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WO 98/42391 PCT/FR98/00595
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PROCEDE DE STIMULATION DE LA REGENERATION NERVEUSE
La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en
particulier de la biologie médicale du système nerveux. Elle concerne plus
particulièrement des méthodes de stimulation de la régénération nerveuse,
applicables aussi bien sur les nerfs périphériques que dans le système
central, et en particulier la moelle épinière. De part leur caractère local et
spécifique, les méthodes de l'invention peuvent être utilisées pour stimuler
la
régénération nerveuse dans différentes situations pathologiques, et en
particulier dans des cas de lésions de la moelle épinière, de nerfs
périphériques, du plexus brachial ou lombaire.
Les lésions du système nerveux aussi bien central (SNC) que
périphérique (SNP) sont fréquentes en traumatologie et dramatiques. Ainsi,
les lésions médullaires, qu'elles soient d'origine traumatique ou
dégénérative, les lésions de nerfs périphériques, les lésions de plexus
brachial ou lombaire, laissent à ce jour les blessés ou malades lourdement
handicapés à vie. Bien que le SNP possède une forte capacité à régénérer
spontanément, l'utilisation de techniques classiques de réparation des nerfs
ne donne que des résultats décevants. Ces techniques sont principalement
composées par l'anastomose directe ou la pose d'un greffon nerveux
autologue ou hétérologue lorsque les tensions sont trop importantes pour
permettre la suture des deux extrémités nerveuses (en cas de perte de
substance, ou de lacération excessive du nerf demandant la résection d'un
segment nerveux). Avec ces techniques, moins de 5% des patients ayant
reçu une réparation du nerf médian au niveau du poignet retrouvent une
sensation ou une motricité normale après 5 ans (~ ).
Plus récemment, l'utilisation de prothèses tubulaires joignant les extrémités
d'un nert lésé (technique de manchonnage) a offert une alternative à ces
techniques classiques de réparation des nerfs (2,3). Cette technique offre
l'avantage de simplifier les conditions de réalignement des faisceaux
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nerveux, et a permis de ponter avec succès, à la fois expérimentalement
mais aussi cliniquement, des petites pertes de substance (jusqu'à 5-7 mm (~-
6)). Cependant, il apparait que pour ponter des pertes de substance d'une
taille supérieure l'adjonction de substances neurotrophiques ou de cellules à
l'intérieur des tubes est indispensable. Expérimentalement, plusieurs facteurs
tels les FGF-1 et -2, ou le NGF en application in vivo dans le tuteur (7-10),
ou encore le CNTF ou l'IGF II en application systémique ont été testés, sans
pour autant démontrer clairement leur rôle sur la régénération nerveuse (7
12), par ailleurs, il n'existe actuellement aucun traitement clinique des
lésions de la moelle épinière.
La présente invention apporte une solution à ce problème du traitement des
lésions nerveuses, traumatiques ou dégénératives. La présente invention
concerne en effet un méthode de stimulation de la régénération nerveuse au
moyen d'un manchon biocompatible et d'une composition d'acides nucléique
codant pour des facteurs neurotrophiques. La présente invention concerne
également un dispositif pour stimuler la régénération nerveuse comprenant
un manchon biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression
d'un facteur de stimulation de la croissance nerveuse (facteur
neurotrophique). Un autre aspect de l'invention est relatif à un kit pour la
stimulation de la régénération nerveuse comprenant d'une part un manchon
biocompatible et d'autre part une composition comprenant un système
d'expression d'un facteur de stimulation de la croissance nerveuse. La
présente invention concerne égaiement l'utilisation, pour la préparation d'une
composition destinée à stimuler la régérénation nerveuse, d'un manchon
biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur
neurotrophique.
La présente invention est en outre applicable aussi bien à la régérénation
des nerfs périphériques que pour stimuler la régérénation axonale dans la
moelle épinière.
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La présente invention découle de plusieurs observations. Elle découle en
particulier de ia mise en évidence qu'il est possible de rétablir
chirurgicalement entre deux sections d'un nerf un pont physique au moyen
d'un dispositif approprié, et d'introduire dans ce dispositif un système
d'expression d'un facteur neurotrophique. Elle découle égaiement de la mise
en évidence qu'il est possible d'induire une concentration locale de facteurs
trophiques, pendant une durée suffisante pour stimuler la croissance
neuronale. La présente invention combine ainsi plusieurs propriétés
particulièrement avantageuses sur le plan thérapeutique. Elle permet tout
d'abord un action durable, grace à un effet de libération prolongé du facteur
trophique. L'effet biologique du facteur neurotrophique est de plus
potentialisé par l'effet tuteur du manchon, qui permet d'accelerer et de
guider
la croissance neuronale. La méthode de l'invention permet également une
action très locale et donc très spécifique, les facteurs trophiques étant
cloisonés dans un dispositif étanche, sur le site du traumatisme ou de la
dégénérescence. Les résultats présentés dans les exemples montrent à cet
effet que la méthode de l'invention permet une réparation de nerfs rapide,
efficace et locale.
