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GENE CHIMERE CODANT POUR LA DROSOMICINE, VECTEUR LE CONTENANT ET OBTENTION DES
PLANTES TRANSGENIQUES RESISTANTES AUX MALADIES
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la
drosomicine, un gène chimère la contenant, un vecteur contenant le gène
chimère et un
procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées
résistantes aux
maladies.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes
contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter,
d'avoir
recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en
vue de
protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies
consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des
substances à
même d'assurer leur défense contre ces maladies.
1 ~ On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des
peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment
contre les
champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème
consiste à
trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des
plantes
transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou
fongicides et Ies
?0 conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par
bactéricide
ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites
que les
propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
Les drosomicines sont des peptides produits par les larves et adultes de
drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection
d'une
2~ faible dose de bactéries. Un peptide a déjà été décrit comme présentant
certaines
propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro, notamment dans la
demande de
brevet français 2 725 992, où le peptide est obtenu par induction sur les
drosophiles et
purification. Le gène codant pour ce mëme peptide a également été décrit par
Fehlbaum & coll. ( 1994). La possibilité d'intégrer ce gène à une plante pour
lui
30 conférer une résistance aux maladies d'origine fongique ou bactérienne n'a
toutefois
pas été décrite à ce jour.
On a maintenant trouvé que les gènes des drosomicines pouvaient ëtre insérés
dans les plantes pour leur conférer des propriétés de résistance aux maladies
fongiquzs
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et aux maladies d'origine bactérienne. apportant une solution particulièrement
avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un gène chimère comprenant un
fragment d'acide nucléique codant pour une drosomicine ainsi que des éléments
de
régulation en position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les
plantes et un
vecteur pour la transformation des plantes contenant ce gène chimère. Elle
comprend
aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide
nucléique codant pour la drosomicine et une plante résistante aux maladies
contenant
la dite cellule. Elle concerne enfin un procédé de transformation des plantes
pour les
rendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour Ia
drosomicine.
Par drosomicine. on entend selon l'invention tout peptide pouvant être isolé
des
larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure
septique ou de
l'injection d'une faible dose de bactéries, ces peptides comprenant au moins -
44 acides
1 ~ aminés et 8 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure.
De manière avantageuse, la drosomicine comprend essentiellement la séquence
peptidique de formule (I) ci-dessous
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cvs-Xad-Cys-Xae-Cvs-Xaf Cys-Xag-Cvs-Xah-Cys
?0 dans laquelle
Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins I acide aminé.
Xab représente un reste peptidique de 8 acides aminés.
Xac représente un reste peptidique de 7 acides aminés,
Xad représente unreste peptidique de 3 acides aminés,
2~ Xae représente un reste peptidique de 9 acides aminés,
Xaf représente un reste peptidique de 5 acides aminés,
Xag représente unreste peptidique d'un acide aminé. et
Xah représente un reste peptidique de 2 acides aminés.
De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xac comprenent au moins un
~0 acide aminé basique. Plus avantageusement. Xab comprend au moins 2 acides
aminés
basiques. de préférence ? et/ou Xad et/ou Xaf comprenent au moins 1 acide
aminé
basique, de préférence 1. Par acide aminé basique, on enbtend selon
l'invention ies
acides aminés choisis parmi la lysine. l'arQinine ou l'homoarginine.
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De manière préférentielle.
Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Asp- dans laquelle Xaa' représente
NH?
ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé. rt/ou
Xab représente Ia séquence peptidique -Leu-Xab'-Pro- dans laquelle Xab'
représente
un reste peptidique de 6 acides aminés, et/ou
Xac représente la séquence peptidique -Ala-Xac'-Thr- dans laquelle Xac'
représente
un reste peptidique des acides aminés, et/ou
Xad représente la séquence peptidique -Arg-Xad'-Val, dans laquelle Xad'
représente
un reste peptidique d'un acide aminé, et/ou
Xae représente la séquence peptidique -Lys-Xae'-His- dans laquelle Xae'
représente
un reste peptidique de 7 acides aminés, et/ou
Xaf représente la séquence peptidique -Ser-Xaf -Lys- dans laquelle Xaf
représente un
reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
Xag représente Trp, et/ou
1 ~ Xah représente le reste peptidique Glu-Gly.
De manière plus préférentielle,
Xab' représente la séquence peptidique Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly, et/ou
Xac' représente la séquence peptidique Val-Trp-Asp-Asn-Glu, et/ou
Xad' représente Arg, et/ou
?0 Xae' représente la séquence peptidique Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-Ser-Gly, et/ou
Xat représente la séquence peptidique Pro-Ser-Leu.
