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CA 02296736 2000-O1-14
WO 99/03987 PCT/FR98/Oi 570
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EPITOPES DU VRS ET ANTICORPS LES COMPORTANT,
UTILES DANS LE DIAGNOSTIC ET LA THERAPIE.
La présente invention se rapporte au virus respiratoire sync,ytial, ct
plus particulièrement à l'identification de nouveaux épitopcs et aux
anticorps correspondants, utiles notamment dans le domaine du
traitement, de la prophyla.~cie et du diagnostic des affections provoquées
par ce virus.
Le virus Respiratoire syncytial (VRS) est l'un des agents étiologiques
les plus fréquemment rencontrés chez le nourrisson et chez les personnes
àgées. Les bronchiolites sont souvent graves chez l'enfant et nécessitent
l'hospitalisation. Actuellement, il n'existe pas de moyens de prévention
contre la maladie due au VRS, Ia première infection au VRS ne prévient
pas contre la suivante. Le traitement des cas graves par antibiothcrapie
(Ribavirine) et/ou associé avec l'immunothérapie (immunoglobulines
humains) ne peuvent pas atténuer l'aggravation de la maladie. Néanmoins,
ce type de traitement reste encore très coùteux. Les essais cliniques
récents avec les anticorps monoclonaux HNK20 de ORAVAX (dirigés contre
la protéine F du VRS) n'ont pas montré d'efficacité du traitement par
rapport au placebo contre l'infection du VRS chez l'enfant. Dans les années
60, les tentatives d'immunisation des enfants avec un vaccin VRS inactivé
à la formalise avaient pour conséquence l'aggravation de la maladie au lieu
de conférer une protection des poumons contre l'infection naturelle au
VRS. Associé à ce problème, les diagnostics actuels ne permettent pas
d'identifier de manière fiable L'infection au VRS, au moins chez l'adulte.
Le VRS est classé dans Ia famille des Paramyxoviridae, genre
pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité
négative, codant pour 10 protéines spécifiques.
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La demande WO 87/04185 a proposé d'utiliser des protéines
structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe
appelées protéine l' (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine
de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside
(protéine N).
La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection dc la
protéine F entière du VRS, éventuellement modifiées sous forme
monomérique ou déglycosylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de
rechercher leurs propriétés neutralisantes.
Dans la demande WO 95/27787, il a été montré que la protéine G
du VRS peut être utile dans la préparation de produits destinés au
traitement et/ou à Ia prévention d'affections provoquées par le VRS, sous-
groupe A ou B.
Dans le cadre de la présente invention, il a maintenant ctc trouvé
que des fragments de la protéine G du VRS, contenant des épitopes
spécifiques, possèdent des propriétés particulièrement avantageuses. De
nouveaux fragments peptidiques de la protéine G du VRS peuvent ainsi
être préparés, notamment pour les applications suivantes
(i) ledit fragment de peptide couplé ou fusionné, par des méthodes
chimiques ou par gënie génétique, à un porteur, constitue un vaccin
efficace contre l'infection au VRS, quel que soit le mode d'administration ;
(ü) les mémes fragments peptidiques peuvent servir à générer des
anticorps polyclonaux et monoclonaux qui sont très efficaces dans les
traitements prophylactiques ou thérapeutiques de l'hôte infecté par le
VRS ;
(iii) ces fragments peptidiques et les anticorps monoclonaux
peuvent ètre utilisés comme réactifs dans un Kit de diagnostic permettant
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d'affirmer et d'identifier l'infection chez l'hôte infecté par Ic VRS-A ou le
VRS-13.
l.'lI1VC11tI011 a donc pour objet des anticorps polyclonaux ou
monoclonaux dirigés contre un épitopc de la protéine G du VRS
S correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séclucnccs
peptidiques comprises respectivement entre les résidus d'acides aminés
150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine
G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80 %, et de
préférence au moins 98 % d'homologie.
Ces anticorps reconnaîtront des peptides portés par la séquence
comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la protéine G du
VRS, sous-groupe A ou sous-groupe B.
Cette région correspondant aux acides aminés 130-230 dc la
protéine G du VRS A est désignée ci-après G2Na. G2Na a été produite dans
1S une bactérie telle que E. coli, donc non glycosylée. Elle confére,
notamment
lorsqu'elle est couplée à un porteur comme une OmpA de bactérie gram
négatif, par exemple de Klebsiella (protéine p40, décrite dans WO
96/ 14415) ou une protéine dérivée du streptocoque (comme la protéine de
liaison à la sérumalbumine humaine, appelée ci-après BB, décrite dans
WO 96/ 14416), une protection immunitaire contre les infections au VRS.
De manière inattendue, il a été montré qu'une série de peptides
préparés selon l'invention confëre une protection croisée contre le VRS
sous-groupe A ou sous-groupe B.
En particulier, une protéine recombinante BBG2al, un dérivé de
2S BBG2Na où seulement quatre résidus ont été modifiés sur G2Na : les
résidus Asn(aa191), Lys(aaI92), Gly(195) et Thr(aa198) ont été substitués
par les résidus Ser, Asn, Lys et Pro respectivement, confère une protection
croisée VRS-A ou VRS-8 chez la souris BALB/c. Dans le mème but de
renforcer une protection croisée, deux nouvelles molécules ont été
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produites : BBG2a2 où les résidus Asn(aa157), Asn(aal6O), Asn(aa161) ct
Phe(aa163) Ont été substitués par les résidus Lys, Lys, Asp ct 'I_yr
respectivement ; BBG2a3 comporte les huit rcsidus modifiés de B1:3G2a1 ct
BBG2a2.
Des peptides particulièrement avantageux selOtl l'invention
présentent notamment l'une des séquences choisies parmi ILS sequcnccs
ID n° 1, ID n° 2, ID n° 3, ID n° 4, ID n°
5, ID n° 6, ID n° 7, ID n° 8, ID n° 9,
ID n° 10, ID n° 11, ID n° 12, ID n° 13, ID
n° 14, ID n° i5, ID n° 16, ID
n° 17, ID n° 18, ID n° I9, ID n° 20, ID n°
21 et/ou ID n° 22, figurant en
annexe ; un teI peptide peut, en outre, comporter au moins un résidu
cystéine en position N-terminale ou C-terminale.
La réactivité des peptides est mise en évidence par des sondes
mono ou polyclonales. Quatre régions de G2Na ont été révélées par cette
technique : G5a (aa144-159), Glla(aa164-176), G4a(aa172-187) et
G9a(aa190-204).
L'invention a donc également pour objet des anticorps,
monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre un peptide présentant au
moins l'une des séquences ID n° 1 à ID n° 22.
Des peptides possédant une ou plusieurs unités correspondant aux
épitopes 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence de la
protéine G du VRS seront très utiles pour les différents modes de mise en
oeuvre de l'invention.
Des peptides selon l'invention, couplés à une protéine porteuse,
sont utiles comme agents immunogènes.
La protéine porteuse est avantageusement choisie parmi les OmpA
de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT (tetanus
toxoide), la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du
Streptocoque et ses fragments et la sous-unité B de la toxine cholérique
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. (CTB) ; de préférence, la protéine porteuse est 11I1C OmpA d'une bactérie du
genre: Klebsiella.
Selon l'un des aspects dc l'invention, lc peptide est conjugue à la
protéine porteuse par une protéine de liaison ; cette protcinc dc liaison
5 peut notamment ètre choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique cic
mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosalcs.
Le couplage est de préférence un couplage covalent, qui peut ctre
réalisé par la voie chimique ou par des techniques d'ADN recombinant.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a donc pour objet une
lU séquence nucléotidique codant pour un peptide ou un agent immunogène
tels que définis précédemment. I1 peut s'agir notamment d'une molécule
d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN
codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour un peptide selon
l'une des revendications 4 ou 5 ou l'un de leurs fragments, fusionné avec
un promoteur ; il peut également s'agir d'une molécule d'ARN.
Les peptides, les anticorps, les agents immunogènes et les
séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent étre utilisés à titre de
médicament, et plus particulièrement pour la préparation d'une
composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections
provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
Par exemple, des anticorps monoclonaux reconnaissant de manière
spécifique les peptides G5a et Glla et GI~Ca ont été générés. Le transfert
passif des anticorps monoclonaux 5C2 (anti-G5a) et 18D 1 (anti- G lOCa)
chez la souris naive permet de prévenir l'infection au VRS-A d'une part. Et
' 25 d'autre part, le même monoclonal 5C2 permet d'éliminer rapidement une
infection chronique au VRS-A chez la souris immunodéprimée.
L'invention a donc également pour objet une composition
pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps
mono ou polyclonal, un peptide ou un épitope selon l'invention, un agent
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immunogène, ou une séquence nuclcotidique tels que définis
précédcmment, el des excipients phal'IlIaCCLltlqueIllC'.nt acceptables.
