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- PROCEDE DE NUMERATION DE CELLULES VIABLES
L'invention porte sur un procédé de détection etlou de numération
de cellules viables notamment des microorganismes, comprenant une
étape de marquage avec un marqueur de viabilité et une étape de contre-
marquage avec un agent de blocage, sur les compositions de marquage et
de blocage ainsi que sur un kit pour la mise en oeuvre du procédé.
L'invention porte également sur une composition contenant un ou
des agents de blocage capables de marquer spécifiquement des particules
ou des cellules mortes, à l'exclusion des cellules vivantes qu'elles soient
sous forme cellulaire ou sporulante, permettant une numération
75 différentielle des cellules vivantes des autres particules incluant des
cellules mortes.
La détection etlou la numération de cellules viables dans un
échantillon a un intérét tant pour s'assurer de la qualité des inoculums pour
la production de produits issus de la fermentation tels la bière, ie vin, les
produits laitiers, etc... que pour contrôler la stérilité de produits
alimentaires
ou sanitaires ou pharmaceutiques avant utilisation ou commercialisation.
Par cellules viables, on entend toute matière biologique sous forme
unicellulaire, ou de façon plus générale toute matière contenant une
information génétique qui est auto-reproductible ou reproductible dans un
système biologique. Cela inclut toutes cellules eucaryotes ou procaryotes,
y compris les formes sporulantes ; à titre d'exemple, on citera les bactéries,
les champignons ou les levures.
Différentes méthodes sont disponibles afin de déterminer la viabilité
cellulaire, incluant la méthode traditionnelle de numération sur boite de
pétri. La numération des microorganismes par cette technique est souvent
longue à mettre en oeuvre, le résultat n'est observé qu'après 2 jours à
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7 jours voire 14 jours d'incubation, délai incompatible avec la
commercialisation de denrées périssables, et il est souvent entaché
d'erreurs importantes si le nombre de boîtes ensemencées n'est pas
suffisant pour un comptage statistique. Enfin, ces techniques sont
inopérantes pour détecter et dénombrer les microorganismes vivants dont
les capacités de croissance sur boite de Pétri ou en culture sont limitées ou
nulles.
Des techniques de dénombrement direct ont été développées pour
palier au long délai de réponse des méthodes traditionnelles. 11 s'agit en
particulier de la technique DEFT (direct epifluorescence technic),
dénombrement au moyen de marqueurs fluorescents et en particulier de
l'acridine orange ; l'utilisation de cette technique ainsi que ses limitations
sont décrits dans une récente revue publiée par KENNER et PRATT
(Microbiological Review (1994) 58 603-fi15). Néanmoins, ces techniques
ont l'inconvénient de générer de nombreuses adsorptions non spécifiques
qui conduisent à une surestimation de la numération par comptage de faux
positifs ; en particulier quand ce dénombrement est automatisé à l'aide de
systèmes tels que les cytomètres en flux.
Une variante de cette approche consiste à utiliser des marqueurs
susceptibles de donner un signal fluorescent après transformation par une
enzyme cellulaire. L'émission du signal fluorescent est la conséquence de
l'existence d'une activité enzymatique, et révèle ia présence d'une cellule
viable. Cette technique présente les avantages de minimiser le nombre de
faux positifs, de pouvoir différencier les cellules viables des cellules
mortes
par la conversion enzymatique du précurseur, et de favoriser
l'accumulation intracellulaire des marqueurs grâce au- maintien de l'intégrité
membranaire. Néanmoins, à cette conversion enzymatique intracellulaire
est associée une hydrolyse non spécifique due au tampon de marquage,
comme tout ester en milieu aqueux. Cette hydrolyse bien que minime peut
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générer toutefois un peu de marquage non spécifique, pouvant devenir
critique, dans l'utilisation de ces marqueurs pour un test de stérilité.
Les méthodes de marquage de souches vivantes de bactéries avec
des esters fluorogéniques, comme la fluorescéine diacétate (FDA) ou la
carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) ont été décrites notamment par J.-P.
DIAPER et al. dans Journal of Applied Bacteriology - (1994) -77 : 221-228
et par J. Porter et al. dans Journal of Applied Bacteriology, (1995) - 79
399-408.
Par ester fluorogénique, on entend toute molécule non fluorescente
qui, après action d'une enzyme, donne naissance à une molécule
fluorescente après excitation par la lumière.
De manière générale, les marquages fluorescents obtenus
directement ou par activation par une enzyme cellulaire ont l'avantage de
la rapidité d'obtention des résultats qui est sans commune mesure avec la
culture cellulaire, mais ont l'inconvénient d'être moins fiables sur le plan
quantitatif du fait de l'existence de faux positifs ou de faux négatifs.