Selon un mode plus préférentiel de réalisation de l'invention. la drosomicine
est la séquence peptidique représentée par l'identificateur de séquence
n° ~4 (SEQ ID
No 4) et les séquences peptidiques homologues.
?5 Par séquence peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente
comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par
l'identificateur de séquence n° 4, étant entendu que les 8 résidus
cystéine et le nombre
d'acides aminés les séparant restent identiques certains acides aminés étant
remplacés
par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites ri induisant
pas de
30 modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de
la dite
séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au
moins 7~ % d'homologie, plus préférentiellement au moins $~ % d'homologie,
encore
plus préférentiellement 90 % d'homologie.
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Le résidu NH2 terminal peut présenter une modification post-traductionnelle.
par
exemple une acétylation. de même que le résidu C-terminal peut présenter une
modification post-traductionnelle, par exemple une amidation.
Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de
formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-
dessus. mais
également de telles séquences comprenant à l'une ou l'autre de leurs
extrémités. ou les
deux, des résidus peptidiques, notamment nécessaires à leur expression et
ciblage dans les
cellules végétales ou dans les plantes.
I1 s'agit notamment de la drosomicine « full length » (longueur totale)
représentée
par l'identiticateur de séquence n°2 (SEQ ID No 2).
Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-drosomicine » ou
cc drosomicine-peptide », avantageusement « peptide-drosomicine », dont la
coupure par
les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de la
drosomicine.
définie ci-dessus. Le peptide fusionné à la drosomicine peut être un peptide
signal ou un
1 ~ peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de
la drosomicine de
manière spécifique dans une partie de la cellule végétale ou de la plante.
comme par
exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans
un type
particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice
extracellulaire.
Selon un mode de réalisation. le peptide de transit peut être un signal
d'adressa~~e
'_'0 chloroplastique ou mitochondrial. lequel est ensuite clivé dans les
chloroplastes ou les
mitochondries.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut ëtre
un
signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un
signal
responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou
un peptide
'_'~ d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est
le lieu où sont
pris en charge par ia « machinerie cellulaire » des opérations de maturation
de la protéine
produite, comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles, et dans ce
cas
éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire
comprenant. dans le
30 sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit
d'un gène végétal
codant pour une enzyme à localisation plastidiaIe, une partie de séquence de
la partie
mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation
plastidiale.
puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal
codant pour
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une enzyme à localisation piastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0
X08 909.
Comme peptide de transit utile selon 1"invention, on peut citer en particulier
le
peptide si~~nal du gène PR-la du tabac (WO 9/19443), ou encore l'ubiquitine
représentée
- fusionnée à la drosomicine par l'identiticateur de séquence n° 6.
Le peptide de fusion « ubiquitine-drosomicine » et sa séquence codante sont
également partie de la présente invention. en particulier décrits par
f'identificateur de
séquence n° 5.
La présente invention concerne donc un gène chimère comprenant une
séquence codante pour la drosomicine ainsi que des éléments de régulation en
position
~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes, la séquence
codante
comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour la drosomicine telle que
définie ci-dessus.
La séquence d'ADN peut être obtenue selon les méthodes standards d'isolation
et de
purification à partir des drosophiles. ou encore par synthèse selon les
techniques usuelles
1 ~ d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques
sont
notamment décrites par Ausubel cr al.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour la
drosomicine comprend la séquence d'ADN décrite par les bases ? 1 à 1 ~? de
l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), une séquence homologue
ou
_'0 complémentaire de ladite séquence.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention. la séquence d'ADN codant
pour
la drosomicine « full length » comprend la séquence d'ADN décrite par les
bases 101 à
3I0 de l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID No I ), une séquence
homologue ou
complémentaire de ladite séquence.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant
pour
le peptide de fusion « peptide-héliomicine » comprend la séquence d'ADN
décrite par les
bases I~ à 221 de l'identificateur de séquence n°5 (SEQ ID NO ~), une
séquence
homologue ou une séquence complémentaire des dites séquences.
Par « homologue ». on entend selon l'invention toute séquence d'ADN présentant
30 une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence
nucléotidique décrite
par les identificateurs de séquences n° I, 3 ou ~ et codant pour la
drosomicine. la
drosomicine « full length » ou le peptide de fusion « peptide-drosomicine ».