Les anticorps monoclonaux sont, cic préfcrcncc, h11I11anlses ct
produits par la voie recombinante. Selon un autre aspect de l'invention, ils
sont obtenus par la méthode de librairie de phages.
Les peptides, agents immunogènes, anticorps et séquences
nucléotidiques selon l'invention peuvent, selon un mode de mise en oeuvrc
de i'invention, entrer dans la composition d'un lcit de diagnostic.
Comme indiqué plus haut, les agents immunogènes peuvent être
préparés par la technologie de l'ADN recombinant, par l'introduction d'une
séquence nucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte. Cette
séquence nucléotidique peut être un gène de fusion qu'on introduit par
l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un
bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmidc. Ce gène de fusion peut,
dans un mode de réalisation du procédé de préparation, étre intégré dans
le génome de la cellule hôte.
Le vecteur pourra être un vecteur viral, connu de l'homme du
métier.
La cellule hôte peut ètre un procaryote, notamment choisie dans le
groupe comprenant : E. coli, Bacilles, Lactobacillus, Staphylococcus et
Streptococcus.
Mais la cellule hôte peut également étre une levure, une cellule de
mammifère, une cellule d'origine végétale ou une cellule d'insecte.
Selon l'un des aspects du procédé selon l'invention, la protéine de
fusion est exprimée : sécrétée, localisée dans le cytoplasme, ou encore
exposée à la membrane des cellules hôtes.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention. Dans
ces exemples, on se référera aux figures suivantes.
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Figures 1 et 2 : Principe du clonage des gènes G2al, G2a2 et G2a3 dans
les vecteurs.
Figure 3 : A-Gel SDS-PAG L 20 %, coloration au Bleu dc Comassic. M=
Standards de tailles moléculaires, pistes 1 et 2 protéines B13G2a 1 (masse
théorique 38,7 Kd) purifiées par affinité sur I-ISA-Sépharosc.
B- Immunoblot des protéines BBG2a 1 avec un anticorps
monoclonal 18 D 1.
Figure 4 : A-Immunogénicité des peptides G5a et G9 a.
B- Efficacité protectrice des peptides G5a et G9a sur les
poumons.
Figure 5 : A- Immunogénicité des peptides G7a et GBa.
B- Efficacité protectrice des peptides G7a et G8a sur les
poumons.
Figure 6 : Immunogénicité de BBG2a1 vis-à-vis du VRS A (rigure 6A) et
VRS B (68) et efficacité protectrice contre le VRS A (6C) et le VRS B (6D).
Figure 7 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2.
Figure 8 : A- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 18D 1.
B- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 5C2.
Figure 9 : Identification des épitopes B de G2Na représentés dans un
sérum de souris immunisées par BBG2Na. A : révélation totale ; B
absence de révélation de la région 155-176.
Figure 10 : Détermination de la zone de reconnaissance de l'anticorps
monoclonal 5B7 par la méthode du Pepscan B.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des peptides.
~ Exemple de la synthèse des peptides GSaCys et CysGSa.
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Abréviations
AA : acide amine
Boc : tert Butoxycarbonyl
BHA : Bromo hydrosuccimidyl acide
CE : Capillary Electrophoresis
ES-MS : Electrospray - Mass spectrometry
FMOC : fluorenylmethoxycarbonyl
FZCE : Free Zone Capillary Electraphoresis
I-IBTU : 2-(lf-I-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium
hexailuorophosphate
HMP : p-Hydroxyméthylphénoxyméthyl polystyrène
MBHA : méthylbenzhydrylamine
NMP : N-méthyle-2-pyrrolidone
Pmc : 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
RP-HPLC : Reverse Phase - High Performance Liquide Chromatography
SPPS : Synthèse Peptidique en Phase Solide
tBOC : t-butyloxycarbonyl
tBu : tertio Butyl
TFA : trifluoroacetic acid
Trt : trityle
Le peptide G5a est un peptide de 16 acides aminés qui correspond
au fragment de la protéine G ( 144-159) du VRS-A. Il est obtenu par
synthèse chimique sur phase solide en partant du coté C vers le coté N-
terminal. Les peptides CysGSa et GSaCys correspondent respectivement à
ce peptide avec une Cystéine supplémentaire du côté N ou C-terminal qui
est destinée à un couplage univoque sur une protéine porteuse. Ces 2
peptides permettent d'étudier l'influence que peut avoir l'orientation du
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peptide conjugué à une protéine porteuse sur la rcponsc immunologique
obscivéc.
' Les peptides ont cté synthétises à l'aide cl'un synthétiseur
automatique de peptide cn phase solide du ccité C vers le côté N-terminal
(chimie FMOC à l'échelle de 0.1 ; 0.25 ou 1.0 mmole). La synthcsc du
peptide CysGSa est effectuée à partir d'une Prolinc préchargéc sur une
résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide
libre du côté C-terminal ou une résine de type Rinl{ amide MHBA, qui
permet après clivage d'obtenir une fonction amide du coté C-terminal.
Celle du peptide GSaCys débute par une Cystéinc préchargée sur l'une ou
l'autre des résines. Les fonctions réactives des chaises latérales des acides
aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie'
FMOC [Cys(Trt) ; Arg(Pmc) ; Asn(Trt) ; Gln (Trt) ; Lys(Boc) ; Scr(tBu) ;
Thr(tBu)). Un cycle de couplage se déroule de la manière suivante
déprotection de la fonction amine N-terminale du premier acide aminé à
l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide
aminé à coupler à l'aide d'HBTU/HMP et couplage. En fin de synthése, le
peptide est clivé de la résine et les chaises latérales sont déprotégécs par
réaction avec un mélange eau / TFA. Le peptide est précipité à l'éther
refroidi préalablement à -40°C et le mélange est centrifugé. Le culot
est
lavé à trois reprises avec de l'éther puis séché à l'azote. Le culot est
repris
avec de l'eau contenant 0.1 % de TFA. La suspension est à nouveau
centrifugée et le surnageant qui contient le peptide est séparé du culot, qui
contient la résine. Le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse
semi-préparative. L'homogénétié du peptide purifié est vérifiée par HPLC
en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure
théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse
mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse
calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés.
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.Peptide CysG5aNH2
Synthèse
Poids théorique peptide-résine en fin de synthcsc: 593 mg
S Poids mesuré après séchage à l'azote : 619 mg
Clivage peptide-résine et analyse du peptide brut : 200 mg (1/3 du lot)
Masse de peptide brut clivé après lyophilisation : 84 mg (75 % clé
quantité nette de peptide soit 97 % de rendement)
Homogéneité du peptide brut : 97 % (RP-HPLC ; UV 210 nm)
10 97 % (FZCE/MicrocoatT")
Purification
Masse de peptide purifié après lyophilisation : 50 mg (75 % de quantité
nette de peptide soit 58 % de rendement)
Caractérisation
Homogéneité du peptide purifié : > 99 % (RP-i-IPLC ; UV 210 nm)
> 99 % (FZCE/MicrocoatT" ; UV 200 nm)
Spectrométrie de masse ( ES-MS)
Masse calculée : 1951.29 Da
Masse mesurée : 1950.80 Da ~ 0.31
Exemple 2 : Couplage des peptides GSa, G?a, GBa, G9a, Glla et
GlI~Ca sur une protéine porteuse {P40, BB, TT, KLHj.
~ Exemple du couplage du peptide G 1 lOCa sur la protéine P40.
Le peptide G 1 lOCa (Seq ID n° 14j est un peptide de 13 acides
aminés issu de la protéine G du VRS. Il correspond à la séquence 164-176
de cette protéine. Lors de la synthèse, le résidu Cys en position 173 a été
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remplacé par un résidu Ser afin de ne conserver qu'un seul résidu Cys en
pOSltlOn 17~ et CVItCr la fOrmatLOIl d'UIl pont (1LSUlft,lI'C 1-2
Il'('.XISIAIIt Cla3nS
la protéine G naturelle (appariement 1-4/2-3).
Ce peptide a été couplé à l'aide de glutaraldchy(lo (rcactiC
homobifonctionnel, couplage sur les fOnCt1011S amines et thiols) ou cic
manière univoque à l'aide de 131-IA (r~actii' hctcrot~ii'onctionncl, couplage
sur la fonction thiol de la Cystéine en position C-terminale).
~ Couplage univoque par le BHA
~ Solubilisation du peptide G110Ca.
2 mg de G110Ca sont solubilisés dans 2 ml de tampon phosphate
0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14.
~ Couplage univoque sur la protéine P40 à raide d'un réactif
hétérobifonctionael ~BHAi.