La méthode de l'invention consiste plus particulièrement à intervenir
localement au niveau d'une section nerveuse. La section proximale ou
distale du nerf ou faisceau sectionné est introduite à une extrémité d'un
manchon biocompatible, où elle est maintenue physiquement en place. Un
composition comprenant un système d'expression d'un facteur
neurotrophique est ensuite introduite dans ledit machos. La deuxième
section du nerf ou faisceau sectionné est alors introduite à l'autre extrémité
du manchon, où elle est également maintenue en place physiquement. Pour
éviter une diffusion du système d'expression hors du manchon, celui-ci est
avantageusement ligaturé etlou maintenu par une colle biologique au niveau
des extrémités. Ce dispositif peut en outre permettre de nouvelles injections
de systèmes d'expression. La présence à la fois du support et du facteur
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neurotrophique en concentration élevée et pour une durée prolongée permet,
comme illustré dans les exemples, de reconstituer une continuité nerveuse et
ainsi, de restituer l'activité correspondante.
De manière plus spécifique au système nerveux périphérique, la méthode de
l'invention consiste à prendre un nerf périphérique ou une racine sous
jacente à la lésion et à mettre en place un manchon biocompatible après
résection d'une partie du nerf ou de la racine. La partie proximale de la
section, qu'elle soit motrice ou sensitive, est introduite dans le manchon et
maintenue en place, par exemple par suture ou par pose de colle biologique.
Le système d'expression codant pour le facteur actif est injecté dans ce
manchon, qui est laissé en place. La partie distale de la section est alors
retranchée à l'autre extrémité du manchon permettant ta restitution d'une
continuité axonale (Figure 1 ).
Au niveau du système nerveux central, et en particulier médullaire, la
méthode de l'invention est également particulièrement adaptée pour ponter
les lésions de la moelle épinière. Ce type de traumatisme constitue d'ailleurs
l'une des applications principales du système de l'invention, et pour
lesquelles aucun traitement clinique n'existe à ce jour. Deux types
d'applications peuvent être envisagés : soit le pontage des afférences
périphériques sous-jacentes à une lésion à la moelle saine sus-jacente à
cette lésion (Fig.S), soit le pontage de la moelle saine sus jacente à une
lésion, à la moelle sous jacente à cette lésion (Fig 6).
Dans le premier cas. une ou plusieurs racines sous-jacentes à une lésion
médullaire (Fig.SA) sont sectionnées. introduites dans une prothèse tubulaire
(manchon) et maintenues en place à l'aide de sutures et de colle biologique.
Le tuteur peut alors recevoir des systèmes d'expression portant des gènes
suceptibles de stimuler l'élongation axonale des motoneurones; et/ou
éventuellement différents facteurs connus pour stimuler la repousse axonale
tel un greffon nerveux périphérique, ou des cellules. Le tuteur est alors
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introduit dans une incision longitudinale réalisée dans ia moelle saine sus-
jacente à la lésion de manière à ce que l'extrémité proximale du tube affleure
ia corne antérieure de la sustance grise (lieu de localisation des
motoneurones spinaux). Le tuteur est fixé par une ou plusieurs sutures à
5 l'arachnoïde et de ia colle biologique (Fig.SB). Un tel montage peut ainsi
redonner une fonctionnalité à certains muscles vitaux.
Dans le second cas la partie lésée de la moelle est excisée et un tuteur est
implanté en amont et en aval de manière à joindre les principaux faisceaux
(pyramidal, corticospinal etc..) entre les parties sus- et sous-lésionelles
(Figure 6). Le tuteur est ensuite empli des mêmes substances que
précedemment.
Dans le cadre de l'invention, on entend par partie proximale de ia section, ou
partie proximale du nerf, la partie du nerf qui est en contact avec le système
nerveux central. S'agissant d'un nerf périphérique, sa partie proximale est
celle connec#ée à la moelle épinière. S'agissant d'une lésion de la moelle
épinière, la partie proximale est celle qui est en contact avec le système
nerveux central.
On entend également par partie distale de la section, ou partie distale du
nerf, la partie périphérique du nerf. S'agissant d'un nerf périphérique; sa
partie distaie est donc celle connectée à la plaque motrice (jonction
neuromusculaire). S'agissant d'une lésion de la moelle épinière, la partie
distale est celle qui se trouve déconnectée du système nerveux central.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, le manchon peut être constitué de tout
dispositif compatible avec une utilisation thérapeutique. La structure et la
composition du manchon sont avantageusement définies de sorte que (i) il
restitue une continuité axonale, (ii) il puisse contenir une composition
comprenant un système d'expression de facteurs actifs, (iii) il puisse servir
de tuteur à la repousse axonale, aussi bien de la moelle épinière vers la
périphérie, de la périphérie vers la moelle épinière, que de la moelle
épinière
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vers la moelle épinière. La propriété de tuteur du manchon s'exerce par la
faculté des nerfs d'adhérer et de pousser sur celui-ci, en particulier sur sa
face interne. L'adhérence peut résulter de toute forme d'interaction
biologique et/ou chimique et/ou physique entraïnant l'adhésion etlou la
fixation des cellules sur le manchon. Par ailleurs, pour des applications en
thérapie humaine, il est également souhaitable que ie manchon soit de type
imperméable ou semi-perméable, mais ne permettant pas la passage du
système d'expression.