Ces
modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation,
ou encore
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en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation
de ladite
séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides
nucléiques
pouvant conduire à l'expression d'un mème acide aminé. les différences entre
la séquence
de référence décrite par les identificateurs de séquences n° 1. 3 ou J
et l'homologue
correspondant peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit de
fragments d'ADN de
faible taille réalisables par synthèse chimique. De manière avantageuse, le
degré
d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de
préférence
d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications
sont
généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence
primaire de la
drosomicine ou du peptide de fusion résultants.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une
plante
et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus
différenciés tels
que des embryons. des parties de plantes. des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire
différencié
1 ~ capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones.
plus
particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation
animale ou
humaine, comme le maïs. le blé, le colza. le soja, le riz, la canne à sucre.
la betterave, le
tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'AD?~
?0 codant pour la drosomicine sont bien connus de l'homme du métier en
fonction de la
plante. Ils comprennent notamment des séquences promotrices. des activateurs
de
transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons stars et
stop. LeS IlloyeilS
et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont
bien connus de
l'homme du métier.Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes. on
peut
2~ utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans
les plantes en
particulier un promoteur d'origine bactérienne. virale ou végétale tel que,
par exemple,
celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylaseiowgénase
(RuBisCO)
ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du
choux fleur
(CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-
ia du
30 tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence
on a recours à
une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la
séquence
codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène. tel
que par
exemple. celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans
la
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demande EP 0 307 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence
de
régulation promotrice. d'autres séquences de ré~~ulation, qui sont situées
entre le promoteur
- et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription i
"enhancer"). comme par
exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV)
décrit dans la
demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington &
Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut
utiliser
toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le
terminateur
nos d'~grobacterium tumefaciens. ou encore d'origine végétale, comme par
exemple un
terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur d'intégration pour la
transformation des plantes contenant au moins un gène chimère tel que défini
ci-
dessus.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules
1 ~ végétales par intégration d'au moins un gène chimère tel que défini ci-
dessus.
transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement
décrit dans la littérature spécialisée et notamment les demandes citées dans
la présente
demande.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes
'_'0 avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans
la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium
ra~mefàciens ou
Ri d'Agrobacterium rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent ëtre utilisées telles que la micro-injection ou
i'électroporation.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la
nature de la plante. notamment de son caractère monocotylédone ou
dicotylédone.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération
des
plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
4,439,333,
30 US 4.336.473, US 5,464,763, US 3.177,010, US 5,187,073, EP 267,139. EP 604
662, EP
672 732, US 4,943,030, US 3.036.006, US 3.100,79?, US x,371,01-1. US 3.478,7:1-
t, US
3,179,022, US 5,363,346, US 5,484,956, US 3.308,468, US x,538,877, US
3.334,798, US
5,489,3'_'0. US 3,510,318, US 3.204,253, US 3.-105.763. EP 442 174, EP 486
233, EP 486
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234, EP X39 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 9/06128.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales. de plantes
monocotylédones ou dicotylédones, notamment de cultures, transformées et
contenant
dans leur génome une quantité efficace d'un gène comprenant une séquence
codante
pour la drosomicine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules
transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules
transformées. La
régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature
de
l'espèce. comme par exemple décrit dans les brevets et demandes ci-dessus.
La présente invention a également pour objet les plantes transformées issues
de
la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les
gaines
des plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en
particulier à certaines maladies fongiques. De ce fait. la séquence d'ADN
codant pour
1 ~ la drosomicine peut ëtre intégré avec pour objectif principal la
réalisation de plantes
résistantes aux dites maladies, la drosomicine étant efficace contre des
maladies
fongiques telles que celles causées par Botrytis, en particulier Botrytis
cinerea
(mycélium ou spores), Cercospora, en particulier Cercospora beticolct.
Septoricr, en
particulier Septoria tritici, ou Fusariztm, en particulier Fusarium ct~lmorzrm
(mvcélium
'0 ou spores) ou Fztscrriztm graminearztm.
Le gène chimëre pourra comprendre également et de manière avantageuse au
moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aw
herbicides.
La séquence d'ADN codant pour la drosomicine peut également être intégrée
comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres
séquences
2~ codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des
gènes de
tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du
métier et
notamment décrits dans les demandes de brevet EP 11~ 673, WO 87,'04181, EP 337
899.
WO 96i38~67 ou WO 97/04103.
