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PROCEDE DE CARACTERISATION DE DUPLEX D'ACIDE NUCLEIQUE
La présente invention concerne un procédé permettant la mise en
évidence de signatures correspondant à une séquence spécifique d'acide
nucléique
double brin.
Dans le domaine de l'analyse de séquence de l'ADN, la présente
invention concerne un procédé qui permet d'accélérer ou de contourner le
processus
de séquençage de l'ADN génomique, problème qui présente un intérêt industriel
considérable. Le procédé selon la présente invention permet la mise en
évidence de
signatures spécifiques d'une séquence sur un long fragment d'ADN. Ce procédé
permet notamment de rechercher rapidement la présence de structures
particulières
dans la séquence des bases et/ou la qualité des appariements qui peuvent être
partiels et, en particulier, présenter des mésappariements. Ce procédé permet
aussi
l'analyse et la comparaison des différences génomiques parmi différents
patients.
I1 est entendu que l'invention s'applique aussi à des duplex ADN simple
brin - ADN simple brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés, ou
encore à des duplex ADN simple brin - ARN simple brin, parfaitement appariés
ou
non parfaitement appariés, ou encore à des duplex ARN simple brin - ARN simple
brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés. De plus, le duplex
peut
être constitué du réappariement au moins partiel de deux simples brins
provenant
d'échantillons d'origines différentes. Enfin, l'invention s'applique aussi aux
structures secondaires d'un ADN simple brin unique ou d'un ARN simple brin
unique.
Pour clarifier l'exposé, on utilise dans la suite l'exemple spécifique d'un
2~ ADN double brin, étant entendu que les généralisations ci-dessus sont
facilement
réalisables par simple développement des méthodes décrites.
Une "signature" permet de "caractériser" une séquence d'ADN.
A titre d'exemple, l'appariement des bases G et C implique trois
liaisons hydrogènes, tandis que l'appariement des bases A et T n'en implique
que
deux, dans ces conditions, si l'on ouvre mécaniquement la double hélice d'ADN
en
tirant séparément les extrémités de deux brins d'un même côté d'une molécule
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isolée d'ADN, on peut s'attendre à ce que le signal correspondant aux forces
excercées dépende de la séquence.
Ainsi, la mise en oeuvre de la présente invention a permis de démontrer
que la séparation de deux brins appariés se traduit essentiellement par
l'obtention
d'une "signature", c'est-à-dire un ensemble d'informations spécifiques et
locales
qui est relié à la séquence et/ou à l'état d'appariement.
De façon inattendue, lors de l'ouverture d'un duplex, le signal en force
peut présenter notamment des structures en dents de scie, avec une montée
douce et
une descente plus abrupte, où l'ouverture se produit en partie par saccades.
Les
forces mesurées lors de l'ouverture présentent donc un ensemble de
caractéristiques
particulières, ou signature, combinaison complexe de la séquence où les zones
riches en GC sont plus dures à ouvrir que les zones riches en AT, et de la
raideur
mécanique du système (construction moléculaire et système de mesure), qui
intervient pour induire des événements où plusieurs bases contiguës s'ouvrent
plus
1 S rapidement.
En modifiant la raideur mécanique du système, on peut accentuer (à
faible raideur), ou diminuer (à forte raideur) les effets d'instabilité et
obtenir un
ensemble de signatures pour une mëme séquence.
Ainsi, une "signature" ne constitue pas un séquençage base à base de
toute une séquence, mais permet d'obtenir un ensemble d'informations
spécifiques
et locales, reliées à la séquence et/ou à l'état d'appariement.
Les mesures de force sur des molécules isolées d'ADN constituent
actuellement un domaine très actif (voir références 1 à 11 ). Pour une gamme
de
forces s'étendant du subpicoNewton jusqu'à des dizaines de picoNewtons,
lesquelles forces sont typiquement mises en jeu dans les interactions
moléculaires
faibles, des dispositifs de mesure de forces sensibles tels que les pinces
optiques
(Svoboda et al., 1993 ; Yin et al., 1996) ou les micro-aiguilles souples sont
de plus
en plus utilisés.
Dans une configuration typique destinée à ouvrir l'ADN, les molécules
peuvent être spécifiquement ancrées sur deux substrats solides (lame de
microscope, micro-pipette, microparticule). L'une des extrémités étant fixée
et
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l'autre étant connectée par exemple par l'intermédiaire d'une particule, à- un
dispositif de mesure de force.
Le brevet n° WO 94/23065 décrit un dispositif pour mesurer la
force,
base à base, lors de l'ouverture mécanique de l'ADN en utilisant un microscope
à
S force atomique.
Cependant, la résolution base à base se heurte à des limitations
fondamentales liées au bruit thermique (Thompson al., 1995 ; Viovy et al.,
1994).
Par ailleurs, la réalisation pratique de l'ouverture présente des difficultés
de mise en oeuvre, notamment
- le dessin de la construction moléculaire,
- la chimie des surfaces et leur préparation,
- la façon de sélectionner l'endroit où l'on fait la mesure.
En particulier, il est crucial pour effectuer ces expérimentations de
réduire:
- le niveau d'adsorption de la molécule à l'étude sur les surfaces (lame de
microscope ou particule) ;
- les interactions adhésives entre les particules et entre les particules et
les
surfaces.
Finalement comme une seule mesure peut prendre quelques dizaines de
minutes, il est nécessaire d'avoir un mécanisme de sélection très efficace
pour
identifier macroscopiquement les points les plus intéressants de façon à
effectuer les
mesures en dépit du fait que la chimie des surfaces est imparfaite, et bien
entendu,
du fait que les constructions en elles-mêmes peuvent être imparfaites.
La présente invention inclut les aspects concernant la chimie des
surfaces et les constructions particulières de façon à obtenir des résultats
satisfaisants.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de
caractérisation de duplex d'acide nucléique comportant deux séquences d'acide
nucléique au moins partiellement appariées, caractérisé en ce qu'on enregistre
au
moins une "signature" desdits duplex, qui est liée à la variation de force
nécessaire
pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites deux séquences, et en ce
que
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l'on compare la signature obtenue ou certaines caractéristiques de celle-ci
avec des
références.
II est entendu, à titre d'exemple, qu'une référence peut être constituée
par une aùtre mesure, une combinaison de plusieurs mesures, ou encore par un
calcul numérique, par exemple comme celui qui sera décrit par la suite, ou
encore
une combinaison des cas précédents.
Par "duplex d'acide nucléidue" on entend désiâner n'importe quel type
de duplex ADN/ARN comme cela a été mentionné précédemment.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé
caractérisé en ce que l'extrémité 5' de l'un des brins du duplex est fixée sur
un
support 1 et l'extrémité 3' de l'autre brin du duplex est fixée sur un support
2, la
variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement apparier,
lesdites
séquences étant mesurées par éloignement, respectivement rapprochement,
desdits
supports 1 et 2, caractérisé en ce due, lors de la fixation, le point de
fixation de
l'extrémité 3' sur le support 2 et le point de fixation de l'extrémité 5' sur
le support
1 sont reliés ensemble par un fii moléculaire d'une longueur d'au moins 0,03
um, et
de préférence comprise entre 0,5 et 30 um.
Dans le cadre de la présente invention, et pour clarifier les notations,
l'extrémité 5' de l'un des brins du duplex sera appelée "extrémité 5' du
duplex" et
l'extrémité 3' de l'autre brin du duplex sera appelée "extrémité 3' du
duplex", et,
dans cette définition, les brins peuvent être inversés, bien entendu.
Par "fil moléculaire", on entend désigner aussi bien la distance comptée
sur la molécule (celle-ci pouvant être repliée), par exemple le bras espaceur
(Mode
I), que la distance spatiale (mesurée notamment le long des brins entre les
deux
points de fixation (Mode II).
Les supports 1 et 2 peuvent également être interchan~és dans les
développements qui suivent.
Avantageusement, le procédé conforme à l'invention est caractérisé en
ce qu'on modifie localement la structure du duplex, notamment par la création
d'un
triplez, d'un complexe ou de la fixation d'une protéine.
Sont définis ci-après quelques termes qui seront ensuite utilisés
conformément à leur définition respective.