Avantageusement, le manchon est un support solide, non toxique et
biocompatible. II peut s'agir en particulier d'un manchon constitué
matériaux) synthétique(s), tels que silicone, PAN/PVC, PVFD, des fibres de
polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou encore des copolymères acryliques. Dans
un mode particulier de mise en oeuvre de l'invention, on préfère utiliser un
manchon constitué ou à base de biomatériaux, tel que notamment le
collagène réticulé, la poudre d'os, les polymères à base d'hydrates de
carbone, les dérivés d'acide polyglycolique/polylactique, les esters d'acide
hyaluronique, ou les supports à base de calcaire. De préférence, on utilise
dans le cadre de la présente invention du collagène ou du silicone. II peut
s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus
préférentiellement, on utilise un manchon constitué d'une bicouche de
collagène de type I ou III ou IV, avantageusement IV/IVox, ou de silicone. On
peut citer à titre d'exemple précis un manchon Silastic (Dow-Corning),
constitué de silicone. Par ailleurs, le manchon possède avantageusement
une forme tubulaire, de section cylindrique ou angulaire. Le diamètre du
manchon peut ëtre adapté par l'homme du métier en fonction des
applications recherchées. En particulier, s'agissant de stimuler la
régénération d'un nerf périphérique, un diamètre relativement petit peut etre
utilisé, de 0,05 à 15 mm. Plus préférentiellement, le diamètre intérieur du
manchon est compris entre 0,5 et 10 mm. Pour des application de
régénération de la moelle épinière. des manchons de diamètre intérieur plus
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important peuvent être choisis. En particulier, pour ces applications, les
manchons utilisés ont un diamètre interne pouvant atteindre 15 à 20 mm,
selon la section nerveuse concernée. Pour ie pontage d'une racine avulsée
au niveau du plexus brachial, le diamètre du manchon correspond
avantageusement au diamètre de la racine. La longueur du manchon est
généralement déterminée par la taille de la perte de substance à compenser.
Des manchons d'une longueur comprise entre 0,5 et 5 cm peuvent être
utilisés. De manière préférentielle, la longueur du manchon reste inférieure à
5 cm, des pertes de substance supérieures à 5 cm étant moins fréquentes.
Comme indiqué ci-avant, la méthode de l'invention consiste, dans un premier
temps, à introduire une première partie du nerf dans le manchon. II s'agit
avantageusement de la partie proximale du nert. Celle ci est ensuite
maintenue en place pour assurer (i) une bonne pousse nerveuse et (ii) une
étanchéité du dispositif. Pour ce faire, il est possible d'effectuer une
suture
entre le nerf et le manchon etlou de poser une colle biologique. La suture
peut être réalisée selon les méthodes classiques de chirurgie, en utilisant du
fil approprié. La colle biologique peut être toute colle biocompatible,
applicable au système nerveux. II peut s'agir notamment de toute colle
biologique utilisée en chirurgie humaine, et en particulier une colle
constituée de fibrine : Biocolle (Biotransfusion, CRTS, Lille), Tissucol
(Immuno AG, Vienne, Autriche), etc.
Le procédé de l'invention comprend, comme indiqué ci-avant, l'introduction,
dans le manchon; d'une composition comprenant un système d'expression
de facteurs neurotrophiques.
Au sens de l'invention, le terme "système d'expression" désigne toute
construction permettant l'expression in vivo d'un acide nucléique codant pour
un facteur neurotrophique. Avantageusement, le système d'expression
comprend un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique sous le
contrôle d'un promoteur transcriptionnel (cassette d'expression). Cet acide
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nucléique peut être un ADN ou un ARN. S'agissant d'un ADN, on peut utiliser
un ADNc, un ADNg ou un ADN hybride, c'est-à-dire un ADN contenant un ou
plusieurs introns de l'ADNg, mais pas tous. L'ADN peut également être
synthétique ou semi-synthétique, et en particulier un ADN synthétisé
artificiellement pour optimiser les codons ou créer des formes réduites.
Le promoteur transcriptionnel peut être tout promoteur fonctionnel dans une
cellule mammifère, de préférence humaine, et notamment nerveuse. II peut
s'agir de la région promotrice naturellement responsable de l'expression du
facteur neurotrophique considéré lorsque celle-ci est susceptible de
fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. If peut également s'agir
de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres
protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de régions
promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de
régions promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les
promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée
stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non,
inductible ou non, forte ou faible. II peut s'agir en particulier de
promoteurs
ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de
promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP,
desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes
thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur
VIII, ApoAl, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur
des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De mème, il
peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. tel que
par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le
promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En
outre, ces régions promotrices peuvent ëtre modifiées par addition de
séquences d'activation, de régulation. ou permettant une expression tissu-
spécifique ou majoritaire.
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On utilise avantageusement dans le cadre de l'invention un promoteur
constitutif eucaryote ou viral. II s'agit plus particulièrement d'un promoteur
choisi parmi le promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline ou Je
promoteur des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du
CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV.
Par ailleurs, la cassette d'expression comporte avantageusement une
séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion
de la cellule cible. Cette séquence signal peut ëtre la séquence signal
naturelle du produit synthétisé, mais il peut également s'agir de toute autre
séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Enfin, la cassette d'expression comprend généralement une région située en
3', qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de
polyadénylation.
Les facteurs trophiques utilisables dans le cadre de l'invention se classent
essentiellement dans la famille des neurotrophines, la famille des
neurokines, la famille du TGF béta, la famille des facteurs de croissance des
fibroblastes (FGFs) et des facteurs de croissance de type insuline (IGFs)
(revue 16).
Plus préférentiellement, dans la famille des neurotrophines, on préfère
utiliser dans le cadre de l'invention le BDNF, le NT-3 ou le NT-4I5.
Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), décrit par Thoenen
(17), est une protéine de 118 acides aminés et de poids moléculaire 13,5 kD.