30 Bien entendu. les cellules et plantes transformées selon l'invention
peuvent
comprendre outre la séquence codant pour la drosomicine, d'autres séquences
hétérologues
codant pour des protéines d'intérêt comme d'autres peptides complémentaires
susceptibles
de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine
bactérienne ou
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fongique. etiou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux
herbicides
et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de résistance aux insectes.
comme les
protéines lit notamment.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur
comprenant un gène chimère, lequel comprend une première séquence codant pour
la
drosomicine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou
protéine
d'intérët.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant
au
moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-
dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de
parents. l'un portant le gène selon l'invention codant pour la drosomicine,
l'autre portant un
gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes
transformées selon l'invention, le procédé consistant à planter les graines
des dites plantes
1 ~ transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des
dites plantes, à
appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans
affecter de
manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées,
puis à récolter les
plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et
éventuellement à séparer
les graines des plantes récoltées.
~0 Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition
agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités
suivantes,
herbicide. fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon
l'invention,
la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins
une
'_' ~ activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant
une activité
complémentaire de celle de la drosomicine produite par les plantes
transformées selon
l' invention.
- Par produit présentant une activité complémentaire de celle de la
drosomicine, on
entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité
complémentaire, c'est
30 à dire un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants
(champi~_nons,
bactéries ou virus) insensibles à la drosomicine, ou encore un produit dont le
spectre
d'activité recouvre celui de la drosomicine, totalement ou en partie, et dont
la dose
d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de
la
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l0
drosomicine produite par la plante transformée.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention. fa préparation du
~,ène
chimère. du vecteur d'intégration, des plantes transformées et leur résistance
à
différentes maladies d'origine fongique. Les figures 1 à 7 en annexe décrivent
les
structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction
des cènes
chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués
en italiques.
Exemple 1: Construction des gènes chimères
Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de
laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits
dans
Ausubel & colt.
pRPA-RD-180:
On insère un clone entier de l'ADNc codant pour la drosomicine décrit par
Fehlbaum & colt (SEQ. ID N° 1) dans le plasmide pCR-1000
(INVITROGEN) comme
1 ~ fragment EcoRl Hindlll.
pRPA-RD-182: Création d'une région codant pour la drosomicine dite "longueur
totale" (correspondant au peptide pre-pro) en éliminant la région non
transcrite
en ~' et en supprimant le premier codon ATG.
Le plasmide pRPA-RD-I80 est digéré avec ies enzymes de restriction Scal et
?0 EcoRl, et le grand fragment d'ADN est purifcé. Un oligonucléotide
synthétique double
brins de séquence Oligo 1 suivante est ensuite lié à la séquence d'ADN
purifiée dérivée
de pRPA-RD-180:
Oligo l: S' AATTCCCGAAGACGACATGCAGATCAAGT 3'
GGGCTTCTGCTGTACGTCTAGTTCA
pRPA-RD-183: Création d'une séquence codant pour la drosomicine mature gui
ne comprend pas la région non transcrite en 3'.
30 Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 2
et Oligo 3 ci-après sont hybridés à 6~°C pendant ~ minutes puis par
diminution lente
de la température à 30°C pendant 30'.
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Oli~;o ~: S ' GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA
CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT GGGACAACGA GACCTGTCGT
CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 3'
011go3: S' GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA
CTGGGGCTGC AGTGGCCACT GGAGCGTCCC TCCTCCTTGC
ACACACGACG 3'
Après hybridation entre l'Oligo 2 et l'Oligo 3, l'ADN resté simple brin sert
de
matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions
standard
préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de
l'oligonucléotide double brin. Cet oligonucléotide double brin est ensuite
digéré par
les enzymes de restriction Sacll et EcoRl et clonés dans le plasmide pBS II
SK(-)
(Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un
clone
I ~ comprenant la région codant pour la drosomicine mature située entre les
sites de
restriction Sacll et BamHl {SEQ ID 3).
pRPA-RD-186: Élimination de la région 3' non transcrite de la région codant
pour la drosomicine longueur totale de pRPA-RD-182.
Le plasmide pRPA-RD-182 est digéré avec les enzymes de restriction BspEl et
?0 h'pnL et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est
ensuite
digéré avec les enzymes de restriction BspEl et Kpnl, et le petit fragment
d'ADN est
purifié. Ces deux fragments purifiés sont ensuites liés de manière à obtenir
un
plasmide contenant la région codant pour le peptide pre-pro de la drosomicine
dont le
premier codon ATG et les deux régions non codantes en 5' et 3' ont été
supprimées
(SEQ ID ~).
pRPA-RD-187: Création d'un vecteur d'erpression dans les plantes comprenant
la séquence codant pour la forme mature de la drosomicine.
