COMPOSITIONS PESTICIDES, PLUS PARTICULIEREMENT INSECTICIDES, A BASE DE DITERPENES DE LA FAMILLE DES DAPHNANES

PESTICIDE, MORE PARTICULARLY INSECTICIDE, COMPOSITIONS, WITH BASE OF DITERPENES OF THE DAPHNANE FAMILY

English Abstract

The invention concerns pesticide, more particularly, insecticide compositions containing as active substance at least a diterpene of the daphnane family or a plant extract containing at least a diterpene of the daphnane family.

French Abstract

L'invention concerne des compositions pesticides, plus particulièrement
insecticides, comprenant comme substance active au moins un diterpène de la
famille des daphnanes ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène
de la famille des daphnanes.

Claims

25
REVENDICATIONS
1) Composition pesticide, plus
particulièrement insecticide, comprenant comme substance
active au moins un diterpène de la famille des daphnanes
ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène
de la famille des daphnanes.
2) Composition selon la revendication 1,
caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance
active au moins un composé de formule (I) ci-après ou un
extrait de plante contenant le(s)dit(s) composés:
<IMG>
dans laquelle:
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un
groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent
ensemble une double liaison entre les carbones (1) et
(2), ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent
ensemble un groupe de formule:

26
<IMG>
dans laquelle le groupement R17 représente
un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur
le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sent choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant
éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une
ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un
groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que
précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble
une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une
fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones
(6) et (7);
- les groupements R6 et R7 sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant
éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une
ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, un groupe
-OR16 dans lequel R16 a la même signification que
précédemment, ou encore R6 et R7 représentent ensemble
une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une
fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones
(1) et (2);
- le groupement R9 est choisi parmi un atome
d'hydrogène, une fonction cétone de formule =O ou un
dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal,
hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe
alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique
comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles

27
liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou
halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R26 a la même
signification que précédemment;
- les groupements R10, R13 et R14 sont
choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle,
alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique
comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles
liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou
halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même
signification que précédemment;
- le groupement R15 est choisi parmi un
atome d'hydrogène, une cétone de formule =O ou un dérivé
de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine,
aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle,
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans
lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome
d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle,
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16
dans lequel R16 a la même signification que
précédemment ;
- le groupement R8 représente un atome
d'hydrogène ou une liaison entre les carbones (10) et
(11) se substituant à la liaison entre les carbones (9)
et (11) pour donner au composé de formule (I) une
structure de type ingénane;
- le groupement R4 est choisi parmi un atome
d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle,
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonctions oxygénées ou halogénées.

28
3) Composition selon la revendication 2,
caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance
active au moins un composé de formule (I) ou un extrait
de plante contenant le(s)dit(s) composés de formule (I)
dans laquelle:
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un
groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent
ensemble une double liaison entre les carbones (1) et
(2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent
ensemble un groupe de formule :
<IMG>
dans laquelle le groupement R17 représente
un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur
le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sont des atomes;
d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison
entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de
formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R7 sont des atomes
d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison
entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de
formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement R9 est un atome d'hydrogène
ou une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de
cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone,

29
imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe
alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel
R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements R10 , R13 et R14
représentent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16
dans lequel R16 a la même signification que
précédemment ;
- le groupement R15 est un atome
d'hydrogène;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome
d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire,
ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou
plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions
oxygénées ou halogénées;
- le groupement R8 représente un atome
d'hydrogène;
- le groupement R4 est choisi parmi un atome
d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle,
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonctions oxygénées ou halogénées.
4) Composition selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle
comprend comme substance active au moins un des composés
choisis parmi l'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D,
ou un extrait de plante les contenant.
5) Composition selon l'une quelconque des
revendications des revendications précédentes,
caractérisée en ce que la substance active est un
extrait de Lasiosiphon kraussianus.
6) Composition selon l'une quelconque des
revendications des revendications précédentes,

30
caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou
plusieurs véhicules habituels des pesticides.
7) Utilisation des diterpènes de la famille
des daphnanes ou d'un extrait de plante contenant au
moins un diterpène de la famille des daphnanes et des
composés de formule (I) définis aux revendications 2 ou
3, comme pesticide, plus particulièrement comme
insecticide, dans la protection des cultures ou pour le
traitement des lieux de stockage des produits desdites
cultures ou des locaux domestiques ou publics.
8) Wikstrotoxine D substantiellement pure
obtenue à partir de racines de Lasiosiphon kraussianus.