In vitro. le BDNF stimule la formation de neurites et la survie en culture des
neurones ganglionaires de la rétine, des neurones cholinergiques du septum
ainsi que des neurones dopaminergiques du mésencéphale (revue 18). La
séquence d'ADN codant pour le BDNF humain et pour le BDNF de rat a été
clonée et séquencée ( 19). ainsi que notamment la séquence codant pour le
BDNF de porc (20). Bien que ses propriétés soient potentiellement
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intéressantes, l'application thérapeutique du BDNF se heurte à différents
obstacles. En particulier, l'absence de biodisponibilité du BDNF limite toute
utilisation thérapeutique. Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau
(BDNF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le BDNF
5 humain ou un BDNF animal.
La neurotrophine 3 (NT3) est une protéine secrétée de 119 aa qui permet la
survie in vitro de neurones même à des concentrations très faibles (21 ). La
séquence du cDNA codant pour la NT3 humaine a été décrite (22).
La famille du TGF-B comprend notamment le facteur neurotrophique dérivé
10 des cellules liliales. Le facteur neurotrophique dérivé des cellules
Gliafes,
GDNF (23) est une protéine de 134 acides aminés et de poids moléculaire
de 16 kD. II a la capacité essentielle de promouvoir in vitro la survie des
neurones dopaminergiques et des motoneurones (16). Le facteur
neurotrophique dérivé des cellules liliales (GDNF) produit dans le cadre de
la présente invention peut être le GDNF humain ou un GDNF animal. Les
séquences d'ADNc codant pour le GDNF humain et le GDNF du rat ont été
clonées et séquencées (23).
Un autre facteur neurotrophique utilisable dans le cadre de la présente
invention est notamment le CNTF ("Ciliary NeuroTrophic Factor"). Le CNTF
est une neurokine susceptible d'empécher la mort des neurones. Comme
indiqué précédemment, des essais cliniques ont été interrompus
prématurément faute de résultats. L'invention permet maintenant la
production prolongée et continue in vivo de CNTF, seul ou en combinaison
avec d'autres facteurs trophiques. Le cDNA et le gène du CNTF humain et
murin ont été clonés et séquencés (EP385 060; W091104316.
D'autres facteurs neurotrophiques utilisables dans le cadre de la présente
invention sont par exemple l'IGF-1 (Lewis et al., 1993) et les Facteurs de
Croissance des Fibroblastes (FGFa, FGFb). En particulier, l'IGF-I et le FGFa
sont des candidats très interessants. La séquence du gène du FGFa a été
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décrite dans la littérature, ainsi que des vecteurs permettant son expression
in vivo (W095/25803).
Préférentiellement, le système d'expression de l'invention permet donc la
production in vivo d'un fac#eur neurotrophique choisi parmi les
neurotrophines, les neurokines et les TGF. II s'agit plus préférentiellement
d'un facteur choisi parmi le BDNF, le GDNF, le CNTF, la NT3, le FGFa et
l'IGF-I. D'un intérêt tout particulier est la production de NT3.
Par ailleurs, selon une variante de l'invention, il est également possible de
mettre en oeuvre un système d'expression permettant la production de deux
facteurs neurotrophiques. Dans ce mode de réalisation, le système
d'expression comporte soit deux cassettes d'expression, soit une seule
cassette permettant l'expression simultanée de deux acides nucléiques (unité
bicistronique). Lorsque le système comprend deux cassette d'expression,
celles-ci peuvent utiliser des promoteurs identiques ou différents.
Dans les systèmes d'expression de l'invention, la ou les cassettes
d'expression font avantageusement partie d'un vecteur. II peut s'agir en
particulier d'un vecteur viral ou plasmidique. Dans le cas d'un système
d'expression comportant plusieurs cassettes d'expression, les cassettes
peuvent être portées par des vecteurs séparés, ou par le même vecteur.
Le vecteur utilisé peut être un vecteur plasmidique standard, comportant, en
plus de la ou des cassettes d'expression selon l'invention, une origine de
réplication et un gène marqueur. Différents types de vecteurs améliorés ont
par ailleurs été décrits, dépourvus de gène marqueur et d'origine de
réplication (W096/26270) ou possédant par exemple une origine de
réplication conditionnelle (PCT/FR96101414). Ces vecteurs sont utilisables
avantageusement dans ie cadre de la présente invention.
Le vecteur utilisé peut également être un vecteur viral. Différents vecteurs
ont été construits à partir de virus, ayant des propriétés de transfert de
gènes
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remarquables. On peut citer plus particulièrement les adénovirus, les
rétrovirus, les AAV et le virus de l'herpès. Pour leur utilisation comme
vecteurs de transfert de gènes, le génome de ces virus est modifié de
manière à les rendre incapable de réplication autonome dans une cellule.
Ces virus sont dits défectifs pour la réplication. Généralement, le génome est
modifié par substitution des régions essentielles en trans à la réplication
virale par la ou les cassettes d'expression.
Dans le cadre de l'invention, on préfère utiliser un vecteur viral dérivé des
adénovirus. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une
taille de 36 (kilobases) kb environ. Leur génome comprend notamment une
séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence
d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les
principaux gènes précoces sont contenus dans fes régions E1, E2, E3 et E4.
Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région E1 notamment sont
nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont
contenus dans les régions L1 à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été
entièrement séquencé et est accessible sur base de données (voir
notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité
d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad12, etc) ont également été
séquencées.
