, ou le promoteur du gène de
l'albumine humaine par exemple. Cependant, si ces promoteurs présentent
une certaine spécificité tissulaire, ils ne sont pas régulables et de ce fait,
offrent des possibilités de controle limitées. D'autres systèmes, plus
complexes,ont été décrits dans la littérature. Ainsi) la demande W096/01313
décrit un système d'expression de gènes régulé par la tétracycline. De
même, Wang et al. (PNAS 91 (1994) 8180) ont décrit un système
d'expression de gènes régulé par le RU486. Evans et al. Ont quant à eux
décrit un système basé sur le récepteur à f'ecdysone, hormone d'insecte
l0 (PNAS 93 (1996) 3346). Cependant, ces différents systèmes, bien
qu'inductibles, ne présentent pas de spécificité tissulaire. De ce fait, ils
ne
permettent pas à eux seuls de cibler l'expression au niveau d'organes ou de
tissus désirés, mais simplement d'induire ou de réprimer l'expression de
manière ubiquitaire. De plus, le système tétracycline présente un niveau de
régulation relativement faible, inférieur à un facteur cinq. Par ailleurs, ces
systèmes fonctionnent avec des molécules hybrides et nécessitent la
cotransfection de 2 constructions au moins. En outre, ils mettent en oeuvre
des éléments hétérologues et risquent donc de générer des réactions
immunitaires.
L'invention décrit maintenant de nouvelles constructions permettant
l'expression ciblée et régulée de gènes. L'invention décrit en particulier des
vecteurs recombinants permettant une expression de gènes inductible et
hépatospécifique. L'invention décrit également de nouvelles constructions
promotrices ayant des niveaux de régulation améliorés. La présente invention
offre ainsi un moyen particulièrement performant pour le ciblage de
l'expression de gènes dans des cellules hépatiques, in vivo ou in vitro) et
pour la régulation de cette expression.
La présente demande repose en particulier sur l'utilisation du
promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine All. L'apolipoprotéine All
(apoAll) est l'un des constituants protéiques majeurs des lipoprotéines de
hautes densité (HDL). L'apoAll est synthétisée majoritairement dans le foie,
bien que des résultats contradictoires suggèrent une synthèse égaiement au
niveau de l'intestin. Le gène humain de l'apoAll a été cloné et séquencé
(Tsao et al., J.BioI.Chem 260 (1985) 15222). La région promotrice s'étend sur
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environ 1 kb en amont du codon d'initiation de la transcription. Elle comporte
des éléments régulateurs localisés au niveau des nucléotides -903 à -680,
ainsi que des sites multiples additionnels situés au niveau de la région
intermédiaire (nucléotides -573 à -255) et proximale (-126 à -33).
L'expression optimale est obtenue lorsque des facteurs nucléaires sont liés
aux éléments régulateurs proximaux et distaux du promoteur.
La séquence du promoteur du gène humain de l'apoAll, du résidu -
911 à +29 est représentée sur la séquence SEQ ID n° 1.
II a été observé des mécanismes de régulation du promoteur apoAll
contradictoires chez l'homme et chez les rongeurs. Dans un cas, une
stimulation par les fibrates a été observée, dans l'autre, une inhibition. Les
fibrates, souvent utilisés comme agents hypolipidémiques, appartiennent à la
famille chimique des proliférateurs de peroxisome, dans la mesure où ils
induisent une hépatomegalie liée à la prolifération des peroxisomes chez les
rongeurs. Leur action est médiée -par des récepteurs activés (PPAR
"Peroxisome Proliferator Activated Receptor"), un groupe de 4 récepteurs
nucléaires distincts (a, ~, y, 8). Les PPAR appartiennent à la superfamille
des
récepteurs hormonaux nucléaires qui se lient à des éléments de réponse
spécifiques désignés PPRE ("Peroxisome Proliferator Response Element"}.
?0 Des PPRE ont été identifiés dans de nombreux gènes codant pour des
enzymes impliquées dans la voie de ~-oxydation, qui se sont avérés être
inductibles par les fibrates.
La demanderesse a maintenant mis au point un système
d'expression de gènes hépatospécifique et inductible par les fibrates,
''S utilisables in vitro et in vivo. Plus particulièrement, la demanderesse a
construit pour la première fois un vecteur ayant un tropisme pour le foie
permettant l'expression de gènes de maniére sélective dans le foie ou les
cellules hépatiques, et de manière inductible par les fibrates. La
demanderesse a également construit de nouveaux promoteurs dérivés du
30 promoteur du gène de l'apoAll humain, ayant des propriétés d'inductibilité
et
de force améliorées.
Un premier objet de l'invention réside dans un vecteur recombinant
pour l'expression inductible et hépatospécifique d'une molécule caractérisé
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en ce qu'il comprend, une cassette d'expression constituée d'un acide
nucléique codant pour ladite molécule placé sous controle du promoteur du
gène de l'apolipoprotéine All humain.
Selon une variante particulièrement préférée le vecteur recombinant
est un vecteur viral dérivé des adénovirus, comprenant, inséré dans son
génome, ladite cassette d'expression.
De manière particulièrement remarquable, la demanderesse a en
effet montré qu'un tel adénovirus permettait d'exprimer un gène
spécifiquement dans le foie, que cette expression était fortement inductible
in
vivo par les fibrates, et que les niveaux d'expression obtenus étaient
comparables à ceux décrits antérieurement avec les promoteurs constitutifs
les plus forts.
Le caractère hépatospécifique des virus de l'invention signifie que
ces virus permettent l'expression d'un gène de manière très sélective dans
les cellules hépatiques, in vitro, ex vivo ou in vivo. Une expression non-
spécifique faible dans d'autres tissus ou types cellulaires peut être tolérée,
dès lors qu'une expression très majoritaire est observée dans les cellules
hépatiques (de préférence plus de 80% des cellules exprimant le transgène
sont des cellules hépatiques. Encore plus préférentiellement, plus de 90%).
En particulier, contrairement aux indications contradictoires relevées dans
l'art antérieur, !e virus selon l'invention n'induit aucune expression
détectable
dans l'intestin et offre donc une sélectivité particulièrement élevée. Ceci
est
très important pour des approches de transfert et d'expression de gènes
toxiques, pour lesquelles un niveau de sélectivité très élevé est nécessaire.
Par ailleurs, comme indiqué précédemment, les sytèmes inductibles décrits
dans l'art antérieur présentent une inductibilité moyenne, d'un facteur cinq
environ. Les résultats présentés dans les exemples démontrent que
l'adénovirus de l'invention est inductible d'un facteur dix environ. Le niveau
d'inductibilité est également très important pour obtenir un contrôle de la
quantité de molécules délivrées in vivo. Ceci est particulièrement sensible
dans le cas de molécules immunogènes ou susceptibles de générer des
réponses inflammatoires. Ceci est également particulièrement intéressant
pour l'expression de molécules dont l'efficacité biologique implique des
concentrations élevées. D'autre part, une autre caractéristique
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particulièrement remarquable du vecteur de l'invention réside dans les
niveaux d'expression élevés obtenus. En effet, les systèmes inductibles
présentent généralement en contrepartie, des niveaux d'expression moyens
voire faibles. De manière surprenante et avantageuse, la demanderesse a
5 montré que le système de l'invention permet d'obtenir des niveaux
d'expression in vivo comparables à ceux décrits pour les promoteurs
constitutifs les plus forts. Le système de l'invention combine donc pour la
première fois des propriétés remarquables de sélectivité, d'inductibilité, et
de
force.
L'un des aspects de l'invention réside donc dans l'utilisation du
promoteur du gène humain de l'apoAll. Un autre aspect de l'invention réside
dans ia construction de vecteurs dérivés des adénovirus. Les vecteurs selon
l'invention combinent des propriétés remarquables de transfert de gènes,
d'inocuité, de spécificité tissulaire, d'inductibilité et de force.