En effet, dans ce type de technique, il existe plusieurs causes de
mésestimation du nombre de cellules viables
a) lorsque le microorganime se présente sous une forme sporulante,
l'entrée d'un composé quelconque et en particulier des marqueurs
fluorescents à l'intérieur de fa spore est difficile sinon impossible et
conduit
donc à sous-estimer le nombre de microorganismes vivants.
b) un marquage parasite de particules en suspension ou de cellules
mortes peut entraîner la numération de faux positifs, surtout dans le cas de
2~ marquage fluorescent obtenu directement.
c) après transformation du précurseur fluorogénique par une
enzyme caractéristique de la cellule viable, il peut se produire un effiux par
un mécanisme actif, lequel efflux diminue bien évidemment le marquage
infra cellulaire et pose donc un problème de sensibilité de ia méthode.
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La présente invention vise à surmonter tous les inconvénients du
marquage direct par les esters de fluorescéine qui, rappelons-le, sont
essentiellement de trois types
- l'efflux actif des produits d'hydrolyse des esters,
- l'obtention de faux positifs par le marquage des particules en suspension
ou des cellules mortes conduisant à une surestimation,
- l'impossibilité de détecter les spores de bactéries, levures ou
champignons, conduisant à une sous-estimation de cellules viables.
A cet effet, la présente invention porte sur un procédé de détection
et de numération de cellules viables dans une flore totale par détection et
mesure sélective du nombre de cellules vivantes, des particules et des
cellules mortes dans un échantillon.
Plus particulièrement, la présente invention porte sur un procédé de
détection etlou de numération de cellules viables dans un échantillon et
caractérisé par une succession d'étapes comprenant au moins
a) la mise en contact des cellules avec une composition contenant des
agents de blocage des marqueurs de viabilité,
b) la mise en contact des cellules avec un ou plusieurs marqueurs de
viabilité dans un tampon de viabilité,
c) la détection et la numération des ceüules viables dans la flore totale.
Dans le procédé de l'invention, l'étape a) est antérieure ou
simultanée à l'étape b).
Le procédé de l'invention comprend avantageusement une étape
complémentaire qui est la mise en contact des cellules avec un milieu de
gonflement, laquelle étape est préalable ou simultanée à l'étape b). Si elle
est simultanée, le milieu de gonflement et le tampon de viabilité peuvent ne
constituer qu'un seul et même milieu.
Cette étape a pour but de permettre l'incorporation et la conversion
des marqueurs fluorogéniques dans des cellules viables existant sous
...... .....~.?..... ... ,. . r
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forme de spores. Le milieu de gonflement sera un milieu de culture
susceptible de faire germer les spores, et contenant par conséquent des
inducteurs de germination, tels des acides aminés, des peptides, des
. sucres etc... A titre d'exemple, on pourra citer, le tampon TCS (tripton
5 caseine soja) qui induira plus particulièrement la germination des spores
bactériennes, ou l'extrait de malt qui sera plus particulièrement approprié à
induire la germination de spores de moisissure. Un milieu de gonflement
avantageux lorsque l'on souhaite mesurer une flore viable globale, contient
donc un mélange de TCS et d'extrait de malt.
Dans le procédé de l'invention, l'échantillon étudié peut être à
l'origine sous forme liquide, apte à être filtré, ou résulter de la mise en
suspension de particules présentes sur un solide ou dans un gaz
quelconque ; les cellules peuvent être détectées et dénombrées, soit
directement dans un échantillon liquide, soit après filtration de
l'échantillon
liquide.
Le filtre sera bien évidemment choisi de telle façon que la taille des
pores soit suffisamment petite pour retenir !'ensemble des cellules viables
que l'on souhaite détecter et/ou mesurer.
Les étapes a) et b) sont alors réalisées sur le filtre et l'étape c) est
appliquée par l'utilisation d'un cytomètre à balayage de type CHEMSCAN~
de façon à obtenir, d'une part, la détection et le comptage de la
fluorescence spécifique des cellules viables et, d'autre part, le cas échéant,
la détection de la fluorescence des particules inertes et des cellules
mortes, sur la base de leur longueur d'onde d'émission de fluorescence.
L'avantage dans le mode de réalisation de l'invention dans lequel
l'échantillon Liquide est préalablement filtré est d'augmenter
significativement la concentration des éléments que l'on souhaite détecter.
En outre, la mise en oeuvre des différentes étapes est plus aisée quand les
cellules sont déposées sur un support solide.
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s
Dans le procédé selon l'invention, l'étape de filtration peut être suivie
d'une étape de Pavage.
Après filtration de l'échantillon, le vide est cassé et la composition
d'agents de blocage telle que décrite ci-dessous est passée suc le filtre
portant l'échantillon susceptible de contenir des cellules ou ajouté
directement dans l'échantillon dans fie cas d'une analyse en milieu liquide.
Par agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant, on entend
toute molécule ou mélange de molécules susceptible d'interagir avec les
sites de fixation du ou des marqueurs de viabilité sur des particules inertes
ou des cellules mortes présentes dans l'échantillon à analyser et
empêchant une fixation non spécifique du ou des marqueurs de viabilité
sur lesdites particules ou cellules mortes.