Description

CA 02274012 1999-06-02
WO 98/24318 - PCT/FR97/02194
COMPOSITIONS PESTICIDES, PLUS
PARTICULI~REMENT INSECTICIDES, Ä BASE DE DITERP~NES DE
LA FAMILLE DES DAPHNANES.
La présente invention concerne de nouvelles
compositions pesticides, plus particulièrement
insecticides, comprenant comme substance active un
diterpène de la famille des daphnanes. L'invention
concerne également la préparation de ces diterpènes soit
par synthèse chimique, soit à partir d'extrait de
plantes.
L'utilisation intensive des insecticides de
synthè~.c favorise le développement de résistances (1) et
justifie la recherche de nouveaux insecticides.
Les plantes produisent, selon un même schéma
de bio~5~nthèse, des métabolites secondaires les
protégeant de l'attaque de divers herbivores (2). Ceux-
ci con~t:tuent une source très importante de substances
biologiquement actives et biodégradables mais dont peu
présent er.t des caractéristiques leur permettant de
concuT:E-~ncer les composés agrochimiques synthétiques.
Cep substances peuvent être utilisées comme
modèlt~= t~uz la préparation d'analogues susceptibles de
pré~~E.~::~ ~ : U~~s avantages par rapport au composé original
(3).
Lue:.- travaux ayant conduit à la présente
invf>.-w. i ~ :. ter. t e té réalisés dans le cadre d' un programme
de c: . i. ï n«t tie~ plantes sauvages du Soudan visant à
ident:'.:c~r cive nouveaux composés chimiques présentant des
activetE~:. agronomiques intéressantes. Parmi les
matérieàs analysés durant ce programme, l'exploitation
d'un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon
kraussianus (Meisn. ) (Thymelaeceae) a permis de
caractériser deux terpènes de la famille des daphnanes,

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connus sous les noms de Excoecariatoxine et
Wikstrotoxine D et répondant à la formule développée ci-
dessous .
O
~~4, I 5
12 ~'~ 16
13
1811m(I(~O~I~~) 14
O III II i" H
9 8
1 10
4 6 "~ ~~~
19 2 3
~ I OH ~
O OH OH
5 dans laquelle le groupement R représente,
- un groupe (E,E)-nona-1,3-diényle, dans le
cas de l'Excoecariatoxine, et
- un groupe nonanyle, dans le cas de la
Wikstrotoxine D.
LO
La plante Lasiosiphon kraussianus est
largement distribuée en Afrique (9), notamment à Darfour
à l'ouest du Soudan, où elle est connue sous le nom de
"Komma" ou "Mahjiria". Les racines sur lesquelles a été
l5 effectuée l'étude ayant conduit à l'invention ont été
collectées au Soudan dans le Jebel Marra, situé à Wadi
mertagello à 1160 mètres au dessus du niveau de la mer,
par K. Uhlig et A. A. Adam du Jebel Marra Forest Circle,
Golol au Soudan, où des spécimens sont conservés.
20 Une description détaillée de Lasiosiphon
kraussianus a déjà été réalisée (10) et les études
pharmacologiques effectuées à partir d'extraits de ses
racines ont permis d'obtenir des résultats intéressants
contre des types de leucémie (4, 5), mais aucune
activité insecticide n'a été décrite jusqu'à ce jour.
La présence d'Excoecariatoxine dans les
racines de Lasiosiphon kraussianus (6) et dans d'autres
T ~ __.____~ ~_... __.__. _. _..

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3
plantes comme Excoecaria agalloa (Euphorbiaceae) (6) et
Gnidia lamprantha (Thymelaeceae) (7) a déjà été décrite
dans l'art antérieur. La présence de la Wikstrotoxine D
dans des plantes, comme Wikstroemi monticola
S (Thymelaeceae) (8) a également déjà été rapportée mais
jamais dans Lasiosiphon kraussianus.
Les travaux effectués par les Inventeurs sur
un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon
kraussianus (Meisn. ) et sur les deux composés
diterpéniques de type daphnane qui en ont été isolés ont
maintenant permis de mettre en évidence d'intéressantes
propriétés qui permettent leur utilisation dans la lutte
contre certains insectes nuisibles.
IS I1 peut s' agir de parasites de végétaux ou
de parties de végétaux, du sol, des locaux domestiques
ou publics et d'animaux à sang chaud. Parmi-ceux-ci, on
peut citer les pucerons et les diptères, parasites
importants en agriculture et en santé et hygiène
vétérinaire et humaine.
En conséquence, l'invention concerne ies
compositions pesticides, plus particulièrement
insecticides) comprenant comme substance active au moins
un diterpène de la famille des daphnanes ou un extrait
de plante contenant au moins un diterpène de la famille
des daphnanes.
Par famille des daphnanes, on entend selon
l'invention également les produits apparentés aux
daphnanes, tels que les ingénanes.
Plus particulièrement l'invention concerne
les compositions insecticides comprenant comme substance
active au moins un composé de formule (I) ci-après ou un
' extrait de plante contenant le(s)dits composés) .