Le plasmide pUGUS(118), dérivé du pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
Richard Vierstra de l'Université du Wisconsin (plasmide non décrit). Ce
plasmide dont
30 la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le
promoteur CaMV
3~S qui dirige l'expression d'un ARN contenant la séquence non traduite en ~'
du virus
de la mosaïque alfalfa {AMV ~' UTR; Brederode & coll., 1980), la région N-
terminale
du gène de l'ubiquitine ubqll d'Arabidopsis thaliana jusqu'au site de clivage
de
l'ubiquitine hydrolase (ubql l N-term; Callis & coll., 1993) laquelle est
fusionnée dans
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WO 99/02717 I ' PCT/FR98/01462
le mème cadre de lecture avec le gène de la ~3-glucuronidase de E. coli (GUS;
Jefferson
& coll.. 1987). suivi du site de polyadenvlation du gène de la nopaline
svnthase
d'.J;~rubucterium tunrcfcrciens (NUS polyA; Bevan & coll.. 19831.
Le plasmide pUGUS( 1 I 8) est digéré avec les enzymes de restriction Sacll et
BarnHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-I83 est
digéré
avec les enzymes de restriction Sacll et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant
la région codante pour la forme mature de (a drosomicine est ensuite purifié.
Les deux
fragments d'ADN purifiés sont liés ensemble dans une cassette d'expression
dans les
plantes qui synthétisent une protéine de fusion ubiquitine-drosomicine dans le
cytoplasme des cellules végétales. La structure schématique de cette cassette
d'expression est représentée sur la figure 2. Sous l'action de I'ubiquitine
hydrolase sur
cette protéine de fusion. la drosomicine mature est libérée dans le cytoplasme
des
cellules de la plante.
pRP.4-RD-188: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant
I ~ la lonâueur totale de la séquence codant pour la drosomicine (pre-pro).
Le plasmide pRTL-? GUS, dérivé du plasmide pUC-I9, a été obtenu auprès du
Dr. Jim Carrington (Texas A&M University. non décrit). Ce plasmide dont la
structure
schématique est représentée sur la figure 3, contient le promoteur CaivIV 35S
dupliqué
isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x3~S; Odell 8;
coll..
~'U 1980 qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en
~' du virus
etch du tabac (TEV ~' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la (3-
glucuronidase
de E. coli (GUS Jefferson & coll.. 1987) suivi du site de polyadenylation de
TARN
35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll.. i98~).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction ~Vcol et
BamHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-186 est
digéré
avec les enzymes de restriction Bbsll et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant
la région codant pour la drosomicine pre-pro est purifié. Les deux fragments
d'ADN
purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans Ies
plantes qui
synthétisent une protéine de drosomicine pre-pro. La structure schématique de
cette
30 cassette d'expression est représentée sur la figure ~t. « pre-pro-
drosomicine »représente
la région codante pour la drosomicine de pRPA-RD-186. La drosomicine est
transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action d'un
peptide signal
( pre-pro ).
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pRP.4-RD-19~: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple
modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un
site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques
complémentaires
Oligo 4 et Oligo 5 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la
procédure
décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo4: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
I 0 CATGC 3 '
OligoS: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3'
1 ~ L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été
préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRl et HindIll et rendu
bouts
francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. coli. On
obtient
un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter
l'introduction des
cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacreria~m tumefaciens.
La
~'0 structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur
la figure 5.
pRPA-RD-190: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de
pRP.~-RD-187 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-187 est digéré avec les enzymes de restriction Kpnl et
Sall, et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la
drosomicine est
purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RD-195 qui a été
préalablement
digéré avec les même enzymes de restriction.
pRPA-RD-191: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de
;0 pRPA-RD-188 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-188 est digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll et
déphosphorylé avec de la phosphatase intestinale de veau. Le fragment d'ADN
contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment
purifié est
ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de
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restriction Hindlll.
I~RPA-RD-17:1: Plasmide dérivé de pRPA-BL-1~OA (EP 0 ~O8 909) contenant le
gène dc tolérance au bromoxynil dc pRPA-BL-237 (EP 0 S08 909).
Le gène de toiérance au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une
amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est
cloné dans
le site EcoRl de pRPA-BL-1~OA qui a été rendu bouts francs par l'action de la
polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur
d'Agrobacterium tarmefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à
proximité de sa bordure droite. un gène de tolérance à la kanamycine à
proximité de sa
bordure gauche et le site de clonage multiple de pUC-19 entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-17~ est représentée sur la figure 6. Sur
cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline
synthase
d'.~grobacrerium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NOS pro" représente le
promoteur de la nopaline synthase d'.4grobacterium tzrmefaciens (Bevan &
coll.,
I~ 1983). "NPT II" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du
transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981 j, "3~S pro" représente le
promoteur
3~S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX"
représente le gène de la nitrilase isolé de K. ozaenae (Stalker & coll.,
1988). "RB" et
"LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence
d'un
'_'0 plasmide Ti d'.Agrobacteriunr tumef~ciens.