Un agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant peut
également être constitué de toute molécule ou mélange de molécules
suceptibles d'interagir spécifiquement avec les particules inertes ou
cellules mortes ayant comme caractéristique de neutraliser une émission
éventuelle de fluorescence parasite par le marqueur de viabilité ou ses
dérivés, soit par
- absorption de la lumière parasite, par transfert d'énergie,
- compétition sur le site de fixation non spécifique,
- soit les deux simultanément ou par combinaison d'agents de blocage.
De manière avantageuse, les agents bloquants seront choisis dans la
gamme de marqueurs fluorescents, ayant des caractéristiques structurales
analogues, mais n'émettant pas ou émettant à des longueurs d'onde,
différentes de celles de marqueurs de viabilité, et d'une façon avantageuse
parmi les marqueurs ayant une longueur d'onde d'absorption de la
fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission des
marqueurs de viabilité utilisés.
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Les marqueurs de viabilité utilisés dans l'étape b} sont
avantageusement des marqueurs fluorescents, tels des esters de la
fluorescéine, de fa carboxyfluorescéine, du BCEF, du 5-6-
carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) ou du fluorescéine diacétate ou un
mélange de ceux-ci. Ces marqueurs de viabilité ont chacun une spécificité
de cibles, et nécessitent des conditions de tampons de marquage
adaptées. A titre d'exemple, le CFDA est plus particulièrement approprié
pour marquer des bactéries alors que le FDA a une meilleure capacité
d'accumulation dans les champignons ou les levures dans des conditions
de pH neutre. Un mélange de ces deux esters fluorescents permettra donc
de détecter et de dénombrer un large spectre de microorganismes
présents simultanément dans un échantillon biologique.
De manière générale, les marqueurs de viabilité sont choisis dans le
groupe formé par les xanthènes, les acridines, les fluorones et les
aminoazides.
II doit être noté ici que le procédé de l'invention est aussi utilisable
quand l'isothiocyanate de fluorescéïne (FITC) est utilisé comme marqueur
fluorescent en association avec un ligand spécifique (anticorps mono ou
polyclonal etlou sonde nucléique) qu'il s'agisse de l'identification de
microorganismes ou de cellules animales. Dans ce cas, il est souvent
observé une adsorption non spécifique de la fluorescence émise.
L'utilisation d'une composition d'agents bloquants préalable ou simultanée
au marquage par le ligand peut permettre d'éviter cet artefact.
L'invention porte également sur une composition d'agents de
blocage susceptible de prévenir la fixation de premiers composés
fluorescents sur des particules inertes ou des cellules non vivantes
caractérisée en ce qu'elle comprend
a) un ou plusieurs seconds composés fluorescents ayant une longueur
d'onde d'absorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur
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d'onde d'émission de la fluorescence des premiers marqueurs de viabilité ;
sont plus particulièrement choisis des fluorones tels l'érythrosine B, l'éthyl-
éosine, la methyl-eosine, l'Eosine B, Y, la Phloxine B ou un mélange de
ceux-ci ;
b) un ou plusieurs composés susceptibles d'entrer en compétition avec le
produit résultant de l'hydrolyse du marqueur, cause du marquage parasite ;
c) un mélange de a) et b).
La présente invention est égaiement relative à une composition de
marquage constituée d'un ou des mélanges de marqueurs de viabilité dans
un tampon à haute force ionique.
L'invention porte égaiement sur l'utilisation du procédé à la détection
et/ou à la numération des cellules viables dans un échantillon y compris
des formes sporulantes, à l'exclusion des cellules mortes ; elle permet de la
méme façon de dénombrer spécifiquement ces dernières.
L'invention porte enfin sur un kit ou trousse permettant la détection
et la numération des cellules viables dans une flore totale, lequel kit
comprenant au moins
- un agent de blocage d'un marquage parasite par les marqueurs de
viabilité ou une composition de marqueurs de viabilité telle que décrite ci-
dessus ;
- une composition contenant un ou plusieurs marqueurs de viabilité tels
que décrits ci-dessus ;
- un tampon de viabilité ;
- le cas échéant, un milieu de gonflement ;
- un protocole expérimental pour les dilutions extemporanées des différents
compositions et tampons.
Description détaillée de !'invention
Dans le procédé de l'invention, les agents de blocage permettent de
différencier d'une part les cellules vivantes et, d'autre part, les particules
et
......* . , ,,
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les cellules mortes par marquage différentiel. Quand les agents de
marquage sont des dérivés de la fluorescéine et ayant une longueur d'onde
d'émission de 515 nm, les agents de blocage seront de préférence des
dérivés halogénés de la famille des xanthènes ayant une longueur d'onde
d'absorption dans la même fenêtre ou fies dérivés de ceux-ci.