Avantageusement, le promoteur utilisé dans les virus de l'invention
comprend les éléments régulateurs du promoteur du gène de l'apoAll. Plus
particulièrement, ces éléments sont localisés au niveau des nucléotides -903
à -680; -573 à -255; et -126 à -33 du gène humain de l'apoAll. A cet égard,
selon une variante particulière, le promoteur comprend les résidus -911 à
+29 du gène de l'apoAll (séquence SEQ ID n° 1 ).
II est entendu que des formes plus courtes ou plus longues du
promoteur peuvent être utilisées. Ainsi, du coté 3', ü est important que le
promoteur comprenne le site d'initiation de la transcription du gène de
l'apoAl I (numéroté +1 sur SEQ ID n° 1 ). En revanche, il est
préférable que ce
?5 promoteur ne contienne pas le premier intron du gène de l'apoAll, qui
commence au nucléotide +38. Ainsi, avantageusement, le fragment utilisé
possède une extrémité 3' comprise entre les résidus +5 et +35, plus
préférentiellement +10 et +30 du gène apoAll. Pour ce qui est de l'extrémité
5', il est préférable, pour obtenir des niveaux importants d'expression dans
le
foie, de conserver au moins en partie le site de liaison des facteurs
hépatiques. Ce site est localisé au niveau des nucléotides -903 à -680. De ce
fait, avantageusement, ie fragment utilisé possède une extrémité 5' localisée
en amont du nucléotide -903. Cette extrémité peut être localisée par exemple
dans la région -950 à -910. Par ailleurs, pour des raisons de capacité de
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clonage, il est avantageux d'utiliser une région promotrice de taille réduite.
De
ce fait, on préfère utiliser un fragment dont l'extrémité 5' est localisée
dans la
région -925 à -910.
Selon une variante avantageuse de l'invention, le promoteur comporte les
éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -680 (ou -
903 à -720) et -126 à -33, mais pas les éléments intermédiaires localisés au
niveau des nucléotides -573 à -255. En particulier, le promoteur utilisé
comprend avantageusement une délétion dans la région comprise entre les
résidus -710 et -150. A titre d'exemple spécifique, le promoteur peut être
avantageusement constitué d'un variant de la séquence SEQ ID n° 1
obtenu
par délétion des résidus 708-210. De manière encore plus préférentielle, le
promoteur utilisé comprend une délétion dans ia région comprise entre les
résidus -670 et -210. A titre d'exemple spécifique, le promoteur peut être
avantageusement constitué d'un variant de la séquence SEQ ID n° 1
obtenu
par délétion des résidus; 653-210.
Les résultats présentés dans les exemples montrent en effet que ce
type de construction présente une force élevée et une inductibilité par les
fibrates supérieure au promoteur natif de l'apoAll, dans un contexte
adénoviral. Ces constructions sont donc avantageuses sur le plan des
propriétés régulatrices, comme sur le plan de la capacité de clonage du
vecteur, puisque la région promotrice est réduite.
Selon un autre mode de réalisation, les adénovirus selon l'invention
comprennent comme promoteur un variant du promoteur du gène de
l'apolipoprotéine All comprenant une répétition de motifs J. La multiplication
de la région J permet de manière avantageuse d'augmenter également le
caractère inductible par les fibrates du promoteur. La région J est constituée
de la séquence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID n° 2, soulignée sur
SEQ -ID n°1 ). Elle est localisée dans le promoteur All au niveau
des
nucléotides -734 à -716 du promoteur. La demanderesse a maintenant
construit des virus recombinants comportant des promoteurs modifiés au
niveau de ia région J. Ces virus présentent des propriétés particulièrement
avantageuses pour ie transfert et l'expression de gènes, in vitro comme in
vivo.
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Préférentiellement, le promoteur comprend de 2 à 5 motifs J. Encore
plus préférentiellement, il comprend 3 motifs J. Pour la construction de ces
. variants, la répétition de motifs J peut être positionnée en 5' du
promoteur, en
3' du promoteur, ou insérée dans la séquence du promoteur, de préférence
au niveau de la séquence J native. Par ailleurs, la multiplication de motifs J
peut avantageusement être combinée avec une délétion telle que décrite cl-
avant. Ceci permet d'obtenir un promoteur ayant des propriétés encore
améliorées en terme de puissance et de contrôle de l'expression de gènes.
Ces différentes constructions peuvent être réalisées selon tes
techniques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Ainsi, en
partant de la séquence SES ID n° 1, l'homme du métier peut effectuer
différentes délétions en sélectionnant des enzymes de restriction
appropriées. Les délétions peuvent également être réalisées par mutagénèse
dirigée ou par PCR. D'autre part, les régions J peuvent être synthétisées
artificiellement au moyen de synthétiseurs de nucléotides, puis insérées dans
ou fusionnées au promoteur par PCR ou par clivage et ligation au moyen
d'enzymes appropriées. Ces différentes approches sont illustrées dans les
exemples.
Comme indiqué ci-avant, les capacités remarquables des vecteurs de
l'invention découlent du promoteur utilisé) comme du choix du vecteur. La
mise en évidence de la fonctionnalité des promoteurs dans un contexte
adénoviral in vivo a en effet permis la réalisation de ces vecteurs très
pertormants.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille
de 36 (kilobases) kb environ. II en existe différents sérotypes, dont la
structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une
organisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adénovirus
y recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les
adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés
dans le groupe C, en particulier les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7
(Ad7) ou 12 (Adl2). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on
peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine canine, et notamment
toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61
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(ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont
cités notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par
référence.
Le génome des adénovirus comprend notamment une séquence
inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation
(Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes
précoces sont contenus dans les régions E1, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci) les
gènes contenus dans la région E1 notamment sont nécessaires à la
propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les
régions L1 à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquencé
et est accessible sur base de données avoir notamment Genebank M73260).
De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2,
Ad7, Adl2, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation comme vecteurs recombinants, différentes
t 5 constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant
différents gènes thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions,
l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication
dans ia cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art
antérieur
sont des adénovirus délétés de la région E1, essentielle à la réplication
virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue
(Levrero et al., Gene 101 (1991 ) 195 ; Gosh-Choudhury et al.) Gene 50
(1986) 161 ). Par ailleurs) pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été
proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de
l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite
dans le mutant ts125, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à
l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une
deletion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la
propagation
virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation
de
l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs,
dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans
l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans
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lesquels les régions E1 et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond
de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De tels
vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes W094/28152,
W095/02697, W096/22378). En outre, des vecteurs portant une modification
au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (W096/10088).
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de !'invention, l'adénovirus
recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De maniëre plus
préférentielle, il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou AdS.
Avantageusement, l'adénovirus recombinant utilisé dans ie cadre de
t o l'invention comprend une délétion dans la région E 1 de son génome. Encore
plus particulièrement, il comprend une délétion des régions E1 a et E1 b. A
titre d'exemple précis, on peut citer des délétions affectant les nucléotides
454-3328; 382-3446 ou 357-4020 (par référence au génome de l'Ad5).
Selon une variante préférentielle, l'adénovirus recombinant utilisé
dans le cadre de l'invention comprend en outre une délétion dans la région
E4 de son génome. Plus particulièrement, la délétion dans la région E4
affecte l'ensemble des phases ouvertes. On peut citer à titre d'exemple
précis les délétions 33466-35535 ou 33093-35535. D'autres types de
délétions dans la région E4 sont décrites dans les demandes W095/02697 et
W096/22378, incorporées à la présente par référence.
La cassette d'expression peut être insérée en différents sites du
génome recombinant. Elle peut être insérée au niveau de la région E1, E3 ou
E4) en remplacement des séquences délétées ou en surplus. Elle peut
égelement être insérée en tout autre site, en dehors des séquences
nécessaires en cis à la production des virus (séquences ITR et séquence
d'encapsidation).
