Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02301978 2000-02-18
_ WO 99/09189 1 PCT/FR98/01814
Gène codant pourl'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformées
obtenues
résistantes aux maladies
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour
l'androctonine, un vecteur la contenant pour la transformation d'un organisme
hôte et le
procédé de transformation dudit organisme.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules
végétales
et des plantes, l'androctonine produite par les plantes transformées leur
conférant une
résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes
contre
les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir
recours à des
traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger
l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à
transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à même
d'assurer
leur défense contre ces maladies.
On connaît différentes substances d'origine naturelle. en particulier des
peptides,
présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les
champignons
responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à
trouver de telles
substances qui pourront non seulement être produites par des plantes
transformées, mais
encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer
aux dites
plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou
fongicide tant les
propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés
bactériostatiques
ou fongistatiques.
Les androctonines sont des peptides produits par les scorpions, en particulier
de
l'espèce Androctonus australes. Une androctonine et sa préparation par
synthèse chimique
est décrite par Ehret-Sabatier & coll., de même que ses propriétés
antifongiques et
antibactériennes in vitro.
On a maintenant identifié les gènes des androctonines, et on a également
trouvé
qu'ils pouvaient être insérés dans un organisme hôte, en particulier une
plante, pour
exprimer une androctonine tant pour la préparation et l'isolation de cette
androctonine que
pour conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies
fongiques et
aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement
avantageuse au
CA 02301978 2000-02-18
7
WO 99/09189 " PCT/FR98/01814
problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un fragment d'acide nucléique codant
pour
une androctonine, un gène chimère comprenant ledit fragment codant pour une
androctonine ainsi que des éléments de régulation en position S' et 3'
hétérologues pouvant
fonctionner dans un organisme hôte, en particulier dans les plantes et un
vecteur pour la
transformation des organismes hôtes contenant ce gène chimère, et l'organisme
hôte
transformé. Elle concerne aussi une cellule végétale transformée contenant au
moins un
fragment d'acide nucléique codant pour une androctonine et une plante
résistante aux
maladies contenant la dite cellule, en particulier régénérée à partir de cette
cellule. Elle
concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon
l'invention.
Par androctonine, on entend selon l'invention tout peptide pouvant être
produit et
isolé des scorpions, en particulier de l'espèce Arrdroctonz~s australes ces
peptides
comprenant au moins 20 acides aminé, de préférence au moins 25, et 4 résidus
cystéine
formant entre eux des ponts disulfure. De manière avantageuse, l'androctonine
comprend
essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I) suivante
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae
(I)
dans laquelle
Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé,
Xab représente un reste peptidique de 5 acides aminés,
Xac représente un reste peptidique de S acides aminés,
Xad représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et
Xae représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.
De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xae comprennent au moins un acide
aminé basique, de préférence 1. Par acides aminé basique, on entend selon
l'invention les
acides aminés choisis parmi la lysine, l'aspargine ou l'homoaspargine.
De manière préférentielle,
Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Val, dans laquelle Xaa' représente
NH2 ou un
reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, et/ou
Xab représente la séquence peptidique -Arg-Xab'-Ile, dans laquelle Xab'
représente un
reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
Xac représente la séquence peptidique -Arg-Xac'-Gly-, dans laquelle Xae'
représente un
reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 3 PCT/FR98/01814
Xad représente la séquence peptidique -Tyr-Xad'-Lys, dans laquelle Xad'
représente un
reste peptidique de 1 acide aminé, et/ou
Xae représente la séquence peptidique -Thr-Xae', dans iaqueile Xae' représente
COOH ou
un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé
De manière plus préférentielle,
Xaa' représente la séquence peptidique Arg-Ser-, et/ou
Xab' représente la séquence peptidique -Gln-Ile-Lys-, et/ou
Xac' représente la séquence peptidique -Arg-Arg-Gly-, et/ou
Xad' représente le reste peptidique -Tyr-, et/ou
Xae' représente la séquence peptidique -Asn-Arg-Pro-Tyr.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'androctonine est
représentée par la séquence peptidique de 25 acides aminés décrite
l'identificateur de
séquence n° 1 (SEQ ID NO 1) et les séquences peptidiques homologues.
