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WO 99/06547 PC'T/FR98/Ot704
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PRODUITS DE TfIERAPIE GÉNIQUE ET PROTÉIQUE DE LA MUCOVISCIDOSE ET INDUCTEURS
D'UNE FONCTION
DE GLUTATHION-S-TRANSFERASE
La mucoviscidose, aussi parfois dénommée fibrose kystique, est
réputée causée par des mutations dans le gène codant pour la protéine
dite CFTR, selon l'abréviation de l'expression anglaise « Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator » (Régulateur de la conductance
transmembra-paire de la Fibrose Kystique).
io La séquence nucléique codant pour cette protéine CFTR qui
comporte 1480 résidus d'acides aminés, a été clonée et identifiée par
Riordan J.R. et al., « identification of the Cystic Fibrosis Gene: Cloning and
Characterization of Complementary DNA » (1989) Science 245:1066-1072.
La séquence codante pour la protéine CFTR est également reproduite
dans la figure 1 de la demande PCT W0/9102796 rendue publique le 7
mars 1981 et dont Riordan lui-même est aussi l'un des co-inventeurs. Cette
demande PCT -et d'autres qui ont suivi- décrivent effectivement le
clonage de la séquence codante et son expression dans un certain nombre
d'organismes.
2o Selon une hypothèse récurrente dans fa littérature scientifique,
la protéine CFTR normale posséderait une fonction dite « canal chlore » ou
« canai à ions chlorure », en d'autres termes réglerait des transferts
d'anions, plus particulièrement d'ions chlorure (CI-), hors des cellules
épithéliales, vers l'extérieur, sous l'effet de sa phosphoryiation par une
?s protéine kinase dépendant de l'AMP cyclique (CAMP) ou protéine-kinase C
. (Riordan, J.R. et al. (1989) Science 245:1066-1073 ; Frizzell, R.A. et al.
(1986) Science 233:558-560 ; Welsh, M.J. and Liedtke, C.M. (1986) Nature
322:467 ; Li, M. et aI. {1988) Nature 331:358-360 ; Hwang, T-C. et al.
{7989) Science 244:1351-1353).
3o A 37°C, la protéine CFTR passerait aussi du réticulum
endoplasmique à l'appareil de Golgi, et de là dans la membrane plasmique
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comme rappelé par Ko et al., (1997) Biochemistry 36:5053-5064, qui
renvoient eux-mémes à des auteurs antérieurs.
De nombreuses mutations de la CFTR ont été observées chez
des patients atteints de mucoviscidose.
s Des études épidémiologiques effectuées dans des populations atteintes
ont révélé dans approximativement 70% des cas une mutation CF
(abréviation de l'expression anglaise « Cystic Fibrosis ») ou délétion des 3
nucléotides codant pour le résidu phénylatanine à ta position 508 de la
séquence en acides aminés de la CFTR. Le site de cette mutation se
io trouverait localisé plus particulièrement dans la région dite NBF1
(abréviation de l'expression anglaise « Nucleotide Binding Fold I » (ou
Région repliée de nuciéotides)) qui contiendrait le premier domaine de
fixation de l'ATP dans CFTR et qui, selon Ko et al. déjà cité s'étendrait du
résidu Phénylalamine 433 (P433) au résidu Sérine 589 (S~gg). Cette
is mutation est souvent tenue pour responsable d'un défaut de repliement du
domaine NBF1 dans les cellules alors CF-défectives des patients, défaut
qui entraînerait un blocage de la CFTR ainsi mutée (dénommée OF508)
dans les organelles intracellulaires (golgi, reticulum endoplasmique), puis
sa destruction avant qu'elle ait pu achever sa maturation post-
2o traductionnelle. Et c'est bien la déficience de la fonction « canal à ions
chlorure » que vise à détecter le test dit « de la sueur », qui mesure la
sécrétion du chlore dans un liquide biologique issu du patient concerné, à
l'appui d'un diagnostic de la mucoviscidose.
La corrélation souvent faite entre des phénomènes cliniques
2s observés chez nombres de malades et les mutations observées dans le
gène codant pour la CFTR, est à l'origine de l'une des voies déjà
proposées pour le traitement de ta mucoviscidose, en l'occurrence la voie
fondée sur la thérapie génique, aux fins de transférer un ADN codant pour
une CFTR « intacte » dans les cellules sous une forme permettant alors
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son expression r~éme dans des cellules CF-défectives, en particulier dans
les cellules épithéliales des voies respiratoires des patients.
Ainsi des essais mettant en oeuvre un complexe d'ADN codant
pour la CFTR et de lipides cationiques ont-ils été administrés à des souris
a par voie intra-trachéale aux fins d'obtenir leur admission directe dans les
poumons {Yoshimura et al. « Nucleic Acid Research, 20:3233-3240, 1992)
ou encore par aérosol, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11277-
11281, 1992). On a égaiement constaté que l'administration du gène
codant pour la CFTR complexé avec des lipides cationiques à une souris
io modèle souffrant de mucoviscidose, avait pour effet la correction du défaut
de la fonction du canal à ions chlorure (Hyde et al., Nature 362:250-255,
1993).
II a aussi été proposé, par exemple dans les demandes
internationales WO 95/13365 et WO 96/13598 d'induire l'expression dans
i~ les cellules CF- des patients à traiter, d'un gène CFTR entier apporté de
l'extérieur, ce gène ayant au préalable été incorporé sous le contrôle
d'éléments de régulation appropriés dans des vecteurs, par exemple des
adénovirus ou rétrovirus génétiquement modifiés, de préférence défectifs
mais encore capables d'infecter ces cellules, d'y transférer le gène CFTR,
Zo celui-ci étant alors apte à s'y exprimer sous le contrôle des susdits
éléments de régulation.
Ces méthodes se révèlent en général sinon inefficaces, à tout le
moins insuffisantes. Mais comme le remarquent les auteurs de ia demande
PCT WO 95/25796, les vecteurs viraux de ce type ne peuvent héberger ou
2s empaqueter que des gènes étrangers ou exogènes de tailles restreintes,
au plus 4,5 Kb. Or l'ADN codant pour la CFTR naturelle atteint cette taille
limite, ce qui en rend l'expression aléatoire dans les cellules infectées,
sous le contrôle des promoteurs viraux correspondants.
A cette difficulté s'en ajoute une autre apparemment majeure, à
3o savoir la faible solubilité du produit d'expression dans le milieu
cytoplasmique des cellules en cause. S'y ajoute enfin le caractère
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wo ~io6sa~ Pcr~9sromo4
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vraisemblablement immunogénique des produits d'expression à hauts
poids moléculaires éventuellement formés.