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Les expériences étant réalisées dans un tampon, un "puits" est un
élément destiné à contenir un petit volume de tampon et il peut, avec
avantage,
incorporer ou contenir un ou plusieurs éléments détachables ou non appelés
"lames".
5 La "lame" est un élément solide de nature flexible ou rigide et présente
les particularités suivantes
a) Une partie au moins de cette lame est en contact avec un tampon
essentiellement aqueux, et une fraction au moins de cette partie en contact
est
fonctionnalisable sur une surface d'au moins 0,01 p.m2, et de préférence entre
1
p.m2 et 10 cm2.
b) La lame étant en place dans le puits, on peut approcher, pour obtenir une
image
de la partie fonctionnalisable en contact avec le tampon, soit un objectif de
microscope à immersion en milieux aqueux, soit un objectif de microscope à
immersion dans l'huile et, en ce cas, la lame peut avec avantage être mince,
plane et substantiellement transparente.
A titre d'exemple particulier, la lame peut être une lamelle de
microscope, une lamelle de polymère ou une particule maintenue par une
micropipette.
Un puits peut être conçu avec avantage de façon à pouvoir recevoir une
"micropipette".
Une "micropipette" est un élément solide, de nature flexible ou rigide,
dont on peut fixer une extrémité sur un système fixe ou de déplacement, et
dont au
moins l'autre extrémité est destinée à être immergée dans un liquide. Elle est
d'aspect substantiellement allongé et son diamètre caractéristique est
supérieur à
0,01 pm, de préférence entre 0,1 pm et 2 mm, et elle peut avec avantage être
creuse.
Les supports envisagés peuvent être aussi bien des lames, des particules,
des micropipettes ou un élément d'un appareil de mesure de force.
Dans le procédé selon la présente invention, les manipulations sont
réalisées, de préférence, avec des constructions moléculaires spécifiques,
attachées
avec avantage, respectivement, entre une lame par exemple, et des
microparticules,
ou bien par fixation des extrémités sur deux particules.
Ce procédé comporte essentiellement deux modes de mise en oeuvre.
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Plus particulièrement, dans le premier mode (mode I) de mise en oeuvre
du procédé, il s'agit d'un procédé dans lequel l'extrémité 3' du duplex à
caractériser
(respectivement l'extrémité 5') est fixée sur l'un des supports par
l'intermédiaire
d'un bras~espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 pm, de préférence
comprise
entre 0,5 et 30 pm.
Dans ce procédé, l'une des caractéristiques est que les duplex d'ADN
destinés à être ouverts ne sont pas directement fixés sur un support, mais le
sont par
l'intermédiaire d'au moins un bras espaceur placé soit sur le support 1, soit
sur le
support 2, soit sur les deux. En effet, l'utilisation d'un bras espaceur
permet de
sélectionner l'endroit et/ou le moment où on effectue la mesure. On peut, par
exemple, adapter à ce type de construction moléculaire la technique de
sélection et
de mesure utilisée par Smith et al. ( 1996). On peut aussi réaliser des
ancrages
multiples sur une lame.
Dans ces conditions, les particules reliées à la lame par l'intermédiaire
d'une construction moléculaire ont une certaine liberté de mouvement. Bien
entendu, la longueur du bras espaceur peut être adaptée avec avantage par
rapport à
la résolution spatiale du système de repérage de la position des billes.
Lorsqu'on applique simplement une force faible sur les particules,
l'ADN ne va pas s'ouvrir, et l'on va pouvoir constater le mouvement
caractéristique
suivant
Une particule se déplace mais est ensuite bloquée dans son déplacement
par la présence du bras espaceur. Les caractéristiques de ce mouvement
permettent
de sélectionner les systèmes intéressants sur lesquels lancer un cycle de
mesure et
permettent notamment (i) d'éliminer les attachements imparfaits, en
particulier si la
particule commence à s'adsorber sur la lame, ou si l'ADN commence à
s'adsorber,
les caractéristiques des déplacements seront plus limitées, et donc
différentes ; (ü)
lors de la phase un peu brutale de collage d'une micro-aiguille de mesure, la
relative
liberté de mouvement de la particule permet d'éviter l'arrachement des points
d' attache.
Le bras espaceur pourra être constitué d'ADN double brin, de 100 à S00
bases, soit environ 0,03 pm à 0,2 pm, mais de préférence le bras espaceur
correspondra à 1 kb ou même comportera de 5 à 100 kb, ce qui correspondra
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environ à un débattement de 1,5 à 30 um, mais il est possible également de
prévoir
des brâs espaceurs qui ne seraient pas constitués d'un ADN double brin, mais
qui
seraient constitués par d'autres composants de type polymère synthétique, de
type
protéique, ~ou bien d'autres polymères, polysaccharidiques par exemple.
Ainsi, juste avant la mesure, l'échantillon se trouvant sous le
microscope consiste en
- des particules non attachées mobiles ;
- des particules immobiles sur la lame ;
- des particules avec un mouvement limité.
Bien entendu, seules ces dernières particules présentent de l'intérêt.
Afin d'améliorer la sélection de ces particules, il est possible de leur
appliquer, soit
un gradient de champ magnétique, en particulier un aimant, si on a choisi des
particules sur lesquelles un gradient magnétique exerce une force, soit un
champ de
type fluidique, soit un champ électrique, soit un gradient de champ
électrique. Et
l'on choisit à ce moment les particules qui ont une zone de déplacement qui
correspond à l'extension attendue du bras espaceur en l'absence de fixations
non
désirées du bras espaceur ou de la séquence d'ADN avec la surface ou avec les
particules elles-mêmes.
De façon générale, on connait la longueur du bras espaceur, ce qui
permet de repérer les particules pouvant faire l'objet d'une étude. Les
techniques
destinées à permettre le greffage sur les extrémités de constructions
moléculaires
sont connues, il s'agit essentiellement de systèmes utilisant une association
ligand/récepteur, ou encore de liaisons covalentes. De préférence, les
extrémités à
greffer sont biotinilées ou fonctionnalisées avec un ligand tel que dig,
tandis que les
lames de verre par exemple, ou les particules sont revêtues respectivement
avec de
l'avidine ou de la streptavidine ou un anticorps antidig.
De façon générale, pour fixer l'extrémité de la séquence d'acide
nucléique au support on peut utiliser une interaction
- covalente
- antigène / anticorps
- ligand / récepteur
- avidine ou streptavidine / biotine.
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La fixation éventuelle de la particule ou du support sur le dispositif de
mesure de force pourra être réalisée par tout moyen, notamment par liaison,
comme
précédemment, mais également par collage ou par influence magnétique en
utilisant
des billes appropriées.
S Des constructions plus spécifiques seront décrites dans les exemples ci-
après.
Le bras espaceur peut, bien entendu, être placé ou bien sur le premier
support, une lame constituée d'une surface de verre par exemple, mais il est
possible de prévoir une fixation sur la particule par l'intermédiaire d'un
bras
espaceur, dans ce cas le procédé est caractérisé en ce que l'extrémité S' du
duplex à
caractériser, respectivement l'extrémité 3', est fixée sur le support 2 par
l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 pm, mais
de
préférence comprise entre 0,5 pm et 30 pm, dans ce cas, l'une des extrémités
du
duplex peut être fixée directement sur la lame. ~n d'améliorer encore le
procédé,
il est possible de prévoir l'utilisation de deux bras espaceurs, l'un par
rapport à la
surface ou support l, l'autre par rapport à la particule ou support 2.
Dans le second mode de réalisation (mode II), le support 2 est fixé à
l'eartrémité 3', respectivement 5', alors que le duplex à caractériser a été
au moins
partiellement dénaturé et que les extrémités des deux séquences d'acide
nucléique
désappariées le comportant ont été partiellement éloignées spatialement d'une
distance d'au moins 0,03 pm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 pm.
De préférence, les extrémités libres du duplex sont reliées par une
séquence en épingle à cheveux, ce nui permet de dénaturer l'ensemble du
duplex.
De façon plus spécifique,
- le duplex étant bloqué par une épingle à cheveux, on fonctionnalise chacune
des
extrémités libres, par exemple avec de la biotine et du dig,
- puis on fixe une particule comportant, par exemple, de la streptavidine, sur
l' extrémité correspondante,
- cette bille est alors immobilisée par un moyen quelconque, mécanique par
exemple (micro-pipette),
- on dénature alors le complexe et on place l'ensemble dans un courant de
fluide,
f .. y
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- d'extrémité non fixée sur la bille s'éloigne et on fixe par exempie une
bille
traitée anti-dig sur cette extrémité, la bille peut être approchée par tout
moyen,
notamment des pinces optiques.