Les adénovirus recombinants sont produits dans une (ignée
d'encapsidation, c'est-à-dire une lignée de cellules capables de
complémenter en trans une ou plusieurs dés fonctions déficientes dans le
génome adénoviral recombinant. L'une de ces lignées est par exemple la
lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été
intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules
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embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11-12
%) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la
région d'encapsidation, la région E1, incluant E1 a et E1 b, la région codant
pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine piVa2.
5 Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus
recombinants défectifs pour la région E1, c'est-à-dire dépourvus de tout ou
partie de la région E1, et de produire des stocks viraux ayant des titres
élevés. Cette lignée est également capable de produire, à température
permissive (32°C}, des stocks de virus comportant en outre ia mutation
E2
10 thermosensible. D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la
région E1 ont été décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome
de poumon humain A549 (W094/28152) ou sur des rétinoblastes humains
(Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées capables de trans-
complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites.
En particulier, on peut citer des lignées complémentant les régions E1 et E4
(Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559 ; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322 ;
Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées
complémentant les régions E1 et E2 (W094/28152, W095/02697,
W095/27071 ).
Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par
introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse
des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral
étant
de 24 à 36 heures). Pour la mise en oeuvre du procédé, l'ADN viral introduit
peut être le génome viral recombinant complet, eventuellement construit
dans une batterie (W096/25506) ou dans une levure (W095/03400),
transfecté dans les cellules. II peut ëgalement s'agir d'un virus recombinant
utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN viral peut aussi ëtre
introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du génome viral
recombinant et une zone d'homologie permettant, après introduction dans la
cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome vira! recombinant par
recombinaison homologue entre les différents fragments.
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Après la lyse des cellules) les particules virales recombinantes sont
isolées par centrifugation en gradient de chlorure de césium. Une méthode
alternative a été décrite dans la demande FR96:08164 incorporée à la
présente par référence.
Le vecteur recombinant ayant un tropisme pour le foie peut
également être construit à partir d'un vecteur non viral de type plasmidique,
en particulier tel que décrit dans les demandes W096/26270 et
PCT/FR96/01414.
Comme indiqué ci-avant, les vecteurs de l'invention permettent la
production régulée, à haut niveau, et hépatospécifique, de molécules
d'intérêt. La molécule d'intérêt est avantageusement une molécule
thérapeutique. II peut s'agir d'une protéine ou d'un acide nucléique (ARNt,
ARN antisens, etc).
De manière particulièrement préférée, la molécule thérapeutique est
une protéine sécrétée dans la circulation. On peut citer à titre d'exemple les
enzymes, les dérivés sanguins) les hormones, les lymphokines
interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance,
les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse) les
facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS,
etc; les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (W094/25073), la
dystrophine ou une minidystrophine (W093/06223)) les gènes suppresseurs
de tumeurs : p53, Rb, Rap1 A, DCC, k-rev, etc (W094/24297), les gènes
codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII)
IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou
artificielle (Fab, ScFv, etc, W094/29446).
Pour assurer la sécrétion de la protéine, la cassette d'expression
comprend avantageusement une séquence signal appropriée. II peut en
particulier s'agir de la séquence signal naturelle de la protéine sécrétée, si
celle-ci est fonctionnelle dans une cellule hépatique. II peut également
s'agir
de toute séquence hétérologue appropriée. A titre d'exemple, on peut citer la
séquence signal de l'apolipoprotéine AI. En outre, la cassette comporte
généralement une région située en 3' qui spécifie un signal de terminaison de
la transcription et de polyadénylation. On utilise par exemple le site polyA
du
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virus SV40. II est entendu que le choix de ces signaux entre dans les
compétences générales de l'homme du métier.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant un vecteur tel que décrit ci-avant. Les compositions
pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une
administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale,
intraveineuse,
intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des
véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable.
II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique,
disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou
des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches,
notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de
sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple un hydrogel.
Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro)
bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été
décrits dans la demande W093/08845. Certains d'entre eux, comme
notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont
?0 commerciaux. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être
adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du
mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à
exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière
générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et
administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de
préférence 108 à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond
au pouvoir infectieux d'une solution d'adénovirus, et est déterminé par
infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après
15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de
détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans ia
littérature.
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En raison de leur caractère hépatospécifique) les vecteurs
' (notamment adénovirus) selon l'invention sont également utilisables pour la
création de modèles animaux de pathologies hépatiques.
Par ailleurs, l'invention concerne également toute cellule modifiée par
un vecteur (notamment un adénovirus) tel que décrit ci-avant. Ces cellules
peuvent être utilisées pour la production de protéines recombinantes in vitro.
Elles peuvent également être destinées à une implantation dans un
organisme, selon la méthodologie décrite dans la demande W095/14785.
Ces cellules sont préférentiellement des cellules hépatiques.
l0 La présente invention a encore pour objet un procédé de production
de protéines recombinantes comprenant l'infection ou la transfection d'une
population cellulaire avec un vecteur, un adénovirus recombinant ou le
génome viral correspondant comprenant une cassette d'expression codant
pour une protéine désirée, la culture de ladite population cellulaire
recombinante, et la récupération de ladite protéine produite.
Avantageusement, pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on
utilise des cellules d'origine hépatique. II peut s'agir de lignées établies
ou de
cultures primaires.
L'invention concerne également de nouveaux variants du promoteur
'?0 du gène de l'apolipoprotéine All humain ayant des caractéristiques
d'expression améliorées. Ces variants selon l'invention comprennent en
particulier une répétition de motifs J tels que décrits précédemment. En
outre, ces variants comprennent avantageusement une délétion dans la
région comprise entre les résidus -710 et -150 du promoteur natif.
?5 L'invention concerne également des promoteurs hépatospécifiques et
inductibles dérivés du promoteur du gène de l'apolipoprotéine All humain
comprenant une région régulatrice composée d'un ou plusieurs motifs J du
promoteur de l'apolipoprotéine All et une région promotrice hépatospécifique
issue d'un autre promoteur.
30 Avantageusement, la région promotrice hépatospécifique est issue
d'un promoteur hépatospécifique autre que le promoteur du gène humain de
l'apolipoprotéine All. Préférentiellement, elle est composée d'un promoteur
choisi choisi parmi le promoteur de la sérum albumine, le promoteur de
l'apoüpoprotéine AI, le promoteur de l'apolipoprotéine Cs, le promoteur de
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l'apolipoprotéine 8100, le promoteur de la chaise gamma du fibrinogène
(JBC 270 (1995) 28350)) le promoteur du gène de la phénylalanine
hydroxylase humaine (PNAS 93 (1996) 728), le promoteur du gène de
l'AMBP (NAR 23 (1995) 395), le promoteur du gène du facteur X (JBC 271
(1996) 2323), le promoteur du cytochrome P450 1 A1 (PNAS 92 (1995)
1 i 926), le promoteur du virus de l'hépatite B (BioLChem. 377 (1996) 187) ou
encore le promoteur de l'a-antitrypsine. La région promoteur utilisée est
préférentiellement constituée de la région nécessaire et suffisante pour
l'expression hépatique (promoteur minimum). Cette région comprend
l0 généralement fa boite TATA, et peut être préparée selon les techniques
classiques de biologie moléculaire, comme indiqué dans les références
citées. Ainsi, tes 209 premières paires de bases du promoteur du gène du
facteur X sont suffisantes pour-conférer l'expression hépatique (JBC précité).
De même, des fragments -20 à -23; -54 à -57 et -66 à -77 du promoteur de la
chaise gamma du fibrinogène constituent un promoteur minimal permettant
une expression hépatospécifique. Ces régions peuvent être jointes aux
régions J (de préférence 1 à 5) selon la méthodologie décrite ci-avant et
illustrée dans les exemples, pour générer des promoteurs hépatospécifiques
et inductibles. En outre, ces promoteurs peuvent porter des séquences
additionnelles de régulation de type "enhanceur", permettant d'améliorer les
niveaux d'expression.