Aussi, les auteurs de la demande WO 95/26796 ont-ils proposé
de remplacer le gène entier par un gène tronqué d'une partie significative
de ia région C-terminale de la CFTR, sous réserve cependant, que la
suppression de cette région C-terminale ne s'accompagne pas de la perte
des propriétés biologiques du type canal à ions chlorure, caractéristiques
de la CFTR humaine naturelle, ou encore des propriétés fonctionnellement
analogues de la CFTR entière recombinante.
io Selon les auteurs de La demande, une protéine tronquée
recombinante encore susceptible d'exercer ses fonctions doit normalement
comprendre
- la séquence MSD (abréviation de l'expression anglaise « Membrane
Spanning Domain » ou « Domaine s'étendant à travers la membrane »)
n qui s'étend approximativement entre les résidus acides aminés 76 à 360
(à compter du résidu N-terminal de la protéine CFTR),
- le domaine MBD1 (abréviation anglaise de l'expression « Nucleotide
Binding Domain-1 » ou « domaine nucléotidique de fixation-1 ) -ou
NBF1- qui s'étend approximativement du résidu 360 au résidu 708 de la
zo CFTR entière, et enfin
- le domaine régulateur R qui s'étend approximativement des résidus
aminoacides 590 à 830 de ia CFTR, ce domaine étant réputé assurer,
au repos, la fermeture du canal à ions chlorure et son ouverture sous
('effet d'une phosphorylation par la protéine kinase cAMP-dépendante
ou protéine kinase C.
En particulier une protéine recombinante comportant les 884
aminoacides N-terminaux de la CFTR exercerait encore les fonctions
requises de canal à ions chlorure et de régulateur de l'ouverture et de la
fermeture de ce canal.
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Mais à supposer que l'on puisse effectivement obtenir une
meilleure expression avec de telles CFTR amputées de leurs régions C-
terminales, on ne peut manquer de constater la taille encore importante
des produits d'expression susceptibles d'être obtenus, et par conséquent
s d'anticiper la persistance d'un caractère immunogène rendant son
utilisation plus qu'aléatoire dans des essais de thérapie génique.
On remarquera aussi que cette proposition de thérapie génique,
Qui ne mettrait en oeuvre que le gène tronqué de la CFTR répondant aux
conditions décrites dans ie brevet WO 95125796, lie encore l'efficacité du
~o traitement au rétablissement de la seule fonction de canal à ions chlorure
exercée chez des sujets sains par une protéine CFTR fonctionnelle.
C'était cependant omettre que si te défaut de transport des ions
chlorure constitue effectivement une manifestation clinique souvent
observée chez des patients atteints de mucoviscidose, d'autres
is manifestations également observées restent à ce jour inexpliquées.
L'invention découle précisément de la constatation que le
traitement de la mucoviscidose passerait en grande partie par une
approche thérapeutique différente, car, comme cela a été mis en évidence
par les inventeurs, la CFTR jouerait elle-même un rôle particulièrement
2o important dans le transport actif du glutathion (GSH), de sorte que la
mucoviscidose pourrait aussi être liée de façon importante à des mutations
ou autres causes qui perturberaient la capacité de la CFTR à exercer une
fonction de transporteur du giutathion.
L'invention concerne donc des fragments d'ADN dont les
2s séquences, incluant des séquences issues du gène codant pour ta CFTR,
sont choisies parmi celles qui codent pour une fonction de transport actif de
glutathion. Et l'invention s'intéresse tout particulièrement à des fragments
de tailles plus réduites que celles des fragments d'ADN dont l'utilisation en
thérapie génique pour le traitement de la mucoviscidose a déjà été
3o évoquée dans la littérature technique ou scientifique.
C'est en effet à la faveur
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wo mo6s4~ rcr~t9aromoa
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- d'une part, de fa découverte de propriétés particulières d'un polypeptide
de fusion contenant une partie de la séquence de la CFTR, qui avait été
produit dans le cadre d'études visant à l'étude de la structure
tridimensionnelle de la séquence codant pour le domaine NBF-1, et
- d'autre part, d'observations relatives à une amélioration clinique durable
des symptômes liés à ia mucoviscidose chez un patient également
cancéreux traité par une chimiothérapie, qui s'était accompagnée d'une
surexpression de fa protéine dite MRP (abréviation anglaise de
Multidrug Resistance Associated Protein » (Protéine associée à une
~o résistance aux drogues multiples)),
que les inventeurs ont été conduits à la découverte, qui est à la base
même de l'invention.
L'étude de la structure tridimensionnelle de la séquence codant pour
le domaine NBF1 -en particulier aux fins d'étudier l'effet de la mutation
is oF508 présumée responsable du défaut de repliement de la CFTR dans le
domaine NBF1- impliquait l'obtention préalable de quantités importantes
de protéine pure, soluble et stable (quelques dizaines de mg). De telles
quantités n'étant pas accessibles par purification de la protéine naturelle,
les inventeurs avaient donc entrepris de produire NBF1 (dans sa définition
2o initiale) par clonage dans un système d'expression vivant (E-colis, sous
forme d'une protéine de fusion avec la GST (Glutathion-S-Transférase). Ce
2~
choix avait initialement pour but d'utiliser la capacité de reconnaissance
spécifique de glutathion S-transférase par le glutathion pour purifier la
protéine recherchée (GST-NBF1 ) de l'ensemble des protéines
bactériennes. A cette fin, une séquence issue du gène de la CFTR
(séquence 8450-1586) et contenant la séquence de nuciéotides codant pour
la séquence NBF1 a été insérée dans un plasmide Dermettant ia
transformation de bactéries E.coli et l'expression dans celles-ci de ia
séquence d'insertion dans les bactéries transformées, par exemple un
3o plasmide du type pGEX-I<'T. La mise en culture de la souche de E.coli ainsi
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transformée a effectivement conduit à une surproduction d'une protéine de
fusion de la NBF1 et de la glutathion-S-transférase (GST). Les rendements
obtenus étaient de 5 mg/l de culture. La protéine soluble obtenue a été
séquencée. Elle a été reconnue par les anticorps anti-NBF1 et fixait
également l'ATP. Une coupure à la thrombine a permis de préparer les
domaines NBF1 libres qui présentaient les mémes caractéristiques.
Cependant, il n'est pas possible de séparer la GST et le domaine NBF1
sur colonne d'affinité greffée avec du glutathion (GSH) : bien que
parfaitement séparées sur gel d'électrophorèse, les deux protéines NBF1
~o et GST co-éluaient sur colonne de GSH immobilisée.