Dans ce cas, l'agent bloquant est choisi de préférence dans le
groupe formé par les fluorones substituées par au moins un atome
d'halogène, tel que chlore, brome, fluore et/ou iode; parmi les fluorones
substituées on peut citer, par exemple, l'éosine B, I'éosine Y, la phloxine B,
l'éryihrosine B, l'éthyl-éosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci.
L'agent bloquant est, de manière préférée, choisi dans le groupe formé par
les fluorones substituées au moins par 3 atomes d'halogène, et, de
préférence, par 4 atomes d'halogène, et, notamment, par 4 atomes d'iode
ou 4 atomes de brome, tels que, notamment, l'éosine Y, la phloxine B,
l'érythrosine, l'éthyléosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci. De
bons résultats ont été obtenus lorsque l'agent bloquant est choisi dans le
groupe formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine ou un mélange de ceux-ci.
La similitude des marqueurs est importante dans ia mesure où la
plupart des colorants testés se révèlent inefficaces dans l'application
recherchée, en particulier les colorants bleus sont inefficaces comme le
bleu evans, le bleu trypan ou le bleu de méthylène.
Le tableau 1 ci-dessous résume les principaux colorants qui ont été
testés avec leurs caractéristiques et leurs effets
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Tableau 1
COLORANTS ACTION COLORANTS ACT10N
Colorants bleus Pas d'action Congo Red Pas d'action
:
. bleu Evans, (0,005 %)
. bleu Trypan,
. bleu Mthylne
Rutheni~m Red Pas ou peu d'actionAlizarin Reds Pas d'action
(0.005 %)
Nile Red Pas d'effet Eosine B (0,005 Peu d'action
%)
(8 pg/ml)
Fast Red Non utilisable Phenosafranine Peu d'action
(30 Nglml) (0,002 %)
Rouge neutre Actif Eosine Y (0,01 Actif
%)
(0,003 %)
Erythrosine B Actif Phloxine B Actif
(0,004 %) (0,005 %)
Ethylosine Actif
(0,002 %)
Les agents bloquants actifs peuvent être utilisés seuls ou en combinaison.
L'avantage d'utiliser une combinaison est d'augmenter le spectre d'action
5 de ces agents bloquants.
A titre d'exemple, l'éthyl-éosine, la Phloxine B et i'Eosine Y qui sont
des dérivés bromés de la fluorescéine vont marquer préférentiellement ies
microorganismes tués alors que l'érythrosine, dérivé iodé de la
fluorescéine, va marquer de préférence les particules inertes dans le milieu
10 à analyser. Un mélange d'éthyl-éosine et d'érythrosine sera donc
particulièrement performant pour marquer l'ensemble des parücules o~r
cellules qui ne sont pas des microorganismes viables dans un échantillon
quelconque.
L'invention porte également sur une composition d'agents bloquants
comprenant des fluorones plus particulièrement choisis dans le groupe
_... _ _ , . , , ,
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formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine, la methyl-eosine, l'Eosine B, Y, la
Phloxine B ou un mélange de ceux-ci dans des rapports de concentrations
en poids allant de 1011 à 1/10. Le choix des fluorones et de leurs
concentrations relatives dépendra du type de produit que l'on doit analyser,
ainsi que de son milieu. Par exemple, pour l'analyse microbiologique de
l'eau, I'érythrosine et l'éthyl-éosine sont utilisées dans des rapports
compris
entre 5l1 et 1/5, et c~e façon préférée, par exemple de 2/1, soit des
concentrations finales respectives de 0,004 %o et 0,002 %°.
La solution comprend les constituants à une concentration qui est
entre 2 et 15 fois celle du produit d'hydrolyse du marqueur de viabilité
responsable des signaux de fluorescence non spécifiques, sachant que les
produits d'hydrolyse représentent entre 1 et 10 % en poids du marqueur de
viabilité selon le type d'échantillon analysé.
Le procédé de l'invention comprend l'utilisation d'une composition de
marquage de type universel susceptible de marquer n'importe quel type de
cellules présent dans l'échantillon étudié. Les cellules peuvent être un
procaryote, un eucaryote monocellulaire, une cellule animale, sous une
forme biologiquement active ou sous . une forme sporulante. Une
composition de marquage sera, quand le signal fluorescent sera recherché,
une composition de marqueurs que l'expérimentateur diluera
extemporanément dans le tampon de marquage à haute force ionique. La
composition de marqueur sera constituée préférentiellement d'un mélange
de 5(6)carboxyfluorescéine diacétate {CFDA) à une concentration
comprise entre 5 et 10 mg par ml, et de fluorescéine diacétate (FDA) à une
concentration comprise entre 0,5 et 5 mg par ml dans de l'acétone pur
(q.s.p.). De préférence, les rapports en poids de CFDA et de FDA seront
compris entre 511 et 1511 et de façon optimale de 9l1 soit pour 1 ml,
9 mg/ml (19,5 mM) de CFDA et 1 mglml (2,4 mM) de FDA dans de
l'acétone pur.