Par séquences peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente
comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par
l'identificateur de séquence n° 1, étant entendu que les 4 résidus
cystéine et le nombre
d'acides aminés les séparant restent identiques, certains acides aminés étant
remplacés
par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant
pas de
modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la
dite
séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au
moins 75 % d'homologie, plus préférentiellement au moins 85 % d'homologie,
encore
plus préférentiellement 90 % d'homologie.
Le résidu NH2-terminal de l'androctonine peut présenter une modification post
traductionnelle, par exemple une acétylation, alors que le résidu C-terminal
peut
présenter une modification post traductionnelle, par exemple une amidation.
Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de
formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-
dessus, mais
également de telles séquences comprenant ~ l'une ou (autre de leurs
extrémités, ou les
deux, des résidus peptidiques nécessaires à leur expression et ciblage dans un
organisme
hôte, en particulier une cellule végétale ou une plante.
Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-androctonine » ou
« androctonine-peptide », avantageusement « peptide-androctonine », dont la
coupure par
les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de
l'androctonine,
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 't PCT/FR98/01814
définie ci-dessus. Le peptide fusionné à l'androctonine peut être un peptide
signal ou un
peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de
l'androctonine de
manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, en particulier de la
.cellule
végétale ou de la plante, comme par exemple le cytoplasme, la membrane
cellulaire, ou
dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires
ou de tissus
ou dans la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal
d'adressage
chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les
chloroplastes ou les
mitochondries.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut être
un
signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un
signal
responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou
un peptide
d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le
lieu où sont
pris en charge par la « machinerie cellulaire » des opérations de maturation
de la protéine
1~ produite. comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles, et dans ce
cas
éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire
comprenant, dans le
sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un
gène végétal
codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de
la partie
mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation
plastidiale,
puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal
codant pour
une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0
508 909.
Comme peptide de transit utile selon l'invention, on peut citer en particulier
le peptide signal du gène PR-la du tabac (WO 95/19443), représenté avec sa
séquence
codante par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID NO 2) et fusionné
à l'androctonine
par l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), en particulier
correspondant à la
protéine de fusion correspondant aux bases 12 à 176 de cette séquence, en
particulier
lorsque l'androctonine est produite par des cellules végétales ou des plantes,
ou le
précurseur du facteur Mat al lorsque l'androctonine est produite dans des
levures..
La présente invention concerne donc d'abord un fragment d'acide nucléique, en
particulier d'ADN, codant pour l'androctonine définie ci-dessus. Il peut
s'agir selon
l'invention d'un fragment isolé de Androctonus australes, ou encore un
fragment dérivé,
adapté pour l'expression de l'androctonine dans l'organisme hôte où le peptide
sera
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 S PCT/FR98/01814
exprimé. le fragment d'acide nucléique peut être obtenu selon les méthodes
standards
d~isolation et de purification, ou encore par synthèse selon les techniques
usuelles
d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniaues
sont
notamment décrites par Ausubel & colt.
Selon la présente invention, on entend par « fragment d'acide nucléique » une
séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type
ADN,
en particulier ADNc, notamment double brin.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le fragment d'acide nucléique
codant
pour l'androctonine est la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de
séquence n° 1
(SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite
séquence, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID NO1,
correspondant aux
bases 1 à 75.
Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique
présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la
séquence
1 ~ nucléotidique décrite par I'identificateur de séquence n° 1 et
codant pour l'androctonine.
Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de
mutation, ou
encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la
préparation de
ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides
nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les
différences entre
2U la séquence de référence décrite par l'identificateur de séquence n°
1 et l'homologue
peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit d'un fragment d'ADN de
taille
inférieure â 1 UO acides nucléiques, réalisable par synthèse. De manière
avantageuse, le
degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence,
de
préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces
modifications
25 sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la
séquence primaire de
l'androctonine résultante.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette
d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de
régulation en
position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en
particulier
30 les cellules végéales ou les plantes, liés de manière fonctionnelle à
ladite séquence
codante, ladite séquence codante comprenant au moins un fragment d'ADN codant
pour
l'androctonine tel que défini ci-dessus (y compris le peptide de fusion «
peptide-
androctonine » ou « androctonine-peptide »).