L'activité de la protéine de fusion a été vérifiée par fluorescence:
une affinité pour un dérivé fluorescent de l'ATP (le TNP-ATP) a en effet été
observée.
Cependant, de multiples essais de purification du domaine
m NBF1, isolé de la GST, par clivage à la thrombine sont:restés infructueux.
Par ailleurs, la protéine GST-NBF1 a pu être clivée sélectivement et
quantitativement, mais le domaine NBF1 seul s'est alors révélé être
instable. il avait une forte tendance à former des agrégats.
Ces résultats ont conduit les inventeurs à reconsidérer ou
2o réévaluer la définition du domaine NBF1, tel qu'il avait été décrit par
Riordan. En effet, la définition d'un domaine doit correspondre à une entité
stable, caractérisée par un repliement propre codant pour sa fonction, et
dont la stabilité est indépendante de la protéine complète (ici CFTR) à
laquelle ce domaine appartient. Pour assurer ce repliement, les limites
Zs choisies pour NBF1 doivent contenir l'ensemble des éléments de structure
secondaire (hélices et feuillets) nécessaires à la stabilisation du domaine
dans sa conformation native.
Cr, la CFTR appartient à la famille des transporteurs ABC (ATP
Binding Cassette) qui forment l'une des plus grandes familles de protéines
3o membranaires (A11.96), retrouvées tant chez les eucaryotes que chez les
procaryotes. Ces protéines sont en général des transporteurs actifs qui
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hydrolysent l'ATP pour fournir le potentiel chimique nécessaire au
transport. Chez ies eucaryotes elles transportent des molécules (ions,
vitamines, peptides, sucres, drogues, etc... ) à travers toutes les
membranes. Leurs organisations globales présentent des caractères
communs : régions (TM) qui participent à la sélection de l'entité chimique à
transporter, et domaines de fixation des nucléotides. Ces gènes sont
souvent issus de la fusion entre deux c< demi gènes ». La topologie globale
est alors: (TM1 )-(NBF1 r(TM2}-NBF2). Et de fait, la CFTR appartient plus
particulièrement à la sous famille CFTR/MRP, et possède une similarité de
lo séquence d'environ b0 % avec la protéine MRP humaine (Multi-drag
Resistance associated Protein). Elle est égaiement très proche de la
protéine YCF1 (Yeast Cadmium resistance Factor 1 ) qui confère à la levure
Saccharomyces cerevisiae la résistance aux ions cadmium (Tom.96). Dans
une moins grande mesure elle est également proche de STE6 (de la sous
is famille MDR/TAP) et qui transporte la phéromone «'facteur a » chez .la
levure Saccharomyces cerevisiae (Tom.93), et de MDR humain (Mufti-drag
Resistance protein), ou encore l'ATPase-F1 de boeuf, seule protéine de
structure connue dans la famille des ABC protéines (Abr.94).
Et c'est parce que la structure de l'ATPase de boeuf est connue
2o que les inventeurs ont choisi ses domaines NBF en tant que structure de
référence pour la réévaluation également du domaine de la NBF1 de la
CFTR. II est découlé de ce choix, discuté dans deux publications récentes
(Ann.97a, Ann.97b), un modèle de structure 3D pour NBF1, construit par
homologie avec la structure de l'ATPase-F1 de boeuf, méthode
2s développée dans (Pat.96), permettant entre autre
_ 1. de rendre compte du phénotype lié à la mutation OFb08, contrairement
aux modèles précédents (Hyd.90, Mim.91 ) ;
2. de rendre compte du rôle clé de la séquence consensus i_SGGQ, très
conservée dans fes protéines ABC ;
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wo ~io6sa~ rcrrnR9sromoe
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3. de redéfinir les limites du domaine NBF1 -ci-après « NBF1 revisité »-
qui est désormais considéré comme s'étendant approximativement du
430e résidu d'acide aminé jusqu'à approximativement le résidu 650
(empiétant d'environ 70 résidus sur le domaine R, dans sa définition
s initiale) de la séquence de la CFTR.
Ce dernier point découle directement de l'hypothèse d'un
repliement comparable pour les régions NBF de l'ATPase-F1 de boeuf et
de la CFTR. L'argument principal est que la famille des transporteurs ABC
forme un groupe homogène bien distinct des autres protéines liant l'ATP,
io dont les membres sont issus d'une évolution divergente. Dans ce cadre,
ces protéines doivent présenter un repliement comparable dans leurs
régions conservées (typiquement, dans les « briques élémentaires » NBF).
II est alors licite de modéliser la structure d'une de ces protéines à partir
de
la structure connue d'une autre.
is Le modèle de structure ainsi construit pour le domaine NBF1 de
CFTR, par homologie avec la structure connu des domaines de fixation des
nuciéotides de l'ATPase-F1 de boeuf (Abrahams J.P., Jeslie A.G.W., Lutter
R., Walker J.F. (1994) Nature 370:621-628), selon la méthode décrite par
Annereau et al. (FEBS Letters, (1997) 407:303-308), comprend un coeur
2o hydrophobe constitué d'un feuillet ~ à 6 brins parallèles, respectivement
L453-5456 N505-5511 ~ N538-G542~ D567-D572~ R600-V603)~ Ces feuillets
alternent avec 6 hélices a s'organisent de part et d'autre du plan moyen du
feuillet ~i central, comme montré dans l'article de FEBS Letters, Vol. 407,
pp.:303-308, 1997. Des boucles situées en surface du domaine relient les
2s hélices aux feuillets.
Et de fait le produit d'expression du fragment correspondant au
gène codant pocir ta CFTR (fragment qui tait lui-même partie de l'invention)
s'est avéré stable, ce qu'accrédite les résultats du clonage dans E.coli du
nouveau » domaine NBF1 (ou domaine NBF1 revisité),_ dans F.coli en
3o système polyhistidine, c'est-à-dire d'un ADN de fusion codant pour le
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domaine « NBF1 revisité » (c'est du fragment codant pour ie polypeptide
s'étendant de 448e au fi50e résidus d'acides aminés de la CFTR) et une
queue ne comportant que 6 résidus histidine (on peut considérer alors qu'il
est produit « seul »). Les taux de production obtenus sont notoirement plus
s grands que sur le fragment précédent, atteignant pour le système
polyhistidine environ 200 mg par titre de culture (dès le premier essai,
avant toute optimisation). Ce fragment purifié « NBF1 revisité » a été purifié
en quantités massives, sous forme d'une protéine soluble et stable.