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~+
R, ~ R 1 ..
~2
( I)
R~ R11
R12
?- R10
dans laquelle .
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un
groupe alkyle, alkényle, aryle) linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent
ensemble une double liaison entre les carbones (1) et
(2), ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent
ensemble un groupe de fornnule .
Oi (~)
R1~~0_(14) (II)
0~
(9)
dans laquelle le groupement R1~ représente
un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées, ou encore le groupe R1~ est cyclisé sur
le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant
éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une
T
R9 H14

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ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un
groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que
précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble
une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une
fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones
(6) et (7);
- les groupements R6 et R~ sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant
éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une
ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées) un groupe
-OR16 dans lequel R16 a la même signification que
précédemment, ou encore R6 et R~ représentent ensemble
une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une
fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones
(1) et (2) ;
- le groupement Rg est choisi parmi un atome
d'hydrogène, une fonction cétone de formule =O ou un
dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal,
hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe
alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique
comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles
liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou
halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même
signification que précédemment;
- les groupements Rlp, R13 et R~q sont
choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle,
alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique
comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles
liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou
halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même
signification que précédemment;
- le groupement R15 est choisi parmi un
atome d'hydrogène, une cétone de formule =O ou un dérivé
de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine,
aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle,

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6
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans
lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome
d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle,
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16
dans lequel R16 a la même signification que
précédemment ;
- le groupement Rg représente un atome
d' hydrogène ou une liaison entre les carbones ( 10 ) et
(11) se substituant à la liaison entre les carbones (9)
IS et (11) pour donner au composé de formule (I) une
structure de type ingénane;
- le groupement Rq est choisi parmi un atome
d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle,
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonctions oxygénées ou halogénées.
Parmi les composés de formule (I) ci-
dessous, l'invention envisage plus particulièrement ceux
dans lesquels .
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle,
aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un
groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent
ensemble une double liaison entre les carbones (1) et
(2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent
ensemble un groupe de formule .
_~._ .._ _._..... T __~_ _._.:. .~.._m...

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Oi (13)
R17~ (II)
0-(14)
0~
(9)
dans laquelle le groupement R17 représente
un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou
cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs
doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées
ou halogénées, ou encore le groupe R1~ est cyclisé sur
le carbone (1) pour former des daphnanes macroçyliques;
- les groupements R11 et R12 sont des atomes
d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison
l0 entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de
formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R~ sont des atomes
d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison
entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de
formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement Rg est un atome d'hydrogène
ou une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de
cétone de type oxime, acétal) hémiacétal, hydrazone,
imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe
alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel
R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements Rip, R13 et R14
représentent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16
dans lequel R16 a la même signification que
précédemment;
- le groupement R15 est un atome
d'hydrogène;
le groupement R5 est choisi parmi un atome
d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire,
- 30 ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou
plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions
oxygénées ou halogénées;

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- le groupement Rg représente un atome
d'hydrogène;
le groupement R4 est choisi parmi un atome
d'hydrogène, un groupe alkyle) alkènyle, aryle,
linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement
une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs
fonctions oxygénées ou halogénées.
Parmi les composés ci-dessus, on peut citer
!0 tout particulièrement l'Excoecariatoxine, la
Wikstrotoxine D ou un extrait de plante, comme
Lasiosiphon kraussianus, les contenant.
Les composés de formule (I), constituant la
LS substance active des compositions pesticides de
l'invention, peuvent être synthétiques, hémisynthétiques
ou naturels.
Les composés naturels, comme
l'Excoecariatoxine la Wikstrotoxine D, peuvent être
20 obtenu< <~ partir de plantes, notamment comme décrit dans
les ex~,r;F~les ci-après à partir d'un extrait méthanolique
de rac_¿IE'f. dF Lasiosiphon kraussianus.
La Wikstrotoxine D n'ayant jamais été décrit
dan: ..a.-: c~; iphon kraussianus, l' invention envisage
25 spéc~~:quc~ment l'obtention de la Wikstrotoxine D à
partir c:~ rmcines Lasiosiphon kraussianus. Un procédé
d' oh; E-r:' :c,:: àe Wikstrotoxine D à partir de racines
La: :~~_ :y:: :. j::-aussianus consiste par exemple à
- extraire les principes actifs à partir
30 d' c~: c~~s:.~~_ v~<~~m~taux par exemple à l' aide de solvants;
- purifier les substances recherchées toute
opér at i <~:: cic~ purification appropriée.
Ues opérations de purification susceptibles
d'être- e~;p:oyées sont par exemple les opérations
35 suivantes . partage avec des solvants non miscibles,
chromatographie d'adsorption en phase polaire et en
T ~._~_

CA 02274012 1999-06-02
WO 98124318 ~ PCT1FR97/02194
phase inverse, gel filtration; opérations qui sont tout
d'abord effectuées à une échelle préparative, puis en
HPLC pour obtenir les produits purs.
Ces composés, ainsi que leurs analogues et
_5 dérivés peuvent aussi être obtenus par synthèse ou
hémisynthèse.
Outre la substance active, les compositions
de l'invention peuvent contenir un ou plusieurs
véhicules habituels des pesticides et insecticides, tels
que des solvants, des mouillants, des dispersants,
etc....
Ces compositions peuvent se présenter sous
forme de poudres, granulés, suspensions, émulsions,
solutions, ou autres formulations traditionnellement
employées dans ce domaine et permettant divers modes
d'applications comme l'épandage, la pulvérisation,
etc...
La dose à appliquer varie àvec le composé
mis en oeuvre, le type de composition utilisée et son
mode d'application, et dépend en outre de la nature du
parasite à combattre ainsi que de l'espèce végétale ou
du lieu à protéger, mais en général les compositions de
l'invention peuvent contenir de 5 à 80 ~ en poids de
substance active.
L'invention concerne bien entendu aussi
l'utilisation des composés de formule (I) comme
pesticides, plus particulièrement comme insecticides,
dans la protection des cultures ou pour le traitement
des lieux de stockage des produits desdites cultures ou
des locaux domestiques ou publics.
- D'autres avantages et caractéristiques de
l'invention apparaîtront au cours de la description qui
suit et qui se réfère à des exemples de préparation des
composés de formule (I) et de leur utilisation comme