3 mg de BHA en solution dans 25 ul dc DMF sont ajoutés à 2,5 mg
de protéine P40 préalablement dialysés contre un tampon phosphate 0,1 M
pH7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 et agités pendant 1 heure à température
ambiante. Après dessalage sur colonne PD 10 et élution avec un tampon
phosphate 0,1 M pH ? + 0,1 % Zwittergent 3-14 des fractions de 500 X11
sont collectées et les tubes contenant la protéine bromoacétylée sont
rassemblées (lecture de DO à 280 nm) dans des tubes contenant 0,95 ml
de solution du peptide G 1 l~Ca sont ajoutés. Le milieu réactionnel est
saturé avec de l'azote et agité à l'obscurité pendant 2 heures à température
ambiante. La solution est dialysée ensuite à l'aide d'un tampon phosphate
0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant une nuit à + 4°C sous
agitation et la solution obtenue est conservée congelée.
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~ Couplage sur Ia protéine P40 à l'aide d'un réactif homobifonctionnel
(glutaraldéhyde).
mg de P40 sont dialyses contre un tampon phosphate 0,1 M pl f
7 + 0,1 % Zwittergent 3-14. La concentration est ajustce a 2 mg/ml à l'aide
5 d'un tampon carbonate 0, i M pH 9 + 0,1 % Zwittergent 3-14. 200 mg clé
SDS d'une solutiuon à 4 % sont ajoutés.
55,5 ul de glutaraldéhyde à 2,5 % sont ajoutés à 2,5 ml d'une
solution de peptide Gl l~Ca à 1 mg/ml dans un tampon carbonate 0,1 M
pH 9 + 0,1 % Zwittergent 3-14 à un pl-1 se situant entre 9 et 10. Le milieu
10 réactionnel est agité à + 4°C pendant 24 heures puis ramené à
température ambiante. 25 ul de lysine 1 M sont ajoutés pour bloquer la
réaction. La solution est dialysée contre du tampon phosphate 0,1 M pH 7
+ 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à + 4°C sous agitation. Le
dialysat est récupéré et le SDS éliminé par précipitation à l'aide d'une
solution de KCl 0,02 M à 6 reprises. Le dernier surnageant qui contient le
conjugué P40-G 1 l~Ca glutaraldéhyde est conservé sous forme congélce à
- 20°C.
~ Stérilisation des conjugués
Les conjugués sont décongelés, filtrés stérilement (0,22 um),
aliquotés et conservés à + 4°C afin d'éviter les problèmes de
précipitation.
~ Caractérisation analytique des conjugués
Les conjugués sont caractérisés par dosage des protéines par la
méthode de Lowry, électrophorèse de type SDS-PAGE (révélation au bleu
de Coomassie) et par dosage des acides aminés après hydrolyse acide en
phase gazeuse, dérivation par le PITC et analyse par HPLC.
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Conjugu Volume [prot] Nb de G110C jG110C)
(ml) mg/ml Fixs m /ml
rP40-G110Ca 2,7 0,74 2 0,05
BHA
rP40-G110Ca 5,1 1,29 16 0,49
lutaraldh de
Exemple 3 : Clonage de gène G2al, G2a2 dans vecteur d'expression
pvaBB308 et production de protéines de fusion BBG2a1 et BBG2a2
dans E. coli
Le principe de clonage de gène G2a1 (Seq ID n° 15), G2a2 (Seq ID
n° 16) et de G2a3 (Seq ID n° 17) dans les vecteurs est explicité
dans les
figures 1 et 2.
3.1 Construction de G2a 1
Le gène codant pour la protéine G2a1 (Seq ID n° 15) est construit
par mutagénèse dirigée en utilisant comme matériel de départ le plasmide
pRIT28G2Na. Pour cela, deux réactions de PCR (Polymerase chain
reaction) sont réalisées avec les couples d'oligonucléotides
RIT29/TH 137(PCR 1) d'une part et RIT30/TH 136 (PCR 2)d'autre part dans
les conditions suivantes
PCR (94°C 15 secondes
cycles (55°C 30 secondes
(72°C 30 secondes
20 ~ Fixation sur les billes magnétiques
hes fragments obtenus respectivement de 262 pb et 208 pb pour les
réactions 1 et 2 sont fixés sur des billes magnétiques. 25 ~~l de billes
magnétiques DYNALO M-280 couplées à la streptavidine sont
préalablement rincées deux fois avec du tampon T.E. (Tris 10 mM; EDTA
25 imM, pH 7,5) puis mises à incuber 20 minutes à 37°C avec 90y1 des
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réactions d'amplification 1 et 2. Après fixation les fragments sont
dénaturés en incubant Ics billes magnctiqucs avec 50p1 de NaOI-1 0,15 M
pendant 10 I111IlutcS a tcmpc:ralurc ambiante. LC'.S Clellx Sut'nFIgC:antS
SOIR
récupérés, précipités à l'éthanol absolu ct I'CSllspeIlCllls Clai'1S 5U yl d'I-
I20.
~ Réaction d'extension
Celle-ci est réalisée par PCR en prenant 10 yl de chacune des
réactions d'amplification dans les conditions ci-dessous
(95°C 15 secondes
5 cycles (35°C 30 secondes
(72°C 30 secondes
Le fragment généré est amplifié par PCR avec les oligonucléotides
RIT27 et RIT28
(95°C 15 secondes
25 cycles (55°C 30 secondes
(72°C 30 secondes
Le fragment amplifié de 509 pb est digéré avec les enzymes de
restrictions PstI et HindIIi. Le fragment généré de 169 pb est cloné dans le
vecteur pRIT28 digéré par les mêmes enzymes.
Le plasmide obtenu pRIT28G2a1 down est séquencé avec la chimie
des Dye Deoxy Terminator selon le protocole décrit par Applied Biosystem
(Perkin Elmer) .
Le plasmide pRIT28G2a1 est obtenu en clonant le fragment
PstI/HindIII de pRIT28G2aldown (fragment en aval du site Pst lj dans lc
vecteur pRIT28G2Na.
Le gène G2a1 est ensuite cloné dans le vecteur d'expression
pvaBB308 aux sites de restriction EcoRI/HindIII générant le vecteur
pvaBBG2al.
La liste des séquences des oligonucléotides est indiquée ci-dessous
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RIT27: 5' - GCTTCCGGCTCGTA'fGTTGTGTCI - 3'
Rl'28: 5' - AAAGGGGGnTGTGCTGCAnGGCG - 3'
' 1'I-I 136: 5'- CCGAAGAAAAAACCGlICGACCAAnCCGACC - 3'
1'1-I137: 5' - TT'T'f1'TC'I"I'CGG1"1"fG1"I'G.CfCGGG - 3'
5 RIT29 : RIT27 biotinylé en 5'
RIT30 : RIT28 biotinylé en 5'
3.2 Construction de G2a2 i(Seq ID n° 16~
Le principe du clonage est schématisé en bas de la figure 2.
10 Les couples d'oligonucléotides utilisés dans cette construction sont
les suivants : RIT29/TNG193(PCR 1) d'une part et TNG192/RIT30(PCR 2)
d'autre part. Les séquences des oligonucléotides sont décrites ci-dessous
TNG 192 : 5'- CCGCCGAAAAAACCGAAAGACGAT - 3'
TNG 193 : 5' - CGAAATGGTAATCGTCTTTCGG - 3'
3.3 Construction de G2a3 I(Seq ID n° 17~
Les deux fragments en amont et en aval du site unique PstI ont été
rassemblés sur le mème vecteur pour donner pRIT28G2a3.
Les trois fragments d'inserts G2al, G2a2 et G2a3 ont été clonés
dans différents vecteurs d'expression dans E. coli, en particulier dans nos
exemples les vecteurs pvaBB308 où BB est le gène codant pour le
récepteur d'Albumine. Les protéines de fusion obtenus BBG2al, BBG2a2
et BBG2a3 peuvent étre aisément purifiées par affinité sur colonne HSA-
Sepharose (Hurnan serum Albumin).
3.4 Fermentation et purification de protéines de fusion BBG2a1 et
BBG2a2
Dans deux erlenmeyers contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic
Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline (100 ug/ml, Sigma) et de la
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Tétracycline (8 ug/ml, Sigma), on inocule avec E. coli RV308 transformes
avec les plasmides pvaBBG2a 1 et pvaBi3G2a2 respc:ctivcmcnt. On incu tee
pendant 16 heures à T° = 37°C sous agitation. 200 ml de cette
culture sont
inoculés dans un fermcntcur {CI-IEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2
litres cie milieu de culture. Lc milieu contient (g/1) = glycérol, S ; sulfate
d'ammonium, 2,6 ; dihydrogénophosphatc de potassium, 3 ; hydro-
génophosphate dipotassium, 2 ~ citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure,
1 ; Ampicilline, 0,1 ; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; sulfate de
magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0,65 ml/1 dc
solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation
sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation,
l'alimentation de' sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé
à 7,0. La température est fixée à 37°C. La croissance est contrôlée cn
alimentant du glycérol (87 %) à un débit constant ( 12 ml/h) pour
maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la
turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (aprcs
environ 24 heures de culture), la production des protéines est induite par
addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de
mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par
20 centrifugation. Les rendements en biomasse obtenus sont environ 200gr
de biomasse humide. Les rendements de production de BBG2a1 et de
BBG2a2 sont environ de 4 à 6 mgr de protéines par gr de biomasse.