L'existence potentielle d'un site de fixation du gfutathion dans
lo NBF1 de CFTR pratiquement superposable au site de fixation du glutathion
dans la GST est mise en évidence par comparaison de ce modèle avec la
structure connue de ia GST (Glutathion-S-Transférase), protéine qui
présente un site de fixation du glutathion et qui catalyse les réactions
d'attaques nucléophiles du glutathion. Les résidus de NBF1
is potentiellement impliqués dans la fixation du glutathion se situent dans
une
région formant une crevasse aux extrémités de brins impliqués dans un
feuillet ~ (voir l'article de FEBS letter). Ces résidus sont situés plus
précisément dans des boucles, aux extrémités N-terminales des feuillets 1
à 4 de la structure de NBF1. Ces boucles contiennent les résidus I~g-Q4~2
(IERGQ), S4~g-K4g~ (SEGK), M4gg-1506 (MPGTIKENI), A~ss-L5sa
(ADLVL), A5gg-T~gg (ANKT).
La nouvelle définition de NBF1 et le modèle de structure 3D
construit, ont permis aux inventeurs de proposer une nouvelle fonction pour
CFTR, suggérée par le fait inattendu que NBF1 est retenu sur colonne de
2s glutathion, même après clivage de ia protéine de fusion GST-NF1. En effet,
la comparaison de ce modèle avec la structure 3D connue de la GST,
protéine qui présente un site de fixation du glutathion et qui catalyse les
réactions d'attaques nucléophiles du glutathion (Lim.94), rnet en évidence
la présence d'un site de fixation potentiel du glutathion.
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Des informations fonctionnelles portant sur tes deux protéines
ABC les plus proches de CFTR (MRP humaine et YCF1 de la levure)
semblent conforter cette hypothèse. En effet, il est maintenant établi que
t~IRP exporte les drogues par l'intermédiaire du glutathion, soit sous forme
d'adduits directs « glutathion-drogue », sait par fixation simultanée ou
séquentielle du glutathion et de la drogue (Zam.95). De même, YCF1
transporte les ions cadmium sous la forme de doubles adduits du
glutathion. Ainsi, il semble que CFTR puisse être une « pompe à
glutathion », comme MRP et YCF1.
lo Or les protéines MRP et MDR humaines sont impliquées dans
les phénomènes de mufti-résistance aux drogues anti-tumorales (Dean et
al., Current Opinion in Genetic & Development 5, 779-785, 1995). Ces
protéines sont capables de transporter activement ces drogues, participant
ainsi aux mécanismes de détoxification de la cellule. Leur surexpression
1~ est induite par les drogues elles-mêmes, ce qui constitue la principale
cause d'échec des traitements des cancers par chimiothérapie. Or il a été
montré récemment que la surexpression de CFTR pouvait également être
déclenchée par des drogues anti-tumorales, et qu'elle conférait le
phénotype de multi-résistance (L1.95).
?o De là découle aussi l'hypothèse formulée par les inventeurs que
la fonction de transporteur du glutathion pourrait être importante et que des
mutations susceptibies de la perturber expliqueraient également nombre de
symptômes de la mucoviscidose. Le rôle de CFTR comme « pompe à
glutathion » (en plus de son rôle connu de canal chlore) permet aussi une
2s compréhension plus globale de la mucoviscidose (Sto.97).
Un déficit de la fonction de transport du glutathion rendrait aussi
mieux compte des réactions inflammatoires chroniques et/ou le nombre
très élevé de polynucléaires Que l'on rencontre souvent dans les voies
respiratoires des patients atteints de mucoviscidose, puisque l'on sait que
30 le glutathion joue un rôle central dans le contrôle de la réaction
inflammatoire en protégeant les cellules de l'agression des radicaux fibres
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par les poiynuc'éaires neutrophiles et, en outre, qu'if intervient dans la
protection vis-à-vis des oxydants tels que les radicaux libres ou les hyper-
oxydes.
De la même façon, ce sont les organes dans lesquels le
s glutathion est normalement sécrété et dans lesquels il exerce une fonction
de détoxification (poumons, intestins, colon) qui sont en général gravement
affectés par la mucoviscidose.
Un certain nombre d'observations cliniques concordent avec
l'hypothèse qui est à ia base de l'invention. Le taux de GSH est en effet
io abaissé dans le sérum et le mucus bronchique des sujets atteints de
mucoviscidose. Les organes où CFTR est exprimée ie mieux sont ceux où_
la GSH joue un rôle important et est transportée activement : pancréas,
poumon, foie, rein. La fonction hépatique détoxifiante apparaît altérée,
fonction dans laquelle la GSH pourrait jouer un rôle central. Ceci se traduit
is par exemple par une sensibilité particulière des malades à un métal lourd
comme le mercure. Des phénomènes de stress oxydatif sont également
observés depuis longtemps au niveau pulmonaire. La N-acétyl cystéine,
médicament utilisé avec profit pour les patients, est désacétylée en
pénétrant dans la cellule, fournissant ia cystéine (acide aminé semi
2o indispensable chez l'homme).
Et de fait ia validité de l'hypothèse trouve d'ores et déjà une
confirmation dans l'amélioration durable qui a été constatée au plan de la
mucoviscidose chez un malade, âgé de 29 ans, porteur de mucoviscidose
(avec signes cliniques depuis la naissance). Le malade traité présentait
2s l'exon 12 de CFTR sur un allèle et, G673X, située dans l'exon 13 sur
l'autre
allèle. Ce malade présentait, depuis sa naissance en 1968, tous les signes
cliniques associés à la mafadie : tests de la sueur positifs, sinusites
répétées, bronchites répétées, polypes de la fosse nasale etc... En 1989 il
a présenté une infection à Pseudomonas aeruginosa, classique dans la
3o mucoviscidose et habituellement pratiquement définitive chez ces malades.
En outre, en avril 1993, un fibrosarcome de la cuisse gauche a été
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diagnostiqué. Le malade a subi un traitement chirurgical et radiothérapique
puis une chimiothérapie de juillet à octobre 1993, suivis d'un nouveau
traitement en janvier 1994.
Plus particulièrement le traitement anti-tumoral a été le suivant
- épirubicine, 110 mg pendant deux jours (J1 et J2) ;
- ifosfamide, 3,3 g pendant cinq jours (J1 à J5) ;
- Filgrastime, 300 p.g par jour pendant huit jours (J8 à J15) ;
sous couvert de
- granisétron, pour la prévention des nausées ;
lo - Méthylprednisolone ;
- Mesna.
Trois mois plus tard, le malade a reçu à nouveau six cycles
épirubicine et ifosfamide.