Pour leur utilisation comme vecteurs de transfert de gènes, différentes
constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant
différents gènes therapeutiques. Plus particulièrement, les constructions
décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région E1,
essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les
séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991 ) 195 : Gosh-
Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161 ). Par ailleurs, pour améliorer les
propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou
modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle
thermosensible a été introduite dans le mutant ts125, permettant d'inactiver
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la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (13). D'autres vecteurs
comprennent une deletion d'une autre région essentielle à la réplication etlou
à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée
dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des
ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la
cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des
vecteurs
adénoviraux dans lesquels les régions E1 et E4 sont délétées possèdent
donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très
réduits. De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes
W094/28152, W095/02697, W096/22378. En outre, des vecteurs portant
une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits
(W096/10088).
Les adénovirus recombinants décrits dans la littérature sont produits à partir
de différents sérotypes d'adénovirus. II existe en effet différents sérotypes
d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais
qui
présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement,
les adénovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale.
Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer
préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les
adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Ad12). Parmi les
différents adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les
adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des
adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26161 (ATCC VR-800) par
exempte]. D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans
la demande W094I26914 incorporée à la présente par référence.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus
recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De manière plus
préférentielle. il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou AdS.
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Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation,
c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une
ou plusieurs des fonctions déficientes dans le génome adénoviral
recombinant. L'une de ces lignées est par exemple la lignée 293 dans
laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus
précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires
humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome
de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région
d'encapsidation, la région E1, incluant E1 a et E1 b, la région codant pour la
protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine pIVa2. Cette
lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants
défectifs pour la région E1, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la
région E1, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés. Cette
lignée est également capable de produire, à température permissive
(32°C),
des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible.
D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région E1 ont été
décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon
humain A549 (W094/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum. Gen.
Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées capables de trans-complémenter
plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites. En
particulier,
on peut citer des lignées complémentant les régions E1 et E4 (Yeh et al.,
J. Virol. 70 (1996) 559 ; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322 ; Krougliak et al.,
Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant les régions
E1 et E2 (W094128152, W095102697, W095/27071 ). Les adénovirus
recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral
dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des ceüules après environ 2
ou 3 )ours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures). Après
la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par
centrifugation en gradient de chlorure de césium. Des méthodes alternatives
ont été décrites dans la demande FR96 08164 incorporée à la présente par
référence.
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La cassette d'expression du ou des gènes thérapeutiques peut être insérée
en différents sites du génome de l'adénovirus recombinant, selon les
techniques décrites dans l'art antérieur. Elle peut tout d'abord être insérée
au
niveau de la délétion E1. Elle peut également être insérée au niveau de la
5 région E3, en addition ou en substitution de séquences. Elle peut également
être localisée au niveau de la région E4 délétée. Pour la construction de
vecteurs portant deux cassettes d'expression, l'une peut être insérée au
niveau de la région E1, l'autre au niveau de la région E3 ou E4. Les deux
cassettes peuvent également être introduites au niveau de la mëme région.
10 Pour la mise en oeuvre de la présente invention, la composition comprenant
le système d'expression peut être formulée de différentes façons. II peut
s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique,
chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des
mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches,
15 notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou
de
sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple des protéines
stabilisatrices (sérum-albumine humaine notamment : FR96 03074), du
poloxamère ou encore un hydrogel. Cet hydrogel peut être préparé à partir
de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels
polymères ont par exemple été décrits dans la demande W093/08845.
Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde
d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux. Par ailleurs, lorsque le
système d'expression est composé de vecteurs plasmidiques, il peut être
avantageux d'ajouter dans la composition un ou plusieurs agents chimiques
ou biochimiques favorisant le transfert de gènes. A cet égard on peut citer
plus particulièrement les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n,
(LKKL)n tels que décrits dans la demande W095I21931, polyéthylène
immine (W096/02655) et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou
lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir
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son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut
citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, tels que décrits dans la
demande W095/18863 ou W096117823) différents lipides cationiques ou
neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine
nucléaire (W096125508), éventuellement fonctionalisés pour cibler certains
tissus. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel
vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du
métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
De manière particulièrement préférée, le système d'expression utilisé dans
l'invention est constitué par un adénovirus recombinant défectif codant pour
un facteur neurotrophique. Encore plus particulièrement, le
facteurneurotrophique est la NT3. Pour leur utilisation dans l'invention, les
adénovirus sont avantageusement formulés et administrés sous forme de
doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1010 pfu. Le
terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une
solution d'adénovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire
appropriée, et mesure; généralement après 15 jours, du nombre de plages
de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une
solution virale sont bien documentées dans la littérature. Les exemples ci-
après montrent de manière tout à fait remarquable que des doses de 109 et
10' permettent (i) un transfert efficace de gènes dans ies neurones
sectionnés, (ü) une expression durable du transgène dans lesdits neurones
et (iii) une restitution de la continuité axonale.
L'introduction du système d'expression dans le manchon peut être réalisée
de différentes manières, et en particulier au moyen de seringues. L'injection
au moyen de microseringues est préférée (microseringue Hamilton ou
Terumo).
Une des applications particulièrement interessantes de la présente invention
est la stimulation de la repousse des nerfs périphériques. Ce traitement peut
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être appliqué dans différentes situations pathologiques, notamment des
traumatismes ou des dégénérescences nerveuses. II peut être appliqué à
tout nerf accessible chirurgicalement, et en particulier aux nerfs radial,
cubital, médian, colatéraux des doigts et inter-osseux, pour les membres
supérieurs, et aux nerfs sciatique (diamètre d'environ 1 cm à sa naissance)
ou crural (diamètre 6-7 mm), pour les membres inférieurs.