Une fraction de 30 g de biomasse humide est resuspendue dans 70
ml de solution de TST (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCI 200 mM, 0,05
25 Tween 20 et EDTA 0,5 mM). Les cellules sont désintégrées par sonication
(Vibracell 72401, Sonies & Materials). Après centrifugation du lysat
cellulaire, le surnageant est filtré (1,2 gym) et dilué dans 500 ml de TST.
Les
protéines de fusion ainsi obtenues sous forme soluble sont purifiées sur
colonne d'affinité : HSA-Sepharose (human serum albumin) selon le
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protocole décrit par (Stahl et col, J. Immunol. Methods, 1989 ; 124 : 43-
52).
Le lysat insoluble, aprcs centrifugation, est lavé une fois avec lin
tampon ('tris-HCl 50 mM pl-I 8,5 ; MgCI,, 5 mM). Aprcs lavage, lc culot est
S solubilisé dans 30 ml dc chlorhydrate de guaniciinc 7 M, 'fris-I-ICl 25 mM
(pH 8,5), Dithiotreitol (DT'f) 10 mM, suivi d'une incubation n 37°C
pendant
2 heures. Les protéines solubilisées sont additionnées à un tampon dc
renaturation (Tris-i-ICl 25 mM (pH 8,5) ; NaCI 150 mM et 0,05 % Tween
20). La concentration du chlorhydrate de guanidine est ajustée à la
concentration finale de 0,5 M dans le tampon de renaturation avant
l'addition des protéines de fusion solubilisées. Le mélange est incubé à
température ambiante, sous agitation modérée, pendant 16 heures. Après
centrifugation, les produits de fusion solubles dans le surnageant sont
purifiés sur colonne HSA-Sepharose. Les protéines de fusion purifiées sont
analysées sur gel SDS-PAGE ( 12 %), sur l'appareil MINI PROTEAN Il
SYSTEM (BIORADS). Les protéines sont visualisées avec du Coomassie
brilliant blue 8250. De plus, l'analyse des protéines recombinantes par
Immunoblot avec des anticorps spécifiques du VRS montre que les
protéines sont antigéniques.(voir exemple de gel SDS et immunoblot de
BBG2a1 sur la figure 3).
Exemple 4 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptides
G5a et G9a couplés à P40.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 7 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p. avec
20 ug de P40-G9aCys, P40-CysGSa, ou P40-GSaCys. Des souris témoins
ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé
comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été
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prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation
pour confirmer leur séroconvcrsion vis-à-vis lc VRS-A, challcngécs unc
semaine plus tard avec 105 TCIDSO VRS-I1 par voie i.n., ct sacrifices 5 jours
post-challenge. Les poumons ont cté prclcvcs ct le turc dc virus clans les
poumons détcrrniné.
Résultats
Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 4A, l'immunogénicité du peptide G5a
est dépendante de l'orientation du couplage au P40. Après couplage par la
partie C-terminale du peptide, des titres en anticorps anti-VRS-A faibles à
modérés ont été induits dans le sérum. Par contre, après couplage par la
partie N-terminale, G5a n'a pas induit de tels anticorps. En général, le
peptide G9a, couplé en C-terminal à P40, a été faiblement immunogénique
en terme d'induction d'anticorps anti-VRS-A. Une souris sur sept
immunisées avec P40-G9acys a développé un titre d'anticorps sériques
anti-VRS-A élevé.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G5a et G9a.
Comme démontré dans la Fig. 4B, et en corrélation directe avec la
détection des anticorps anti-VRS-A, le peptide G5a a induit des réponses
immunes protectrices quand il était couplé en C-terminal, mais pas après
couplage en N-terminal. En effet, 6 souris sur 7 immunisées avec le P40-
GSacys (couplage C-terminal) ont été protégées sans évidence de virus
dans les poumons, le dernier n'a eu du virus qu'à la limite de détection de
l'essai. Par contre, les souris immunisées avec P40-cysGSa (couplage N-
terminal) ont eu des titres de virus dans les poumons aussi élevés que les
souris témoins, immunisées avec le PBS. Ces résultats confirment que
l'orientation du couplage de ce peptide à une protéine porteuse est capitale
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pour son efficacité protectrice. La corrélation entre la protection et
l'induction des anticorps asti-VRS-A sttgn~~rc: clac la prolcction pulmonnirc
observce est médicc, en partie au moins, par ics anticorps.
Malgré le fait que le P40-G9aCys ait été faiblement immunogéniquc
S chez la souris en termes d'induction d'anticorps sériques anti-VRS-A, les
poumons de S souris sur 7 ont été protégés contre un challenge par Ic
VRS-A. En effet, 1 souris sur 7 n'a pas montré d'évidence de virus dans les
poumons, ni même d'anticorps anti-VRS-A dans le sérum.
Conclusions.
Les peptides GSa et G9a contiennent des épitopes protecteurs vis-à-
vis d'une infection VRS-A des poumons. L'orientation du couplage de GSa
à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice.
1 S Exemple 5 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptîdes
G7a et GBa.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 3 à 4 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p.
avec 20 ug de G7a, GBa, BB-G7a, ou BB-GBa. Des souris témoins ont été
immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été ulitisé comme
adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au
sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour
confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une
semaine plus tard avec 105 TCIDSO VRS-A par voie i.n., et sacrifiées 5 jours
post-challenge. Les poumons ont été prélevés et les voies nasales lavées.
Les titres de virus dans les poumons et les voies nasales ont été
déterminés.
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Résultats.
Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 5A, les peptides G7a rt G8a sotlt LUUs
cieux immunogéniques vis-à-vis du VRS-A couples ou non a 1313. Si l'on
S COIlsld(:I'e les titres d'anticorps sériques, les pCptICICS nOI1 COUpIéS
SCI11u1(:Ilt
être un peu plus immunogènes que les peptides couplés.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G7a et GBa.
Comme indiqué dans la Fig. 5B, les poumons de toutes les souris
10 immunisées avec les peptides G7a ou GBa, couplés ou non à BB, sont
protégés contre un challenge avec Ie VRS-A, sans présence de virus ou
seulement à la limite de détection de l'essai.
Conclusions.
15 Les peptides G7a et G8a contiennent des épitopes protecteurs vis-à-
vis des poumons. Les peptides sont efficaces couplés ou non à BB.
Exemple 6 : Immunogénicité et efficacité protectrice de la protéine
de fusion BBG2a 1.
Matériels et méthodes.
Afin de déterminer l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de
BBG2a1 contre les VRS-A et B, des groupes de 3 souris ont été immunisés
2 et 3 fois, respectivement, par voie i.p. avec 20 ug de protéine à 2
semaines d'intervalle. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS.
L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé comme adjuvant pour toutes les
immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2
semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur
séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec
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i05 TCIDSO VRS-!1 par voie i.n., et sacrifices S jours post-challenge. Les
pOL1n10I1S OIlt CtC pl'C1CVCS CL 1C tltrC C1C'. V1I'uS CIMtIS ICS pOUI110I1S
(lCtc'.I't111n('.
Résultats.
Immuno~énicité cie BBG2a 1 V1S-rl-V¿S C1CS VIES-A ct 13.
Les résutats présentés dans les Fig. f~A et B démontrent clac Ie
BBG2a1 est capable d'induire des anticorps anti-VRS-A et B. Comme.
attendu, le titre en anticorps anti-VRS-A est bien supérieur au titre en
anticorps anti-VRS-B. Néanmoins, des titres cn anticorps contre lcs deux
souches de VRS sont élevés.
Efficacité protectrice de BBG2a1 vis-à-vis du VRS-A et du VRS-B.
Comme indiqué dans ies Fig. GC et D, l'immunisation des souris
avec BBG2a1 a induit des réponses immunitaires capables de protéger les
poumons contre un challenge avec le VRS-A et contre un challenge avec le
VRS-B. Les souris challengées avec le VRS-A ont étc protégées sans
évidence de virus dans les poumons (2 souris/3) ou seulement à la limite
de détection ( 1 souris/3). Les souris challengées avec le VRS-B ont été
protégées, soit sans évidence de virus dans les poumons ( 1 souris/3) soit
avec du virus qu'à la limite de détection (1 souris/3) ou juste au-dessus de
cette limite (1 souris/3) de détection.