Le traitement anticancéreux a été efficace. Concernant aussi le
ls tableau clinique de ~ la mucoviscidose, à la suité du traitement
chimiothérapique, on a observé les améliorations suivantes
- l'état respiratoire du malade s'est amélioré considérable-
ment ;
- son infection par Pseudomonas aeruginosa a disparu
20 - ses paramètres respiratoires atteignent environ 75 % des
valeurs théoriques ;
- il a recouvré un état respiratoire à peu près équivalent à celui
qu'il présentait au début de son adolescence ;
- il se déclare lui-même guéri de la mucoviscidose.
2s Un test de sueur effectué chez lui au début de l'année 1997
s'est révélé toujours très positif, ce qui signifie que la fonction de canal à
ions. chlon.ire n'a pas été rétabtie chez ce patient. Cette constatation, liée
au fait que le malade se déclare lui-même guéri de la mucoviscidose
permet de conclure qu'une autre fonction essentielle a été rétablie par le
3o traitement chimiothérapique. On peut présumer au vu de ce qui précède,
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que c'est en l'occurrence la fonction de transport du glutathion qui a été
considérablement accrue.
Comme cela a déjà été indiqué, l'invention vise donc plus
s particulièrement des fragments d'ADN correspondant à des parties du
gène codant pour la CFTR, ces parties codant aussi pour un polypeptide
possédant une fonction de transport actif de glutathion. Dans ce qui suit,
les séquences d'ADN sont en général définies par référence aux
séquences peptidiques qui leurs correspondent, ces séquences
io peptidiques étant chaque fois, pour fa commodité du langage,
généralement désignées par l'expression « produit d'expression » des
séquences d'ADN de l'invention. Ces séquences d'ADN peuvent
naturellement être reconstituées pair le lecteur, notamment en se fondant
sur la figuré 1 qui, pour l'essentiel, est une reproduction de la séquence du
m gène codant pour la CFTR qui a été publiée dans l'article de Riordan et al.
déjà mentionné ou encore dans la demande PCT WO 91102796.
Dans les définitions des séquences d'ADN -ou de leur produit
d'expression- qui suivent, il sera fréquemment fait référence à des régions
« en aval » ou « en amont » de la séquence d'ADN ou de son produit
2o d'expression auquel l'invention se rapporte. II apparaitra de façon
immédiate qu'une région « en amont » d'une séquence d'ADN donnée au
sein du gène codant pour la CFTR représentée à la figure 1 ou du produit
d'expression correspondant est située en amont de l'extrémité 5' de cette
séquence d'ADN ou de l'extrémité N-terminale de la séquence en acides
2s aminés du produit d'expression correspondant. A l'inverse, les régions « en
aval » sont celles qui sont situées au-delà de l'extrémité 3' de cette
séquence d'ADN ou de l'extrémité C'-terminale de la séquence en acides
aminës du produit d'expression correspondant.
Également de toute évidence, l'indication d'une lettre (dans le
3o système d'identification symbolique des acides aminés mettant en oeuvre
une lettre unique pour chacun d'entre eux) suivie d'un indice « n » fait
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référence au « n~sme » acide aminé qui découle de l'examen de la figure 1
jointe, à compter du premier résidu d'acide aminé de la CFTR.
D'une façon générale, la molécule d'ADN conforme à l'invention
la plus longue contient une séquence d'ADN dont le produit d'expression a
s une séquence peptidique en commun avec une partie de celle de la CFTR,
cette partie étant essentiellement exempte au moins de la région N-
terminale de la CFTR qui s'étend nom~alement en amont de la région MSD
de cette demiére et qui comprend, en particulier, les 360 acides aminés N-
terminaux de la CFTR, ou, en variante, toute séquence d'ADN résultant de
io fa modifcation de la précédente par délétion, substitution ou addition de
nucléotides, sous réserve que soit conservée au moins en partie ta
capacité du produit d'expression correspondant à exercer une fonction de
transporteur de glutathion.
Par « composé transporteur de glutathion », on entend selon
is l'invention, un composé qui appartient à la famille déjà répertoriée des
transporteurs ABC qui exercent leur fonction de transport par
l'intermédiaire du giutathion. On entend égaiement tout fragment ou
analogue d'un tel transporteur résultant d'une ou plusieurs mutations, qui
conserve fa propriété de transport par l'intermédiaire du glutathion.
2o On entend par glutathion, le gfutathion lui-même ou ses adduits
avec d'autres composés. II peut s'agir d'adduits naturels, tels que les
leukotriènes, ou encore d'adduits de détoxification, avec les métaux lourds,
les oxydants puissants (radicaux libres, peroxydes...); ou les drogues.
En particulier, les capacités des produits d'expression des
2s séquences d'ADN conformes à l'invention à exercer une fonction de
transporteur de glutathion peut s'apprécier par leur capacité à induire in
vitro une production de CFTR dans des cellules épithéliales, ~ par exemple
ir vitro, en mettant en oeuvre les techniques expérimentales déjà utilisées
pour apprécier le même type d'induction sous l'effet de drogues
3o antitumorales, telles qu'elles ont été décrites et utilisées par Wey L.Y.
et aI.
dans l'article intitulé « Overexpression of the cystic fibrosis transmembrane
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regulator in NIH 3T3 cells lowers membrane potential and intracellular pH
and confers a multidrug resistance phenotype » (La surexpression du
régulateur transmembranaire de la fibrose cystique dans des cellules
NIH 3T3 réduit le potentiel de membrane et le pH intracellulaire et confère
un phénotype de résistance à des médicaments multiples) ; Biophysical
Journal (1995) 69:883-898.
On peut aussi avoir recours à la mesure des proportions
d'ARNm correspondant à la CFTR dans les cellules épithéüales
préalablement prélevées dans un mammifère d'épreuve souffrant de
lo mucoviscidose, telle que la souris, à laquelle avait au préalable été
administrée la molécule d'ADN conforme à l'invention à tester, sous le
contrôle d'éléments de régulation autorisant la transcription et la traduction
de sa séquence d'ADN dans les cellules épithéliales, en particulier dans les
conditions décrites par Yoshimura et al., dans l'article identifié plus haut.
ls Les souris de type TgH (Unc), obtenues à partir de
recombinaison homologue au niveau de l'exon 10 du gène Cftr (insertion
du gène de résistance à fa néomycine) représentent un modèle intéressant
pour cette étude. Les animaux hétérozygotes ne présentent aucune
modification du phénotype. Les mutants homozygotes montrent des
2o anomalies semblables à la mucoviscidose humaine chez les jeunes souris
(Kolier B.H. et al, Science, 248 , 1227-1229). Ces souris sont des modèles
adéquats étant donné qu'elfes souffrent et meurent d'obstruction intestinale
avant mëme d'arriver à l'âge adulte, soulignant ainsi un modèle d'étude
d'exacerbation inflammatoire au niveau de cet organe.