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Au moment du marquage des microorganismes éventuels
recherchés dans l'échantillon, la composition de marqueur telle que décrite
ci-dessus est diluée au centième dans un tampon de marquage dont la
force ionique est supérieure à 0,5 et comprenant dans une solution
aqueuse.:
- un détergent non ionique,
- un agent chélateur,
- un tampon, et
- un sel .
Une composition préférée est présentée dans le tableau 2 suivant
Tableau 2
Limites de Concentration
concentration prfre
Tween 20 (Pokyoxythylne 0,005 % - 0,1 0,03
Sorbitan %
Monolaurate)
Ethylne Diamine ttra actique1 mM - 10 mM 5 mM
3SS trisodium
Actate de Sodium trihydrat 10 mM 50 mM
Chlorure de sodium 0,5 mM - 1,5 1,13 M
M
Eau Ultrapure - qsp
Le tampon acétate de sodium peut étre indifféremment remplacé par
d'autres tampons de type tampon phosphate, HEPES, citrate, etc... De la
même façon, le chlorure de sodium peut étre remplacé par du chlorure de
potassium (KCL), du NH4~2~S04 etc...
La composition constituée d'un marqueur, ou d'un mélange de
marqueurs telle que décrite ci-dessus et diluée dans le tampon de
marquage, fait également partie de l'invention.
L'efficacité particulièrement importante du tampon en question est
surprenante du fait de sa très haute force ionique. En effet, l'isotonicité
était
..... ..._..,...,......._.,.~,.~_,.,_.._.._.d,..,.._.~,.. .. ........ .~ ....
~ ,. r,.
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généralement la solution retenue pour conserver l'intégrité de la cellule
viable. Des essais réalisés en cytométrie en flux sur des bactéries en
phase stationnaire sont présentés dans la figure 1.
La figure 1 représente l'effet de la force ionique sur le nombre de
cellules détectées. L'abscisse indique l'intensité de fluorescence, et
l'ordonnée le nombre de cellules détectées. La colonne de gauche
représente les résultats avec ~acillus subtifis et celle de droite avec
Serratia marcescens. Ils montrent qu'une augmentation de la force ionique
s'accompagne d'une augmentation de l'intensité de fluorescence, résultant
d'une meilleure accumulation du marqueur dans les cellules vivantes.
Cette expérience indique clairement qu'une force ionique supérieure
à 0.8 M est recommandée pour un dénombrement précis.
Dans le procédé de l'invention, une étape de gonflement des spores
présentes ie cas échéant dans le milieu à analyser est réalisée par
l'addition d'un milieu de type TCS, d'un extrait de malt ou avantageusement
d'un mélange des deux.
L'échantillon traité au préalable avec l'agent bloquant tel que décrit plus
haut est mis en contact avec le milieu de gonflement soit par dilution ou
resuspension de l'échantillon à analyser dans le milieu de gonflement dans
le cas d'un dénombrement en milieu liquide, soit par transfert de la
membrane sur lequel l'échantillon à analyser a été filtré, sur un support
absorbant saturé du milieu de gonflement. L'échantillon est alors incubé de
40 mm à 3 heures à 30° ou 37°C selon l'application recherchée ;
une
incubation courte 40 mm à 37°C permettra la détection des spores de
bactéries, tandis qu'une incubation . plus longue (3 heures à 30°C)
permettra aussi la détection des spores de moisissures.
Néanmoins, on peut diminuer la température et allonger la durée
d'incubation pour obtenir le même résultat.
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Pour la détection des microorganismes, les échantillons sont mis en
présence de la solution de marquage tel que décrit précédemment, d'une
manière similaire à l'étape de gonflement et incubés 30 minutes à 30°C
à
plus ou moins 3°C.
Dans le procédé de ('invention, le ou les agents de blocage a
comme particularité d'être dans un rapport de concentration avec le ou les
marqueurs de viabilité de 5 à 15 pour 1, ce qui est l'inverse des rapports
habituels utilisés entre colorants et contre-colorants qui sont de l'ordre de
1110. Un ratio optimal, pour les dérivés dela fluorescéine, sera d'environ 10
pour 1.
Le traitement de l'échantillon avec l'agent de blocage sera toujours
antérieur, ou à la limite simultané au traitement par la composition
contenant les marqueurs de viabilité.
Dans une variante de l'invention, on peut s'affranchir du support
hydrophile, soit dans l'étape de gonflement, soit dans l'étape de marquage
par dépôt direct du milieu de gonflement ou du tampon de marquage sur
ou sous le filtre porteur des microorganismes filtrés.
Le procédé de l'invention comprend enfin une étape d'analyse par
tout moyen approprié à mesurer le signal émis par le marqueur de viabilité.