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 6 PCT/FR98/01814
Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire,
inférieur ou
supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit,
pour la
production d'androctonine. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple
E. coli, de
levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de
champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacylovirus, ou de préférence
des cellules
végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une
plante
et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus
différenciés tels
que des embryons, des parties de plantes. des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention. tout organisme multicellulaire
différencié
capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones,
plus
particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation
animale ou
humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre,
la betterave, le
tabac. le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression du fragment d'ADN codant
pour l'androctonine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de
l'organisme
hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de
transcription, des peptides de transit, des séquences terminatrices, y compris
des codons
start et stop. Les moyens et méthodes pour identifïer et sélectionner les
éléments de
régulation sont bien connus de l'homme du métier.
Pour la transformation des microorganismes comme les levures ou les bactéries,
les
éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent
notamment des séquences promotrices, des activateurs de trancription, des
peptides de
transit, des séquences terminatrices et des codons start et stop.
Pour diriger l'expression et la sécrétion du peptide dans le milieu de culture
de la
levure, un fragment d'ADN codant l'héliomycine est intégré dans un vecteur
navette qui
comprend les éléments suivants
- des marqueurs perméttant de sélectionner les transformants,
- une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du
plasmide
dans la levure.
- une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du
plasmide
dans E. coli,
- une cassette d'expression constituée
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 ~ PCT/FR98/01814
. ( 1 ) d'une séquence de régulation promotrice,
(? ) d'une séquence codant pour un peptide signal (ou prépeptide) en
association
avec un peptide d'adressage (ou propeptide,
(3) d'une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation.
Ces éléments ont été décrits dans plusieurs publications dont Reichhart et
al., 1992,
Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 et Michaut et al., 1996, FEBS Letters, 395,
pp 6-10 .
De manière préférentielle, on transforme des levures de l'espèce S. cerevisiae
avec
le plasmide d'expression par la méthode à l'acétate de lithium (Ito et al.,
1993, J.
Bacteriol, 153, pp 163-168).
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes.
Comme
séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute
séquence
promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier
un
promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple,
celui d'un gène de
la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou d'un
gène de
1 ~ virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur
(CAMV 19S ou
35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-la du tabac,
tout
promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à
une
séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence
codante de
manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par
exemple, celle
comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0
507 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence
de
régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées
entre le promoteur
et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription
("enhancer"), comme par
exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV)
décrit dans la
demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington &
Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut
utiliser
toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le
terminateur
nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par
exemple un
terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
Selon la présente invention, le gène chimère peut également être associé à un
marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs
de
sélection sont bien connus de l'homme du métier. II pourra s'agir d'un gène de
résistance
aux antibiotiques, ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les
plantes.
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 g PCT/FR98/01814
. La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou
d'expression
pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère
tel que
défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au
moins une
origine de réplication, et le cas échéant un marqueur de sélection approprié.
Ce vecteur
peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus,
transformés
par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de
transformation en
fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du
métier et
largement décrits dans la littérature.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira
notamment
d'ùn virus qui peut être employé pour la transformation des plantes
développées et
contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De
manière
préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des
plantes selon
l'invention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes
hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un
fragment d'acide
nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui
peut être
obtenue par tout moyen connu approprïé, amplement décrit dans la littérature
spécialisée
et notamment les références citées dans la présente demande, plus
particulièrement par le
vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou
des
tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une
autre série
de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un
gène chimère
inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d Agrobacterium
rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou
félectroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la
nature
de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier
cellules végétales ou plantes, transformés et contenant une quantité efficace
d'un gène
chimère comprenant une séquence codante pour l'androctonine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules
transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules
transformées. La
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 9 PCT/P'R98/01814
. régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature
de l'espèce,
comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération
des
plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
4,459,355,
S US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604
662, EP
672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744,
US
5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US
5,554,798, US
5.489,520, US S,S 10,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233,
EP 486
234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la
culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les
graines de
plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en
particulier à
certaines maladies fongiques ou bactériennes. De ce fait, la séquence d'ADN
codant pour
1 S l'androctonine peut être intégrée avec pour objectif principal la
réalisation de plantes
résistantes aux dites maladies, l'androctonine étant efficace contre des
maladies fongiques
telles que celles causées par Cercospora, en particulier Cercospora beticola,
Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusariarm, en particulier
Fusarium
culmorum ou Fttsaritun graminearum, ou par Phytophthora, en particulier
Phytophtora
cinncnnomi.