Dans le mode I préféré de réalisation, le bras espaceur sera constitué
d'un ADN double brin, par exemple d'un ADN double brin provenant du phage-~,.
Le duplex d'ADN (DNA I) dont on souhaite obtenir une signature selon
la présente invention doit être relié au bras espaceur. De préférence, le
duplex est
digéré par au moins une enzyme de restriction, ce qui permet de connaître la
nature
de ses extrémités, tranchée ou cohésive, et en ce cas la séduence cohésive.
Il est ensuite aisé pour l'homme de l'art d'attacher le segment au bras
espaceur (ADN lambda ou autre), par exemple par un système de type cassette.
Un exemple de réalisation est donné sur la figure 2B qui est un système
cassette de bras espaceur, DNA 2 est un ADN double brin du phage-~,, complété
par
(i) fonctionnalisation dig d'un côté : ceci est réalisé, par exemple, à l'aide
de oligo 3, qui est une séquence Cos fonctionnalisée dig en 3' et est attachée
de
façon covalente par hybridation puis ligation ;
(ü) le système d'adaptateurs oligo 1 et oligo 2 : oligo I a une séquence Cos
et est fixé par hybridation et ligation sur DNA 2 ; oligo 2 est fonctionnalisé
3' avec
de la biotine, il possède une séquence complémentaire d'une partie d'oligo 1
et peut
donc s'y fixer par simple hybridation, l'extrémité libre du duplex oligo 1-
oligo 2 est
choisie de façon à ce qu'elle soit cohésive avec la coupure de l'ADN DNA-1
avec
une enzyme de restriction.
Par hybridation puis ligation, on obtient une liaison covalente des deux
brins 3' et 5' d'une extrémité de DNA 1 : le brin 3' sur oligo 2 et le brin 5'
sur oligo
1.
Dans la construction finale, on fixe l'extrémité dig sur un support 1 et la
biotine sur un support 2. Le support I peut être, par exemple, une lamelle de
verre
recouverte d'antidig, et le support 2 peut, par exemple, être une microbille
recouverte de streptavidine.
L'ouverture de DNA 1 peut être obtenue en déplaçant le support par
rapport à la bille, ce qui tire son brin 3' lié à la bille, et son brin 5' lié
à la lamelle
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par le bras espaceur DNA 2. Dans cet exemple, on peut naturellement
interchanger
les positions des fonctionnalisations dig et biotine.
Un ensemble cassette tel qu'il vient d'être décrit à titre d'exemple peut
être un élément d'une trousse de diagnostic, de façon à obtenir la
construction qui
5 permet l'ouverture, par une simple opération d'hybridation-ligation.
A titre d'exemple, on décrit une telle technique, appliquée à l'ouverture
de l'ADN du phage lambda (DNA 1, figure 2), avec un bras espaceur constitué
par
l'ADN double brin d'un phage lambda (DNA 2, figure 2).
Dans la construction finale, le connecteur oligo 2 peut avoir une région
10 non appariée libre, près de la biotine, de façon à faciliter la réaction
ultérieure avec
les microparticules. L'ensemble de la construction est lié par des étapes de
ligation
après les différentes étapes d'hybridation, laissant la possibilité d'ouvrir
la molécule
à l'extrêmité biotinilée. Naturellement, d'autres combinaisons de ligands et
de
récepteurs peuvent être choisies, ou encore de multiples ligands d'un mëme
type
peuvent être utilisés à la place d'un seul (Cluzel et al., 1996 ; Strick et
al., 1996).
Enfin, le bras espaceur peut être naturellement placé, soit entre support 1 et
ADN à
ouvrir {exemple donné ici), soit entre ADN à ouvrir et support 2, soit une
combinaison de cas précédents. Un élément complémentaire du procédé est
introduit en ce qui concerne l'autre extrêmité de la molécule à ouvrir. Celui-
ci petit
être coiffé avec un oligonucléotide en épingle à cheveux cohésive (hairpin-
oligo),
ce qui évite que les deux brins se séparent lorsque l'on atteint la fin du
processus
d'ouverture. Ceci permet de répéter des cycles complets d'ouverture-fermeture.
On
peut aussi ne pas utiliser cet élément complémentaire et procéder à une
ouverture
partielle en évitant de désapparier complètement le duplex, ce qui permet
avantageusement de répéter des cycles partiels d'ouverture-fermeture.
Modification de si nature
Comme on le verra dans la suite, la signature dépend de la raideur totale
du système, c'est-à-dire du système de mesure et aussi de la construction
moléculaire, notamment celle des simples brins de la molécule ouverte. On peut
avec avantage varier ce paramètre de raideur pour obtenir des signatures
différentes
pour une même séquence.
I ) Raideur du système de mesure
t
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S'agissant du levier, il est facile de changer pour des leviers de raideur
différente. Dans le cas d'une mesure par pince optique, ceci peut être obtenu,
par
exemple, par simple modification de l'intensité ou de la position du laser de
piégeage. Naturellement d'autres modes de fonctionnement, notamment avec
rétroaction (par exemple Finer et al, 1994 ; Svoboda et al., 1993 ; Yin et
al., 1996),
peuvent être utilisés avec avantage.
On donne deux exemples
(i) Dans un de ces cas, la position de la pince peut être ajustée
automatiquement par rétroaction pour s'opposer aux déplacements de la bille.
La
variation de la force lors de l'ouverture se traduit par une variation de la
position du
piège.
(ü) Dans l' autre exemple, l' intensité de la pince peut être contrôlée par
rétroaction de façon à garder fixe la position de la bille. La variation de la
force lors
de l'ouverture se traduit par une variation de l'intensité du laser.
En conclusion, la présente invention inclut plusieurs modes de mesures,
se traduisant éventuellement par différents types de signatures. On peut donc
pour
une même séquence accumuler plusieurs signatures différentes dont les
informations peuvent se recouper et se compléter.
2) Raideur des simples brins
Dans le même esprit, la présente invention inclut la modification de la
raideur des simples brins (qui sont en série dans la mesure) en introduisant
dans le
tampon de mesure des molécules particulières connues pour modifier la raideur
des
simples brins.
Notamment, il existe de nombreuses protéines qui ont une affinité pour
les simples brins, comme recA ou SSBP (Single Strand Binding Protein), et qui
peuvent augmenter la raideur des simples brins. De même, des oligonucléotides
(par
exemple une population de séquence aléatoire) peuvent aussi être utilisés.
Autres conditions expérimentales envisa eg, ables
Il peut être utile de varier les conditions expérimentales pour obtenir des
signatures différentes sur la même molécule. Ainsi, on peut varier la
température
et/ou modifier le tampon utilisé. En particulier, on peut utiliser avec
avantages
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91)
ISAJEP
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certains tampons spécifiques pour avoir une action sur la stabilité des
appariements
entre bases (par exemple, Rees, 1993).
Modification du duplex ou des simples brins
On peut induire en certains points de la signature des marques
particulières, ou empreintes. Celles-ci sont obtenues en ouvrant une molécule
modifiée par adjonction de réactif. Par le terme "réactif', on entend ici
toute
molécule capable d'établir une interaction spécifique avec partie du duplex,
que
celui-ci soit ouvert, fermé ou à la fois ouvert sur certaines parties et fermé
sur
d'autres. La modification du duplex ou des simples brins est choisie avec
avantage
pour modifier, de façon locale et substantielle, la force de séparation des
brins,
pouvant même aller jusqu'à un blocage complet de l'ouverture.