La région promotrice hépatospécifique peut également être
composée d'un promoteur ubiquitaire couplé à un élément enhanceur
conférant une expression hépatospécifique.
A cet égard, l'élément enhanceur conférant le caractère
hépatospécifique peut ëtre choisi parmi l'enhancer des apolipoproteines E/C-I
(J. Biol. Chem., 268 (1993) 8221-8229 et J. Biol. Chem, 270 (1995) 22577-
22585), l'enhancer de l'albumine (Gene therapy, 3 (1996) 802-810))
l'enhancer de la transthyretine (Mol. Cell Biol. 15 (1995) 1364-1376),
l'enhanceur du virus de l'hépatite B (BioI.Chem. 377 (1996} 187) ou encore
des enhancers artificiels contenant des sites HNF (hepatic nuclear factors),
sites de liaison aux recepteurs orphelins, membres des recepteurs aux
hormones steroidiennes (Humas Bene therapy, 7 {1996) 159-171 ).
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IS
Le promoteur ubiquitaire peut être tout promoteur non spécifique d'un
tissu. II peut s'agir en particulier d'un promoteur viral ou d'un promoteur
domestique {"housekeeping"). Parmi les promoteurs viraux, on peut citer plus
particulièrement le promoteur SV40 (Mol Cell Biol 1982; 2:1044-1051 ); RSV
LTR, Rous sarcoma virus long terminal repeat (PNAS USA, 1982; 79:6777-
6781); CMV-IE, human cytomegalovirus (Gene 1986; 45:101-105); MoMLV
LTR, Moloney murine leukemia virus (Gene Therapy 1996; 3:806-810} et le
promoteur du gène HSV-TK, Thymidine Kinase (Nucleic Acid Res 1980;
8:5949-5964). Parmi les promoteurs domestiques, on peut citer le promoteur
des gènes Human EF-1 alpha, elongation factor (Gene 1993, 134:307-308),
Beta Actine de poulet (Nucleic Acids Res 1983; 11: 8287-8301 ), POL II
promoteur, ARN polymerase II de souris (Mol Cell Biol 1987; 7: 2012-2018):
PGK, Phosphoglycerate Kinase (Gene 1987; 61: 291-298); Histone H4 (Mol
Cell Biol 1985; 5:380-398), HMG, Hydroxymethylglutaryl CoA:reductase
humain (Mol Cell Biol 1987; 7: 1881-1893), HK2, Hexokinase II de rat (J. Biol.
Chem. 1995; 270:16918-16925) et PRP, Prion (Virus genes 1992; 6: 343-
356). Tout autre promoteur ubiquitaire connu de l'homme du métier peut
également être utilisé.
La région promotrice hépatospécifique peut ëtre obtenue en couplant
selon les techniques classiques de biologie moléculaire tout ou une partie
fonctionnelle d'un promoteur ubiquitaire avec l'élément enhanceur ci-dessus.
En particulier, les oligonucleotides correspondants aux sites J contenant les
bases -737 à -715 du promoteur de l'apoA-II humaine peuvent etre clonés
dans les sites BamHl/Gglll de pIC20H (Gene 1984; 32:481-485}, digérés par
Hindlll, et sous clonés en 5' du promoteur ubiquitaire choisi, par exemple du
promoteur de la Thymidine Kinase (TK) dans le plasmide pBLCAT4 (Nucl
Acid Res 1987; 15: 5490), pour générer un vecteur contenant fes sites J et
un promoteur ubiquitaire devant un gène d'intérêt. L'enhancer hépatique peut
être ajouté soit en 5' du promoteur ou en 3' du site de polyadenylation.
Ces variants sont particulièrement avantageux car combinent les
propriétés de force d'expression, de spécificité tissulaire, et
d'inductibilité.
Ces différents variants peuvent être utilisés pour l'expression de gènes
d'intérêt, in vitro et in vivo comme indiqué ci-avant et illustré dans les
exemples.
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L'invention concerne également des vecteurs recombinants
comportant une cassette d'expression composée d'un gène d'intérêt sous
contrôle d'un promoteur tel que décrit ci-avant.
L'invention concerne également une composition comprenant un
vecteur recombinant tel que décrit ci-avant et un activateur de PPAR, en vue
d'une utilisation simultanée ou étalée dans le temps.
Le vecteur recombinant est avantageusement un adénovirus
recombinant tel que défini ci-avant, et l'activateur de PPAR est
avantageusement un activateur de PPARa.
Parmi les activateurs de PPARa, on peut utiliser plus
particulièrement les fibrates ainsi que tout composé augmentant l'expression
de facteurs de transcription se fixant sur les sites J.
A titre d'exemples préférés de fib~ates, on peut citer par exemple
l'acide fibrique et ses analogues tels que notamment le gemfibrozil
(Atherosclerosis 114( 1 ) ( 1995) 61 ), le bezafibrate ( Hepatology 21 ( 1995)
1025), le ciprofibrate (BCE&M 9(4) (1995) 825), le clofibrate (Drug Safety 11
(1994) 301 ), le fénofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinicat
Communications, 1995), le clinofibrate (Kidney International. 44(6) (1993)
1352), l'acide pirinixique (Wy-14,643) ou l'acide 5,8,11,14-eicosatetranoique
(ETYA). Ces différents composés sont compatibles avec une utilisation
biologique et/ou pharmacologique in vitro ou in vivo.
A titre d'exemples de composés augmentant l'expression de facteurs
de transcription se fixant sur les sites J, on peut citer notamment les
rétinoïdes, qui activent l'expression de RXR et HFN4.
Par ailleurs, les compositions selon l'invention peuvent comporter
plusieurs activateurs de PPAR en association, et en particulier un fibrate ou
un analogue de fibrate associé à un rétinoïde.
Comme indiqué ci-avant, le vecteur et l'activateur peuvent être
utilisés simultanément ou de manière espacée dans le temps. En outre) ils
peuvent être conditionnés de manière séparée. Selon un mode de mise en
oeuvre préféré, le vecteur et l'activateur sont conditionnés séparément et
utilisés de manière espacée dans le temps. En particulier, le vecteur est
avantageusement utilisé en premier, puis, dans un second temps, l'activateur
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de PPAR. Le terme utilisé désigne la mise en contact dudit vecteur ou
activateur avec les cellules, in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro ou ex
vivo, la
( mise en contact peut être effectuée par incubation d'une population
cellulaire
telle que mentionnée plus haut avec ie vecteur (par exemple de 0,01 à 1000
ug de vecteur pour i Os cellules, ou de virus à une Multiplicité d'Infection
(MOI) de 0,1 à 1000), suivie d'une incubation avec l'activateur (généralement,
dans une gamme de concentration comprise entre 10-3 mM et 10 mM, de
préférence entre 10 uM et 500 NM). In vivo, par exemple pour la création
d'animaux transgéniques ou pour l'expression hépatospécifique de gènes
d'intérêt, la mise en contact comprend généralement l'administration du
vecteur (dans les conditions décrites ci-avant) suivie de l'administration de
l'activateur. A cet égard, l'activateur peut être administré par voie orale,
par
exemple dans la nourriture (pour les animaux en particulier) ou sous forme
de gélules (pour l'homme). Les doses journalières administrées aux animaux
sont de l'ordre de 0,01 à 1 % (poids/poids), de préférence de 0,2 à 0,5
(poids/poids). Une dose journalière typique chez ia souris par exemple est de
50 mg. Une dose journalière typique de fénobibrate chez l'homme varie entre
100 et 300 mg) de préférence autour de 200mg, qui correspond à une
concentration plasmatique de 15 Ng/ml environ (Vidai, 1996). En outre, des
administrations/incubations répétées de vecteur et/ou d'activateur peuvent
être effectuées.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des
exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non
limitatifs.