~RPA-RD-18.x: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-
RD-17-1.
Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 6 et Oligo 7 ci-après,
sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-
183.
Oligo6: S' CGGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3'
Oligo7: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
30 GTGGCCTGAC TGG 3'
L~oligonucléotide double brin hybridé (9~ paires de bases) est purifié après
séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-17~
est
digéré wec l'enzyme de restriction :¿mcrl, et le grand fragment d'ADN est
purifié. Les
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dmx fragments d'ADN obtenus sont ensuite liés.
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de
restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la
kanamvcine
marqueur de sélection.
s La strucure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la
figure 7 où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "3~S pro", "BRX gene". "RB"
et
"LB" ont la même signification que pour la figure 6.
pRPA-RD-192: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la
construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers le cytosol des
cellules.
Le plasmide pRPA-RD-190 est digéré avec les enzymes de restriction Apal et
.~scl. et le ti-agment d'ADN contenant la cassette d'expression de la
drosomicine est
purifié. Le fragment d'ADN purifié contenant la cassette d'expression de la
drosomicine est lié dans pRPA-RD-184, après digestion préalable avec les même
deux
1 ~ enzymes. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacteriz~m tumefaciens
contenant la
séquence codant pour la protéine de fusion drosomicine-ubiquitine qui conduit
à
l'expression de la drosomicine dans ie cytosol des cellules de la plante.
pRPa-RD-193: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tttntefaciens contenant la
construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers la matrice
'_'0 ertracellulaire.
On reprend le mode opératoire décrit ci-dessus avec le plasmide pRPA-RD-191
et les enzymes de restriction Pmel et Ascl, remplaçant le plasmide pRPA-RD-190
et
les enzymes de restriction Apal et Ascl. On obtient ainsi un vecteur
d'Agrobacterium
runrefaciens contenant la séquence codant pour ia protéine pre-pro de la
drosomicine
qui conduit à l'expression de la drosomicine dans la matrice extracellulaire
de la
plante.
Exemnle 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
- 2.1- Transformation
Les vecteurs pRPA-RD-192 and pRPA-RD-193 sont introduit dans la souche
30 d'.~ «robacterizrm tzzmefaciens EHA 1 O l (Hood & coll.. 1987) porteuse du
cosmide
pTVK?91 (Komari & coli., 1986). La technique de transformation est basée sur
la
procédure de Horsh & colt. (1980.
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2-2- Régénération
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants
foliaires zst réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS)
comprenant 30
g/1 de saccharose ainsi que ?00 ugiml de kanamycine. Les expiants foliaires
sont
prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformées selon
la
technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes
successives: la
première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1
de
saccharose contenant 0.05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de
benzylaminopurine (BAP) pendant 1 ~ jours. Les pousses formées au cours de
cette
étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS
additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on
prélève
des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à
teneur
moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout
d'environ 1 ~
jours. les pousses enracinées sont passées en terre.
1 ~ 2-3- Tolérance au bromoxvnil
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour chaque
construction pRPA-RD-19? et pRPA-RD-193. Ces plantes ont été traitées en serre
au
stade ~ feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,? kg
de
matière active bromoxvnil par hectare.
~0 Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont
employées dans les expérimentations suivantes pour tester les effets de
l'expression de
la drosomicine sur la tolérance des plantes transformées aux agressions
fongiques.
Exemple 3: Détection de la drosomicine dans les tabacs transformés
Une analyse immunoblot (telle que décrites par Coligan & coll.) est employée
pour détecter la drosomicine produite par les tabacs transformés. en employant
un
anticorps de lapin dirigé contre la drosomicine synthétique fixée sur une
protéine
porteuse KLH, avec la drosomicine synthétique comme antigène.
Les protéines de feuilles sont extraites d'abord par broyage des tissus
congelés
30 à -180°C. suivi par l'addition d'un tampon d'extraction (urée 8 M,
tris HC1 pH 6,8 ~0
ml~f. SDS ? %, (3-mercaptoéthanol ~ %, saccharose 10 %. EDTA 2 mM et
dithiothreitol l0 mM). La quantité totale de protéines extractables est
ensuite mesurée.
100 pg de protéines extraites sont ensuite char«ées dans des puits de bel SDS-
PAGE
_ _ _ __.__._ . _ _ _ ______ _.
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WO 99/02717 1 ~ PCT/FR98/01462
(20 % acrylamide) pour une analyse immunoblot (selon Coligan & colt.).