Conclusions.
La protéine de fusion BBG2a1 est très immunogénique vis-à-vis du
VRS-A et vis-à-vis du VRS-B. BBG2a1 est capable d'induire des réponses
qui protègent les poumons contre un challenge avec les 2 sous-groupes de
VRS.
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Exemple 7 : Obtention des anticorps 18D 1, 5C2 et 5B7
Peptide d'llnn1L1111S~itlOn : (i) CTIdCa couples au 1L1-i (Hcyholc
Lcmpct 1-Iaomocyanin), (ü) G2nCa ct (iii) B13G2Na.
Lcs souris ont cté immunisccs à JO avec 50 pg (~'e111tIbCIIC Cil CFA
(complote Frcund Adjuvant) en ip, à J 14 avec 10 ug dc chacluo antigène on
IFA (Incomplete Freund Adjuvant) en ip, puis a J38 cn iv avec lOllg cle
chaque peptide sans adjuvant. Les rates sont prélevées ct fusionnées avec
les cellules dc myélome SP2-O à J42 dans un rapport 1 / 1. Les hybridomcs
positifs contre chaque antigène sont gardés. Ces hybridomcs ont été
injectés à des souris pour obtenir des ascites puis les différents anticorps
obtenus ont été sélectionnés sur différents peptides afin de déterminer la
spécificité des anticorps obtenus. Les anticorps monoclonaux 18D 1, 5C2
sélectionnés par leur spécificité contre les peptides G ldCa, GSa,
reconnaissent spécifiquement le VRS-A. L'anticorps monoclonal 5B7
obtenu à partir de BBG2Na et reconnaissant lc peptide G 1 la rcconnait lc
VRS-A.
Exemple 8 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2 sur
l'infection chronique à VRS-A obtenue chez la souris SCID.
Matériels et méthodes.
Les souris C.B-17 scid/scid ont été challengées par voie i.n. avec
IOs TCIDSO de VRS-A, sous 50 ul. Vingt six jours plus tard, les souris ont
reçu par voie i.n. et à raison de 7 souris par groupe, 50 ~1 d'une
préparation d'anticorps 18D1 ou d'anticorps 5C2 à un titre ELISA anti-
VRS-A de 104. Des souris témoins ont reçu du sérum anti-BB à un titre
ELISA anti-BB de 104. Les souris ont été sacrifiées 5 jours plus tard et
leurs poumons ont été prélevés pour titrage du virus.
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Résu ltats.
Lcs résultats prCacntés d~lns la l'ig. 7 clémont.rcnt que ILS zntlcorps
11'lOIlOCIOnaux 18D1 Ct 5C2 SOIR Cfl~~l~lCS Cl'C11I111nCI' unC iII¿CCtlOt1
chronique avec le VRS-A chez la souris SCID et CCCI C1'unC IllalIlIC'.t'C
stérilisante. Aucune trace de virus n'a étc dctectée clans les poumons au
moment du sacrifice. Les résultats obtenus dans les poumons des souris
traitées avec le 5C2 correspondent à la moyenne des limites de dcacction
de l'essai, limite plus élevée du fait du manque de disponibilité
d'échantillon, et non pas à la présence de virus.
Conclusions.
Les anticorps monoclonaux 5C2 et 18D 1 pourraient ètre utilisés
comme traitement thérapeutique dans le cadre des infections pulmonaires
à VRS-A.
Exemple 9 : Effet prophylatique de l'anticorps monoclonal 18D 1 sur
l'infection à VRS-A chez la souris.
Matériels et méthodes.
Un groupe de souris BALB/c naïves, séronégatives vis-à-vis du
VRS-A, ont reçu par injection intrapéritonéale 200 ul d'une préparation
d'anticorps 18D 1 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 105. Un groupe de
souris témoins transfert i.p. ont reçu en parallële 200 ul d'une préparation
de sérum anti-P40 (sérum irrelevant) ajustée au titre ELISA anti-P40 de
104. Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec 50
~Il
d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont
sacrifiées 5 jours plus tard pour dosage de virus dans les poumons.
_. _ ___ _.____. _ , _ .__.
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t~~~" if.,t~
Comme indique clans la f ig. 8A, l'anticorps 18I~ I est: calrWlc apres
tI'flnSfel't i.p. d'induire une protection <.~u niveau d<~.s pOL11110I1S CIC
sUUI'1S
naïves lors d'un challenge avec Ie VRS-A. 'foutes lc~s souris sonl protcgcos
après injection dc 200 ul de 18D 1 au titre dc 105. 'I~I'O1S sOLII'1S SL1I' 7
sUIII.
protégées sans évidence de virus dans les poumons. Lcs aLltres Illonll'cnl
des traces de virus seulement à la Iimite dc dètection de l'essai (3
souris/7), ou juste au-dessus de cette limite ( 1 souris/7). Les souris
témoins ont des titres compris entre logl0 3.70 et 4.45 par gramme cie
IO poumons.
Conclu sion.
L'anticorps 18D 1 est capable de prévenir une infection pulmonaire
à VRS-A chez la souris BALB/c. Il démontre une efficacitc prophylactique
importante.
Exemple 10 : Effet prophylatique d'anticorps monoclonal 5C2 sur
l'infection à VRS-A chez Ia souris.
Matériels et méthodes.
Des souris naïves séronégatives vis-à-vis du VRS-A reçoivent par
transfert i.n., 50 ~1 d'une préparation de 5C2 ajustée au titre ELISA anti-
VRS-A de 104. Des souris témoins reçoivent en parallèle du sérum anti-BB
ajusté au titre ELISA anti-BB de 104.
Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec
50 ul d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont
sacrifiées 5 jours plus tard pour titrage de virus dans les poumons.
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Résu ltats.
Comme le montre la l~ ig. 813, toutes ILS souris traitcca avec Ie 5C2 à
104 ont cté protcgccs au niveau pulmonaire. Seule 1 souris sur 7 montre
des traces de virus. Lcs souris tcmoins ont clos titres compris entre loglt)
5 3.70 et 4.70 par gramme dc poumons.
Conclusion.
L'anticorps 5C2 est capable de prévenir une infection pulmonaire à
VRS-A chez la souris BALB/c. I1 démontre une efficacité prophylactique
10 importante.
Exemple 11 . Pepscan . exemple de la synthèse muliple de 94
octapeptides couvrant la séquence de l'aa 130-230 de G2Na et se
chevauchant par un acide aminé.
15 Une plaque "PEPSCAN" de 96 octapeptidcs synthétisés en parrallcle
(2 peptides de contrôle + 94 peptides couvrant la séquence 130-230 de la
protéine G du VRS-A) est préparée selon la technique MULTIPINT'" décrite
par Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81, 3998-4002.
Ces peptides sont synthétisés sur support solide à l'extrémité de 96
20 "pins" (8 x 12) complémentaires d'une plaque de microtitration ELISA dans
laquelle sera effectuée directement le criblage d'anticorps monoclonaux ou
polyclonaux (sera).
~ Système de repérage des positions des pins et des puits
25 Le système de numérotation utilisé est le suivant
position A 1 ( 1 ) = Plaque n°A, ligne 1 ( 12 lignes) colonne 1
(position H 1 en
ELISA)
position A2( 1) = Plaque n°A, ligne 2, colonne 1 (position H2 en ELISA)
A 1 ( 1 ) : peptide de contrôle # 1 : PLAQGGGG
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A2(1) : peptide de contrôle # 2: GLAQGGGG
A3( 1) : octapcptide # 1 : TVhThN1"f
A4( 1) : octapcptidc # 2 : VK'fi~N'Cl"f
ctc.
A 12(8) : oclapcptidc # 94 : I'EVPT'fKI'
~ Synthèse
La synthèse correspond à plusieurs cycles de déprotcction, de
lavages et de couplage jusqu'à obtention des séquences peptidiques
désirées. A la fin de la synthèse, les peptides sont N-acétylés, avant l'étape
de déprotection des chaines latérales.
Les acides aminés utilisés pour la synthèse sur pins sont protégés
par un groupement Fmoc (9-Fluorénylméthoxycarbonyl) et les
groupements protecteurs des chaines latérales suivants : t-Butyle éther
(tBu) pour la Sérine, la Thréonine et la Tyrosine, t-Butyle ester (OtBu) pour
les Acides Aspartique et Glutamique, t-Butoxycarbonyle (Boc) pour la
Lysinc, l'I-Iistidine et le Tryptophane, 2,2,5,7,8-pcntaméthylchroman-6-
sulfonyle (Pmc) pour l'Arginine, Trityle (Trt) pour la Cystéine, l'Asparagine
et la Glutamine. L'activation de la fonction acide est effectuée avec de la
Düsopropylcarbodümide (DIC) et du 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)
dissouts dans du DMF.