2s Un vecteur d'expression utilisable dans ce test et adrninistrable
par voie générale, serait par exemple formé par un adénovirus de type
Av1 CF2 (Genetic Therapy inc, Gaithersbourg, MD, USA) dans lequel la
séquence codante à étudier remplacerait la séquence codante pour CFTR
entier.
3o La mise en évidence d'une expression de la fonction de
transporteur de giutathion est alors appréciés par l'accroissement des
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quantités d'ARNm induites dans les souris traitées par rapport à ce qui est
observé dans des souris mucoviscidosiques témoins non traitées, par
exemple après quantification des ARNm par rapport à une référence
interne de RT-PCR mettant en jeu le taux d'ARNm de la ~2-microgfobuüne.
s selon la méthode de Lechapt-Zaicman E. et al. décrite dans Resp. J. 1997,
« M. MDR1-PgP 170 expression in human Bronchas o (L'expression de
F.MDR-1-PgP 170 dans l'appareil bronchique humain »). De plus, les
quantités de protéines MDR étant élevées dans l'épithélium intestinal, la
transfection des mammifères épreuves cités ci-dessus par le fragment de
lo CFTR étudié devrait provoquer une résorption de l'état inflammatoire
exacerbé au niveau intestinal.
En variante, on peut également avoir recours pour définir les
molécules d'ADN de l'invention au test dont il a déjà été question plus haut.
Entre dans ie cadre de l'invention, toute molécule d'ADN répondant aux
ls conditions sus-indiquées et qui se caractérise par une conservation de
l'affinité du produit d'expression correspondant pour le glutathion, cette
affinité pouvant étre mise en évidence par la mise en oeuvre du test
consistant à cliver le produit d'expression de la molécule d'ADN en cause à
l'aide de thrombine en un fragment C-terminal et en un fragment N-
zo terminal, à recueillir le fragment N-terminal et à le mettre en contact
avec
une colonne d'affinité sur laquelle est greffée du glutathion, l'affinité
dudit
produit d'expression pour le glutathion découlant alors de ses capacités,
analogues à celles de la glutathion-S-transférase, à ëtre fixée sur cette
colonne d'activité et à en être éluée.
zs Cependant de préférence, cette molécule d'ADN est plus courte,
en particulier caractérisée en ce que son produit d'expression est
également essentiellement exempt du côté de son extrémité C-terminale
de la séquence en acides aminés de ia région de la CFTR qui s'étend
normalement en aval de la région R de cette dernière.
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II suffit même que la séquence en acides aminés du produit
d'expression de ia susdite séquence d'ADN comprenne elle-même, d'une
part et du côté de son extrémité C-terminale, la sous-séquence
d'approximativement 80 résidus d'acides aminés {qui étaient auparavant
s considérés comme appartenant à la région R et Qui désormais font partie
de la région « NBF1 revisitée ») qui, dans la CFTR, s'étend en aval de son
~70e résidu d'acide aminé et, d'autre part et dans ia direction de son
extrémité N-terminale, la région NBF1 de la CFTR, voire seulement d'une
partie de celle-ci, pour que soit retenue la capacité du produit d'expression
lo de la susdite séquence d'ADN à exercer ladite fonction de transporteur de
glutathion.
D'une façon générale, la séquence d'ADN selon l'invention
comprend donc pour l'essentiel la région de la séquence codant pour tout
ou partie de la région « NBF1 revisitée » de la CFTR qui s'étend de son
is extrémité C-terminale jusqu'au delà du site de fixation présumé du
glutathion (naturellement dans la direction de lecture inverse de fa
séquence en acides aminés de cette « NBF1 revisitée », c'est-à-dire de
son extrémité C-terminale vers son extrémité N-terminale.
Une molécule d'ADN préférée est celle dont le produit
2o d'expression possède lui-même une séquence en acides aminés qui
s'étend entre approximativement le 430e et le 660e résidu d'acide aminé de
ia CFTR.
Parmi les molécules d'ADN préférées selon l'invention, on citera
celles qui sont caractérisées en ce que les séquences en acides aminés de
's leur produits d'expression respectifs contiennent eux-mêmes, d'une part et
du côté de leur extrémité C-terminale, la séquence NLQPDFSSKLMGCDS
{N635 à S64g) de la CFTR et, d'autre part et dans la direction de leur
extrémité N-terminale, un ou plusieurs des sites peptidiques suivants
- ANKT (ASgs à T599)
30 - ADLYL (ASgg à LS~p),
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- MPGTIKENI (M4gg à l5pg),
- SEGK (S4~g à K4g~ ),
- (ERGQ (I~g à Q452)
de la CFTR.
s En particulier, la molécule d'ADN selon l'invention peut être
choisie parmi celles possédant une séquence d'ADN caractérisée en ce
que la séquence en acides aminés de son produit d'expression inclut,
d'une part et à proximité de son extrémité C-terminale, la séquence
NLQPDFSSKLMGCDS (Ng35 à S~g) et, d'autre part et à proximité de son
io extrémité N-terminale
- soit le site peptidique ANKT (ASgg à TSgg),
- soit le site peptidique ADLYL (ASgg à L5~0),
- soit le site peptidique MPGTIKENI (M4gg à ~~15p6),
- soit le site peptidique SEGK (S4~g à K4g~ ),
m - soit le site peptidique IERGQ (I~g à Q452)
de la CFTR.
Cela étant, la séquence en acides aminés du produit
d'expression de la susdite séquence d'ADN peut encore inclure, en aval du
site NLQPDFSSKLMGCDS (Ng35 à 5649) un segment de 10 à 20 résidus
2o d'acides aminés dont la séquence correspond à celle qui suit ce rnëme site
aussi dans la CFTR ou encore, à l'amont du susdit site à proximité de son
extrémité N-terminale, un segment de 10 à 20 résidus d'acides aminés qui
précède ce même site aussi dans la CFTR, ou les deux segments à la fois.
Ces segments peuvent aussi être remplacés par des ofigonucléotides de
2s (iaïson (linkers) contenant des sites de restriction facilitant leur
incorporation dans un vecteur destiné à les transférer dans des cellules
compétentes appropriées.