Si, toutefois, l'analyse n'est pas réalisée immédiatement après l'incubation
avec la composition de marquage, les échantillons doivent être placés à 8~
4°C à l'abri de fa lumière, mais sans toutefois excéder une durée de
minutes.
Le procédé de détection etlou de numération selon l'invention peut
25 notamment être mis en oeuvre dans l'appareil décrit dans les demandes de
brevet EP 0 333 561 et WO 89/08714 et vendu sous les marques
CHEMSCAN~ et CHEMFLOW~.
_. r , , ,.
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L'invention porte également sur la mise en oeuvre et l'utilisation du
kit du procédé de l'invention dans toutes les applications où la présence de
cellules vivantes est recherchée.
Le procédé et le kit selon l'invention peuvent être utilisés notamment
5 pour détecter etlou dénombrer d'éventuels microorganismes dans des
produits d'hygiène, alimentaires ou pharmaceutiques.
Le procédé et le kit de l'invention peuvent être également utilisés
pour contrôler un processus industriel comme la stérilisation que ce soit
dans les applications agroaümentaires, pharmaceutiques ou nutraceutiques
10 et ce, soit dans une étape d'un procédé de fabrication, soit sur ie produit
fini. De la même façon, le procédé et le kit peuvent être utilisés pour
contrôler la charge bactérienne avant et après une filtration stérilisante
(bioburden).
Le procédé et le kit de l'invention peuvent être enfin utilisés pour la
15 mise en évidence de microorganismes viables non détectables par les
méthodes classiques. 11 peut s'agir par exemple
- du contrôle d'efficacité d'un antibiotique, particulièrement pour ceux qui
interfèrent avec la division cellulaire des microorganismes et donc ne sont
pas détectables avec les méthodes classiques de type boite de pétri ;
- la recherche de contaminations susceptibles de produire des infections
nocosomiales en milieu hospitalier ;
- d'établir une éventuelle corrélation entre un test de pyrogénicité en cours
de process de fabrication, par exemple de médicaments, et la présence de
micro-organismes dans l'échantillon ;
- la détection de lymphocytes dans les urines.
L'homme du métier saura, en tant que de besoin, mettre en oeuvre le
procédé pour l'utilisation souhaitée.
Pour la première fois, on est en présence d'une invention qui fournit
un moyen de marquer dans un seul et même échantillon et discriminer les
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cellules viables des particules de taille sensiblement identique aux cellules
viables que peuvent être des cellules mortes ou des particules en
suspension, et ce avec une fabilité confërée par
- l'élimination des faux négatifs par fa présence d'un milieu de gonflement
et le marquage des spores,
- l'élimination des faux positifs grâce à la composition d'agents de blocage,
- !'augmentation de la sensibilité du fait de l'utilisation d'un tampon de
marquage a haute torce ionique plus particulièrement pour les
microorganismes.
Outre les développements et avantages détaillés ci-dessus,
l'invention comporte également d'autres avantages et caractéristiques
découlant des exemples qui suivent, donnés à titre d'illustration sans
cependant en limiter la portée.
Exempte 1 : Mise en oeuvre du r~rocédé en absence de toute filtration
d'échantillons
Dans un premier temps, la mise en oeuvre du procédé consiste à réaliser
un pré-traitement avec un agent de blocage préalablement au traitement
par les marqueurs de viabilité. Le but de cette expérimentation est de
montrer l'efficacité de ce traitement pour éliminer les faux positifs
résultant
d'une interaction non spécifique entre tes marqueurs de viabilité et la
membrane de filtration.
Nous avons utilisé une composition de contre-colorants contenant
Erythrosine et Ethyl Eosine dans un rapport pondéral de 2, appelé CSE
(Counter Staining E), ayant la compositüon suivante : 0,004 %
d'Erythrosine B dilué dans l'Hépès et 0,002 % d'Ethyl-Eosine dilué
également dans l'Hépès. -
Le tableau 3 ci-dessous compare les résultats de fluorescence
mesurés au CHEMSCAN et obtenus sans ou avec traitement préalable par
le CSE
...
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Tableau 3
agent de blocageNombre F+ % des
r de membranes
membranes donnant
0
b Sans 36 mem- . 9 membranes donnent25
0
braves
_ 14 membranes donnent
1
. 3 membranes donnent
1
. 2 membranes donnent
3
.2 membranes ont un
nombre de F+>3
Avec CSE 42 mem- . 34 membranes donnent81
0
(Erythrosine braves
+ Ethyl
_ 1 ,membrane donne
Eosine) 1
. 2 membranes donnent
2
.1 membrane a un
nombre de F+>3
Le protocole suivi est le suivant
a) préparation des supports de filtration
Les supports de filtration sont rincés successivement avec trois fois 1 ml
d'éthanol à 70 % (vlv) puis par 3 fois 1 ml d'eau filtrée (à travers 1 fltre
de
0,22 Nm). Le support de filtration utilisé est une membrane de poyester, qui
est ensuite placée sur un support de filtration humide.