Le gène chimère pourra également ëtre associé, et de manière avantageuse, à au
moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aux
herbicides.
La séquence d'ADN codant pour l'androctonine peut également être intégrée
comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres
séquences
2S codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des
gènes de
tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de (homme du métier
et
notamment décrits dans les demandes de brevet EP 115 673, WO 87/04181, EP 337
899,
WO 96/38567 ou WO 97/04103.
Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent
comprendre outre la séquence codant pour l'androctonine, d'autres séquences
hétérologues
codant pour des protéines d'intérêt comme d'autres peptides complémentaires
susceptibles
de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine
bactérienne ou
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 10 PCT/FR98/01814
fongique, et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux
herbicides,
notamment définies èi-dessus et/ou d'autres séquences codant pour des
protéines de
résistance aux insectes, comme les protéines Bt notamment.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur
comprenant le gène chimère selon l'invention, lequel comprend une séquence
codant pour
l'androctonine, et comprenant au moins un autre gène comprenant une autre
séquence
codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant
au
moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-
dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de
parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pour l'androctonine,
l'autre portant un
gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Parmi les séquences codant pour d'autres peptides antifongiques, on peut citer
celle
codant pour la drosomicine, décrite dans la demande de brevet FR 2 725 992 et
par
1 ~ Fehlbaum & colt. ( I 994), et dans la demande de brevet non publiée FR 97
09115 déposée
le 24 juillet 1997.
La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes
transformées selon l'invention. le procédé consistant à planter les graines
des dites plantes
transformées dans une surface d'un milieu de culture, en particulier d'un
champ, approprié
pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface une
composition
agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les
dites plantes
transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la
maturité
souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
Par composition agrochimique, on entend selon l' invention toute composition
agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités
suivantes,
herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon
l'invention,
la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins
une
activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une
activité
complémentaire de celle de l'androctonine produite par les plantes
transformées selon
l' invention.
Par produit présentant une activité complémentaire de celle de l'androctonine,
on
entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité
complémentaire, c'est
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 11 PCT/FR98/01814
. à dire un. produit qui sera actif contre des attaques de contaminants
(champignons,
bactéries ou virus) insensibles à l'androctonine., ou encore un produit dont
le spectre
d'activité recouvre celui de l'androctonine, totalement ou en partie, et dont
la dose
d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de
l'androctonine produite par la plante transformée.
Enfin, la culture des organismes hôtes transfomrés permet de produire de
l'androctonine à large échelle. La présente invention concerne donc également
un procédé
de préparation de l'androctonine, comprenant les étapes de culture de
l'organisme hôte
transformé comprenant un gène codant pour l'androctonine tel que défini ci-
dessus dans
un milieu de culture approprié, puis l'extraction et la purification totale ou
partielle de
l'androctonine obtenue.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation de la
séquence codant pour l'androctonine, du gène chimère, du vecteur d'intégration
et des
plantes transformëes. Les figures 1 à 5 en annexe décrivent les structures
schématiques de
certains plasmides préparés pour la construction des gënes chimères. Dans ces
figures, les
différents sites de restriction sont marqués en italiques.
E~cemple 1: Çonstruction des gènes chimères
Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de
laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits
dans
Ausubel & coll.
pRPA-MD-P: Création d'un plasmide contenant le signal peptide du gène PR-la du
tabac.
Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 1 et Oligo 2 ci-
après, sont hybridés à 65 °C pendant 5 minutes puis par diminution
lente de la température
à 30°C pendant 30'.
Oligol: 5' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC
ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3'
Oligo2: 5' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA
GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3'
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 12 PCT/FR98/01814
Après hybridation entre l'Oligo 1 et l'Oligo 2, l'ADN resté simple brin sert
de
matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions
standard
préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de
l'oligonucléotide
double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. L'oligonucléotide
double brin
obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et Nael et
cloné dans le
plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction.
On
obtient alors un clone comprenant la région codant pour peptide signal du gène
PR-la du
tabac (SEQ ID NO 2).
pRPA-PS-PRla-andro: Création d'une séquence codant pour l'androctonine
fusionée au signal peptide PR-la sans région non transcrite en 3'.
Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 3 et
Oligo 4 selon les conditions opératoires décrites pour pRPA-MD-P.