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wo 99io6sa~ rcr~9sromo4
D'une façon générale les ADNs préférés de l'invention sont ceux
dont les produits d'expression sont solubles dans l'eau ou dans un sénrm
physiologique, en particulier à raison d'au moins 0,5, de préférence d'au
moins 1 mglml d'eau, notamment sous forme de soluté physiologique.
s L'invention concerne naturellement aussi toute molécule d'ADN
de recombinaison, dans laquelle la séquence d'ADN telle qu'elle a été
définie ci-dessus se trouve recombinée avec des éléments d'acides
nucléiques exogènes, en particulier des molécules recombinantes codant
pour une protéine de fusion présentant néanmoins les propriétés
io biologiques essentielles, telles qu'elles ont été définies plus haut, du
produit d'expression de ia séquence d'ADN caractéristique des molécules
selon l'invention.
Une autre catégorie de molécules d'ADN conformes à l'invention
sont celles dans lesquelles les éléments d'acide nucléique exogènes sont
is constitutifs d'un vecteur d'expression, comprenant' ~ des éléments de
régulations appropriés, ladite séquence d'acide nucléique s'y trouvant à
l'état de séquence d'insertion placée sous le contrôle de ces éléments de
régulation, ceux-ci autorisant alors l'expression de ladite séquence d'acide
nucléique dans un organisme cellulaire compétent.
20 ll s'agit en particulier de vecteurs d'expression aptes à
transformer des organismes cellulaires compétents aux fins d'assurer
l'expression de la séquence d'ADN caractéristique de l'invention, le produit
d'expression pouvant ensuite, la cas échéant, être récupéré à partir des
cellules en culture, voire même à partir du milieu de culture. II va de soi
que
2s l'invention ne saurait être limitée à des vecteurs modifiés par la séquence
d'ADN selon l'invention qui ne seraient utilisables qu'à des fins de thérapie
génique. Elle étend également ses effets à tout autre forme de vecteurs
susceptibles d'ëtre utilisés pour fa production du produit d'expression
correspondant dans des cellules en culture, en particulier aux fins de
3o produire le produit d'expression recombinant qui pourrait lui-même être
directement utilisé, comme cela est envisagé plus loin.
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WO 99/06547 PGT/FR98~01704
21
II est renvoyé aux descriptions des demandes internationales
WO 91 /02796 déjà citée, WO 91110374, WO 92/05273 et WO 93117040
pour ce qui est d'exemples de vecteurs d'expression qui ont déjà été
décrits pour l'expression gène CFTR entier, et à ta demande WO 95!25796
s déjà mentionnée dans laquelle sont décrits des vecteurs utilisables pour
l'expression d'une CFTR dont ia région C-terminale avait été tronquée. Ces
différents vecteurs sont naturellement également utilisables pour
l'expression des séquences d'ADN conformes à la présente invention. Les
descriptions de ces demandes de brevet doivent être considérées comme
io faisant partie de la description de la présente demande pour ce qui est des
variantes de vecteurs d'expression utilisables pour la production des
produits d'expression des molécules d'ADN conformes à l'invention.
Sont d'un intérêt particulier, les vecteurs permettant la
transformation de cellules humaines, en particulier de cellules épithéliales.
is Des vecteurs d'expression particulièrement préférés sont des vecteurs
dérivés de virus du type adénovirus ou rétrovirus ou encore de virus
apparentés à ceux-ci (virus AAV), dont l'utilisation a déjà été envisagée
pour ia réalisation de thérapies géniques appliquées au traitement de la
mucoviscidose. On mentionnera aussi les demandes internationales
2o WO 95113365 et WO 96/13598 qui décrivent des vecteurs et plus
généralement des techniques applicables à l'expression du gène codant
pour la CFTR, à des fins d'application en thérapie génique sous forme de
cassettes de transcription et d'expression comprenant la séquence codant
pour la CFTR, recombinées avec des séquences régulatrices
2s fonctionnelles in-vivo dans des cellules de mammifères. A nouveau ces
techniques sont applicables à l'expression des séquences d'ADN
conformes à l'invention (en lieu et place des séquences d'ADN codant pour
la CFTR entière) de sorte que les descriptions de ces demandes doivent
aussi être considérées comme faisant partie de ia description de la
3o présente demande, pour ce qui est de la description de techniques et de
vecteurs utilisables à cet effet.
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wo moss4~ pcr~9eromoa
Z2
Tout indique que l'expression induite in-vivo des molécules
d'ADN selon l'invention, qui ont toutes vocation à coder pour un
polypeptide ayant une fonction de transporteur de giutathion, peut remédier
à une insuffisance à cet égard d'une CFTR endogène en raison des
s mutations qu'elle porterait et auxquelles semblent devoir être imputés au
moins une partie des signes cliniques de la mucoviscidose et, plus
généralement, de stimuler une expression endogène de CFTR et, ce
faisant, même de rétablir en partie la fonction de canal à ions chlorure, dès
lors que celle-ci ne serait pas totalement annihilée par d'autres mutations
lo affectant cette CFTR endogène.
L'effet thérapeutique attendu d'une thérapie génique mettant en
oeuvre des séquences d'ADN répondant aux définitions sus-indiquées,
peut être d'autant plus grand que les produits d'expression de ces
séquences d'ADN sont plus petits, solubles, stables, et d'une
i s immunogénicité propre réduite, voire inexistante dans la pratique.
D'une façon générale l'invention concerne aussi toute
composition pharmaceutique associant les molécules d'ADN conformes à
l'invention, le cas échéant déjà sous forme « vectorisée » avec des
véhicules pharmaceutiques favorisant leur pénétration au sein de cellules
2o humaines et leur expression dans celles-ci.
II s'agit de tous types de cellules susceptibles d'être ciblées par
des molécules mises en oeuvre directement ou indirectement (par exemple
lorsqu'il s'agit de polypeptides générés in situ comme dans le cas de la
thérapie génique) dans une thérapie anti-mucoviscidose. II s'agit par
2s exemple des cellules épithéliales, en particulier dans les traitements
focaux, par exempte au plan pulmonaire, ou de toutes autres cellules, .par
exemple les cellules hépatiques, Qui sont susceptibles d'intervenir dans
l'effet bénéfique du traitement, en particulier lorsqu'il résulte d'un
traitement
par la voie générale. Celui-ci revêt un intérêt tout particulier dans le cadre
3o de l'invention, compte tenu du mode d'action préféré dont elle tire profit,
à
savoir l'amélioration de la fonction de transporteur de glutathion.