Sans pour autant s'y limiter, on donne ci-dessous quelques exemples
avec
A) - l'introduction d'une liaison plus forte en une ou plusieurs zones
particulières de Ia séquence ; ceci conduit dans la signature à une ou
plusieurs
montées caractéristiques, quand le point d'ouverture moyen atteint ces zones ;
- l'introduction d'une ou plusieurs protéines caractérisées en ce qu'elles
sont capables de se fixer de façon spécifique sur le duplex, par exemple sur
certaines séquences (telle une enzyme de méthylation) ou encore sur certaines
structures (telles la fixation sur un mésappariement, avec la protéine Mut par
exemple) ; une telle liaison peut également être utilisée pour positionner un
réactif
particulier (attaché à une protéine) permettant d'induire un "cross-link"
inter-brin,
avec un groupement photoactivable par exemple ;
- l'introduction d'une liaison inter-brin renforcée, par exemple par
formation de triple hélice (avec une séquence d'oligonucléotides ou de leurs
analogues) ; une telle liaison peut également être utilisée pour positionner
un réactif
particulier (attaché à I'oligo) permettant d'induire un "cross-link" inter-
brin, avec
un groupement photoactivable par exemple ;
- le tampon utilisé etlou le choix de la température peuvent également
modifier de façon substantielle la force nécessaire pour désapparier,
respectivement
réapparier, le duplex.
r ,
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B) on peut faire interagir sur les simples brins de la molécule d'acide
nucléique partiellement ouverte des molécules additionnelles caractérisées en
ce
qu'elles se fixent de préférence sur au moins un site spécifique sur un simple
brin ;
lors de la réfermeture et/ou réouverture, le signal de la signature est alors
modifié.
Utilisations des signatures
Une ou plusieurs signatures, avec empreinte ou non, correspondant à un
duplex donné, peuvent être comparées à des références, constituées soit par
une ou
plusieurs mesures sur un autre duplex, soit à des calculs numériques, soit une
combinaison des deux.
On peut ainsi détecter et localiser l'absence ou la présence d'un ou
plusieurs des éléments suivants donnés à titre d'exemple
- homologie,
- translocation,
- délétion,
I S - amplification,
- des régions de répétition homologue,
- zone d'appariement partiel,
- motif particulier de la séquence,
- différence,
- mutation,
- contigation,
- une région particulière, identifiable par son contenu GC,
- un ilôt CpG.
Cette méthode constitue une aide au séquençage. Elle permet aussi
l'analyse et la comparaison des différences génomiques parmi différents
patients ou
différents échantillons d'ADN à tester.
L'invention concerne, enfin, un coffret de diagnostic destiné à la mise
en oeuvre du procédé revendiqué et qui est décrit ci-dessous.
Le coffret de diagnostic est caractérisé en ce qu'il comporte un ou
plusieurs des éléments suivants
- au moins un bras espaceur,
- au moins une construction moléculaire cassette de bras espaceur,
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- au moins un oligonucléotide de jonction,
au moins un oligonucléotide en épingle à cheveux,
- au moins une enzyme de restriction,
- ~ au moins une construction moléculaire destinée à fixer les brins du
S duplex à ouvrir sur des éléments de l'appareil de mesure de force,
- un support fixable à l'extrémité fonctionnalisée du bras espaceur.
- au moins un puits,
- au moins une lame,
- au moins un type de billes fonctionnalisées et avantageusement
aimantables, destinées à être attachées à un élément fonctionnalisé du
duplex à ouvrir,
- au morns un aEmant,
- au morns un tampon,
- au moins une enzyme de ligation,
- au moins un tampon de ligation,
- au moins une colonne de séparation par centrifugation.
- La figure 1 illustre, sur un exemple, le principe de la mesure de la force.
Un
ADN double brin (5) est ouvert en force. Le simple brin d'un coté de la double
hélice est connecté à un substrat solide (lamelle de microscope) (;) par
l'intermédiaire d'un bras espaceur (4) et l'autre simple brin est greffé sur
une
bille microscopique (2). La bille est visible sous le microscope et permet de
localiser la molécule. Un dispositif de mesure de force (par exemple aiguille
souple (1), pince optique, etc.) est connecté à la bille choisie. La force est
mesurée en fonction de l'extension de la molécule.
- La figure 2,A et B, illustre un exemple de la construction moléculaire.
- La figure 3 représente une section en coupe de ('échantillon. Un anneau (6)
retient un petit volume de liquide tampon et l'ancrage de la construction a
lieu
sur la lamelle de verre (7), (a) : billes collées sur la surface, (b) :
exemples de
billes correctement attachées.
3U - La figure 4 est une vue schématique du montage expérimental.
L'échantillon est
posé sur un microscope inversé relié à une caméra vidéo. Le détecteur de force
est une aiguille de verre flexible (8) montée sur un micro-manipulateur. Une
r ~
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fois que le levier (fixé à sa base) est attaché, à son extrémité souple, à une
construction moléculaire, le puits est déplacé latéralement et la déflexion
correspondante de l'extrémité du levier est mesurée sur la vidéo. Un
ordinateur
{PC) est utilisé pour contrôler le déplacement et acduérir les données de
5 déflexion.
- La figure S rend compte de ce que la force (déflexion du levier) est une
fonction
de la "distance extrémité à extrémité" pendant l'extension de la construction
moléculaire.
La figure 6 rend compte de données relatives à la force en fonction de la
10 distance extrémité à extrémité pour trois mesures (A, B, C) de la mëme
molécule utilisant des vitesses de translation variées. Une structure à
l'intérieur
du plateau apparaît plus clairement quand la translation est lente (figure
6A).
- La figure 7 illustre la comparaison des forces en fonction du signal de la
distance extrémité à extrémité de la construction moléculaire A et A-~,
(défini
15 plus loin). La vitesse de translation utilisée dans ces mesures d'ouverture
est
d'environ V = 0,06 pms-1. Au niveau de la figure 7B, les deux mesures sont
directement superposables.
La figure 8 illustre la teneur moyenne en GC le long de la molécule du pliage
~,
Un moyennage est réalisé sur 200 bases (figure 8C), sur I 000 bases (figure
8B)
et sur 2 000 bases (figure 8A).
- La figure 9 illustre la comparaison de la force mesurée pendant l'ouverture
(figure 9A) et la fermeture (figure 9B) de la même molécule à la même vitesse
de translation.
La figure 10 montre la reproductibilité du ,signal de force pour deux mesures,
à
des instants différents, sur la même molécule, et à la même vitesse de
déplacement (160 nm/sec).
- La figure 11 montre le détail d'un signal de force à faible vitesse de
déplacement (40 nm/sec), où l'on voit clairement la structure en dents de
scie.
- La figure 12 permet de comparer un détail de la mesure (amplitude pic-pic de
2
pN environ ; creux GC au milieu de l'ouverture du ~.) avec le contenu GC
(moyenne glissante sur 500 bases) représenté pour le morceau correspondant
entre les index de base de 15 000 à 25 000.
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- ~La figure 13 illustre un calcul numérique du signal de force pour une
molécule
d'ADN du phage ~,. L'axe horizontal est décalé par rapport aux mesures
expérimentales car le bras espaceur n'est pas inclus dans la description
théorique.
- La figure 14 illustre un ensemble de résultats théoriques sur la physique de
l'ouverture. Du bas vers le haut, la force de déflexion, le nombre moyen < j >
de
paires de bases ouvertes, et la variance de j sont présentés en fonction du
déplacement de l'échantillon (en micromètre) qui contrôle le processus
d'ouverture. La teneur moyenne en GC correspondant à la séquence ouverte est
tracée sur la droite (moyenne glissante sur 100 bases).
Par le choix des axes communs, la figure permet de relier les structures dans
le
contenu GC, à la force de déflexion, à < j > et à la variance de j (et vice
versa).
- La figure 15 illustre l'effet de la raideur du levier et des simples brins.
On a
porté le nombre moyen < j > de paires ouvertes, en fonction du déplacement
(échelle de déplacement donnée par la barre horizontale).
Dans ces calculs, la raideur du levier k,r~. est quatre fois plus petite
(courbe A),
deux foix plus brande (courbes B et C), ou dix fois plus grande (courbe D) que
la raideur du levier utilisé dans les expériences. Pour les courbes C et D, on
a
supposé que la longueur de chacun des deux simples brins est réduite de 20 000
bases, ceci permet d'observer l'influence de l'élasticité des simples brins.
- La figure 16 illustre une mesure de force pendant l'ouverture sur la
construction
n, réalisée avec un levier de raideur 2,5 pN/lzm environ. Les points sont
obtenus expérimentalement par l'analyse III, décrite par ailleurs. On a tracé
la
force exprimée en picoNewton en fonction de la distance bout-à-bout exprimée
en micromètres.