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine
pre-pro), on a trouvé jusqu'à 160 ng de drosomicine pour 100 u~_ du total de
protéines
extraites des feuilles.
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-192 (drosomicine
mature), on a trouvé jusqu'à 50 ng de drosomicine pour 100 pg du total de
protéines
extraites des feuilles.
La drosomicine synthétisée et isolée dans les plantes transformées avec les
plasmides pRPA-RD-192 et pRPA-RD-193 co-migre avec la drosomicine isolée des
drosophiles. Ce résultat montrent que chacune des drosomicines dirigée soit
vers le
cytoplasme (pRPA-RD-192) soit vers la matrice extracellulaire (pRPA-. RD-193)
conduisent à une drosomicine mature. En outre, Ie système de gel employé dans
cet
analyse (20 % acrylamide) aurait permis de détecter aisément de la drosomicine
qui
n'aurait pas été transformée puisque les deux constructions (ubiquitine-
drosomicine et
1 ~ drosomicine pre-pro) font approximativement 10 kD, contre ~ kD pour la
drosomicine
mature.
Exem~ale -t: Résistance au Botrytis cinerea des tabacs transformés.
l~/?0 plantes issues des plantes obtenues à l'exemple 2.3. sont cultivées en
serre dans des pots de repiquage de 7 cm de côté dans les conditions
suivantes:
- température: 16° C durant la nuit: 19° C durant le jour:
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour,
- hygrométrie: 90-1400
Deux feuilles par plantes sont innoculées avec 6 disques de 6 mm de diamètre
par feuille. chaque disque étant constitué d'une suspension de Botyvtis
cinerea ( 100
000 spores/ml). L'évolution de l'infection est observée 7 jours après
l'innoculation en
mesurant l'augmentation du diamètre de chaque disque.
Pour l'essentiel des plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192
(protéine mature dans le cytoplasme) ou par le plasmide pRPA-RD-193
(drosomicine
extra-cellulaire), on observe une absence d'augmentation des diamètres des
disques.
ou une augmentation très minime, ce qui indique une forte résistance aux
infections
causées par Botritis cinerea.
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Exemple ~: Résistance à Chalara elegans des tabacs transformés.
On reprend le mode opératoire précédent avec les conditions opératoires
smvantes:
- température: 18° C durant la nuit; 22° C durant le jour:
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour.
L'innoculation est effectuée 18 jours après le semis par apport dans chaque
pot
de 1 ml d'une suspension d'endoconidies à 1 000 000 conidies/ml. La lecture
des
résultats de l'infection est effectuée 21 jours après l'innoculation en
observant les
racines des plantules préalablement nettoyées à l'eau. L'évolution de Ia
maladie est
appréciée par une échelle de notation de 0 à 1 I , 0 correspodant à une
absence
d'infection. Pour les plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192
(protéine
mature dans le cytoplasme) et celles transformées par le plasmide pRPA-RD-193
(drosomicine extra-cellulaire). la notation moyenne est de 4, ce qui
correspond à une
forte résistance à Chalara elegans.
1~
Les résultats obtenus in vivo dans les exemples 4 et ~ montrent que la
transformation par le gène chimère selon l'invention confère à la plante
transformée de
nouvelles propriétés de résistance aux champignons. activité est liée à la
conservation
des propriétés antifon5iques de la drosomicine produite par les plantes
transformées
'_'0 selon l'invention.
REFERENCES
Ausubel, F. A. & colt. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology.
Publ.
Wilev & Sons.
Bevan. M. & colt. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.
Brederode. F.T.M. & coll. ( 1980). Nuc. Acids Res. 8:2213-2223.
Callis & roll. (1993). Plant Mol. Biol. 21:895-906.
Carrineton and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.
30 Coligan. J.E. & coil. (ed. V.B. Chanda). Current Protocois in Protein
Science. Publ.
Wilev & Sons.
Fehlbaum & colt. (1994). J. Biol. Chem 269: 331459-33163.
Horsch c~; coll. (1980. Science 227:1229-1231.
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WO 99!02717 1.9 PCT/FR98/01462
Jefferson & colt. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
Komari & col!. {1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Rothstein & col!. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. -1~: 99-10~.
Stalker & colt. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
~ Odell, J.T. & col!. (1985). Nature 313:810-812.