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pesticides, étant entendu que ces exemples ne sauraient
constituer une limitation quelconque de l'objet de
l'invention.
Dans ces exemples, il est fait référence aux
5 dessins en annexe, dans lesquels .
- La figure 1 représente le chromatogramme
d'HPLC préparative en phase inverse sur fraction brute
de l'extrait étudié.
- La figure 2 représente le chromatogramme
10 d'HPLC analytique en phase inverse sur
l'Excoecariatoxine après la collecte.
I - MATÉRIEL ET MÉTHODES.
IS 1) Matériel véaétal.
Les racines ont d'abord été découpées puis
séchées pendant deux semaines avant d'être transportées
en France, où elles ont été étendues et stockées à la
température ambiante (20°C). Elles ont ensuite été
broyées pour être utilisées sous forme de poudre.
a) Extraction.
700 g de de la poudre de racine ont été
placés dans un flacon conique de 2 litres. 1200 ml de
méthanol ont été ajoutés et le flacon a été agité
pendant deux heures puis laissé une nuit au
réfrigérateur. Après filtration sous vide, une
extraction supplémentaire a été pratiquée avec 600 ml de
méthanol sur le culot solide séché. Les deux filtrats
ont été rassemblés et évaporés avec un évaporateur
rotatif (40°C) sous vide partiel. L'extrait concentré a
été finalement dissous dans 25 ml de méthanol, dont 5 ml
ont été utilisés pour les essais biologiques grossiers.
b) Fractionnement.
L'extrait méthanolique (20 ml) a été
suspendu dans 40 ml d'eau et partagé dans du
T -_._~~~_.. -._____

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WO 98/24318 . PCT/FR97/02194
11
dichlorométhane (2 fois 60 ml). La fraction non polaire,
où l'activité a été mise en évidence, a ensuite été
chromatographiée sur une colonne de gel de silice (40 cm
x 2,5 cm). 80 g de gel de silice, dont les particules
ont une taille comprise entre 0,063 et 0,125 mm (120-130
mesh ATSM), ont été. conditionnées dans du
dichlorométhane. Pour l'élution, la fraction a été
soumise à une chromatographie avec un gradient de
dichlorométhane jusqu'à un mélange
dichlorométhane/acétate d'éthyle/méthanol (0/60/40,
v/v), à un débit de 3 ml/mn (Matériel Waters . formeur
de gradient modèle 600). Soixante tubes (18 mm x 180 mm)
contenant 16 ml chacun, ont été collectés. Tous les
tubes ont été soumis à un contrôle par une
chromatographie en couche mince (CCM) (Polygram sil G/UV
254, épaisseur de couche 0,25 mm, Macherey-Nagel), élués
avec un mélange héxane/acétate d'éthyle (30/70, v/v), et
observés sous lumière UV à 254 nm puis rassemblés en 11
fractions. L'activité insecticide à été montrée dans les
fractions No. 3, 4, 9 et 10.
Les fractions 9 et 10 ont été rassemblées et
rechromatographiées par gel filtration (Colonne . 1,3 m
x 2,5 cm. Support . Sephadex LH 20 Pharmacia, particules
de taille entre 25-100 ~.un, conditionné dans du méthanol.
Phase mobile . méthanol délivré à 2 ml/mn par une pompe
Gilson 301. Détection . détecteur UVICORD LKB, longueur
d'onde = 254 nm. Collecteur de fractions . Foxy, isco).
Cinquante six tubes (13 mm x 100 mm) de 7 ml chacun ont
été collectés. Après contrôle en CCM, tous les tubes ont
été rassemblés en 6 fractions. L'activité biologique a
- été mise en évidence dans la fraction 4, qui a alors été
soumise à une HPLC préparative en phase inverse (Waters
- 600, mufti solvent delivery system; Injector U6K;
Detector Waters 990, photodiode array detector; Colonne
. ~.-BONDAPAK C 18 Water ' s ( 3 0 cm x 7 , 5 mm; tai l le des
particules . 10 Nzn; température de la colonne . 45°C);