Une autre application particulièrement avantageuse de l'invention est la
restitution d'une continuité nerveuse au niveau des racines du plexus
brachial (diamètre 5-6 mm) ou au sein même de la moelle épinière,
consécutivement à un traumatisme. Ce type de lésion ne connait pas
aujourd'hui de traitement. La méthode de l'invention permet de réaliser un
pontage entre la section sous-jacente à une section de la moelle et la section
sus-jacente de celle-ci, de manière à joindre les principaux faisceaux et à
régénérer une continuité nerveuse. Pour ces applications, les manchons
utilisés ont de préférence un diamètre interne pouvant atteindre 15 à 20 mm.
En particulier, pour le pontage d'une racine avulsée au niveau du plexus
brachial, le diamètre du manchon correspond au diamètre de la racine.
La présente invention a donc également pour objet un produit pour la
libération locale et prolongée d'une substance neurotrophique au niveau
d'une lésion nerveuse composé d'un manchon biocompatible permettant de
joindre les parties sus- et sous-lésionnelles, dans lequel est introduit un
système d'expression d'un facteur neurotrophique.
La présente invention peut être utilisée pour stimuler la régénération
nerveuse in vivo aussi bien chez l'animal que chez l'homme. Elle peut en
outre être utilisée; chez l'animal, pour étudier les propriétés d'un nouveau
facteur trophique (nouvelle protéine, mutant, etc). Pour cela, un animai est
soumis à une section nerveuse, puis un système d'expression du facteur à
tester est introduit dans un dispositif selon l'invention. La capacité dudit
facteur à restaurer une continuité nerveuse est déterminée comme indiqué
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dans les exemples. Ce dispositif permet en outre de comparer différents
facteurs, ou d'étudier des association synergiques de différents facteurs.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui
suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures
Figure 1 : Description de la mise en place, sur un nerf périphérique. d'un
dispositif selon l'invention.
Fi ure 2 : Microphotographie prise au niveau de la portion sacro-lombaire de
la moelle épinière et montrant une forte production de (3-galactosidase
(révélée par le substrat X-Gal) au sein des motoneurones spinaux.
Figure 3 : Aspect macroscopique de la repousse tissulaire à J12. (A)
Exemple observé chez un animal témoin. Aucune continuité tissulaire n'est
observée entre les extrémités proximale et distale de la réparation nerveuse.
(B) Aspect du contenu du tuteur chez un animal ayant reçu une injection de
10' pfu Ad-NT3. II est possible de noter la présence d'un Gable tissulaire
joignant les extrémités proximale et distale de la réparation nerveuse.
Fi ure 4 : Aspects de marquages rétrogrades par la HRP observés à J12. (A)
Dans le groupe témoin, quelques rares motoneurones faiblement marqués
sont observés. (B) Dans le groupe traité par 10' pfu Ad-NT3, un grand
nombre de neurones spinaux fortement marqués sont présents.
Figure 5 : Description de la mise en place selon l'invention d'un pontage des
afférences périphériques sous-jacentes à une lésion au niveau de la moelle
saine sus jacente à ladite lésion.
Figure 6 : Description de la mise en place, dans la moelle épinière, d'un
dispositif selon l'invention.
Figure 7 : Description de la réponse motrice observée en fonction du temps
après l'intervention sur le nerf et la mise en place du dispositif selon
l' invention.
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'l. Méthodologie
1-1. Vecteurs adénoviraux:
Comme indiqué précédemment, les vecteurs viraux, et notamment les
adénovirus, constituent un mode de réalisation particulièrement préféré de
l'invention.
Les adénovirus recombinants utilisés ont été obtenus par recombinaison
homologue selon les techniques décrites dans l'art antérieur. En bref, il sont
construits dans les cellules 293, par recombinaison entre un fragment de
génome viral linéarisé (d1324) et un plasmide contenant l'ITR gauche, les
séquences d'encapsidation, le transgène ainsi que son promoteur et des
séquences virales permettant la recombinaison. Les virus sont amplifiés sur
cellules 293. ll sont régulièrement repurifiés dans le P3 de notre
laboratoire.
Les génomes viraux peuvent également être préparés dans une cellule
procaryote selon la technique décrite dans la demande W096/25506. Les
virus suivants sont plus particulièrement utilisés:
- Ad-Gal : Adénovirus recombinant défectif dérivé d'un sérotype Ad5
comprenant (i) une délétion de la région E1 au niveau de laquelle est
introduite une cassette d'expression comportant un acide nucléique codant
pour la ~-galactosidase de E.coli sous controle du promoteur du LTR du
virus du sarcome de tous (désigné LTR-RSV ou RSV), et (ii) une délétion de
la région E3. La construction de cet adénovirus a été décrite dans Stratford-
Perricaudet et al. (J.Clin.lnvest. 90 (1992) 626).
Ad-NT3 : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant. inséré
dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette
d'expression du NT3 composée du cDNA codant pour le NT3 sous controle
d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Une
construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la
région E4, telle que décrite dans la demande W096I22378.
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- Ad-CNTF : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré
dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette
d'expression du CNTF composée du cDNA codant pour le CNTF sous
controle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Les
5 détails de la construction sont données dans la demande W094/08026. Une
construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la
région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378.
Ad-GDNF : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré
dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette
10 d'expression du GDNF composée du cDNA codant pour le GDNF sous
controle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Les
détails de la construction sont données dans la demande W095/26408).
Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la
région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378.
15 - Ad-BDNF : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré
dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette
d'expression du BDNF composée du cDNA codant pour le BDNF sous
controle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Les
détails de la construction sont données dans la demande W095/25804).