Lé4ende des figures
Fi ure 1 : Structure du promoteur apoAll et des formes délétées.
Fi ure 2 : Stratégie de duplication de la région J.
Figure 3 : Structure des promoteurs apoAll comportant une duplication
de la région J en 5', éventuellement combinée à des délétions internes.
Fi ure 4 : Str'ucture des promoteurs apoAll comportant une duplication
de la région J en interne, éventuellement combinée à des délétions internes.
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Fi ure 5 : Représentation de l'adénovirus recombinant.
Fi ure 6 : Inductibilité et force de l'adénovirus recombinant in vivo.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles
que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels
d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par
électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-
chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de
l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien
connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la
littérature [Maniatis T. et al., "Molecuiar Cloning, a Laboratory Manual".
Cold
Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et
al. (eds)) "Current Protocols in Molecular Bioiogy", John Wiley & Sons, New
York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13
sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les
ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par
électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par
un mélange phénoi/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en
présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations
du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être
effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coii (Biolabs)
selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3'
proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4
(Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des
extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la
nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynuciéotides synthétiques
peut être effectuée selon la méthode développée par Tayior et al. (Nucleic
Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
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PCR ~olymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230
(1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 {1987)
335-350j peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin
Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des
séquences nucléotidiques peut être effectuée par ia méthode développée par
Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467j en utilisant
le
kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1 : Clonage du promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine
All.
Cet exemple décrit le clonage-du promoteur gu gène humain de l'apoAll. II
est entendu que toute autre technique peut être utilisée pour reclouer ce
promoteur. Par ailleurs, il est également possible, à partir des fragments
clonés, de préparer selon les techniques de biologie moléculaire classiques
des versions plus courtes en 5' et/ou en 3'.
1.1. Clonage d'un fragment -911/+29
Le promoteur de l'apoplipoproteine Af I humaine a été cloné par PCR à partir
d'ADN génomique humain. Des amorces ATC GAA GCT TCT GAT ATC TAT
TTA ACT GAT (SEG~ ID n°3) et CGT CTC TGT CCT TGG TGT CTG GAT
CCA TCG (SEQ ID n°4) qui introduisent, pour la première, un site
Hindlll en
5' du promoteur, et pour la seconde, un site BamHl en 3', ont permis de
cloner le promoteur de la position -911 à la position +29. La séquence du
promoteur a été confirmée par séquençage (SEQ ID n° 1 ) et le fragment
Hindlll-BamHl introduit dans le vecteur pBLCAT5 pour vérification de
l'activité
transcriptionnelle.
1.2. Clonage d'un fragment -911 /+160
Un fragment comportant le promoteur apoAl I des résidus -911 /+160 a
également été obtenu à partir de la banque génomique, puis cloné dans le
vecteur pBLCATS.
Exemple 2 : Construction de variants du Promoteur All
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2.1. Création de formes tronquées
Cet exemple décrit la construction de variants du promoteur apoAll
comportant une délétion interne, dans la région comprise entre les éléments
de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -720, et -126 à -33.
5 Ces variants ont été construits à partir des fragments -911 /+29 et -911
/+160
décrits dans l'exemple 1.
A partir des vecteurs pBLCATS comportant le promoteur complet sous forme
d'un fragment -91 1/+29 ou -911/+160, la région -210 à +29 ou -210 à +160 a
été obtenue par PCR en utilisant comme amorce un oligonucléotide -210/-
10 198 de séquence 5'-GACTCTAGATGTACCCCCTTA-3' (SEQ ID n°5) et un
oligonucléotide interne au gène CAT. Le fragment obtenu a été cloné dans
un plasmide pBLCATS pour générer les plasmides -210/+160A11-CAT et
210/+29A11-CAT. La région distale -911 à -653 (N-I) a été obtenue par
digestion du fragment -911 à +29 au moyen de l'enzyme alul, puis clonage
15 du fragment obtenu dans les plasmides -210/+160A11-CAT et -210/+29A11-
CAT. La région distale -911 à -708 (N-J) a été obtenue par PCR en utilisant
comme amorce un oligonucléotide -708/-722 de séquence 5'-
GGAAGCTGCAGAGGCTTCTACCAG-3' (SEQ ID n°6). Le fragment obtenu a
ensuite été cloné dans les plasmides -210/+160A11-CAT et -210/+29A11-CAT.
?0 La structure des promoteurs est représentée sur la figure 1.
2.2. Dualication du site J
Cet exempte décrit ta construction de variants du Promoteur All dans
lesquels la région J a été répétée.
Les deux oligonucléotides suivants, correspondant au site J. ont été
synthétisés en utilisant un synthétiseur d'ADN.
Oligo 1: 5'-gatcctTCAACCTTTACCCTGGTAGa-3' (SEQ ID n°7)
Oligo 2: 5'-gatctCTACCAGGGTAAAGGTTGAag-3' (SECS ID n°8)
Ces oligonucléotides reconstituent, à l'extrémité 3') un site BamHl et à
l'extrémité 5', un site Bglll. Ces oligonucléotides ont été hybridés ensemble
et
le fragment obtenu a été cloné aux sites BamHl-Bglll dans le vecteur pIC20H
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(Figure 2). Les plasmides pIC20H-J résultant ont été analysés pour
déterminer le nombre de copies de sites J insérés, ainsi que leur orientation
respective.
Les plasmides suivants ont été sélectionnés
- un plasmide portant une seule copie du site J,
- un plasmide portant 2 copies du site J dans la mëme orientation,
- un plasmide portant 2 copies du site J, en orientation inverse.
Pour construire les variants du promoteur apoAll comportant des motifs J
répétés en 5', les inserts contenus dans les plasmides ci-dessus ont été
excisés sous forme de fragments Hindlll et clonés en 5' du promoteur apoAll
{exemple 1 ) ou des variants décrits dans l'exemple 2.1, au niveau d'un site
Hindlll. La structure des promoteurs résultants est donnée sur la figure 3.
Pour construire les variants du promoteur apoAll comportant des motifs J
! 5 répétés en interne, les inserts contenus dans les plasmides ci-dessus ont
été
excisés sous forme de fragments de restriction appropriés, puis clonés dans
le promoteur apoAll {exemple 1 ) ou dans les variants décrits dans l'exemple
2.1, au niveau d'un site correspondant situé entre la région J native et la
région de régulation -126-33 du promoteur natif. La structure des promoteurs
résultants est donnée sur la figure 4.
Le nombre de copies de la région J dans la construction finale est déterminé
par le choix du plasmide.
Exemple 3 : Etude de la fonctionalité des variants du promoteur apoAll.
La fonctionaiité des promoteurs a été étudiée par transfection dans une
lignée cellulaire hépatique, les cellules HepG2. Une expérience contrôle a été
effectuée dans une lignée cellulaire non-hépatique, les cellules Hela.
Les transfections dans les cellules HepG2 ont été réalisées à 50-60% de
confluence par la méthode de précipitation au phosphate de calcium. Les
cellules ont été co-transfectées par un mélange de plasmides comprenant
- le plasmide test
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- un plasmide d'expression du PPARa (PBK-CMV-PPARa) ou le
plasmide correspondant vide (PBK-CMV), et,
- 0,5 pg d'un plasmide d'expression de la (i-Gal (CMV-(i-Gal) comme
controle de l'efficacité de transfection.
Toutes les transfections ont été réalisées avec la même quantité d'ADN total.
4 h après la transfection, les cellules sont lavées dans un tampon PBS, puis
incubées 24 heures avec le fibrate (Wy-14643, 1 NM). L'activité CAT est
ensuite déterminée selon la méthode de Gorman et al (MoI.CeILBioI. 2 (1982)
1044). Les résultats sont ensuite rapportés à l'efficacité de transfection
telle
que mesurée par l'expression de la ~-Gal.