~ Fmoc-dëprotection et lavages : La plaque de pins est immergée dans
un bain contenant 200 ml d'une solution de pipéridine à 20 °.ô dans le
DMF (40/ 160 ml) pendant 20 min. à température ambiante sous agitation.
Les pins sont ensuite retirés du bain. L'excès de solvant est éliminé en
frappant le bloc de pins sur du papier-linge. Les pins sont lavés dans
200 ml de DMF pendant 2 min. à température ambiante sous agitation. Le
bloc est frappé sur du papier-Iinge et immergé complètement dans un bain
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dc MeOI-I pendant 2 min. sans agitation. I,es pins sont imlncrgcs dans
200 nll dc MeOI-I eriSUllC (3 bains dc 2 I111I1Lll.CS, 200 I111~1J~11t1~. L~l
pl~iqL1('
est séchcc pendant 30 min.
~ Couplage des Fmoc-amino acides : Lcs Fmoc-amino-acides subissent
une étape d'activation avant de pouvoir être couplés. La durée d'une étape
de couplage est de 2 heures pour une concentration de 100 mM avec 1.5
équivalent d'HOBt et 1.2 équivalent de DIC. Un logiciel permet de calculer
les quantités de réactifs nécessaires pour l'étape de couplage. Les pesées
sont effectuées dans des tubes classés par ordre alphabétique du code a
une lettre des acides aminés. Les tubes sont remplis en dehors de la
balance sur une feuille de papier-linge, puis pesés jusqu'à l'obtention
d'une masse proche de celle indiquée sur la feuille de pesée. La masse ne
doit pas être inférieure de 0.2 mg ni supérieure dc 0.9 mg par rapport à la
quantité théorique.
~ Etape de couplage : Les pins sont introduits délicatement dans les
puits. La boîte est fermée soigneusement et laissée sous une hotte pendant
la durée du couplage pendant 2 h pour une concentration en acides
aminés de 100 mM. Un couplage de 2 h permet de réaliser 3 couplages par
jour.
~ Traitement des blocs de pins après couplage : Les pins sont retirés de
la plaque contenant les solutions de couplage et lavés avec 200 ml de
MeOH sous agitation pendant 5 min. Le bloc est frappé sur du papier-linge
et laissé sécher pendant 2 min. Le bloc est placé dans 200 ml de DMF et
lavé pendant 5 min. sous agitation avant d'effectuer le cycle suivant de
déprotection. La plaque est lavée classiquement et subit l'étape de clivage
des groupements Fmoc comme décrit ci-dessus après le dernier couplage.
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~ Acétylation des amines terminales : Ics tétcs tlc pins sont mises Z
incuber dans les puits d'une plaque contenant 150 ul du mélange rc<~ctif
suivant : DMF/Anhydridc acctiquc/trictylaminc SONS/ 1 (v/v/v). I,c bloc
est enfermé dans une boîte pendant 90 min. à tempcraturc ambiante. Lc
bloc est lavé ensuite avec 200 ml de McOI-I pendant 15 min. puis séchc
pendant 15 min.
~ Déprotection des chaînes latérales : les groupements protecteurs des
chaînes latérales sont éliminés en immergeant Ies pins dans 200 ml d'un
lU mélange TFA/anisole/IJthanedithiol 190/5/5 ml pendant 2 h 30 à
température ambiante. Après cette étape de déprotection, le bloc de pins
est retiré de la solution acide. La boîte est rincée une fois au MeOI-I, puis
remplie de MeOI-I pour y immerger complètement le bloc de pins pendant
min. Le bloc est alors frappé sur du papier-linge puis immergé dans
200 ml d'un mélange MeOi-I/eau/acide acétique ( 100/ 100/ 1 ml) pendant
1 heure et frappé à nouveau sur du papier-linge. Le bloc est mis sous-vide
dans un dessiccateur pendant une nuit.
Exemple 12 : ELISA
La plaque portant les pins est saturée 1 heure à 37°C en tampon de
saturation (PBS, Tween 0,1 %, gélatine 1%), lavée 10 min en PBS et
incubée une nuit à 4°C sous agitation avec le sérum à analyser
préalablement dilué. La plaque est ensuite lavée 4 fois 10 min en PBS et
incubée une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire
marqué à la péroxydase, dilué au 1/5000 e. Après 4 lavages en PBS, le
substrat TMB est ajouté. L'arrét de la réaction est effectué par addition
d'acide sulfurique.
Le résumé des données résultant de l'analyse d'un sérum murin
anti BBG2Na par la méthode du Pepscan B est représenté sur la figure 9.
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29
Les figures 9A et 9B montrent une réactivité du sérum de souris
anti-BBG2Na contre 4 régions dc la molécule G2Na (Ics résidus en trait
' gras représentent les acides aminés jouant un rôle important dans la
reconnaissance Ae/Ag)
- la région 1 située entre les résidus 150 et 159 dont la séquence est
QRQNKPPNKP. Cette région est comprise dans le peptide G5a ( 144-15~)) et
correspond à la zone de réactivité de l'anticorps monoclonal 5C2 ;
- la région 2 située entre les résidus 176 et 189 dont la séquence est
CSNNP'I'CWAICKRI. I1 s'agit d'une région localisée au niveau du peptide
G lOCa ( 174-187) et correspondant à la réactivité des anticorps
monoclonaux 18D 1 et 5D3 ;
- la région 3 située entre les résidus 194 et 207 dont la séquence est
PGKKTTTKPTKKPT. Cette séquence correspond à une réactivité au niveau
du peptide G9 ( 194-204), réactivité déjà mise en évidence lors de la
production d'anticorps monoclonaux dirigés contre BBG2Na ;
- la région 4 qui s'étend sur une large zone allant du résidu 155 au résidu
176 semble étre le résultat de différentes réactivités. L'une de ces
réactivités qui couvre une région très hydrophobe de la molécule G2Na
(Glla) correspond à la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal
5B7 (obtenu après immunisation de souris BALB/c par le candidat vaccin
BBG2Na) dont le pepscan B est représenté ci-dessous dans la figure 10.
Cet anticorps monoclonal reconnaît la séquence FEVFNFVP ( 165-
172).
L'ensemble des quatre réactivités ci-dessus a par ailleurs été
confirmé par la titration du sérum anti-BBG2Na au moyen de différents
ELISA mis au point pour chacune des réactivités. Le tableau I montre que
le sérum anti-BBG2Na présente bien des activités "anti-G4a, G5a cys, G9a
cys et Glla".
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Tableau I : Titres anti-G4a, GSaCys, G9aCys et Gll~Ca exprimés en
1og10 du sérum anti-BBG2Na ref. BE-02.
Titre(loglo) BE - 02
G2Na 5.9
KLH-G4a 4.7
KLH-G9aCys 5.0
KLH-GS aCys 3 , $
P40-G 11 ~Ca 3 .5
5 Conclusion
L'étude d'un sérum anti-BBG2Na par la technique du Pepscan
montre que l'immunisation de souris avec BBG2Na génère des anticorps
contre 4 épitopes B situés respectivement dans les régions 150-159, 176-
189, 194-207 et 155-176. Cette technique permet donc de confirmer
10 l'importance de la région 164-176 (G 1 lOCa).
Ces résultats sont, par ailleurs, en parfait accord avec les donnces
ELISA concernant la réactivité d'un sérum anti-BBG2Na sur ies peptides
G4a, GSaCys, G9aCys et G 1 laCa.