La figure l7 illustre une mesure de force pendant l'ouverture sur la
construcüon
/1, réalisée à la même vitesse d'ouverture que pour la figure 16, et par le
même
système de mesure mais avec un levier de raideur 19 pN/um environ. On a
tracé la force exprimée en picoNewton en fonction de la distance bout-à-bout
exprimée micromètres.
- La figure 18 illustre une superposition entre le signal de force obtenu lors
de
l'ouverture, et le contenu moyen en base G ou C le long d'un segment donné de
r. i
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la séquence (de 3000 à 8000) ; la moyenne est une moyenne gaussienne, de
largeur caractéristique totale à 1/e de 50 bases. La courbe donnant la moyenne
est tracée avec un trait continu. La courbe expérimentale est tracée avec des
points discrets.
Exemple de réalisation~ratique
On décrit ici à titre non limitatif, et comme exemple, le détail de la
préparation et de la mesure de signature selon la présente invention sur l'ADN
du
phage lambda.
Construction (figures 1 et 2)
Oligo 1 est un élément connecteur entre DNA 1 (ADN du phage ~.
destiné à être ouvert) et DNA 2 (ADN du phage ~, qui sert de bras espaceur).
Oligo
2, élément connecteur, est biotinylé 3', ce qui sert à l'attachement sur une
bille.
Oligo 3 est fonctionnalisé 3' dig et sert à l'attachement sur la surface.
Oligo 4 est
une mini-épingle à cheveux cohésive.
Les séquences choisies à titre d'exemple sont les suivantes
Oligo 1
5' Agg TCg CCg CCC AAg ggA CTA CgA gAT Tg 3'
Oligo 2 (fonctionnalisé 3' biotine)
5' Agg TCg CCg CCC CAA TCT CgT AgT CCC AAA AAA TCA gCA gTA AC
Biotine 3'
Oligo 3 (fonctionnalisé 3' dig)
5' ggg Cgg CgA CCT dig 3'
Oligo 4 (mini-épingle à cheveux cohésive)
5' ggg Cgg CgA CCT AgC gAA AgC T 3'
La préparation est effectuée de la façon suivante, par exemple à partir
de 10 pg de DNA 1 et 10 pg de DNA 2
Le tampon utilisé lors des fusions ci-après est le tampon de ligation sans
ATP (Pharmacia). Les volumes de réaction sont typiquement de 20 à 60 pl.
1) Fusion (SS°C, 1 heure) et ligation (T4 ligase (l'harmacia) 0,2
unités Weiss, 1
heure, 16°C) de
- DNA2 + oligo 3, c'est-à-dire la préparation A
(rapport de molarité : 1/10) ;
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- DNA1 + oligo 4, c'est-à-dire la préparation B
(rapport de molarité : 1/10).
lbis) Thermo-inactivation de la ligase.
2) Fusion (55°C, 1 heure), ligation (T4 ligase (Pharmacia) 0,2 unités
Weiss, 1
S heure, 16°C), thermo-inactivation de la ligase et purification
de
- préparation A + oligo 1, c'est-à-dire la préparation-C
(rapport de molarité : I/20) ;
- préparation B + oligo 2, c'est-à-dire la préparation D
(rapport de molarité : 1/20).
3) Fusion (40°C, 1 heure, puis refroidissement lent), Iigation (T4
ligase
(Pharmacia) 0,2 unités Weiss, 2 heures, 16°C), thermo-inactivation de
la ligase
et purification de
- préparations C et D, en ajoutant du PEG (10%) pour promouvoir
la réaction, c' est-à-dire la préparation E.
Typiquement, on a utilisé 2 ng de construction par expérience.
Les étapes de purification sont réalisées par des colonnes de filtration
Am icon-100.
L'échantillon
Les expériences sont effectuées dans un liquide (tampon de pH contrôlé
et de concentration en sel donnée, on utilise par exemple du PBS, lOrrWI
phosphate,
150mI~I Na+, pH = 7.0). Un anneau en plastique est collé à la paraffine sur la
lame
du microscope et permet de maintenir un petit volume de tampon au-dessus de la
surface de verre. Ceci constitue un puits dans lequel les mesures seront
effectuées.
La surface de verre fonctionnalisée (fond du puits) va ancrer la construction
moléculaire. Puis les particules sont ajoutées et un certain nombre d'entre
elles vont
se fixer. Le puits est placé sur un microscope inversé et la mesure des forces
est
effectuée en utilisant une micro-aiguille souple, introduite dans le liquide
par la
partie libre du ménisque.
Naturellement, un piège optique (Svoboda et al., 1993 ; Finer et al.,
1994 ; Yin et al., 1996) peut être utilisé avec avantage comme capteur de
force, à la
place d'une micro-aiguille.
i i
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On doit, enfin, prendre garde d'éviter les surfaces chargées positivement
de façôn à éviter les adsorptions non souhaitées d'ADN.
1 ) Support n° 2 : les particules sont des billes
Les billes utilisées sont des billes commerciales Dyna, paramagnétiques
(diamètre 2,9 pm). Ces billes sont revêtues de streptavidine et on leur a
appliqué un
traitement complémentaire avec un agent d'acétylation (NHS acétate).
2) Support n° I : Lamelles de microscope et leur préparation
Dans les étapes de préparation un très petit volume de réaction, environ
pl est créé par l'utilisation d'un petit disque circulaire de verre mince
(diamètre
10 12 mm) qui est disposé à l'intérieur de l'anneau en plastique du puits et
sert du
couvercle. Lorsqu'il est nécessaire d'effectuer une chimie par voie liquide,
le
liquide, environ 10 pl, est d'abord ajouté au puits et le disque placé ensuite
par
dessus adhère par capillarité. Le liquide se retrouve confiné entre le fond du
puits,
d'une part, et la lamelle circulaire, d'autre part ; le liquide est réparti
sur toute la
surface avec une épaisseur approximativement uniforme d'environ 10 pm.
L'incubation est alors effectuée dans le puits couvert. Pour l'étape suivante
300 à
400 pl de tampon sont ajoutés à l'intérieur de l'anneau du puits, le disque en
verre
flotte en dehors de la base du puits et est facilement éliminé avec des
brucelles.
L'excès de tampon est éliminé en inclinant le puits sur un papier absorbant.
On prépare des lamelles de microscope en verre sur lesquelles sont
greffés des polymères linéaires, chargés négativement (polymérisation
statistique
d'acide maléfique et d'acrylamide sur les lamelles silanisées vinyl, ce qui
crée une
surface chargée négativement et très hydrophile). Ceci permet la
fonctionnalisation
subséquente avec l'antidig.
2~ A titre d'exemple, on peut utiliser pour fia silanisation un
trichlorosilane,
avec une chaîne intermédiaire composée de 5 à 20 carbones, terminée par un
groupe
vinyle. Les surfaces de verre sont introduites dans une enceinte étanche,
munie
d'une trappe d'accès et de tuyaux d'entrée et de sortie, munis de robinets.
Cette
enceinte contient un tube qui génère de l'U.V., constitué d'une lampe basse
pression à mercure (marque Heareus) générant de l'U.V. sur une gamme de
longueur d'onde qui recouvre partiellement la bande d'absorption de l'oxygène.
Dans un premier temps (10 minutes), l'enceinte est balayée par un courant
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d'oXygène,.gazeux. Les robinets sont ensuite fermés et on allume la lampe
pendant
une à plusieurs heures. De l'ozone est créé et aide au nettoyage des surfaces
de
verre. Après arrêt de l'U.V., un flux gazeux est introduit pendant S minutes.
Il s'agit
d'oxygèné ayant barboté dans de l'eau. Les lamelles sont extraites rapidement
de fa
S chambre et introduites dans une enceinte hermétique, en verre, dans laquelle
on a
disposé quelques gouttes de silane. La silanisation se produit par transfert
gazeux.
Après quelques heures, les lamelles sont mises dans un four (typiquement 1
SO°C
pendant une heure), puis rincées sous un filet d'eau et stockées dans un
pochon de
feuille d'aluminium par exemple.
10 A partir des lamelles, on fabrique des puits comme décrit
précédemment. Dans les puits on introduit un petit volume d'un mélange
constitué
de
- acrylamide,
- acide maléfique neutralisé pH 7 au moment de l'utilisation,
1 S - eau désoxygénée,
- persulfate (initiateur),
- T'EMED (initiateur).