Les résultats obtenus pour deux séries d'expérience sont présentés dans les
Tableaux 1 et 2 ci-après.
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Tableau 1 : Activité des Promoteurs sur cellules hépatiques
Promoteur Vecteur ActivateurActivit CAT Correction
-Gal
hA-II PBK-CMV 2,52 5,52
PBK-CMV W 5,37 11,75
mPPARa 12,44 27,22
mPPARa W 12,04 26,34
hA-!I J3 PBK-CMV 4,17 9,13
PBK-CMV W 7,80 17,06
mPPARa 15,67 34,29
mPPARa W 24,96 54,61
hA-I I N-1 PBK-CMV 1,31 2,86
PBK-CMV W 2,46 5,38
mPPARa 3,58 7,83
mPPARa W 14,77 32,31
hA-II N-I PBK-CMV 1,32 2,89
J3
PBK-CMV W 2,95 6,45
mPPARa 7,81 17,10
mPPARa W 17,51 38,32
hA-II N-J PBK-CMV 0,37 0,80
PBK-CMV W 0,41 0,90
mPPARa 0,44 0,97
mPPARa W 1,11 2,42
hA-I! N-J PBK-CMV 0,46 1,00
J3
PBK-CMV W 0,77 1,69
mPPARa 4,04 8,83
mPPARa W 13,06 28,59
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Tableau 2 : Activité des Promoteurs sur cellules hépatiques
Promoteur Vecteur ActivateurActivit CAT Correction
-Gal
hA-II PBK-CMV 5,03 2,12
PBK-CMV W 6,68 3,41
mPPARa 49,77 16,99
mPPARa W 60,86 32,20
hA-II J3 PBK-CMV 5,80 2,16
PBK-CMV W 8,17 3,50
mPPARa 69,71 17,08
mPPARa W 81,20 21,15
hA-I I N-I PBK-CMV 2,91 1,25
PBK-CMV W 1,35 0,67
mPPARa 20,85 3,88
mPPARa W 32,34 8,86
hA-II N-I PBK-CMV 2,20 1,19
J3
PBK-CMV W 3,01 1,68
mPPARa 57,07 11,65
mPPARa W 75,39 17,53
hA-I I N-J PBK-CMV 2,02 1,50
PBK-CMV W 0,56 0,37
mPPARa 1,65 0,49
mPPARa W 2,91 1,26
hA-II N-J PBK-CMV 1,04 0,64
J3
PBK-CMV W 0,55 0,60
mPPARa , 21,40 3,87
mPPARa W 30,56 9,95
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Ces résultats font apparaitre clairement que la duplication du motif J
dans le promoteur n'altère pas ia force du promoteur) et augmente très
significativement son inductibilité par les fibrates.
5 Par ailleurs, dans une expérience contrôle réalisée dans les cellules
Hela, aucune inductibilité par les fibrates ou par le PPAR n'a été observée.
Ceci démontre que les promoteurs selon l'invention conservent leur
spécificité tissulaire.
10 Ces résultats démontrent donc que les promoteurs selon l'invention
sont forts, hautement inductibles, et specifiques des cellules hépatiques. En
outre, les promoteûrs phA-II N-I(J3); phA-II' N-I(J3); phA-II N-J(J3); phA-II'
N-
J(J3); phA-II N-I(J3i); phA-II' N-I(J3i); phA-11 N-J(J3i) et phA-II' N-J(J3i)
possèdent l'avantage d'être de petite taille, comparés au promoteur apoAll
15 natif. Ceci permet donc avantageusement, dans un vecteur de transfert et/ou
d'expression de gènes, d'avoir une capacité de clonage supérieure.
Exemple 4 . Construction d'adénovirus inductibles et
hépatospécifiques.
Cet exemple décrit la construction d'adénovirus inductibles et
hépatospécifiques, et donnant des niveaux d'expression très élevés. Ces
adénovirus sont utiles pour l'expression de gènes in vitro, ex vivo ou in
vivo.
Les adénovirus décrits ont été construits à partir du sérotype AdS. II est
entendu que tout autre sérotype peut être utilisé, et notamment les sérotypes
Ad2) Ad7, Adl2 et CAV2. Les adénovirus ont été construits par
recombinaison homologue, dans une lignée de packaging) entre un vecteur
navette apportant partie gauche du génome viral et l'ADN d'un adénovirus
linéarisé, apportant la partie droite du génome viral.
4.1. Construction des vecteurs navette
Le vecteur navette construit porte une cassette d'expression constituée d'un
promoteur apoAll et d'un acide nucléique codant pour une molécule sécrétée
: l'apolipoprotéine AI (apoAl). Ce vecteur apporte en outre la partie gauche
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du génome viral, c'est-à-dire l'ITR gauche et un région permettant la
recombinaison.
Les vecteurs navette servant à la construction de l'adénovirus ont été
construits à partir d'un plasmide pC05 (W096I22378), d'un plasmide
pIC20H-Alb-U-AI-SV40 qui contient le premier intron de l'apoAl et l' ADNc de
l'apoAl sous controle d'un promoteur de l'albumine de Rat, et d'un plasmide
pBLAIICAT5 qui contient un promoteur apoAll tel que décrit dans l'exemple 1
ou un variant selon l'exemple 2.
a) Constuction de pIC20H-Alb-U-Al-SV40
Les deux amorces GCG GC~GCT TCG AGC AGA CAT GAT AA (SEQ ID
n°9) et CGA TCT CAA GGG CAT CGG TCG ACG G (SEQ ID n°10) ont
permis l'amplification des séquences de polyadénylation de SV40 dans
l'orientation tardive: L'amorce 5' introduit un site Notl en amont de cette
sequence et l'amorce 3' introduit un demi site Nrul. Le fragment PCR obtenu
est traité par la klenow pour obtenir des bout francs et cloné dans le vecteur
pIC20H clivé par Smal et Nrul, dans l'orientation qui régénère un site Nrul.
Le
plasmide resultant est appelé pIC20H-SV40.
La construction pXL2336 contenant un minigene de l'apolipoprotein AI a été
decrite précedemment (W094/25073). Un fragment PCR est amplifié à partir
de pXL2336 grace aux amorces GGG ATC CGC TGG CTG CTT AGA GAC
TGC (SEQ ID n°11 ) et GGC GGC CGC CGG GAA GGG GGG CGG CGG
(SEQ ID n°12) qui introduisent respectivement un site BamHl en amont du
premier exon de l'ApoAl et un site Notl en aval de la séquence codante de
l'ApoAl.
Le fragment PCR est cloné dans pCRll (Invitrogen) et sa séquence vérifiée.
Le fragment BamHl/Notl contenant l'ADNc et le premier intron de l'apoA-I est
ensuite cloné aux mëmes sites du plasmide pIC20H-SV40 pour générer le
plasmide pIC20H-AI-SV40.
Les oligonucléotides CAC GTG CTT GTT CTT TTT GCA GAA GCT CAG
AAT AAA CGC TCA ACT GTG GC (SEQ ID n°13) et CGT GGC CAC AGT
TGA GCG TTT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG ,aAC AAG CA (SEQ ID
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n°14) sont ensuite hybridés entre eux et clonés au site Dsal de pIC20H-
AI-
SV40 de façon à ce que le site Pmll créé lors de ce clonage soit du coté de
l'intron et que le site Dsal soit régénéré à l'autre extrémité. Ces
oligonucléotides permettent d'introduire un fragment de la partie 5' non
traduite de l'ARN messager de la f3 Globine. Le plasmide obtenu est appellé
pIC20H-U-AI-SV40.