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1
T~T~ DE
Infa~naticn pour la SD~ m NO : 1 C~,Ca
TYPE DE SES : acides aminés et nucléotides
I~C~E(1R DE LA SD~UE~E : 14 acides aminés, 42 nucléotides
N~RE DE BRINS : simple
O~VF'IC~Jf~ATI~1 : linéaire
TYPE DE NDI~t.~E : peptide
174 176 182 186 187
N - Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pn~ Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys - C
5' - AGC AT~ TGC AGC AAC AAC CC7G ACC ZGC 'ICI GC~ A~ AC~C AAA - 3'
?~fomnatian pour la SaQ m NO : 2 Q'OCa
TYPE DE SD: acides aminés
LDE LA S: 14 acides am;r~és
NCZ~RE DE BRINS : simple
0~1FIC~AZTC~T : linêaire
TYPE ~ ~3CC11.~E : peptide
174 176 182 186 187
N - Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Czn Trp Ala Ile Ser Lys - C
Info~c~at3.an pour la S~ ID NO : 3 Gl~Cb
TYPE DE SD: acides aminés et nucl~tides
L~JEIkt ~ LA SD: 14 acides am>.r~és, 42 nucléotides
NC~RE DE BRIrIS : simple
CJ~1FIC~RA~TCY~1 : linéaire
TYPE DE NDLECi~E : peptide
174 176 182 186 187
N - Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys - C
5' - AOC AZL~ 'IC~C 03C AAC AAC CAG C'IG TC3C AAA AOC ATC AOC AAA - 3'
Z~afo~nation paur la SaQ m NO : 4 Gl'ACb
TYPE DE SF7: acides aminés
Ll~7EUR DE LA SF7: 14 acides aminés
NC~RE DE BRIS : simple
03~1F'IC~7RATIC~1 : linéaire
TYPE L~ M~LECL~E : peptide
174 176 182 186 187
N - Ser Ile Asp Gly Asn Asn Gln Leu Orn Lys Ser Ile Ser Lys - C
fEüILLE DE REMPLACEMENT (REt~LE 26)
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2
zhfaxa~ticn pour la SDQ ID NO : 5 G5a
TYPE DE S: acides aminés et nucléotides
Uft DE LA SE~J~'E : 16 acides aminés, 48 nuclêotides
NC~RE DE BRINS : simple
CxNF'IG(k~ATICN : linéaire
TYPE DE Nt3LECL~.Ir : peptide
144 159
N - Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Azg Gln Asn Lys Pn~ Pn~ Asn Lys Pro - C
5' - ACC AAA CCN ACC ACar AAA CAG CCT CAG AAC AAA CGJ GC~ AAC AAA CCN - 5'
7~nfa~uation pour la SDQ Zn NO : 6 Gôb
TYPE DE SD: acides aminés et nucléotides
IGNGC~kt DE LA E : 16 acides aminés, 48 nucléotides
NC~RE DE SR~IS : simple
O~k'IG'üRATICB~T : linéaire
TYPE DE NDL~~E : peptide
144 159
N - Asn Lys Pzt~ Ser Thr Lys Ser Atg Ser Lys Asn Pn~ Pro Lys Lys Pro - C
5' - AAC AAA ~ AOC AGA AAA .SOC CCT AOC AAA AAC Cû~ C0.G AAA AAA OCG - 3'
Tnfoarmat3on pour la SEQ ID NO : 7 Gla
TYPE DE SD~7E~E : acides am~r~és et nucléotides
L~~1R ~ LA S: 33 acides aminés, 99 nucl.éotides
NC~RE DE BRINS : simple
Q~1FICCN : linéaire
TYPE DE N~JL~7CL~E : pirotêine
158 173
N - Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe As~n Pige Val Pro Cys Ser Ile
5' -AAA CL'~ AAC AAC GAT T'IC CAT TIC GàA GIS TIC AAC TIC GTG ~ ~C AOC P.'Ilr
176 182 186 190
Cys Ser A9n Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pn~ - C
TGC AOC AAC AAC CCN AOC TC3C TGG GCx A'I~ 'I'U"~C AAA C~T A'IC CCN - 3'
~fcrmation pour la S~7Q m N0 : 8 G'lb
TYPE DE SD: acides aminés et r:ucléotides
It DE LA SD~~ : 33 acides aminés, 99 rnzcléatides
NC~RE DE BRIUS : simple
CE~1F'IC~ktP.TICN : linéaire
TYPE DE M~LDCiJLE : prntéirbe
173 176
N - Lys Pro h~s As~ Asp Tyr His Fhe Glu Val Phe A~ Aie Val Pm Cys Ser Ile Cys
Gly
5' - ApA fJT AAA GRT GAT T~tC CEC TIç G7.1A GIG TIC AAC TIC GIG O~ ~ FL3C A'IC
3L~C G~
182 186 190
Asn A~ Gln Leu Cys Lys Ser 11e Cys I~rs ~ Ile Pro - C
AAC ApC CFG CIG TG~ AAA PG~ AZC ~ A~1A ~ ATC OT - 3'
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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3
L-ifornnaticn pour la SDQ ID NO : 9 G8a
TYPE DE SD: acides aminés et nuclêotides
L~C~'t DE LA SE1~IJENCE : 43 acides aminés, 129 nucléotides
NC~RE DE SRINSS : simple
Ct~TFIC'~ATICl~1 : linéaire
TYPE DE M~LECt~.~E : plrotéine
173 176
N - Lys Pro Agn Ain A~p I~ I~ Ft:e Glu Val Phe A~ Plie Val Pzo Cya Ser Ile Cyg
Ser
5' - AAA aT ~i~AC J4FC GAT TIC CCT TI~ G0. C1IG TI~ AF~C TIC GIG OT TCCIr
)1C3C ATC TC~ M3C
182 186 197
A~ P.sn Pro 'Ihr Cys Trp Ale Ile Cys Lys Azg Ile Pm A~ Lys Lys Pro Gly Lys Iys
Zhr
AAC A~1C QT~ ~ 2ï'~ 2C~ C~G ATC 'Iï~ AAA Qsi' A'1C QT AAC AAA J4AA ~ CI:,1C
AAA AAA ~
200
~' 'Ihr - C
PS 14~ - 3'
Irifo~naticn peur la SDQ 1D N0 : 10 G8b
TYPE ~ S~~ : acides aminée et nucléotides
L~k.'CØZ DE L~ SD: 43 acides am;x:és, 129 nucléotides
NC~RE DE HR'~S : simple
ûNFIC~ktATICN : lir:éaire
TYPE DE NDLFX.'L~E : p~r~téine
158 173 176
N - ~ ~ ~ ~P ~P ZYr'~ Phe Glu Val F~he Asn Phe Val Piv Cys Ser Ile Cys Gly
5' - AAA QT AAF1 G'AT G7.1T ThC CAC TIC GP~A GIG TI~ ApC TIC GIG CJJC 'IDC ~
AT~ TOC Q~
178 182 186 l9g
a~ A~ Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Ztsr Ile Pro Ser n~ Lys Pro Lys Lys Lys
Pro
~c sac c~ cic ~ ~ x~ ~c ~c ~ soc azc a~ x~ arc ,~a mc ~ ~ ~ o~c
200
Zhr Ile - C
AOC A'IC - 3'
Iafa~aatiai pour la SDQ ID N0 : 11 G9a
TYPE DE SES : acides aminés et rnlcléotides
LDE LA SD: 15 acides aminés, 45 nucléotides
N~tE DE ~ : simple
C~NFIQ7~ATIC~1 : linéaize
TYPE DE N~ : plvtéine
190 204
N - Pro Asn Lys Lys Pzro Gly Lys Lys Ttlr Thr 'Iizr Lys Plro Thr Lys - C
5' - CCN AAC .'~AA AAA ~ C~C~C AAA AAA. ACE A~ AOC AAA C'CZ3 ACC AAA -3'
Ihfoa~atian pour la SDQ m NO : 12 G9b
TYPE ~ SD~C1E,'NC'3J : acides aminés et nucléotides
LCrIG(~(kt L~ LA : 15 acides aminés, 45 nucléotides
NDE BRINS : simple
FEUILLE DE REMPLAÇ~M~N'~ (REGLE 2fi)
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4
O~1F'IC~tATICN : linéaire
TYPE DE M~LDCIJLE : protéine
190 204
N - Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn - C
5' - CCN P~OC AAC AAA C1'~ AAA AAG AAA CGs ~1C~ ATC AAA CtT ACC AF~C - 3'
~foa~,tian pour la SDQ m NO : 13 Cxll.a
TYPE DE SD: acides aminés et nucléotides
L.''I7R ~ LA : 13 acides aminés, 39 nucléotides
NC~RE DE HR~S : simple
0.'âsF'IC~ATTCi~1 : linéaire
TYPE L1E NIaL~E : protéine
164 176
N - His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys -C
5' - CAT TIC GAA GIG TIC AAC TIC GTG CCN 'IC3C ACC ATL ~ -3'
Ihfo~ation pour la SnQ m NO : 14 ~ll~Ca
TYPE ~ SD: acides aminés et nucléotides
II7E LA 1CE : 13 acides aminés, 39 nuclëotides