Le rapport acrylamide/acide maléfique est choisi dans la gamme 10/1 à
S/1.
20 La polymérisation est réalisée dans les puits, protégés par leur
couvercle.
Cette procédure permet l'obtention d'une matrice électronégative et
hydrophile constituée ici par les groupements acides (issus de l'acide
maléfique),
incorporés dans les polymères longs issus de la polymérisation de
l'acrylamide,
2S eux-mëmes ancrés sur la surface.
L e caractère fortement électronégatif permet de combattre efficacement
l'adsorption de l'ADN, polyélectrolyte de charge négative.
L'homme de l'art peut naturellement adapter cette conception
particulière de matrice électronégative à d'autres systèmes. A titre
d'exemple, on
peut citer encore une matrice obtenue par fixation de dextran, suivie d'une
étape de
transformation des sucres pour obtenir des groupements acides.
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Une matrice électronégative est caractérisée en ce qu'elle est constituée
de pol~mères de caractère globalement électronégatif et hydrophile, attachés
sur un
support, les polymères peuvent être statistiques et/ou branchés, mais en
moyenne
sont constitués de l'assemblage d'au moins un type de monomère. La taille
typique
des polymères exprimée en nombre de monomères incorporés est d'au moins deux,
de préférence entre 10 et 1 000 et pouvant même aller jusqu'à un million, et
la
matrice finale présente de façon statistique ou régulière une densité de
groupements
-COOH au moins supérieure à 1/1 000 et de préférence comprise entre 1/20 et
1/1.
L'antidig (polyclonal, Boehringer Mannheim) est couplé par des
groupes NHZ à une partie de la matrice COOH en utilisant les techniques des
EDC-
NHS ou EDC-NHSS.
Après élimination du couvercle et rinçage, un film mince de tampon
demeure sur la surface hydrophile de la surface en verre traitée. On peut
alors
effectuer ies autres opérations de couplage.
Le couplage de l'antidig est effectué de la façon suivante
- 10 minutes d'incubation EDC-NHSS (dans de l'eau) (EDC = 1-Ethyl-3-(3-
Diméthyl-aminopropyl)-Carbodümide sous forme de chlorhydrate, NHSS =
Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide)) ;
- 10 secondes de rinçage sous un filet d'eau ;
- 10 minutes de couplage avec l'antidig dans du PBS ;
- 10 minutes de désactivation avec de la glycine 1M pHB, pour permettre la
récupération des groupes COOH à partir des sites activés résiduels EDC-NHSS;
- rinçage.
Les surfaces antidig avec un agent antimicrobien (0,02 % NaN3) et
protégées par une lamelle sont placées dans un sac avec une atmosphère humide
et
peuvent être stockées des semaines dans un réfrigérateur. En effectuant ies
expériences, les puits revêtus d'antidig sont rincés avec du PBS, incubés avec
une
dilution de construction moléculaire dans du PBS (typiquement 1 ng de
construction dans 10 lZl) pour 30 minutes. Les dilutions et tampons
d'incubation
peuvent naturellement être adaptés. Puis un excès de tampon est ajouté et les
billes
revêtues de streptavidine sont introduites. Elles sédimentent et réagissent
avec la
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construction moléculaire à la surface de la lame de microscope. Après une
heure
d'incubation typiquement, une grande partie des billes non attachées sont
éliminées
en trempant rapidement un petit aimant dans ie puits, l'aimant attire et colle
les
particules libres. Puis on effectue l'étape de sélection des billes décrite
précédemment et qui utilise la présence de bras espaceur.
Typiquement, de 0 à 50 billes attachées sont observées dans un champ
de vue, sous le microscope avec un objectif 20X. Dans le même champ,
typiquement une fraction variant du I/10 aux 3/4 des billes peuvent être
collées ou
adsorbées.
Naturellement, d'autres surfaces que le verre, notamment des matériaux
polymériques, peuvent être utilisées, à la fois pour le fond du puits et pour
le
couvercle. Ce dernier peut aussi être réalisé avec d'autres matériaux, un
métal ou
une céramique à titre d'exemple non limitatif.
Le levier de force : micro-aiguille souple en verre
On utilise un appareil commercial à tirer des pipettes. On prépare des
micro-aiguilles (dont les dimensions typiques sont : diamètre : 1 mm, diamètre
de
l'extrêmité : 1 pm et longueur 1 cm). La raideur varie en fonction des
aiguilles et
est calibrée (voir suite). Les aiguilles sont biotinilées chimiquement comme
suit
- lavage au mélange sulfochromique ;
- silanisation (avec un silane terminé par une amine primaire) ;
- réaction avec NHS-LC-biotine (Boehringer) (qui réagit les amines primaires).
Le levier traité adhère rapidement aux microbilles revêtues de
streptavidine simplement en les touchant. On peut immédiatement procéder aux
mesures de force. Après la mesure, les microbilles peuvent être séparées par
un
choc mécanique sur le levier, ou en utilisant un effet de ménisque simplement
en
soulevant le levier hors du puits puis en le replongeant dans le liquide.
Mesure des forces
L'échantillon est placé sur un microscope inversé comportant un
objectif à grande magnification (Zeiss Achroplan, immersion dans l'huile, x
100,
N.A. 1,25). L'image de la bille et de l'extrémité souple du levier est
recueillie par
une caméra vidéo. Une platine de translation piezo permet un déplacement
latéral
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précis de L'échantillon par rapport à la base fixe du levier de force.
(L'inversion
cinémàtique est bien sûr envisageable).
Ce déplacement est mesuré avec une résolution meilleure que le micron
en utilisant un senseur inductif. Un ordinateur permet de connecter les
informations
sur le déplacement de l'échantillon et la déflexion du levier qui est
enregistrée par
une caméra vidéo, (l'image vidéo est capturée par un système d'acquisition
numérique). Les forces impliquées dans les expériences d'ouverture de l'ADN
sont
de quelques dizaines de PicoNewtons, qui correspondent typiquement à un
déplacement de l'extrémité du levier de quelques dizaines de microns.
On a utilisé deux types de méthodes pour obtenir ces données de
déflexion. Dans le mode peu résolu (appelé Analyse I), la détermination de la
déflexion est faite à une résolution de 0,2 um environ, qui correspond à celle
des
pixels (acquisition numérique de l'image). Un deuxième mode plus sensible a
été
utilisé (appelé Analyse II). Utilisant le fait que les billes présentent une
image très
1 S contrastée (blanc au centre, noir sur leur périphérie), la méthode choisie
est la
suivante : une unique ligne vidéo de l'image est retenue et sélectionnée de
façon à
recouvrir une section de la bille ; la ligne vidéo présente une structure de
fond gris,
sur lequel est superposée la modulation forte et localisée noir-blanc-noir qui
correspond à la bille. Une méthode numérique permet alors avec une résolution
du
sub-pixel l'interpolation de la position du centre de la bille. On peut ainsi,
à partir
de l'enregistrement vidéo des déplacements de la bille collée au levier,
remonter à
la déflexion au cours de l'expérience, avec une résolution de l'ordre d'une
vingtaine
de nanomètres (Analyse II).
La platine à déplacement piezoélectrique permet des séquences
arbitraires de déplacement en fonction du temps.
Calibration de la raideur des leviers
La micro-aiguille à calibrer est d'abord biotinilée comme décrit
précédemment. Une bille paramagnétique (Dyna) est attachée à l'extrêmité de la
micro-aiguille dans un puits (sans ADN) rempli de tampon. Un petit aimant est
approché à quelques dizaines ou centaines de microns, et la déflexion de
l'extrémité
du levier en fonction de la distance entre la bille et l'aimant est mesurée.
L'aimant
est écarté ensuite à une position qui correspond à une petite déflexion. La
bille est
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alors détachée mécaniquement à partir du levier souple en utilisant une
seconde
micro-aiguille plus raide contrôlée par micro-manipulation. La bille se
déplace alors
rapidement vers l'aimant.