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~3
L'invention concerne donc aussi toutes fomles de compositions
pharmaceutiques appropriées au traitement de la mucoviscidose,
permettant le cibiage des cellules choisies et contenant, associée à un
véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié, une cassette d'ADN
comprenant la molécule d'ADN selon l'invention, sous le contrble
d'éléments de régulation aptes à contrbler la transcription et la traduction
de sa séquence codante dans des cellules de mammifères, de préférence
humaines.
Un premier type de compositions préférées sont des
io compositions pharmaceutiques adaptées à l'administration par voie
générale pour les raisons évoquées ci-dessus. D'autres formes de
compositions sont adaptées à l'administration par l'intermédiaire des voies
respiratoires, des compositions préférées selon ('invention étant alors
celles qui peuvent étre mises sous forme d'aérosols, nébulisats ou
is analogues autorisant l'absorption de la composition notamment par
inhalation, et l'amenée de ces compositions au contact direct des cellules
pulmonaires ciblées.
Des exemples de véhicules pharmaceutiques, notamment du
type lipides cationiques, particulièrement appropriés à ce mode
2o d'administration et à des fins semblables (en rapport avec des thérapies
géniques mettant en oeuvre la CFTR entière) ont déjà été décrits, par
exemple dans les demandes intemationafes WO 93!12240, WO 93/12756
ou WO 93/24640. Il va sans dire qu'ils sont également applicables à fa
constitution de compositions pharmaceutiques mettant en oeuvre la
2s molécule d'ADN selon l'invention.
L'invention concerne enfin aussi les poiypeptides eux-mêmes
qui sont caractérisés par des séquences en acides aminés .telles qu'elles
ont été définies plus haut en rapport avec les séquences d'ADN
caractéristiques des molécules d'ADN selon l'invention. Ces polypeptides
3o sont en particulier ceux qui ont été produits dans des cellules en culture,
après transformation de celles-ci par des vecteurs appropriés contenant
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des séquences d'ADN codant pour ces polypeptides sous le contrôle
d'éléments de régulation appropriés, et récupération des pofypeptides
d'expression obtenus à partir de ces cultures cellulaires.
II a déjà été fait référence plus haut et à titre d'exemples à un
s certain nombre de demandes de brevet déjà publiées relatives à des
systèmes de culture dont l'utilisation a déjà été décrite en rapport avec la
production de CFTR recombinante. Les mêmes systèmes peuvent être
utilisés avec avantage pour la production des polypeptides définis dans la
présente demande.
io De la même façon, l'invention concerne des compositions
pharmaceutiques associant aux susdits polypeptides des véhicules
pharmaceutiques appropriés, en particulier du même type que ceux
envisagés ci-dessus pour les compositions pharmaceutiques à base de
molécules d'ADN.
is L'invention ne se limite pas à la seule utilisation d'une molécule
d'ADN telle qu'elle a été définie ci-dessus, en particulier pour ce qui est de
la séquence peptidique qu'elle possède en commun avec le gène de la
CFTR. Elle concerne aussi des compositions dans lesquelles à cette
molécule d'ADN serait substituée -ou aussi ajoutée-une molécule d'ADN
2o distincte dont le produit d'expression, structurellement différent de celui
de
la molécule d'ADN, telle qu'elle a été définie plus haut, présenterait lui
aussi une fonction de transporteur de glutathion. En particulier seraient
utilisables à cet effet des ADNs contenant une région NBF-1 de protéines
du type protéine MRP ou MDR humaine, qui porte aussi une telle
Zs information génétique. A titre d'exemple, on mentionnera la séquence
d'ADN codant pour la MRP-1 humaine décrite par Cole S.P.C. et al.,
Science 2~8: 1fi50-1ô54 (1992). De la même façon la protéine MRP
humaine ou la région utile à cette fin peut-elfe être substituée -ou aussi
ajoutée- au produit d'expression de la molécule d'ADN conforme à
30 l'invention, telle qu'elle a été définie plus haut.
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WO 99/06547 PCT/F'R98I01704
>>
L'invention n'est finalement limitée, ni à des compositions dont le
principe actif serait constitué seulement par une molécule d'ADN conforme
à l'invention ou plus généralement par une molécule d'ADN codant pour un
polypeptide doté d'une activité de transporteur d'ions giutathion, ou encore
s des produits d'expression correspondants. Elle concerne aussi des
compositions dans IesqueNes ce principe actif serait également associé à
d'autres, par exemple à une molécule d'ADN distincte ou, selon le cas, à
son produit d'expression. 11 s'agit, par exemple, de l'ADN entier codant pour
la CFTR ou l'ADN tronqué de la demande internationale WO 9512b796, ou
io le produit d'expression correspondant, aux fins de restaurer une fonction
canal à ions chlorure déficiente chez le patient traité de façon peut-être
plus marquée Que ne l'autoriserait ~ la seule molécule d'ADN selon
l'invention. On peut alors de cette façon assurer dans les conditions les
plus favorables les restaurations simultanées de la fonction transporteur de
na glutathion et de la fonction canal à ions chlorure chez les patients
concernés.
De la mëme façon l'invention concerne des compositions du
type sus-indiqué, par exemple celles dans lesquelles la molécule d'ADN
selon l'invention, en particulier celle dérivée du gène codant pour la CFTR,
2o serait associée à une séquence d'ADN codant pour la glutathion-S-
transférase, tel que celle portée par le gène GSTM1 humain (Zhong S. et
al., Biochem. J. 291:41-50 (1993)), en particulier aux fins de potentialiser
la
fonction transporteur de glutathion de la composition selon l'invention.
S'agissant des compositions à base de peptides, l'invention
2s étend donc aussi ses effets à celles qui contiendraient, aux mêmes fins, de
la glutathion-S-transférase.
Enfin les indications cliniques de l'invention ne sont pas limitées
au traitement de la mucovisci~os-e. Les compositions pharmaceutiques de
l'invention sont également applicables à d'autres affections fréquemment
30 observées chez des patients CF-hétérozygotes, par exemple de l'asthme
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et des polyarthrites et, plus généralement encore au traitement d'affections
attribuables à un déficit de la fonction de transporteur de glutathion.
Enfin les molécules d'ADN selon ('invention sont utilisables pour
induire une fonction de transporteur de glutathion chez l'animal, par
s exemple la souris, aux fins de créer des modèles animaux exprimant cette
fonction et pour étudier l'effet de composés tiers administrés à ces modèles
animaux, que ce soit pour stimuler davantage encore cette fonction de
transporteur de glutathion de leurs produits d'expression ou, au contraire,
pour apprécier dans quelle mesure ces composés interfèrent avec les
io fonctions de transporteur de giutathion de ces produits d'expression.