Enfin, le fragment Hindlll/Bglll du promoteur de l'albumine de Rat décrit par
F. Troche et al (MoI.CeLBiol, 1989, 4759-4766) traité par ia Klenow a été
cloné dans l'orientation adéquate dans le plasmide pIC20H-U-AI-SV40 cuvé
par BamHl et traité également par la klenow pour générer le plasmide
pIC20H-Alb-U-AI-SV40.
b) Construction des vecteurs navette
i 5 Les oligonucléotides CGT GGC AGG CAG CAG GAC GCA CCT CCT TCT
CGC AGT CTC TAA GCA GCC TTC GAA GCA TG (SEQ ID n°15) et CTT
CGA AGG CTG CTT AGA GAC TGC GAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT
GCC TGC CA (SEO ID n°16) sont hybridés entre eux ce qui crée une
extrémité cohesive Sphl et une extrémité cohésive Hpall. Ce fragment est
introduit dans une ligation trois partenaires avec un fragment Hpall/Dralll
(476/1518) du plasmide pIC20HAlb-U-AI-SV40 contenant le cDNA de l'ApoAl
et un fragment Dralll/Sphl (1518/239) du mëme plasmide. Le plasmide
résultant est appellé pXL2699. Cette construction crée un site BstBl
compatible avec Clal en amont du fragment ADNc + intron de l'apoAl. Le
fragment BstBl / Sall de pXL2699, contenant l'ADNc de l'ApoAl) est cloné
dans le plasmide pC05 clivé par Clal et Sall. Le plasmide résultant est
appelé pC05-U-AI-SV40.
Le promoteur apoAll sélectionné (promoteur complet ou variants) est excisé
du plasmide pBLAIICAT5 correspondant sous forme d'un fragment Hindlll-
BamHI) cloné après traitement à la Klenov au site EcoRV du plasmide pC05-
U-AI-SV40 pour générer les vecteurs navette pXLPromAll/AI. Les vecteurs
suivants sont ainsi obtenus
3~
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Vecteur Navette Version du Promoteur
XLAI I/AI -911 /+29
XLhAII/Al -911 /+160
XLAII J3 /AI -911/+29, 3motifs J en 5'
XLAIIN-I/AI -911 /-653;-210/+29
XLAI IN-I J3 /AI -911 /-653;-210/+29; 3motifs
J en 5'
XLAIIN-J/AI -911 /-708;-210/+29
XLAIIN-J J3 /AI -911 /-708;-210/+29; 3motifs
J en 5'
Ces vecteurs sont validés pour l'expression de l'apoAl humaine par
transfection transitoire dans les lignées 293 ou Cosl. II est entendu que
l'acide nucléique codant pour l'apoiipoprotéine AI humaine peut ëtre
aisément remplacée dans les vecteurs navette par tout autre acide nucléique
codant pour une molécule d'intérêt.
4.2. Construction des adénovirus
Les adénovirus ont été produits par recombinaison homologue, après co-
transfection, dans les cellules appropriées, de deux fragments d'ADN, l'un
apportant ia partie gauche du génome du virus recombinant (vecteur navette
décrit dans l'exemple 4.1., possédant une délétion dans la région E1 ),
l'autre
apportant la partie droite du génome du virus recombinant (possédant
éventuellement une délétion dans la région E4 et/ou E3).
a) Construction d'adénovirus défectifs pour la région E1
L'adénovirus Ad-All/Af a été obtenu par recombinaison homologue in vivo
entre l'ADN du virus Ad-RSV-~iGal et le vecteur navette pXL All/AI, selon le
protocole suivant : le vecteur navette pXL All/AI linéarisé par BstXl et l'ADN
du virus Ad-RSV-~3Gal linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co-transfectés
dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la
recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants générés ont
ensuite été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN
de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce
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29
qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif
recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient
de
chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et
al., Virology 52 (1973) 456), ou par chromatographie (FR96 08164).
L'adénovirus Ad-All/AI peut être conservé à -80°C dans 20 % de
glycérol. La
structure du génome recombinant est présentée sur la figure 5.
La même stratégie est suivie pour construire les adénovirus portant les
différentes formes de promoteurs All, en partant des vecteurs navettes
décrits dans l'exemple 4.1.
b) Construction d'adénovirus défectifs pour les régions E1 et E4
Les cellules IGRP2 (Yeh et al., J. Virol 70 (1996) 559), capables de
transcomplémenter les fonctions E1 et E4 de l'adénovirus, sont
IS cotransfectées par 5 mg du vecteur navette digéré par BstXi , et 10 mg de
l'ADN du virus apportant la délétion fonctionnelle de la région E4 (par
exemple Ad2d1808) Ad5d11004, Ad5d11007 ou Ad5d11014) digéré par
l'enzyme CIa1. Après apparition de l'effet cytopathique, les virus sont
purifiés
par au moins deux cycles consécutifs d'étalement en solide pour la formation
?0 de plages sur IGRP2. Les plages correspondant à l'infection du virus
recherché (analyse de l'ADN démontrant la double délétion E 1 et E4) sont
alors amplifiées par des cycles d'infection consécutives. Des stocks à titre
élevés sont préparés par purification sur gradient de chlorure de césium. Les
virus sont conservés à -80°C selon les techniques classiques de l'homme
de
25 l'art.
Exemple 5 : Activité in vivo des adénovirus recombinants
Cet exempte décrit les propriétés fonctionnelles des adénovirus de
30 l'invention, après administration in vivo.
5 x 109 pfu des virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40 et Ad(RSV-ApoAl-bGH)
ont été injectés respectivement à 8 et 3 souris C57b16. Quatre des souris
injectées avec le Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40) on été nourries avec du
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fenofibrate à la dose de 0,5% (p/p) mélangée à leur alimentation. Les
concentrations plasmatiques en apoA-I humaine et HDL-cholesterol ont été
mesurées chaque semaine. Les résultats obtenus sont présentés sur la
Figure 6.
5 Les niveaux d'apoA-I plasmatique sont inférieurs au seuil de détection (10
mg/dl) pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40),
81 ~0.17 mg/dl pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-
SV40) traitées au fénofibrate et 84~15 mgldl pour les souris injectées aves ie
virus Ad{RSV-ApoAl-bGH) ce qui montre une induction d'au moins 8 fois du
10 promoteur de l'apoA-II dans ces conditions.
Le niveau de HDL-cholesterol n'est pas modifié pour les souris injectées aves
le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40) (52-2 mg/dl) : niveau identique à des
animaux non traités. En revanche, le niveau de HDL-cholestérol est
augmenté au jour 7 jusqu'à 88~14 mg/dl et 121~22 mg/dl pour
15 respectivement pour les souris injectées aves le virus Ad(RSV-ApoAl-bGH)
et les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40) traitées au
fénofibrate (figure 6).
Ces résultats démontrent in vivo le caractère fort, inductible et
20 hépatospécifique des promoteurs de l'invention dans un contexte adénoviral.
Combinées aux propriétés remarquables de transfert de gènes des
adénovirus, les vecteurs de l'invention présentent des performances très
avantageuses pour le transfert et l'expression de gènes.