20 Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la
région E4, telle que décrite dans la demande W096122378.
- Ad-FGFa : Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré
dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette
d'expression du FGFa composée du cDNA codant pour le FGFa sous
controle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV). Les
détails de la construction sont données dans la demande W095/25803).
Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la
région E4, telle que décrite dans la demande W096122378.
La fonctionnalité des virus construits est vérifiée par infection de
fibroblastes
en culture. La présence du facteur neurotrophique correspondant est
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analysée dans le surnageant de culture par ELISA et/ou en mettant en
évidence les propriétés trophiques de ce surnageant sur des cultures
primaires neuronales.
II est entendu que d'autres constructions dérivées des adénovirus peuvent
être réalisées et utilisées dans le cadre de l'invention, et en particulier
des
vecteurs portant des délétions supplémentaires et/ou des promoteurs
différents et/ou codant pour d'autres facteurs neurotrophiques.
1-2. Protocole chirurgical
Les animaux étaient constitués par des rats mâles Sprague-Dawley de 320-
340 g (Iffa Credo - Les Oncins - France). Sous anesthésie générale (injection
intra-péritonéale de Pentobarbital 1 ml/kg - Sanofi Santé Animale), la peau
de la patte postérieure droite est incisée au niveau de la cuisse, et les
plans
musculaires sont écartés de manière à exposer le nerf sciatique droit. Le nerf
est sectionné à mi-distance entre le creux poplité et la séparation du nerf
sciatique, et un segment de 5 mm est oté (Fig. 1 B). Une prothèse tubulaire
en silicone (14 mm de long, 1.47 mm de diamètre interne, épaisseur de la
paroi: 0.23 mm - Silastic , Dow Corning Corporation, USA) est présentée.
L'extrémité proximale du nerf est introduite dans le tube et est maintenue en
place à l'aide d'une suture 9/0 en nylon reliant l'épinèvre et le nerf. Une
seconde suture entre le tube et le nerf au niveau distal est mise en place de
manière à obtenir une perte de substance de 10 mm (distance limite pour
laquelle une régénération nerveuse périphériaue spontanée nP~ ~t ptrA
observée chez le rat dans les conditions expérimentales utilisées) (Fig. 1 C}.
L'étanchéïté du montage au niveau proximal est alors réalisée à l'aide d'une
colle de fibrine (Tissucol, Immuno AG, Vienne. Autriche), avant que 10 pl de
la solution virale. ou de soluté salin isotonique pour les animaux témoins, ne
soit introduite dans le tuteur, en contact avec l'extrémité proximale du nerf,
à
l'aide d'une microseringue (Fig. 1 D). Le volume mort du tuteur est empli par
une solution saline isotonique (solution de Chlorure de Sodium à 0.9%).
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avant que l'extrémité distale du nerf ne soit introduite à son tour dans la
prothèse tubulaire, et l'étanchéïté de cette extrémité assurée par la colle de
fibrine (Fig.1 E). Les plans musculaires et cutanés sont refermés à l'aide
d'une suture standard en nylon 610 et 4/0 respectivement. Les animaux sont
replacés dans une cage individuelle, et maintenus en cycle jour/nuit 12h112h.
1-3. Contrôle de la repousse axonale et marauade rétrograde des
motoneurones spinaux par la Horseradish Peroxydase (HRP)
Douze jours plus tard, et après anesthésie générale des animaux, le
montage est réexposé et disséqué des adhérences l'environnant. La
présence d'une continuité tissulaire est notée avant que le montage ne soit
sectionné à 3 mm en aval de l'extrémité proximale de la section nerveuse
d'origine. Le "moignon" ainsi obtenu est rincé avec du soluté salin
isotonique, avant d'être empli avec une solution de HRP à 30% (wlv)(Sigma
Chemical, St Louis, MO, USA). Après 1 heure d'incubation, cette solution est
otée, et l'extrémité nerveuse rincée avec une solution saline isotonique avant
que les plans musculaires et cutanés ne soient refermés et les animaux
replacés dans leurs cages. Quarante huit heures plus tard, les animaux sont
réanesthésiés, et fixés, après rinçage en PBS, par pertusion intracardiaque
de glutaraldéhyde à 3.6%. Les moelles épinières sont alors disséquées,
post-fixées pendant 3 heures en glutaraldéhyde 3.6%, et placées en sucrose
30%(w/v) pendant 48 heures à 72 heures. Les parties lombo-sacrées des
moelles sont coupées en congélation en coupes longitudinales sériées de 35
Nm d'épaisseur, et la présence de HRP révèlée suivant la technique
classique décrite par Mesuiam(15), et utilisant la 3,3',5,5'-Tetramethyl
Benzidine.
1-4. Détection de la Q-Galactosidase
L'activité ~-Galactosidase a été visualisée par utilisation du substrat X-
Gal(14). Brièvement, des sections longitudinales de la moelle sacro-lombaire
de 100 ~im d'épaisseur sont incubées pendant 18 h. à 37°C en PBS
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contenant de l'hexacyanoferrate de potassium (4 mM), du ferricyanide de
potassium (4 mM), du substrat X-Gal (0.4 mglml), et du chlorure de
magnésium (4 mM). Après incubation, les coupes tissulaires sont rincées en
PBS, puis montées en milieu aqueux (Gélatine-Glycérol).
2. Mise en évidence du transport rétrograde des adénovirus non-
replicatifs par les motoneurones spinaux axotomisés, et vérification de
l'expression du trans4ène.