Oligo 3: 5 ' AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG
GTGG 3'
Oligo 4: S ' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG
GCCTGTTAGT GCACTTGTAG TAGCAACCAC CCCTCCTCCT
GCAGATCTTG ATCTGCC 3'
Après hybridation entre l'Oligo 3 et l'Oligo 4, l'ADN resté simple brin sert
de
matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions
standard
préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de
l'oligonucléotide
double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. Cet oligonucléotide
double brin
contenant la partie codante de l'androctonine (SEQ ID NO 1) est ensuite cloné
directement
dans le plasmide pRPA-MD-P qui a été digéré avec l'enzyme de restriction Nael.
L'orientation correcte du clone obtenu est vérifiée par séquençage. On obtient
alors un
clone comprenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-
androctonine située
entre les sites de restriction Ncol à l'extrémité N-terminale et Scal, Sacll
et BamHl à
l'extrémité C-terminale (SEQ ID NO 3).
pRPA-RD-238: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la
la
séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine.
Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 1 ~ PCT/FR98/01814
Jim Carrington (Texas A&M University, non décrit). Ce plasmide dont ia
structure
schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 355
dupliqué
isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x355; Odell &
coll.,
1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5'
du virus etch
du tabac (TEV 5' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la ~i-
glucuronidase de E.
coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadenylation de TARN
355 de
CaMV (CaMV polyA; Odell & coll., 1985).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et
BamHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-PS-PRIa-andro
est
digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHl et le petit fragment
d'ADN
contenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine est
purifié. Les
deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette
d'expression
dans les plantes qui synthétise une protéine de fusion PR-la-androctonine. La
structure
schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. c
PR-la-
1 ~ androctonine » représente la région codante pour la protéine de fusion PR-
1 a-androctonine
de pRPA-RD-230. L'androctonine est transportée vers la matrice extra-
cellulaire de la
plante par l'action du peptide signal PR-la.
pRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple
?0 modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site
de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires
Oligo 5
et Oligo 6 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure
décrite pour
pRPA-MD-P.
OligoS: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
CATGC 3'
Oligo6: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3'
L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été
préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRl et Hindlll et rendu
bouts
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 I'~ PCT/FR98/01814
francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. cvli. On
obtient un
vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction
des cassettes
d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacteriurn terrnejaciens. La
structure
schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur Ia tïgure 3.
pRPA-RD-233: Introduction de la cassette d'expression de PR-la-androctonine de
pRPA-RD-230 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-230 est digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll. Le
fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est
purifié. Le
fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-19~ qui a été préalablement
digéré avec
l'enzyme de restriction Hindlll et déphosphorylé avec la phosphatase
intestinale de veau.
pRPA-RD-174: Plasmide dérivé de pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) contenant le gène
de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une
amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est
cloné dans le
site EcoRl de pRPA-BL-150A qui a été rendu bouts francs par l'action de la
polymérase
klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium
tumefaciens
qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à proximité de sa bordure
droite, un gène
de tolérance à la kanamycine à proximitë de sa bordure gauche et un site de
clonage
multiple entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 4. Sur
cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline
synthase
d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983). "NOS pro" représente le
promoteur
de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983),
"NPT II"
représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E
coli
(Rothstein & coll., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du
virus de la
mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX" représente le gène de la
nitrilase
isolé de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" et "LB" représentent
respectivement les
bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium
tumefaciens.
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 15 PCT/FR98/01814
pRPA-RD-184: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD-
174.
Les oligonuclëotides synthétiques complémentaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-après,
sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P.
Oligo7: 5' CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3'
Oligo8: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
GTGGCCTGAC TGG 3'
L'oligonucléotide double brin hybridé (95 paires de bases) est purifié après
séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174
est
digéré avec l'enzyme de restriction Xmal, et le grand fragment d'ADN est
purifié. Les deux
fragents d'ADN obtenus sont ensuite liés.
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de
restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la
kanamycine marqueur
de sélection.
La structure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure
~
où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "35S pro", "BRX gene", "RB" et "LB"
ont la
même signification que pow la figwe 4.
pRPA-RD-236: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la
construction du géne codant pour fandroctonine dirigée vers la matrice
extracellulaire.