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Computer . NEC, APCIII; Plotter . Waters 990). Les
conditions isocratiques étaient de . débit de 3,7 ml/mn;
phase mobile MeOH/H20 (74/26, v/v}. Chaque pic a été
collecté manuellement.
2) Insectes et acariens.
Tous les insectes (Aphis gossypii (Glov),
Myzus persicae (Sulz), Drosophila melanogaster (Meig),
Spodoptera littorales (Boisd), Sitophilus granarius L.
et l'acarien Tetranychus urticae (Koch) sont des souches
sensibles. Ils sont élevées dans des conditions
contrôlées (20 ~ 2°C, 60 ~ 10 ~ R.H. et
8 h/16 h de nuit/lumière}. A. gossypii a été élevé sur
des plantules de concombre, M. persicae sur des fèves,
IS Drosophila sur un milieu semi-synthétique, S. granarius
sur du blé, S. littorales sur un régime semi-synthétique
et T. urticae sur des haricots.
3 ) Tests biolocrigues.
a) Activité contre A. ossypii et M.
Persicae.
Ces tests ont été effectués dans des boîtes
de 2,7 cm de diamètre. Ces boîtes ont été remplies d'un
gel semi-solide agar-agar. Des disques de feuilles de
concombre (de fève dans le cas de M. persicae) ont été
placés sur l'agar. Deux à trois heures avant le
traitement, quinze aptères adultes ont été placés dans
chaque boîte pour s'adapter. Deux boîtes ont été
utilisées pour chaque dose. De l'eau déionisée et de
l'acétone (80/20, v/v) ont été utilisés pour la
préparation de cinq dilutions (en progression
géométrique) pour chaque produit. 0,5 ml de chaque dose
a été directement pulvérisé sur les deux boîtes en
utilisant un micropulvérisateur (acétone/eau dans le cas
.__._~ _._._._____ T ____.~.__ _. __- __

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du contrôle), puis les boîtes ont été placées dans les
conditions contrôlées décrites précédemment.
Les pucerons morts ont été comptés après 24
heures (A. gossypii) ou 48 heures (M. persicae) après
l'application. Les insectes ont été considérés morts si
ils se présentaient sur le côté ou sur le dos, avaient
leurs pattes repliées sur la surface ventrale,
montraient des signes de dessiccation, et/ou ne
répondaient pas à un coup de pinceau (11). Les
pourcentages de mortalité, y compris dans les tests ci-
dessous, ont été corrigés par la formule d'Abbott et les
valeurs CL5o ont été calculées par la méthode d'analyse
des probits (12) en utilisant un logiciel spécial (13).
IS b) Activité contre la Drosophile.
- Incorporation au milieu.
Le test de toxicité globale a été effectué
dans de petits flacons de 7 cm de hauteur et 4,2 cm de
diamètre. 35 grammes de milieu semi-synthétique
?0 (2,2 1 de son; 260 mi de sucre; 130 ml de levure de
bière ; 70 ml de vinaigre ; 20 ml de nipagine; 580 ml
d'eau) ont été placés et pressés dans chaque flacon.
Chaque traitement a été effectué en double. Dans chaque
flacon, 1 ml de chaque concentration a été incorporé
25 dans le milieu (acétone et eau dans le cas du contr8le).
Deux à trois heures après le traitement (temps
d'évaporation de l'acétone), 15 adultes de 0 à 3 jours
(10 femelles. et 5 mâles) ont été placés dans chaque
flacon. Les flacons ont été bouchés avec un coton et
30 remis dans les conditions de culture. Les adultes ont
- été enlevés des flacons lorsque dans le témoin quelques
larves se sont transformées en pupes (environ après 13
jours). Le nombre d'adultes a été compté tous les deux
jours pendant deux semaines (7 lectures). Le pourcentage
35 d'émergence a été calculé par rapport au témoin et les

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valeurs CL5o ont été calculées par la méthode indiquée
précédemment .
- Test tot~icrue.
Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre ont
d'abord été lavées avec de l'éther éthylique. De petits
cubes de gel d'agar (10 g d'agar/1 et une petite
quantité de miel) ont été placés dans chaque boîte de
Petri. Les insectes ont été refroidis pendant 2,5
minutes. 0,3 ~.,ll de chaque concentration (méthanol dans
le cas du contrôle) ont été appliqués sur le thorax en
utilisant un micro-applicateur automatique (Burkard
manufacturing co. ltd., UK). Dix insectes ont été
utilisés dans chaque traitement avec trois répétitions.
Après le traitement, les insectes du test sont remis
l~ dans leurs conditions de culture. La mortalité a été
mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48 heures.
- Application par contact.
Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre avec
ou sans papiers filtres ont été utilisées. Dans les deux
cas, 1 ml de chaque concentration (méthanol pour le
contrôle) a été placé dans chaque boîte. Après
évaporation du solvant, les petits cubes alimentaires
cités précédemment et 30 insectes ont été placés dans
les boîtes. Chaque traitement a été répété 3 fois et la
mortalité a été mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48
heures.
c) Activité contre Spodo~tera littoralis.
- Application topique.
Des larves de troisième stade (35 ~ 10 mg)
ont été utilisées. 0,5 ~l de chaque concentration
(méthanol pour le contrôle) ont été appliqués
topiquement sur le thorax de chaque larve. Chaque larve
traitée a été placée dans une boîte séparée de 2,7 cm de
diamètre) approvisionnée en milieu non traité puis
replacée dans les conditions de culture. Chaque
..... _ T.. . .__~..___ ._.___ .._ m . __._