b) filtration du contre-colorant CSE
Le CSE est ensuite filtré à travers la membrane de polyester positionnée
sur le support de filtration humide à raison de 1 ml de CSE.
c) marquage par les marqueurs de viabilité
Le marqueur de viabilité comprend 9 mg par ml (19,5 mM) de diacétate de
carboxyfluorescéine (CFDA) et 1 mg/ml {2,4 mM) de diacétate de
fluorescéine (FDA) dans de l'acétone anhydre pure. La solution de viabilité
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a été préparée et diluée extemporanément ensuite au centième dans un
tampon dont la composition est fa suivante
- 0,03 % (v/v) de tween 20 (polyoxyéthylène sorbitan monolaurate),
- du phosphate de sodium trihydraté 50 mM, pH7
- du chlorure de sodium 1,13 mM dans de l'eau ultrapure.
c.1 }
- Aspirer 20 ml de milieu de gonflement dans une seringue stérile,
- Préfiltrer les 20 ml de milieu de gonflement dans un flacon stérile,
- Garder cette solution à température ambiante.
c.2) Dans une boîte de Pétri, placer un support absorbant (PAD) en
cellulose ou en polypropylène
- Imbiber le support cellulosique absorbant (PAD cellulose) avec 650 NI de
milieu de gonflement, ou imbiber le PAD en polypropylène avec 300 pl de
milieu de gonflement, tel que décrit plus haut,
- Transférer fa membrane polyester sur le PAD,
- Placer les boîtes fermées et identifiées dans l'étuve à l'abri de fa lumière
- Incuber 40 mm (~ 3°C).
c.3) Durant ce temps d'incubation, préparer la solution de marquage.
Exemple pour 20 analyses
- Dans un flacon stérile contenant 20 ml de tampon de marquage préfiltré
sur 0,22 Nm, ajouter 200 NI de substrat de viabilité en prenant soin de ne
pas toucher la paroi du flacon,
- Homogénéiser,
- Envelopper le flacon dans une feuille d'aluminium. Stocker ia solution
ainsi préparée entre 8°C ~ 4°C (4 heures maximum).
c.4) Dans chaque boîte de Pétri, placer un nouveau PAD (cellulose ou
polypropylène)
- imbiber le PAD cellulose avec fi50 pl de solution de marquage, ou le PAD
en polypropylène avec 300 ul de solution de marquage
r i .
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- transférer la membrane polyester du PAD saturé de milieu de gonflement
au PAD saturé de solution de marquage.
- incuber 30 mn {~ 5mn) à 30°C (~3°C) à l'abri de la lumière.
c.5) Analyser chaque échantillon individuellement. Si l'analyse n'est pas
immédiate après l'incubation, placer les échantillons (membranes sur PAD)
à 8°C ~ 4°C à l'abri de la lumière (Ne pas dépasser 30 mn).
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau II ci-dessus
Les 36 membranes non traitées par l'agent de blocage n'ont pas
subi l'étape b) ci-dessus.
Les résultats indiquent que le simple fait de traiter avec l'agent de
blocage permet de faire passer le nombre de membranes portant des faux
positifs de 75 % à 19 %.
Exemple 2 : Efficacité du arocédé sur l'eau~~ehtonée et tam onée
L'eau peptonée est une eau utilisée pour faire des dilutions de bactéries
afin justement d'en réaliser la numération comme cela est décrit
notamment dans le brevet WO 8908714.
Néanmoins, certains types d'eau peptonée posent le problème de donner
de nombreux faux positifs quand l'échantillon est traité avec des ester de
fiuorescéine, ce qui résulte probablement d'une interaction entre la
fluorescéine résultant de l'hydrolyse du marqueur qui s'accrocherait sur des
éléments particulaires résidant dans l'eau peptonée. Le mëme protocole
que dans l'exemple 1 a été utilisé sauf qu'une étape de filtration de 50 ml
d'eau peptonée stérile a été introduite entre l'étape a) de préparation du
filtre et l'étape b) de filtration de l'agent de blocage. Les résultats
obtenus
sont présentés dans les tabieaux 4.1, 4.2 et 4.3 ci-dessous
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Tableau 4.1
Contre-colorantsComptage primaire F+
Contrle 6835 / 7804110677 8 /4 / 11
Rouge neutre 699 I 1371 / 894 1 l 4 I 3
Contrle 2706 / 3142 I 2848 6 I 7 I 6
Erythrosine 87 / 71 I 107 0 I 0 I 1
B
Contrle 7445 l 7588 J 5986 8 I 9 I 15
Nile red 178 I 678 I 343 10 l 4 I 7
Tableau 4.2
Contre-colorantsComptage primaire F+
Contrle 2674 l 2968 / 2997 69 I 95 l 111
Congo red 1425 I 1361 l 3387 72 I 64 171
Alizarin Red 1762 I 2030 56 I 82
S
Phnosafranine 214 / 252 l 273 18 I 25 I 37
5 Tableau 4.3
Contre-colorantsComptage primaire F+
Contrle 2554 I 2492 l 2299 59 I 57 l 56
Eosine B 1229 l 1471 I 1169 31 I 49 I 41
Eosine Y 278 I 451 I 3166 11 I 21 I 21
Phloxine B 122 I 110 I 129 6 I4 I 16
Ethyi-eosine 82 l 66 I 97 5 I 2 l 3
Six fltrations ont été réalisées en l'absence de l'étape b) et avec l'étape
b).