2269864.seq
(1) INFORMATIONS GENERAL:ES:
(i) DEPOSANT:
LISTE DE SEQUENCES
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER
( B ) RUE : 2 0 , A ;Tenue Raymond Aron
( C) VILLE : ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92160
(ii) TITRE DE L'INVEIJTION: Nouvelles constructions et vecteurs pour
l'expression ciblée et inductible de gènes
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 16
(iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE:
(A) DESTINATAIRE: Robic
(B) RUE: 55 St-Jacques
(C) VILE: Montréal
(D) PROVINCE : QC
(E) PAYS: CANADA
(F) CODE POSTAL: H2Y 3X2
(G) TELFsPHONE: 514-987-6242
(H) TELECOPI:E: 514-845-7874
(v) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Disquette 3.5" / 1.44 MO
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTE;ME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGIC'.IEL: Texte ASCII
(vi) DONNÉES RELATIVES Ä LA DEMANDE ACTUELLE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: 2,269,864
(B) DATE DE DÉPÖT: 06-NOV-97
(vii) DONNÉES RELATIVES Ä LA DEMANDE ANTÉRIEURE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: PCT/FR97/01992
(B) DATE DE DÉPÖT: 06-NOV-97
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 96/13691
(B) DATE DE DEPOT: 08-NOV-1996
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTERISTIQUE~; DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 940 paires de bases
(B) TYPE: nuclé.otide
(C) NOMBRE DE E.RINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
Page 1
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2269864.seq
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
( ix) CARACTERISTIQUE:3
(C) AUTRES INFORMATIONS:
Note: /SÉ~quence du promoteur apoAII humain (-911 à +29)
(xi) DESCRIPTION DE hA SEQUENCE: SEQ ID NO: l:
AGCTTCTGAT ATCTATTTAA CTCiATTTCAC CCAAATGCTT TGAACCTGGG AATGTACCTC 60
TCCCCCTCCC CCACCCCCAA CAC~GAGTGAG ACAAGGGCCA GGGCTATTGC CCCTGCTGAC 120
TCAATATTGG CTAATCACTG CC~.,AGAACTG ATAAGGTGAT CAAATGACCA GGTGCCTTCA 180
ACCTTTACCC TGGTAGAAGC CTC:TTATTCA CCTCTTTTCC TGCCAGAGCC CTCCATTGGG 240
AGGGGACGGG CGGAAGCTGT TT7.'CTGAATT TGTTTTACTG GGGGTAGGGT ATGTTCAGTG 300
ATCAGCATCC AGGTCATTCT GGC~CTCTCCT GTTTTCTCCC CGTCTCATTA CACATTAACT 360
CAA.A.AACGGA CAAGATCATT TAC'.ACTTGCC CTCTTACCCG ACCCTCATTC CCCTAACCCC 420
CATAGCCCTC AACCCTGTCC CTC~ATTTCAA TTCCTTTCTC CTTTCTTCTG CTCCCCAATA 480
TCTCTCTGCC AAGTTGCAGT AAAGTGGGAT AAGGTTGAGA GATGAGATCT ACCCATAATG 540
GAATAAAGAC ACCATGAGCT TTC".CATGGTA TGATGGGTTG ATGGTATTCC ATGGGTTGAT 600
ATGTCAGAGC TTTCCAGAGA AATAACTTGG AATCCTGCTT CCTGTTGCAT TCAAGTCCAA 660
GGACCTCAGA TCTCAAAAGA ATCiAACCTCA AATATACCTG AAGTGTACCC CCTTAGCCTC 720
CACTAAGAGC TGTACCCCCT GCC'TCTCACC CCATCACCAT GAGTCTTCCA TGTGCTTGTC 780
CTCTCCTCCC CCATTTCTCC AAC'.TTGTTTA TCCTCACATA ATCCCTGCCC CACTGGGCCC 840
ATCCATAGTC CCTGTCACCT GAC'AGGGGGT GGGTAAACAG ACAGGTATAT AGCCCCTTCC 900
TCTCCAGCCA GGGCAGGCAC AGP,CACCAAG GACAGAGACG 940
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
Page 2
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2269864.seq
(B) TYPE: nuclE=otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURAT:LON: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CI)S
( B ) EMPLACEMEN~~' : 1 . . 19
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
TCA ACC TTT ACC CTG GTA G 19
Ser Thr Phe Thr Leu Val
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ..0 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE~: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..30
(xi) DESCRIPTION DE L~A SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATC GAA GCT TCT GAT ATC TAT TTA ACT GAT 30
Ile Glu Ala Ser Asp Ile Tyr Leu Thr Asp
1 5 10
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
Page 3
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2269864.seq
(B) TYPE: nuclc~otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..30
(xi) DESCRIPTION DE I~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CGT CTC TGT CCT TGG TGT C:TG GAT CCA TCG 30
Arg Leu Cys Pro Trp Cys Leu Asp Pro Ser
1 5 10
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
( i ) CARACTERISTIQUE~'> DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE; : ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
( B ) EMPLACEMENT' : 1 . . 21
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:5:
GAC TCT AGA TGT ACC CCC TTA 21
Asp Ser Arg Cys Thr Pro Leu
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
Page 4
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2269864.seq
(B) TYPE: nuclÉ~otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURAT:LON: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
( B ) EMPLACEMENT' : 1 . . 2 4
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
GGA AGC TGC AGA GGC TTC 7.'AC CAcJ 24
Gly Ser Cys Arg Gly Phe Tyr Gln
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: nuclÉ:otide
(C) NOMBRE DE EiRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE;: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NC>N
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..26
(xi) DESCRIPTION DE L~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GAT CCT TCA ACC TTT ACC C'TG GTA GA 26
Asp Pro Ser Thr Phe Thr Leu Val
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
Page 5
CA 02269864 1999-06-18
2269864.seq
(B) TYPE: nuclé otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURAT:CON: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE : AI)Nc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..26
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GAT CTC TAC CAG GGT AAA C~GT TGAAG 26
Asp Leu Tyr Gln Gly Lys CTly
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
( i ) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE F3RINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE; : ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..26
(xi) DESCRIPTION DE I~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
GCG GCC GCT TCG AGC AGA C'.AT GAT AA 26
Ala Ala Ala Ser Ser Arg His Asp
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUEB; DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
Page 6
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2269864.seq
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURAT:CON: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..25
(xi) DESCRIPTION DE I~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CGA TCT CAA GGG CAT CGG 7.'CG ACG G 25
Arg Ser Gln Gly His Arg ~~er Thr
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
( i ) CARACTERISTIQUE~3 DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE;: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..27
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
GGG ATC CGC TGG CTG CTT P,GA GAC TGC 27
Gly Ile Arg Trp Leu Leu F,rg Asp Cys
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
Page 7
CA 02269864 1999-06-18
2269864.seq
(B) TYPE: nuclé otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURAT:CON: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
( B ) EMPLACEMEN7:' : 1 . . 2'7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
GGC GGC CGC CGG GAA GGG C~GG C.."GG CGG 2 7
Gly Gly Arg Arg Glu Gly Gly Arg Arg
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
( i ) CARACTERISTIQUE~3 DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: ~~0 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE; : ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CL>S
(B) EMPLACEMENT:1..50
(xi) DESCRIPTION DE L~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CAC GTG CTT GTT CTT TTT GCA GAA GCT CAG AAT AAA CGC TCA ACT GTG GC 50
His Val Leu Val Leu Phe F,la Glu Ala Gln Asn Lys Arg Ser Thr Val
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUE~; DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ç0 paires de bases
Page 8
CA 02269864 1999-06-18
2269864.seq
(B) TYPE: nuclé otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:;
(A) NOM/CLE : CDS
( B ) EMPLACEMEN7.' : 1 . . 5 0
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
CGT GGC CAC AGT TGA GCG 7.'TT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG AAC AAG CA 50
Arg Gly His Ser Xaa Ala Phe Ile Leu Ser Phe Cys Lys Lys Asn Lys
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ~>9 paires de bases
(B) TYPE: nuclÉ°otide
(C) NOMBRE DE E4RINS : simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE;: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..59
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
CGT GGC AGG CAG CAG GAC GCA CCT CCT TCT CGC AGT CTC TAA GCA GCC 48
Arg Gly Arg Gln Gln Asp p.la Pro Pro Ser Arg Ser Leu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
TTC GAA GCA TG 59
Phe Glu Ala
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
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2269864.seq
( i ) CARACTERISTIQUE~3 DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 53 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE E3RINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULF~ : ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..53
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
CTT CGA AGG CTG CTT AGA C~AC TGC GAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT GCC 48
Leu Arg Arg Leu Leu Arg Asp Cys Glu Lys Glu Val Arg Pro Ala Ala
1 5 10 15
TGC CA 53
Cys
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