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traitement incluant dix larves et un témoin a été
effectué en double. La mortalité a été mesurée après 24
et 48 heures. L'effet sur la croissance et le
développement a été quantifié chez les insectes par
l'apparition de nouveaux adultes.
- Application orale.
Les insectes (troisième stade larvaire) ont
été privés de nourriture pendant 24 heures . A chaque
petit cube de régime semi-synthétique (3,2 1 d'eau, 80 g
I() agar-agar, 300 g de farine de maïs, 126 g de germes de
blé, 134 g de levure de bière, 200 g de feuilles de
chou, 18 g d'acide ascorbique, 4,2 g d'acide benzoïque,
7,2 g de nipagine, 10 g d'un mélange de sel, 30 g de
vitamines, 5 g de fumidil, 1,5 ml de formaldehyde, 8 ml
I> d'huile de lin), 0,25 E1.1 de chaque concentration
(méthanol pour le contrôle) ont été appliqués. Après
évaporation du solvant, un cube traité a été placé par
boîte de 2,7 cm de diamètre. Les larves ont été soumises
à une alimentation avec le milieu traité (dix larves
pour chaque concentration). Une alimentation non traitée
leur a été donnée après 24 heures. La mortalité a été
déterminée 24 et 48 heures après le traitement. Les
insectes ont été observés jusqu'à l'apparition de
nouveaux adultes pour enregistrer l'effet sur la
croissance et le développement.
d) Activité contre Sitot~hilus aranarius.
- Application tooiaue.
Des adultes de 15 jours ont été utilisés
dans ce test. 0,5 ~.~.1 de chaque concentration (méthanol
pour le contrôle) ont été appliqués topiquement sur le
thorax de chaque insecte en utilisant un micro
applicateur. Pour chaque traitement, 25 insectes traités
ont été placés dans de petits flacons de 7 cm de hauteur
et 4,2 de diamètre avec une petite quantité de blé et

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les bouteilles ont été fermées avec une gaze. Chaque
traitement y compris le contrôle a été répété deux fois.
Pour la toxicité aiguë, les mesures de
mortalité ont été effectuées après 24, 48 et 72 heures.
Pour les effets sur le développement, les adultes ont
été retirés des bouteilles après deux semaines et le
nombre d'insectes nouvellement apparus a été compté
pendant huit semaines. Le nombre total d'insectes
nouvellement émergés a été comparé à ceux du témoin
comme décrit précédemment.
e) Activité contre Tetranychus urticae.
- Activité contre les adultes.
La méthode adoptée dans ce test est
lï sensiblement identique à celle utilisée pour les
pucerons. Des boîtes de 2,7 cm de hauteur et 4,5 cm de
diamètre ont été remplies avec un gel semi-solide
d'agar-agar supportant un disque de feuille de haricot.
Trente adultes ont été placés dans chaque boîte pendant
trois heures avant le traitement pour s'adapter. Deux
boîtes ont été utilisées pour chaque concentration.
0,5 ml de chaque concentration (méthanol pour le témoin)
ont été directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans
tous les cas, les boîtes ont été remises dans les
conditions de culture. La mortalité a été mesurée après
24 et 48 heures.
- Activité contre les neufs.
Vingt adultes ont été placés dans les boîtes
décrites ci-dessus pendant 48 heures. Les adultes ont
ensuite été retirés et les neufs comptés. Deux boîtes
ont été utilisées pour chaque concentration. 0,5 ml de
chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été
directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans tous
les cas) les boîtes ont été remises dans les conditions
de culture. Le nombre d'oeufs non-éclos et de larves
mortes a été compté pendant 7 jours.
.. _...__ _. ~ _. _ _._

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4) Analyse spectroscopiaue.
a) Spectrométrie de masse.
Les spectres conventionnels (MS) ou d'ions-
descendants (MS-MS) ont été obtenus avec un triple
quadrupole Nermag R30-10 (Quad Service, Poissy, France).
Les conditions suivantes de la source ont été adoptées .
température de 130°C; courant dans le filament de 50 ).1,A;
énergie des électrons de 95 eV; NH3 et ND3 comme gaz
réactif et la pression dans 1e compartiment source a été
fixée à 10'4 Torr. Les spectres d'ions-descendants ont
été obtenus avec une énergie de collision de 20 eV et de
l'argon à 7 x 10-2 Torr comme gaz de collision dans le
second quadripole. L'introduction des échantillons a été
IS réalisée par désorption-ionisation chimique (DCI) en
modes positif ou négatif.
b) Résonance maanétique nucléaire.
Les deux composés, Excoecariatoxine et
Wikstrotoxine D, ont été soumis à une analyse RMN H1
(Varian Gemini, 300 Mhz) dans une solution de CDC13 en
utilisant le signal CHC13 comme référence interne (7,27
pPm)
II - RÉSULTATS.
1) Activité de l'extrait brut.
Les travaux réalisés à partir de l'extrait
méthanolique de racine de Lasiosiphon kraussianus
(Meisn) (Thymelaeaceae) décrit ci-dessus ont permis
d'étudier l'activité insecticide sur cinq types
d'insectes et un acarien avec différents modes
d'application. La concentration utilisée dans les tests
de pulvérisation a été de 24 ~L1 d' extrait mélangés à
576 ~,.t,l d'eau distillée, et 0,5 ml de cette solution ont
été directement pulvérisés sur ces insectes. Dans les