NC~~2E DE BIt~S : eic~ple
O~TFIQ.k~ATI~1 : linéaire
'TYPE DE NDI,~X~E : protéine
164 176
N - His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys -C
5' - CAT TIC GAP. GIG ThC AAC TIC G'I~ (33J AGC AOC P.TC TC3C -3'
Tnfca~ticn peur la SDQ TD NO : 15 G2a1
TYPE DE SD~I~ : acides amir~,s et nucléotides
Ikt I7E LA SE7: 101 acides aminés, 303 nucléotides
NC~,RE DE BRAS : simple
C~1FIC~)RATICi~1 : linéaire
TYPE DE NDLEGLIGr : protéine
~o
N - ~r Val Lys ~ Lys A~1 Trx ~ 'mr 'mr Gln Thr CsLn Pro Ser Lys Pro ~r Zhr Lys
5' - POC GIG J4AA ACE AAA AAC Fl'~ AcT FL~ ~ CàG ~ C~G OT Pte AAA US PLZ i~
AAA
250
Gln Atg GLn A9n Lys Pm Pso A~ Lys Pro Asn A~ Asp Fhe Füs Phe Glu Val Aie Asn
Plie
c~c~ra~»cr~a~ac~~c~o~~c~cc~~c~~c~cr~T~~cTTc
171 173 176 182 186 191
Val Pm G~s Ser Ile Cys Ser Aga A~ Pm 'Ihr Cys ZYp Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pm
Ser
GIG OT Tt.~' » ATC 'IC~C J~OC 74~iC RAC QT P~ 'ILS '1~, (~1T A1C Zi3C AAA QTa
AZC aTa FOC
192 195 198
A~ Lys Pm Zys IFS Lys Pxn T~ ~ hys Pm ~r Zys Iys Ps~ ~ phe Lors 'll~ 71~r Lys
AAC AAA QT AFG AAA AAA QT, ACr; Plx AAA 0.~ 7~ A~1A 7~1A ~ ~ TtC A~1A ALE Af~
AAA
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 2ô)
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2L' 230
Lys Asp Hi9 Lys Pro Gln Zhr Zhr Lys Pro Lys Qu Val Pro Zhr Zhr Lys Psv - C
AAF~ G4T CAT AAF1 nT., CAG ACE ACE AAi.1 C1~T, A~4A C~1A GIr QT l~ 1.1C'Zr AAA
CrT - 3'
Ihf~ticn pour la SEQ m NO : 16 C~32a2
TYPE DE STE : aCldes anLl~S et nuCléOtlde9
L~JECk~ DE LA SD: 101 acides aminés, 303 nucléotides
NC~RE DE 8R'~S : simple
ü,NF'IC~IC7I~1 : linéaire
TYPE DE M~LDCL~E : protéine
130
N - Thr Val Lys 'Ihr Lys Agn Thr Thr Zhr Zhr Gln 'Ihr G1n Pro Ser LYs Pro Zhr
Zhr Lys
5' - ALZ G'IG AAA ~ AAA AAC ~ ACG ACE AGC CPG ACC C~GG fJT P13C AAA CvT, 7iC'
l~ AAA
150 157 160 161 163
Gln Azg Qn Asn Lys Pro Pm Lys l.~ys Pro Lys Asp A9P ~'r' His Phe Glu Val Phe
Agn F~he
CPG ~T CFG AAC AAA CT ~ AAA AAA QT, AAA LAC GAT ~1C CAT TIC C~AA GIG Tir AF~
TIC
171 173 176 182 186
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Ain Asn Pro ~ Cys Tip Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pro
A~
GIG Q3; ~ FL~ A'IC TOC PL~C AAC AAC ~ l~ TDC TC~G C~7G ATC TC~ AAA Q~T AZC Of~
AAC
192
Lis Lys Pro Gly Lys Lys Thr ~' 'Ihr Lys Pzo 'll~ Lors Lys Pro Tt~' Phe Lys 1hr
Thr hys
AAA AAA ~,a C~ AAA AAA l~ ACTa Ff.~ AAA ~, l~ AAA J4AA CTïâ ~ TIC AAA ~tOC PQ
AAA
213 230
Lys Asp iLis L:ys Pro Gln T~ ~r Lrys Pra hys Glu Val Pro 'Its ~ Iys Pro - C
Ai~A G4T CAT AAA C4C"a CpG Pû: ACT' iWA QTi ApJ4 G~1A GIG OT'i N.I~ 7~ ~1AA 0T
- 3'
?nfo~ti~ pour la SDQ m NO : 17 Qa3
TYPE DE SD~(7FNCE : acides aminés et nucléotides
L~C'~Ckt DE LA SDQL~ : 101 acides aminés, 303 nucléotides
IVRE DE BRAS : simple
CJSTFIC~RATICN : linéaize
TYPE DE N~ : plrotéine
130
N - Trir Val Lys ~ Irys Asn Thr ~ Tla 'Ihr Gln ~r Gln Pro Ser Lys Pm Tts 'üsr
Lys
5' - P~ GIG J4AA I~ AW~1 AAC ~ 74~ L1CC AC' CFG ~ CpG QT l~ AAA OT, l~ AI>r
AAA
150 157 I60 161 163
G1n Azg Gln A~ Lis Pro Pro hys Ifs Pro Lys A9p Asp Tyr His Phe GLu Val Phe A9n
Phe
CPG Q;T CAG AAC A~1A OT OT AAA AAA OT, AAA CEC GAT 7~1C CAT TIC C~1A GIG TIC
ARC T1C
171 173 176 182 186 19I
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Tlzr Cys Tip Ala Ile Cys Lys Axg Ile
Pro Ser
GIG OS TC~ l~ AT~ TL~ FL~ AAC AAC aT 7àCC TL~ 1L~ OT ATC ~ AF~A Q~T ATC OT PLI
192 195 198
A~ Lys Pro Lis Ifs Lys Pro 'Ihr' ~' Lt~s Pro 'ü~ Iys L:ys Pro ~ F~he Rys ~r
T1~ Lys
ATaC AAA QT A~ AF~i.1 A~4A 0.'G ~ ~ 1~1A OT 7~ ACP. AAA QT, l~ TIC 3WA ~ 3~
A~4A
213 230
hys Asp His Lys Pro C~ln 2hr Thr Lrys Pro Iys Glu Val Pro ~ T>~ Lys Pro - C
AAA G4T CAT AAA C1T CAG PLT FROC AAA CCT AAA C~AA GTG OT äCC I~ AAA OT - 3'
FEUILLE DE REMPLACEMEf~T (REGLE 26)
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Tnfau~ation pour la SDQ m NO : 18 G9v
TYPE DE SD~t.IEI~CE : acides aminés et nucléotides
L~1EUR DE LA S~UEI~C'~ : 15 acides aminés, 45 nucléotides
NC~RE DE BRINS : sitrple
a~LVF'zc~ATrc~1 : linéaire
TYPE DE M~L~CL~E : protéine
190 204
N - Thr Glu And Ala Piro Ser Azg Ala Fzo Thr Ile Thr Leu Lys Lys - C
5' - ACE GAA AGA GC'A CC'A F~C~C AGA GC~. COP. ACE ARC AGC C'IC AAA A~1G - 3'
I~afa~natian pour la SDQ In N0 : 19 GSv
TYPE DE SES : acides aminés et rmcléotic~es
~JEUR DE LA ~NC~ : 16 acides amir~s, 48 nucléotiâes
NC~RE DE BRII~iS : simple
CCB~'IC,~ATICi~1 : linéaire
TYPE DE Nt~LECULE : peptide
144 159
N - Arg Lys Pro Pro Ile Asn Pro Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Asn His - C
5' - AGA AGA CC~1 C~'A ATT AAT CrA ~ 0.1 .àGC ATC aA GCA GAA A~ CAT - 3'
Iynfo~ation pour la SDQ m N0 : 20 G4A
TYPE DE : aciàes aminés et nucléotides
I~JDUR DE LA SE~I,IEt~ : 17 aciàes aminés, 42 nucléotides
NC~RE DE BRAIS : single
Q.NF'IC~AT"ICN : linéaire
TYPE DE NDL~7CULE : peptide
171 173 176 182 186 187
N - Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Tizr Cys Tzp Ala Ile Cys Lys - C
5' - GIG CCN 'Ir~IC FOC ATC 'IGC AOC AAC AAC CL~ AGC ~GC 'IC3G GCG ATC TC3C
AAA - 3'
ISnfo~maticn peur la SDQ m NO : 21 G4B
TYPE DE SD: acides aminés et nucléatides
ICNC'~7~,~lJR DE LA : 17 acides aminés, 42 nucléotides
NC~tE DE BRINS : sitrple
0~1F'IC~'.>RATIC~I : linéaire
TYPE DE NDLDC~E : peptide
171 173 176 182 186 187
N - Val Pzro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys - C
5' -GTG CnC ZC3C 1~('~C A1~ 'InC 03C A~1C AAC CAG CIWC~C AAA PGC ATC 'I~C AAA -
3'
FfUILLE QE REMPLACEMENT (REGLE 26)
CA 02296736 2000-O1-14
WO 99/03987 PCT/FR98/01570
7
lüfaamti.cn peur la SDQ m NO : 22 G4V
TYPE DE SDE : acides aminés et nucléotides
I.ZJR DE LA : 17 acides aminés, S1 nucléotides
N~BRE DE BRINS : single
Oâ~TF'IC~tATICN : linéaire
TYPE DE Nt~L~X.,ï~E : peptide
171 173 176
N - Val Pm Cys Ser Thr Ces Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser ~u 186 187
S' - GTr CJC~ 'IGC AGT ACA 'IGT GAA CCT AAT CIT GC~1 TAC TTA TC~1 C'IC ZL;C
C~1T - 3'
FEüILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