La plasmide pRPA-RD-233 est digéré avec les enzymes de restriction Pmel et
Ascl
et le fragment d'ADN contenant le gène de PR-la-androctonine est purifié. Le
plasmide
pRPA-RD-184 est digéré avec les même enzymes de restriction. Le fragment d'ADN
contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est ensuite liée dans
pRPA-RD-
184. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la
séquence
codant pow la protéine de fusion PR-la-androctonine qui conduit à (expression
de
l'androctonine dans la matrice extracellulaire de la plante.
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 16 PCT/FR98/o1814
Exemple 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
2;1- Transformation
Le vecteurs pRPA-RD-236 est introduit dans la souche d'A~~;robacterium
tumefaciens EHA 1 O 1 (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari
&
coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de
Horsh & colt.
{ 1985).
2-2- Régénération
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants
foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS)
comprenant 30 g/1 de
saccharose ainsi que 200 pg/ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont
prélevés sur
des plantes cultivées en serre ou in vitro et régénérées selon la technique
des disques
foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première
comprend
l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose
contenant 0,05
mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP)
pendant 15
jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées
pendant 10
jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne
contenant
pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur
un milieu
d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant
pas
d'hormone. Au bout d'environ 1 ~ jours, les pousses enracinées sont passées en
terre.
2-3- Tolérance au bromoxvnil
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la
construction pRPA-R.D-236. Ces plantes ont été traitées en serre au stade S
feuilles avec
une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active
bromoxynil
par hectare.
Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont ensuites
employées dans différentes expérimentations qui montrent que l'expression de
l'androctonine par les plantes transformées les rend résistantes aux
agressions fongiques.
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 17 PCT/FR98/01814
REFERENCES
Ausubel, E. A. & colt. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology.
Publ. Wiley
& Sons.
Bevan, M. & colt. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.
Carnngton and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.
Ehret-Sabatier & colt. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47,
29537-29544.
Horsch & colt. (1985). Science 227:1229-1231.
Jefferson & colt. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
Komari & colt. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Rothstein & colt. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.
Stalker & colt. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
Odell, J.T. & colt. (1985). Nature 313:810-812.
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 PCT/FR98/01814
- 1
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 69009
(ü) TITRE DE L'INVENTION: Gène codant pourl'androctonine, vecteur le
contenant et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11
(iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 110 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADN
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..75
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AGG TCC GTG TGC AGG CAG ATC AAG ATC TGC AGG AGG AGG GGT GGT TGC 48
Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys
1 5 10 15
TAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG g5
Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr
20 25
TGTCGACGGA TCCGG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 106 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
110
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 PCT/FR98/01814
2
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:12..101
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GCGTCGACGC C ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT 50
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu
1 5 10
CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 9g
Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg
15 20 25
GCC GGCGA
Ala 106
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
(A) LONGUEUR: 211 paires de bases
(B) TYPE: nuclotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linaire
(ii)TYPE DE MOLCULE: ADN
(ix)CARACTRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:12..176
(xi)DESCRIPTION DE LA SQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GCGTCGACGC 50
C
ATG
GGT
TTC
GTG
CTT
TTC
TCT
CAG
CTT
CCA
TCT
TTC
CTT
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe
Leu
1 5 10
CTTGTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT 9g
TGC CGT
LeuVal Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser
Cys Arg
15 20 25
GCCAGG TCC GTG TGC AGG CAG ATC AAG ATC TGC AGG AGG AGG
GGT GGT
146
AlaArg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg
Gly Gly
30 35 40 45
TGCTAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG
196
CysTyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr
50 55
TGTCGACGGA TCCGG
211
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 PCT/FR98/01814
3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 75 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 1"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA 60
CTCTTCTTCT TTTCC 75
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 72 paires de bases
(8) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 2"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG 60
AAAGATGGAA GC 72
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléeotide synthétique 3"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:
AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG GTGG 44
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 97 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 PCT/FR98/01814
4
(A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 4"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG GCCTGTTAGT GCACTTGTAG 60
TAGCAACCAC CCCTCCTCCT GCAGATCTTG ATCTGCC 97
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: B5 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 5~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC 60
CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC $ç
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucl,ique
(A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 6~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60
TAGAGG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 7~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
66
CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT 60
CA 02301978 2000-02-18
WO 99/09189 PCT/FR98/01814
GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG g3
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 8~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC 60
GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG g3