En utilisant une illumination stroboscopique, on repère la position en
fonction du temps de la bille pendant l'accélération vers l'aimant. La vitesse
de la
bille en fonction de la distance bille/aimant est obtenue à partir
d'informations
vidéo. La vitesse locale v est proportionnelle à la force sur la bille (par la
formule
de Stokes : F = 6n rlRv dans laquelle rl est la viscosité du tampon et R est
le rayon
de la bille).
A partir des deux jeux de mesure (déflexion du levier en fonction de la
distance bille/aimant et vitesse de la bille en fonction de la distance
bille/aimant) on
obtient la relation entre force et déflexion, c'est-à-dire la raideur du
levier. Un seul
levier a été utilisé au cours des différentes expériences. Sa raideur a été
estimée à
1,7 pN/micron (avec une précision de 20 %). Une confirmation indépendante de
cette calibration est la suivante : parfois lorsque la molécule refuse de
s'ouvrir, un
plateau caractéristique dans la courbe extension en fonction de la force de ia
double
hélice, sont alors mesurées (Cluzel et al., 1996 ; Smith et al., 1996). En
utilisant la
raideur de la calibration, les valeurs des forces obtenues pour ce plateau
sont
compatibles avec celles données dans la littérature.
Mesures de l'ouverture de l'ADN par des forces mécaniques
Dans la figure 5, avec l'Analyse I, on a représenté un premier exemple
de mesure de force lors de l'ouverture de l'ADN du pliage ~,. L'axe horizontal
correspond à la distance entre les deux ancrages de la construction
moléculaire
(distance bout à bout, définie comme le déplacement du puits mesuré à partir
de
l'attachement du levier, retranché de la déflexion du levier). Au point A, à
une force
zéro et à une distance zéro, aucune force mécanique mesurable n'est exercée
par le
levier sur la molécule ; par l'action des forces entropiques, le bras espaceur
double
brin de l'ADN ~, avant attachement du levier, se trouve compacté près du point
d'ancrage (distance égale à zéro, identifée comme la position moyenne de la
bille
avant l'attachement au levier). Juste après l'attachement de la bille au
levier, on
lève le levier de quelques micromètres au-dessus de la surface pour éviter les
frictions solides. En déplaçant l'échantillon latéralement clans la direction
X
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positive ou négative, une déflexion mesurable apparaît lorsque les distances
bout à
bout approchent de la longeur du bras espaceur ADN ~, (environ 16 pm). Le
segment A-B-C (respectivement A'-B'-C') correspond à l'extension entropique du
bras espaceur. On trouve ici le régime décrit par Bustamante et al., (1994)
sur
5 l'extension d'une double hélice d'ADN simple.
Au point C (respectivement C'), on observe un soudain changement
dans la dépendance de la force en fonction de la distance. Un quasi plateau C-
D
(respectivement C'-D') est observé à une force d'environ 11 à 13 pN. Ce
plateau
correspond à la séparation de deux brins de la molécule d'ADN, dont un brin
est
10 fixé au long bras espaceur d'ADN et le second brin à la bille. La distance
A-D de la
figure S excède trois fois 16 p.m, ce qui est attendu puisque les longueurs
suivantes
sont impliquées : le bras espaceur d'environ 16 ~m plus deux fois la longueur
de
l'ADN monobrin étendu. A ce niveau grossier de résolution, l'ouverture
apparaît à
une valeur de force pratiquement constante.
15 La figure 5 a été obtenue par un cycle de déplacement rapide. En
effectuant le retour de D à A, les deux brins se réapparient et un nouveau
cycle de
mesure peut être effectué. Durant Ie retour, on observe un phénomène
d'hysteresis
comme cela sera décrit dans la figure 9.
Lorsque la molécule ~. est totalement ouverte, la force augmente et
20 correspond à l'extension linéaire des trois composants en série, le bras
espaceur et
les deux monobrins reliés par l'épingle à cheveux.
Parfois, les caractéristiques de l'ouverture sont différentes
- une force très supérieure à ce qui est attendu, est observée, juste avant
l'ouverture (ceci correspond probablement. à une adsorption partielle des
billes
25 sur le double brin) ; parfois, les molécules ne s'ouvrent pas, mëme pour
des
forces supérieures à 50-pN ;
- la courbe distance bout à bout, en fonction de la force, croît, bien que
l'ouverture ne soit pas complète ; ce blocage de l'ouverture peut être répété
ou
transitoire, ceci peut être dû à des noeuds ou des liaisons inter-brins.
Analyse glus fine de la courbe force/distance
Un certain nombre de détails apparaissent lorsque la vitesse de
déplacement est plus lente (figure 6). Ceci offre la possibilité d'optimiser
la qualité
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du signal force en choisissant une séquence appropriée de déplacement en
fonction
du temps.
Pour montrer que la courbe force en fonction de l'extension est reliée à
la séquence de base de la molécule de l'ADN ~,, on a préparé une construction
dans
laquelle l'ADN ~, destiné à être ouvert, a été inversé. Cette construction
dénommée A-', par opposition à la précédente, notée elle A, est réalisée de
façon à
ouvrir le même type de molécule phage ~,, mais en partant de l'autre
extrémité. En
prenant le brin 5'-3' gauche de l'ADN ~, comme référence, l'ouverture de A
part de
l'extrémité S' et l'ouverture A-' part de l'extrémité 3'.
Sur la figure 7, la courbe force en fonction de l'extension de la structure
inversée A-' est comparée à celle de la structure directe A. Les éléments de
symétrie
apparaissent lors de la mesure de la force. A partir de cette symétrie
approximative
entre A et A-', on peut mettre en évidence des détails qui apparaissent à
l'origine de
la même séquence explorée dans les deux sens. Le signal de force de la
construction
inversée est mis en sens inverse sur la figure 7. Ceci permet de comparer des
détails
d'information obtenus par les deux mesures qui semblent se compléter mais ne
se
superposent pas. Les flèches indiquent l'ouverture de direction.
Signature de la force en fonction de la séquence
La séquence des bases complètes de la molécule de ~, est connue. Dans
la figure 8 on représente les moyennes de contenu G-C le long de la molécule.
Zéro
sur l'axe horizontal correspond aux paires de bases qui s'ouvrent d'abord dans
la
construction A. La mesure des forces sur A correspond à la forme
caractéristique du
contenu local en G-C, comme cela peut être vu en comparant les figures 7 et 8.
On
n'espère pas un accord parfait, compte tenu de ce que l'ouverture mécanique
est un
processus dynamique complexe qui n'est pas le même pour n et n-', et enfin que
la
longueur des simples brins varie lors du processus d'ouverture et donc leur
élasticité
varie. A partir de l'inspection du nombre de caractéristiques dans la courbe
d'ouverture, on constate déjà que la résolution du processus est meilleure que
500
bases. Les zones riches en GC correspondent à des forces d'ouverture plus
grandes
comparativement aux zones pauvres en GC.
Effets de sel
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En effectuant différentes mesures préliminaires avec Na+ IOmM, ou Na+
1M (PB 10 mM Phosphate, 10 mM Na+ ou PBS avec du sel ajouté : 10 mM
Phosphate, 1M Na+), on a constaté une très faible dépendance du niveau initial
de
force Fo ~ nécessaire pour ouvrir l' ADN. Par rapport aux mesures standards
effectuées dans PBS (10 mM de Phosphate, 150 mM Na+), on observe une tendance
d'augmentation faible de Fo (à environ 14 pN) dans Na+ 1M et une décroissance
faible dans 10 mM Na+ (à environ 10 pN). Un effet plus important est
évidemment
envisagé à des niveaux de sel très faibles (de l'ordre du millimolaire ou sub
millimolaire).
Refermeture des brins
Jusqu'à maintenant, on a essentiellement étudié le signal de force
apparaissant lorsque l'on ouvre une double hélice. Lorsque la distance bout à
bout
décroît, les brins indépendants se réapparient. Comme cela apparaît dans la
figure 9,
le signal de force acquis durant l'étape du retour peut différer du signal
obtenu
durant l'ouverture. En particulier, des chutes prononcées apparaissent parfois
dans
la courbe force en fonction de la distance.
Une interprétation possible de ces effets est qu'il existe un
réappariement transitoire différé. Plusieurs sources peuvent être envisagées
1) des structures secondaires, c'est-à-dire une fixation locale entre deux
brins en
mésappariement ;
2) des séquences particulières peuvent induire des instabilités ;
3) d'autres modifications
- d'autres macromolécules (en particulier des molécules d'ADN libres en
solution peuvent s' interposer dans la fourche de fermeture) ;
- des solides microscopiques (des poussières par exemple).