l'agent de blocage et le marqueur de viabilité utilisés sont les mêmes que
ceux de l'exemple 1. Le signe F+ indique le nombre de particules
10 fluorescentes détectées par le CHEMSCAN~. La colonne qui indique
"comptage primaire" est en fait le comptage de fluorescence avant l'étape
.... ..., .,....... . .., ~ . i
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de discrimination effectuée par le CHEMSCAN~ laquelle permet d'éliminer,
nous le rappelons, tous les événements non rattachés à une particule de
forme et de taille pris en compte dans le programme de l'appareil.
L'interprétation de ces expériences rend évidente que l'utilisation de
l'agent de blocage permet d'éliminer environ 90 % de tous les événements
de fluorescence comptés en comptage primaire - et qui sont donc des
artefacts dus probablement aux particules présentes sur la membrane - et
fa grosse majorité des événements de fluorescence vrais obtenus après
discrimination par le CHEMSCAN~ et qui sont donc des faux positifs (les
chiffres sont trop faibles pour raisonnablement mesurer la diminution en
pourcentage). 11 est notamment observé que deux membranes sur ies six
traitées par l'agent de blocage ne donne aucune fluorescence positive par
le marqueur de viabilité après le prétraitement par le CSE.
Exemple 3 : Procédé réalisé sur une solution d'antibiotigues stériliség
L'expérience est strictement identique à celte de l'exemple 2 à l'exception
que 10 ml d'une solution d'antibiotique stérile ont été filtrés sur la
membrane de polyester entre ies étapes a) et b) dans l'exemple 1.
Les résultats sont présentés dans ie tableau 5 suivant
Tableau 5
Produit strile Solution comptage primaireF+
Ab
strile
Sans CSE 2 2206-2426 322-293
Avec CSE 2 79-152 5-12
Phioxine B 290 16 16 - 42
0,005 % 566 44
Eosine B 1442 104 100 - 370
0,005 % 2001 374
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Là-encore, en l'absence de contre-colorant, le CHEMSCAN~ a détecté
respectivement 322 et 293 particules présentant une fluorescence après
discrimination alors que par fe traitement avec le CSE, ce chiffre est
ramené à respectivemet 5 et 12 particules fluorescentes soit une
diminution de 98,5 % dans le premier cas et de 96 % dans le deuxième cas
du nombre de faux positifs.
En conclusion, il apparaît clairement que le procédé de l'invention
conduit à une réduction drastique des faux positifs obtenus par utilisation
directe de marqueurs de viabilité sur un échantillon susceptible de contenir
des microorganismes ; cette diminution allant de 80 à 99 %.
En outre, cette technologie a l'avantage de ne présenter aucun faux
négatif, autrement dit l'agent de blocage ne diminue pas le nombre de
cellules viables dénombrées dans un échantillon.
Le contre-colorant et plus particulièrement le CSE a en outre
l'avantage de pouvoir étre utilisé dans un kit puisqu'il a des propriétés
d'autoclavage et de conservation compatibles avec une distribution
commerciale.
Un avantage et non des moindres de la composition contenant le ou
les agents de blocage est son large spectre d'utilisation puisque le
mélange proposé permet tant de marquer les cellules mortes que les
particules non organiques. II va de soi que selon l'échantillon que l'on
souhaite tester, l'un ou l'autre de ces agents de blocage sera
préférentiellement utilisé de telle façon qu'il reste dans les rapports
souhaités avec les marqueurs de viabilité utilisés dans la suite du procédé.
L'homme du métier saura, en tant que de besoin et en fonction de
l'échantillon qu'il souhaite analyser, choisir tant sa composition d'agents de
blocage que celle de marqueurs de viabilité et le rapport pondéral entre les
deux.
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Enfin, le dernier avantage du procédé et des compositions de
l'invention est que, en une seule série de manipulations, ils permettent de
dénombrer exclusivement les cellules vivantes y compris les formes
sporulantes, d'une part, et les formes inertes, d'autre part.
Le procédé de l'invention est d'application général à d'autres
couples agent de marquagelagent de blocage. L'homme du métier pourra
toujours déterminer l'agent de blocage ayant l'une ou l'autre des
caractéristiques citées en début de texte complémentaires des
caractéristiques du marqueur de viabilité.