CA 02296046 2000-O1-10
WO 99/02717 1 °~'T/FR98/01462
LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATION GÉNÉRALE:
(i) DÉPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14/20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: Lyon
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 69009
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Gène chimère codant pour la drosomicine,
vecteur le contenant pour la transformation des cellules végétales et plantes
transformées obtenues résistantes aux maladies
(iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 14
(iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:1:
(i) CARACTERISTTQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 488 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISMEE: Drosophila melanogaster
(vii) SOURCE IMMÉDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-180
(ix) CARACTÉRISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 101..310
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:1:
GAATTCGAGC TCGGTACCCC TCGAGACCAT GGTCGACCCC ACGCGTCCGG ATAATTCTTT 60
CAGAAATCAT TTACCAAGCT CCGTGAGAAC CTTTTCCAAT ATG ATG CAG ATC AAG 115
Met Met Gln Ile Lys
1 5
TAC TTG TTC GCC CTC TTC GCT GTC CTG ATG CTG GTG GTG CTG GGA GCC 163
Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala
15 20
AAC GAG GCC GAT GCC GAC TGC CTG TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC TGT 211
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26)
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2
Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys
25 30 35
GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG GGA 259
Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly
40 45 50
CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA GGA 307
Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly
55 60 65
TGC TAAATCCATG AGCAATTAGC ATGAACGTTC TGAAAAGCGC GTTTAGCTCT 360
Cys
CCACTACTTA CGACATATTC TATGCTGCAA TATTGAAAAT CTAATAAACA AAACTAATGT 420
ACATTAAAAA AAAAAAAAAA P~~AAAAAAAA AAAAAAAGGG CGGCCGCGAC CTGCAGGCAT 480
GCAAGCTT 488
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:2:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:2:
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu
1 5 10 15
Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val
35 40 45
Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65 70
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:3:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 167 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
CA 02296046 2000-O1-10
WO 99/02717 PCT/FR98/01462
3
(vi) SOURCE D~ORIGINE:
(A) ORGANISME: SynThetique
(vii) SOURCE IMMÉDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-183
(ix) CARACTÉRISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 21..152
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:3:
GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GAC TGC CTG TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC 50
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro
1 5 10
TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG 9g
Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu
15 20 25
GGA CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA 146
Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu
30 35 40
GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC
167
Gly Cys
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:4:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:4:
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
20 25 30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
35 40
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE HRINS: double
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26)
CA 02296046 2000-O1-10
WO 99/02717 4 PCT/FR98/01462
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Synthetique
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-186
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 15..221
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: NO:S:
SEQ ID
GAATTGAAGA GCC TTC GCT GTC 50
CGCC ATG CTC
CAG ATC
AAG TAC
TTG TTC
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Phe Ala Val
Leu
1 5 10
CTG ATG CTG GTG GTG CTG GGA GCC AAC GAT GAC TGC CTG 98
GAG GCC GCC
Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala Asn Asp Asp Cys Leu
Glu Ala Ala
15 20 25
TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC TGT GCC GAC GAG ACC TGT 146
GTC TGG AAC
Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Asp Glu Thr Cys
Val Trp Asn
30 35 40
CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG GGA CGC GGC TGC AGC CCC 194
TCC AGT CAC
Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Gly Cys Ser Pro
Ser Ser His
45 50 55 60
AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA GGA TGC 236
TAAGGATCCG CGCGC
Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 acides amins
(B) TYPE: acide amin
(D) CONFIGURATION: linaire
() TYPE DE MOLCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SQUENCE: D N0:6:
SEQ I
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Val Met Leu Val
Phe Ala Leu
1 5 10 15
Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr
20 25 30
Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys
35 40 45
FEUILLE DE R~~p~qGEMENT (RÉGLÉ 26)
CA 02296046 2000-O1-10
WO 99/02717 5 PCT/FR98/01462
Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys
50 55 60
Trp Cys Glu Gly Cys
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:7:
AATTCCCGAA GACGACATGC AGATCAAGT 29
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:8:
GGGCTTCTGC TGTACGTCTA GTTCA 25
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE; SEQ ID N0:9:
GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT 60
GGGACAACGA GACCTGTCGT CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 100
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
CA 02296046 2000-O1-10
WO 99/02717 b PCT/FR98/01462
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 3
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:10:
GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA CTGGGGCTGC AGTGGCCACT 60
GGAGCGTCCC TCCTCCTTGC ACACACGACG 100
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADN
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucléotide Synthétique 4
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:11:
AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC 60
CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 85
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 5
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0:12:
CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60
TAGAGG
' 66
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases
(81 TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECLJLE: ADN Oligonucléotide Synthétique 6
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26)
CA 02296046 2000-O1-10
WO 99/02717 ~ PCT/FR98/01462
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:13:
CGGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT 60
GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 93
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
fA) LONGUEUR: 93 paires de bases
(B) TYPE: acide nuclêique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN Oligonucléotide Synthétique 7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:14:
CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC 60
GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 93
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