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1~
autres tests décrits précédemment, l'incorporation au
milieu alimentaire, le contact, les applications
topiques et les tests acaricides) l'extrait concentré a
été utilisé directement sans dilution.
Le tableau I ci-dessous montre l'effet de
l'extrait brut sur quelques insectes et un acarien.
Tableau I
Insectes A lication Mortalit (~)
A. oss ii ulvrisation 83,3
Contact 93
D. melanogaster Topique 0
Milieu 100
S. ranarius to i e 0
S. littoralis topique 0
Milieu 0
T. urticae Adulte 0
Oeufs 41,7
L'extrait brut présente une efficacité
importante contre Aphis gossypii auquel il cause une
mortalité de 83,3 ~ après 24 heures, contre Drosophila
melan ogaster avec 100 ~ de mortalité lorsqu'il est
incorporé au milieu et 93 ~ par contact, ainsi que vis-
IS à-vis des neufs de T. urticae avec un pourcentage de
41,7 ~. Aucun effet n'a été observé contre S. Iittoralis
et S. granarius.
2) Activité de fractions de l'extrait brut.
L'extrait a été fractionné et l'activité a
été identifiée dans une fraction non polaire
chromatographiée sur un gel de silice. Pour les tests
biologiques, chaque fraction a été reprise dans 2 ml
d'acétone et 24 ~.~.1 de celle-ci ont été ajoutés à
576 E1,1 d'eau distillée. 0,5 ml de cette solution ont été
pulvérisés sur A.gossypii. Plusieurs fractions
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(fractions 3, 4, 9 et 10) présentant des activités
insecticides significatives ont été obtenues. Après
chromatographie sur une colonne sephadex LH-20, une
activité a été mise en évidence dans la traction 4.
î Cette fraction a alors été soumise à une HPLC
préparative en phase inverse dont le chromatogramme est
représenté à la figure 1. Chaque pic a été collecté
manuellement, concentré puis repris dans 2 ml de
solvant. Les pics actifs sont ceux dont les temps de
rétention sont de 28,84 et 53,90 minutes. Les deux
fractions ont alors été soumises à une identification et
des test:: d'activité plus précis contre trois insectes .
A. Boss}fie _ , M. persicae et D. melanogaster.
3) Identification et caractérisation de
1 ' EXCOEeCc~iz~Loxine et de la Wikstrotoxine D.
L'analyse par spectrométrie de masse (MS et
MS-MS) <~t spectrométrie RMN a révélé que ces deux
compos«:- ~~.-;. i f s sont des diterpènes avec un squelette de
type da~-~:::,n:ic~ répondant à la formule ci-dessous
17
15 16
~ u ~ 'i.
4 6 ,. W O
3 5
~~a:~r laquelle le groupement R représente,
sn groupe (E,E)-nona-1,3-diényle) dans le
cas a~ : ~ E.~c~~~-cariatoxine {[a]D+61, 0 (c=0, 190 CH2C12) } ,
et
- un groupe nonanyle, dans le cas de la
Wikstrotox.ine D {(OC]D+17, 3 (c=0) 643 CH2C12) } .
O ~ d1 Q-I

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La masse moléculaire de ces composés,
considérée de 528 pour l'Excoecariatoxine et de 532 pour
la Wikstrotoxine D, selon l'analyse NH3-DCI-MS (les ions
à m/z 529 et 533 étant les espèces MH+ en mode positif
S et les ions à m/z 528 et 532 correspondant à M-° en mode
négatif). Le spectre ND3-DCI dans le mode positif
contenant des ions à m/z 533 et 537 a confirmé ces
masses moléculaires et indiqué en outre la présence de
trois atomes d'hydrogène échangeables dans les deux
10 composés.
Afin de disposer d'information et de preuves
supplémentaires sur les structures supposées de ces
composés) les spectres d'ions-descendants des ions MH+
ou des ions M-° ont été réalisés. En mode positif, par
15 exemple, la décomposition sous collision des espèces MH+
s'effectue principalement selon deux voies conduisant
d'une part à l'ion m/z 151 (Excoecariatoxine) ou 155
(Wikstrotoxine D) correspondant à une structure RCO+
avec R représentant la chaîne latérale, et d'autre part,
20 pour les deux composés, à l'ion m/z 361 après
élimination d'une molécule RC02H.
Les spectres de RMN H1 ont été enregistrés
et ont conduit à des données spectroscopiques identiques
à celles rapportées dans la littérature (8) .
Excoecariatoxine {b(ppm), J(Hz)}
7, 64 (bs, H-1) ; 6, 71 (dd, 15, 8, H-23) ; 6, 04
(dd, 15, 8, H-24); 5,83 (dt, 15, 7, H-25); 5,72 (d, 15,
H-22);5,04 , 4,92 (2bs, H-16); 4,42 (d, 2, H-14); 4,25
(bs, H-5); 3,85 (2m, H-20); 3,44 (bs, H-7); 2,83 (d, 2,
H-8); 2,48 (m, H-11); 2,05-2,2 (m, H-12); 1,78 (bs, 6H,
H-17, H-19); 1,22 (d, H-18); 0,91 (t, H-30).
Wikstrotoxine D {S(ppm), J(Hz)}
7,62 (bs, H-1); 5,04 , 4,92 (2bs, H-16);
4,38 (d, 2, H-14); 4,26 (bs, H-5); 3,83 (2m, H-20); 3,43
(bs, H-7); 2,91 (d, 2, H-8); 2,45 (m, H-11); 2,2 (3, H
.._ .. j ._.__. ~._. ___~ _.