Cette première étude a permis de mettre en évidence que des neurones
axotomisés pouvaient effectuer un transport rétrograde de vecteurs
adénoviraux et exprimer un transgène sur des temps pouvant atteindre 4
semaines. Le vecteur (Adénovirus ~-Galactosidase décrit en 1-1. ) a été
injecté à raison de 109 pfu par tube, et l'expression de son transgène testée
à J4, J14, 4 semaines.
A 4 jours, une forte expression de a-gafactosidase était observée au niveau
de la corne ventrale de la portion sacro-lombaire de la moelle épinière
correspondant aux racines innervant le nerf sciatique (Fig.2). Cette forte
expression du transgène par les motoneurones spinaux était retrouvée à 14
jours avec au total un nombre moyen de cellules ~-galactosidase positive de
63.2133.6 cell., soit une efficacité d'infection de l'ordre de 12.25% du
nombre
total de neurones spinaux innervant le nerf sciatique. La présence d'une
activité ~i-galactosidase dans la région sacro-lombaire de la moelle épinière
a été détectée jusqu'à 4 semaines avec une intensité de marquage
décroissante (Tableau I).
3. Test de l'effet d'un vecteur codant pour une neurotrophine (NT31 sur
la repousse axonale du nerf sciati4ue de rat au travers d'une perte de
substance de 10 mm.
Suite à ces résultats montrant la possibilité d'utiliser un système de type
thérapie génique in vivo pour stimuler la repousse nerveuse après axotomie,
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Suite à ces résultats montrant la possibilité d'utiliser un système de type
thérapie génique in vivo pour stimuler la repousse nerveuse après axotomie,
nous avons testé l'effet d'un adénovirus portant un transgène codant pour la
neurotrophine 3 (Ad-NT3 décrit en 1-1.) sur la régénération nerveuse
périphérique. Les résultats obtenus 12 jours après réalisation de l'axotomie
et réparation du nerf avec un tuteur guide en Silastic ayant reçu 107 pfu de
vecteur, ou une solution saline isotonique montrent qu'une continuité
tissulaire n'est observée que dans le groupe d'animaux traités par un Ad-NT3
(Fig.3, Tableau II). L'analyse par marquage rétrograde par la HRP du
nombre de motoneurones spinaux ayant régénéré un axone au travers du
tuteur guide, indique que cette continuité tissulaire est constituée par une
repousse nerveuse, avec une moyenne de 182.3~76.5 neurones HRP positif
contre 24.25~42.7 neurones HRP positifs dans le groupe témoin (Fig.4,
Tableau II).
Ces résultats permettent de conclure qu'un dispositif selon l'invention
utilisant des vecteurs adénoviraux replication déficient portant des gênes
codant pour des facteurs neurotrophiques peut être utilisé pour promouvoir
une repousse axonafe aussi bien centrale que périphérique.
4. Comparaison de la reprise fonctionelle après section d'un nerf
périphérigue chez le rat
Une lésion a été pratiquée au niveau du nerf sciatique chez le rat adulte afin
de créer une perte de substance d'au moins 10 mm. Les parties proximaies
et distales de la lésion ont été jointes au moyen d'un dispositif selon
l'invention (tube en silicone,14 mm de longueur, 1.47 mm de diamètre interne
- Silastic) dans lequel a été introduit soit une solution saline, soit AV-
RSVagal (10' pfu dans 10p1), soit AV-RSVNT3 (10' pfu dans10Nl), ou encore
la proteine NT3. La reprise fonctionnelle a été mesurée par
électromyographie: la réponse motrice dans le muscle gastrocnemien a été
enregistrée toutes les deux semaines (Fig 7).
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Une reprise fonctionnelle a été observée dans le gouge traité avec l' AV-
RSVNT3 comparée aux autres groupes. Cette augmentation a été
statistiquement significative par comparaison dans le temps avec le groupe
AV-RSV~3gal au delà du jour 112, et du jour 70 au jour 112 avec le groupe
5 rNT3. Une analyse electromyographique des profils individuels montrent que
le traitement avec AV-RSVNTs augmente la probabilité pour un animal donné
d'initer la repousse du nerf. Cependant, le taux de repousse n'est pas
modifié lorsque la repousse a débuté.
Ces résultats suggèrent donc que le transfert de gène codant pour un facteur
10 neurotrophique au moyen de la technique décrite dans la présente invention
est efficace pour augmenter la reprise fonctionelle après section d'un nerf
périphérique.
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TABLEAU I: Détermination de l'efficacité d'infection des motoneurones
axotomisés par un vecteur adénoviral codant pour la ~i-Galactosidase
Dlai Animaux Nombre de Nombre de Nombre total
de
neurones corps cellulairesneurones
fortement marqus marqus
mar us
J4 1 10 12 22
2 36 55 91
3 17 31 48
J14 1 16 24 40
2 59 48 107
3 24 6 30
4 Marquages diffus
semaine
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TABLEAU II: Effet de l'injection d'un Ad-NT3 sur la repousse axonale à J12
Groupe Animal Dlai Continuit Nombre de
tissulaire neurones HRP
ositifs
Tmoin T01 J12 + 0
T02 J12 - g
T03 J 12 - 88
T05 J 13 - 0
Ad-NT3 N71 J12 +++ 182
107 pfu N72 J12 +++ 106
N73 J12 +++ N.D.*
N75 J14 +++ 259
N.D.: Non déterminé
* Animal décédé en cours de perfusion.