I1 est clair que l'élasticité de l'ensemble du système est impliquée. En
particulier, il faut noter que sur l'instabilité durant la fermeture, la pente
de la
courbe force/distance augmente alors que la longueur des brins simples
diminue.
Reproductibilité
On a effectué des mesures à grande résolution (Analyse II définie
précédemment) sur une même molécule, à deux instants différents, et à la même
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vitesse moyenne de 160 nm/sec. La figure 10 présente !e résultat de ces deux
mesures. On pourra également comparer ces résultats à la figure 8.
AnalYSe de signature à forte résolution et à basse vitesse
A forte résolution (Analyse II définie précédemment) et à basse vitesse,
le signal d'ouverture présente des répétitions de motifs caractéristiques en
dents de
scie, constitués d'une montée lente en force, en fonction du déplacement
imposé,
suivi d'une décroissance brutale, signe d'instabilité.
La figure 11 est un exemple d'une partie de mesure réalisée à la vitesse
moyenne de 40 nm/sec.
Les positions et amplitudes de ces motifs en dent de scie dépendent de
la séquence. Ainsi que décrit plus loin, la naissance d'une instabilité peut
être
induite par une variation très locale du contenu GC, induisant un point de
blocage
d'ouverture, suivi d'une zone d'ouverture plus facile. Après avoir atteint le
seuil de
force nécessaire pour ouvrir un point dur, l'énergie élastique stockée dans la
construction moléculaire et dans le dispositif de mesure de force va permettre
le
déplacement du point d'ouverture le long de l'ADN, même lorsque la position de
la
platine de déplacement est peu changée. Qualitativement, ces motifs se
superposent
à une ligne de base qui dépend de la proportion GC de la séquence.
Il est ainsi clair que la signature des forces résulte d'une interaction
complexe entre les séquences et la raideur mécanique impliquée dans cette
mesure.
On pourra avec avantage réaliser des signatures avec des raideurs différentes.
Dans l'exemple donné, le nombre de dents de scie est typiquement de
50, pour l'ouverture d'un segment de 20 kb. Ceci correspond à un intervalle
moyen
entre dents de scie de 400 bases environ.
On a remarqué que les descentes des dents de scie, observées à
déplacement constant, correspondent à des temps supérieurs au temps
caractéristique de réponse du levier. D'autre part, et de façon remarquable,
l'amplitude caractéristique des plus petites dents de scie visibles est
inférieure au
niveau moyen de vibration de la pointe du levier (sujette à des perturbations
extérieures : acoustiques, sismiques, etc.). La signature n'est donc pas trop
sensible
aux perturbations mécaniques lors de la mesure.
i i
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La figure 12 présente un exemple additionnel de la relation entre la
signature de force et le contenu GC (moyenne glissante sur 500 bases). Les
données
correspondent à une mesure basse vitesse (20 nm/sec) de la région centrale
pauvre
en GC du.A.
On voit clairement la correspondance entre les deux courbes mais la
signature ne se confond pas avec un simple moyennage.
On voit encore que la résolution obtenue révèle des détails
correspondant approximativement à 500 bases.
Modélisation du système et résolution numérique
La signature d'une séquence donnée correspond à un problème de
physique statistique, faisant intervenir l'agitation thermique, les raideurs,
et les
énergies d'appariement. Les valeurs moyennes observables (force d'ouverture,
position de point d'ouverture, etc.) peuvent être calculées numériquement à
partir
de la fonction de partition du système. Comme on va le voir par la suite, on
peut, à
partir d'une séquence connue, calculer numériquement la signature. Notre
modèle,
bien que simplifié, fait ressortir les caractéristiques essentielles observées
expérimentalement.
La ou les signatures de référence d'une séquence peuvent donc être
obtenues) soit numériquement soit expérimentalement.
Sur la figure 13 est présenté un exemple de calcul sur l'ouverture du
pliage 7~ (correspondant à la configuration n précédente).
Un accord entre simulation et expérience apparaît en comparant les
figures 10 et 13.
En bas de la figure 14 est présenté un agrandissement de la zone
centrale de la figure précédente. La structure en dents de scie apparaît
clairement.
Les montées lentes correspondent à des zones où le point d'ouverture se
déplace
très peu, par opposition aux descentes plus rapides, où ce point d'ouverture
se
déplace beaucoup. Ceci apparaît dans le milieu de la figure 14, où la grandeur
< j
tracée sur l'axe vertical est la valeur qui identifie la position moyenne de
la zone
d'ouverture. Le contenu GC de la zone d'ouverture correspondante est tracé à
droite.
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En haut de la figure 14 est présenté le calcul de la variance de la
position du point d'ouverture, mesure de la résolution locale. On observe de
fortes
variations de la résolution qui dépendent de la séquence. Cette résolution est
presque partout meilleure que 100 bases. Les pics de variance correspondent à
des
5 endroits où le signal en force baisse brutaiement.
Modifications de s~nature
Signature et raideurs
La signature dépend de la raideur totale du système, c'est-à-dire les
raideurs totales du système de mesure et les raideurs liées à la construction
IO moléculaire, notamment celles des simples brins de la molécule ouverte. Une
faible
raideur favorise des grands événements d'instabilité et une forte raideur les
diminue. Ceci est démontré théoriquement dans la figure 1 ~.
Analyses supplémentaires
Mode d'acquisition
15 Un troisième mode d'analyse de la force (appelé Analyse III) a été mis
au point et permet l'acquisition du signal en direct (Essevaz-Roulet et al.,
1997 ;
Bockelmann et al., 1997). L'analyse III est basée sur le même principe que
l'analyse
II définie précédemment, mais n'utilise pas l'intermédiaire des
enregistrements
vidéo sur magnétoscope. L'image vidéo en temps réel de la bille et du levier
est
20 numérisée en direct sur un ordinateur Macintosh muni d'une entrée vidéo
(Mac
PPC8600), et un logiciel spécifique d'analyse d'image en extrait en temps réel
la
position du levier. Ceci permet d'obtenir un fichier avec la déflexion du
levier au
cours du temps, et donc la force exercée sur la molécule au cours de
l'ouverture.
Modification expérimentale de la signature par changement de raideur
25 La signature dépend de la raideur totale du système comme précisé
précédemment. Lorsque la raideur augmente, ia densité d'information de la
signature augmente également, c'est-à-dire que, par exemple, le nombre de pics
est
plus important. Ceci est démontré expérimentalement par les figures 16 et 17
(dans
les deux figures, on a représenté la force en picoNewton en fonction de la
distance
30 bout-à-bout déf nie précédemment). Dans 1a figure 16, on présente une
portion de la
signature obtenue avec un levier de raideur 2,5 pN/~m sur une construction A.
La
r r. ,
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figure 17 représente la même portion de signature sur une construction A ,
avecwn
levier de raideur 19 pN/~,m environ.
Comparaison de la signature avec la séquence de l'ADN du phage ~,.
Pour comparer la signature avec la séquence du phage ~,, on représente
la séquence par sa densité en paires de bases G-C. On effectue une moyenne
gaussienne glissante (de largeur caractéristique L donnée) le long de la
séquence,
exprimant le pourcentage moyen en bases G-C (de 0 à 100 %) le long de cette
séquence. Pour superposer la séquence ainsi moyennée à la signature, il faut
leur
donner un axe commun. Ceci est fait en considérant que 1 micromètre
d'ouverture
(ou 1 micromètre de distance bout-à-bout) correspond à l'ouverture de 1000
paires
de bases environ. La superposition de deux de ces courbes est représentée par
la
figure 18. Il s'agit de la signature (courbe tracée en points séparés) à 3
micromètres
du début de l'ouverture jusqu'à 8 micromètres, superposée à la séquence
moyennée
sur L=50 bases (courbe tracée en ligne continue) entre l'index de base 3000 et
8000.
Avec cette superposition, on observe en particulier que les pics de la
signature sont
liés à la présence de zones riches en G-C qui bloquent transitoirement
l'ouverture.
On peut en déduire que la signature est sensible à des détails de la séquence
à
l'échelle de 50 bases environ.
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REFERENCES
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