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12); 1,78 (bs, 6H, H-17, H-19); 1,16 (d, H-18); 0,89 (t,
H-30).
4) Essais comparatifs.
.5 L'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D ont
été comparés à deux insecticides bien connus, la
deltaméthrine et le méthomyl, deux composés présentant
un profil dose-dépendant vis-à-vis de Aphis gossypii et
Drosophila melanogaster. Le tableau 2 ci-dessous
IO rapporte les valeurs CLSO (~g/ml) de l'Excoecariatoxine,
la Wikstrotoxine D, la deltaméthrine et le méthomyl.
Tableau 2
A. oss ii M. ersicae D. melano aster
Excoecariatoxine 18,7 89,8 18,7
Wikstrotoxine 17,0 53,1 22,6
D
Mthom 1 2,03 7,87 38,9
Deltamthrine 0,0570 0,0316 1,42
Les deux composés naturels présentent une
15 activité similaire sur A. gossypii. Avec des CL5o
respectivement de 2,03 , 18,7 et 17,0 ~,~.g/ml, le méthomyl
est environ 9 fois plus actif que l'Excoecariatoxine et
la Wikstrotoxine D. L'activité des deux composés
naturels et du méthomyl sur M. persicae est inférieure à
20 celle contre A. gossypii. Le méthomyl est environ 7 fois
plus actif que la Wikstrotoxine D et 11 fois plus que
l'Excoecariatoxine.
Les deux composés naturels présentent
également une activité similaire vis-à-vis de
25 D. melanogaster (incorporation au milieu), et sont
environ 2 fois plus actifs que le méthomyl. Cette
activité montre une persistance favorable des deux
composés.
Les insectes examinés ont été sélectionnés
30 aléatoirement afin de démontrer les diverses activités
susceptibles de se produire et de démontrer les

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différences d'activité entre les deux composés naturels
et d'autres composés du commerce. Les essais biologiques
montrent que les deux composés présentent une activité
variable selon les insectes. Ils sont actifs sur
A. gossypii) M. persicae et D. melanogaster mais aucune
activité n'a été mesurée sur S. littorales et
S. granarius. Ceci pourrait indiquer que les diterpènes
de type daphnane présentent une certaine spécificité et
donc pourraient réduire les risques vis-à-vis
I~ d'organismes favorables qui semblent avoir un rôle
éventuel dans les programmes de protection intégrée
d'insectc~~. Ceci pourrait être attesté par le fait que
les dei:>: composés sont des produits naturels et, en
conséquence, pourraient être dégradés plus rapidement
IS dans ?'environnement que d'autres pesticides
conventionnels.
Les études déjà réalisées avec l'extrait
méthane: ique de cette racine de plante ont permis de
montre:- une activité contre les leucémies lymphocytaire
20 p-38f~ ~~i et d'autres maladies (14). La toxicité de cet
extra~~ ~~ ot~- examinée chez la souris, le rat, le lapin,
le chm~:~. c>c l'iléum ou le coeur isolé de lapin (14) .
Les au:c~u:~~ ayant rapportés ces études de toxicité aiguë
che_~. 1 ~-:-. souris ont estimé la valeur de la DL5 o
25 respc~~~. : :~e~mer.t à 27, 1 et 330 mg/kg après des
ad:r -:.1 ~ v r a v : or.:~ orale et intrapéritonéale . Dans les
étudE~: c:~ -_-~r.:cité chronique réalisées chez des rats
al ime::- ~~: r~~,~e~c cet extrait pendant 6 mois, ils n' ont
ob:~w ~.~~ :,... .... :signe clinique de toxicité et aucune grave
30 lés _ c~:. r. ~~ r ~ F détectée lors des examens postmortem, ce
qui F~~~: n:~ t c~E~ conclure que cet extrait à une dose de
2 mg r. c: ;~t~: oç n'est pas toxique chez les souris, les
rats f': lE~: i~pins. Ces résultats supportent l'intérêt
des co:r:po:;E~:- de l' invention, car il est nécessaire de
35 disposez de nouveaux insecticides ciblés, biodégradables
et tolérés par l'environnement.
___. _. __...__ 1 _. __._

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